variantes alélicas *4 y *6 de citocromo p450 2d6: estudio piloto.

 ARTÍCULO ORIGINAL
VARIANTES ALÉLICAS *4 Y *6 DE CITOCROMO P450 2D6: ESTUDIO PILOTO. (Allelic Variants * 4 and * 6 of Cytochrome P450 2D6: A pilot study) Verónica Kramer, M.D.1,2, Juan C. Marín, Ph.D.3, Andrés Yarur, M.D.4 y Maximiliano Hormazábal, M.D.5 1 2
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Facultad de Medicina, Universidad Mayor. Instituto Nacional del Cáncer, Santiago de Chile. Departamento de Ciencias Básicas, Universidad 4 5 del Bio Bio. University of Miami. Hospital de San Felipe. RESUMEN ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Dentro de la gran familia de sistemas enzimáticos metabolizadores de fármacos, destaca la CYP2D6 debido a la gran variabilidad interétnica e interpersonal que presenta su actividad, y además, a que es responsable del metabolismo de muchos medicamentos ampliamente usados en la práctica clínica diaria. Esto puede reflejarse en una falta de efecto terapéutico o por otro lado, en la aparición de efectos adversos a dosis estándar de un medicamento. Mediante el uso un PCR anidado, se analizó una población mixta de nuestra Universidad, buscando detectar dos de las variantes alélicas que determinan con más frecuencia una baja actividad metabólica de la CYP2D6 en la población caucásica (CYP2D6*4 y CYP2D6*6). De entre la población estudiada (n=40), se encontró la variante CYP2D6*4 en el 3,75% de los alelos, y la variante CYP2D6*6 en un 1,75%. Nuestros resultados revelan que la población chilena estudiada presenta una prevalencia de alelos mutantes para la CYP2D6*4 intermedia entre la población caucásica y asiática, lo que guarda relación con lo ya estudiado en otras vías de metabolización de fármacos y con la distribución del grupo ABO sanguíneo. Por el contrario, esto no se cumple para la CYP2D6*6, en donde se encontró una prevalencia mayor a lo descrito para caucásicos y asiáticos. Sin embargo, es aún necesario completar el estudio de otras variantes alélicas que codifican sistemas enzimáticos lentos y además estudiar su prevalencia en otras etnias presentes en la población chilena y en una muestra aleatoria de base poblacional. Palabras claves: Citocromo P‐450 (CYP2D6), farmacogenética, toxicidad a fármacos, resistencia a fármacos Publicado por la Sociedad de Farmacología de Chile ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ INTRODUCCIÓN Uno de los objetivos de la Medicina, es tratar o prevenir patologías, sin que ello implique más daño al paciente. Dentro de las opciones terapéuticas, el uso de medicamentos es una importante herramienta. La respuesta a muchos fármacos de uso habitual varía de forma considerable entre los pacientes. Al administrar idénticas dosis de un determinado medicamento, algunos individuos pueden presentar efectos adversos significativos, en cambio otros, pueden no evidenciar la respuesta terapéutica esperada (1,2). Por un lado, importantes fármacos son efectivos en sólo un 25% a 60% de los pacientes y por otro lado, en Estados Unidos se reportan entre 1 y 2 millones de reacciones adversas a medicamentos al año (2). Existen muchas variables que determinan esta respuesta, como por ejemplo la edad, alimentación y el uso concomitante de otros medicamentos. Una causal importante de esta diversidad en la respuesta, es la diferencia en la velocidad del metabolismo del fármaco (3). Desde hace ya bastante tiempo se ha correlacionado la variabilidad de respuesta a fármacos en diferentes poblaciones étnicas, sin haber dilucidado la causa de este comportamiento (4,5). El descubrimiento de las enzimas mono‐oxigenasas dependientes de la citocromo P‐450 (CYP P‐450) ha permitido en gran parte entender este fenómeno (5). Se ha podido estudiar las características de varias de estas enzimas, las cuales participan en la biosíntesis y degradación de compuestos endógenos y en el metabolismo de muchos químicos presentes en la dieta alimenticia, medio ambiente y fármacos (6). ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Correspondencia a: Dra. Verónica Kramer A. Facultad de Medicina Universidad Mayor. Camino La Pirámide 5750, Huechuraba. Santiago de Chile. Fono‐fax: 751‐
2243. Correo electrónico: [email protected] Rev. Farmacol. Chile (2011) 4(1): 9 Cuatro isoenzimas de la citocromo P450 (CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9 y CYP1A2) son las responsables del metabolismo del 95% de todos los fármacos. Dentro de ellas, destacar la isoenzima CYP2D6, debido a la gran variabilidad interétnica que presenta, y a que es responsable de la activación e inactivación de muchos medicamentos ampliamente usados, como por ejemplo los antidepresivos tricíclicos, codeína, inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, neurolépticos y beta‐bloqueadores (7,8,9). La distribución del fenotipo de la CYP2D6 varía con la raza. La mayoría de la población se encuentra en el grupo de metabolizadores rápidos, sin embargo hasta un 10% de Caucásicos y 4% o menos en otras etnias (egipcios y árabes sauditas), presentan una disminución de la actividad de la CYP2D6 (7,10). Dependiendo de la farmacocinética del medicamento y su margen de seguridad, esto se traduce en el potencial riesgo de presentar efectos tóxicos al administrar dosis estándar de un fármaco determinado (Ej.: antidepresivos tricíclicos), o por otro lado, en ausencia de acción farmacológica (ej: codeína) (2,11) Hasta hace un tiempo, se usaban moléculas de sondeo para establecer el fenotipo de metabolización de un determinado individuo (debrisoquina y esparteína). Este era un proceso largo y complicado que implicaba la administración de estos compuestos, su recolección en orina o sangre y luego el cálculo de su índice metabólico (12). Recientes estudios indican que la determinación del genotipo CYP2D6 mediante la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), predice con gran exactitud el fenotipo del metabolismo debrisoquina/esparteína, lo que permitiría clasificar a los individuos en metabolizadores lentos, intermedios, rápidos o ultrarrápidos de acuerdo al genotipo de CYP2D6 que presenten (7,13). De las más de 70 variantes alélicas descritas, por lo menos 15 codifican producto génico no funcional (expresándose fenotípicamente como metabolizadores lentos) (14). Se ha estudiado la frecuencia alélica de varios de estos polimorfismos en distintas poblaciones, incluyendo la Mapuche, encontrándose importantes diferencias entre etnias (15‐19). La farmacogenética estudia la respuesta a fármacos basado en el perfil genotípico de cada individuo. El conocimiento del isotipo farmacogenético específico, en la forma de un perfil de respuesta a medicamentos, permitirá diferenciar aquellos individuos que tienen una mayor probabilidad de responder de cierta manera a un particular medicamento según su tipo de metabolización enzimática (2,20). El objetivo de este estudio fue detectar en una población chilena mixta, la frecuencia alélica de dos de los mas importantes polimorfismos de la CYP2D6 que determinan fenotípicamente una metabolización lenta (CYP2D6*4 y CYP2D6*6) y compararla con lo estudiado en otras poblaciones. MATERIALES Y METODOS Sujetos Se tomaron muestras sanguíneas aleatoriamente en 40 individuos sanos (19 hombres y 21 mujeres) pertenecientes a distintos estamentos de la Facultad de Medicina de la Universidad Mayor (incluyendo estudiantes, auxiliares de servicio, administrativos y académicos). El estudio fue