El Zn y la anhidrasa carbónica

El Zn y la anhidrasa carbónica INTRODUCCIÓN El cinc, junto con el cadmio y el mercurio, forma el grupo 12 de la Tabla periódica. Tiene una configuración electrónica [Ar]3d104s2 y es el segundo elemento en abundancia entre los metales de transición y post‐transicionales. En condiciones normales adopta un único estado de oxidación estable, Zn(II), por lo que no es de esperar que pueda intervenir en procesos redox biológicos directos; es decir, reacciones donde el Zn(II) cambie de estado de oxidación. Las características de este elemento que lo hacen útil para los seres vivos, se pueden resumir de la siguiente forma: a) Tiene una química redox prácticamente inexistente en condiciones biológicas b) Es capaz de generar ligantes hidroxilo por hidrólisis de moléculas de agua de su esfera de hidratación, a pH moderadamente altos. Estos iones OH‐, pese a estar enlazados al catión metálico, mantienen un alto carácter nucleofílico como se verá más adelante. c) Prefiere números de coordinación bajos (4 y 5) con geometrías felxibles al no existir energía de estabilización de campo. Si los átomos coordinados son pequeños, también se podrían alcanzar coordinaciones más altas. Esta flexibilidad es, sin duda, una cualidad excelente para funcionar como centro catalítico. d) Sus complejos presentan, en muchos casos, una labilidad significativa lo que es también de gran valor catalítico. El cinc en sus enzimas puede desarrollar una función: i)catalítica, cuando el ion metálico está implicado directamente en la catálisis; ii)cocatalítica, cuando son necesarios dos o tres metales para que la enzima alcance su actividad completa; iii)estructural, cuando el ión sólo es necesario para mantener la estructura terciaria o cuaternaria de la apoenzima; iv) desconocida. El cinc desempeña un papel catalítico en algunas enzimas oxidoreductasas, transferasas, hidrolasas, isomerasas, ligasas y liasas. Dentro de este último grupo de enzimas se encuentra la anhidrasa carbónica. ANHIDRASA CARBÓNICA. El dióxido de carbono (CO2) es un metabolito clave para los seres vivos. Esta molécula existe en equilibrio con el ion bicarbonato (HCO3‐). A diferencia del CO2 atraviesa por difusión pasiva las membranas, mientras que el ion HCO3‐, debe ser transportado. La transformación del HCO3‐ a CO2 permite la entrada del bicarbonato a la célula y la reacción inversa evita que el CO2 escape al exterior. A pH fisiológico, estas reacciones ocurren muy lentamente, por lo que la célula se reserva el uso de enzimas que agilicen este proceso. Este es el caso de las anhidrasas carbónicas, enzimas con centro metálico de Zn que catalizan la reacción reversible de hidrogenación del CO2 y deshidrogenación del HCO3‐. A su vez, las anhidrasas carbónicas participan en procesos como la respiración y fotosíntesis en células eucariotas o la degradación de cianato en células procariotas. La anhidrasa carbónica cataliza la siguiente reacción: H2O + CO2 ↔ H+ + HCO3
‐ Como ya se ha mencionado anteriormente, esta reacción está presente en todos los seres vivos, ya que intervienen en diversos procesos fisiológicos y bioquímicos. El mecanismo de acción de la anhidrasa carbónica incluye dos pasos: el ataque nucelofílico del ion –OH unido al Zn, en el CO2. El segundo paso consiste en la regeneración del sitio activo por medio de la deshidrogenación de una molécula de agua unida al Zn. Dependiendo del pH del medio, la reacción se desplazará hacia la hidrogenación del dióxido de carbono o deshidrogenación del bicarbonato (Figura 1). La velocidad de reacción enzimática es 107 veces mayor que la del proceso catalizado. La reacción es lenta a pH fisiológico (k~10‐1s‐1), mientras que en presencia de la forma más eficiente de anhidrasa carbónica el número de recambio es aproximadamente 106s‐1. Figura 1. Diagrama esquemático del mecanismo enzimático de la anhidrasa carbónica. La interconversión de CO2 y HCO3‐ se enfatiza. Las líneas punteadas indican puentes de hidrógeno, las líneas (‐ ‐) indican electrones deslocalizados y las flechas sólidas indican transferencia de electrónes. Tomada de Lindskog,S y Liljas A., 1993.
OBJETIVO ACADÉMICO Ilustrar el papel del Zn en el sitio catalítico de la anhidrasa carbónica como catalizador de reacciones ácido‐base, y relacionar el ambiente de coordinación con esta propiedad. PROBLEMA Que el alumno establezca el tiempo que tarda una solución saturada de CO2en disminuir el pH desde 8.3 hasta 6.3 en presencia de anhidrasa carbónica, acetazolamida y ZnCl2. REACTIVOS A.
B.
C.
D.
E.
F.
Tris‐HCl 20mM pH=8.3 Agua desionizada Solución de ZnCl2 (1x10‐9M)) Solución de acetazolamida (1x10‐4M Solución de anhidrasa carbónica 0.1mg/mL Solución saturada de CO2 EQUIPO Potenciómetro MATERIAL Micropipetas de 100 y 1000 L Viales Baño de hielo Puntas para micropipetas Cronómetro PARTE EXPERIMENTAL 1. Todo el procedimiento deberá realizarse en baño de hielo y un ensayo a la vez. Comience el ensayo 1 hasta que se lo indique el protocolo. 2. Los reactivos se agregarán en el orden en el que se indica en la tabla 1 según corresponda el número de ensayo. Tabla 1. Orden de adición de reactivos para los ensayos 1‐4. ORDEN DE ADICIÓN DE REACTIVOS ENSAYO 1
2
3
4 A 6 mL
6 mL
6 mL
6 mL B 0.2 mL
0.1 mL
0.1 mL
C 0.1 mL D 0.1 mL E 0.1 mL 0.1 mL F 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL Registre el pH de la solución. Tome el tiempo que tarda el pH en disminuir de 8.3 a 6.3. Tabla 2. Resultados de los ensayos 1‐4. Muestra pH inicial Tiempo entre pH 8.3 y 6.3 1 2 3 4 3. Antes de iniciar el primer ensayo calcule la concentración final de amortiguador en la mezcla de reacción y anótelo aquí. _____________________________________________________________________ 4. A partir de la concentración final del buffer, calcule la cantidad de ácido que se necesita para hacer virar el pH de 8.3 a 6.3 ___________________________________________ 5. Analice las especies que se forman en disolución y responda: ¿Por qué el punto final de los ensayos se mide a pH 6.3? ___________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________ 6. Realice únicamente el ensayo 1 y registre sus observaciones en la tabla 2. 7. ¿Por qué el pH en la solución blanco (ensayo 1) disminuye drásticamente al agregar el reactivo F (solución saturada de CO2)? ___________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________ 8. Realice el ensayo 2 según el orden de adición de la tabla 1 y registre los resultados en la tabla 2. 9. Compare los tiempos y comente a que atribuye los cambios ___________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________ 10. A continuación se presenta la estructura de la acetazolamida (Fig. 2). Figura 2. Acetazolamida: (N‐(5‐sulfamoil‐1,3,4‐tiadiazol‐2‐il)acetamida) 11. Antes de realizar el ensayo 3 y 4 analice los reactivos que agregará y plantee una hipótesis acerca del tiempo que tardará la solución en virar el pH de 8.3 a 6.3. Registre su hipótesis en la tabla 3. Tabla 3. Hipótesis para los ensayos 3 y 4. No. Ensayo Hipótesis 3 4 12. Realice el ensayo 3 y registre sus resultados en la tabla 2. 13. ¿La solución de ZnCl2 viró el pH de la solución a la misma velocidad que la enzima? ________________________________________________________________ 14. ¿A qué atribuye este hecho? ___________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________ 15. Realice el ensayo 4 y registre sus resultados en la tabla 2. Compare los tiempos. 16. ¿Como cataloga el efecto de la acetazolamida sobre la enzima? _________________________________________________________________ 17. En términos de química de coordinación proponga un mecanismo para este efecto? ___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________ 18.Con el apoyo de la base de datos RCSB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) y el programa RasMol version 2.7.4.2 verifique su hipótesis. 19.¿Qué utilidad o utilidades terapeúticas tienen los inhibidores de la Anhidrasa carbónica? ___________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________ 20.Con base en los conocimientos adquiridos en esta práctica proponga una estructura química de un potencial inhibidor de la Anhidrasa carbónica. BIBLIOGRAFÍA Casas, J.S. Química Bioinorgánica. Editorial Síntesis, Madrid, 2002. McDowell, J., Carbonic Anhydrase, Interpro: Protein Spotlight, UK, January, 2004. Sigma_Aldrich, Enzymatic Assay for Carbonic Anhidrase http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/General_Information/carbonic_anhy
drase_‐_titrimetric.Par.0001.File.dat/carbonic_anhydrase_‐_titrimetric.pdf Sven Lindskog and Anders Liljas. Carbonic anhydrase and the role of orientation in catalysis. Current Opinion in Structural Biology, Volume 3, Issue 6, 1993, Pages 915‐920 C. T. Supuran, A. Scozzafava. Carbonic anhydrases as targets for medicinal chemistry. Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) 4336–4350 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, Protein Data Bank (RCSB‐PDB). http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doRasMol version 2.7.4.2, Freeware. RasWin Molecular Graphics, http://www.rasmol.org/ Copyright © R. Sayle Windows Version 2.7.4.2. Copyright © H. Bernstein, yaya@bernstein‐plus‐sons.com. CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Reacciones que cataliza la anhidrasa carbónica 2. Estado de oxidación más común, propiedades espectroscópicas, ligantes y geometría preferencial de compuestos de coordinación de Zn. 3. Metales que tengan preferencias similares al Zn en cuanto a átomos donadores o ligantes.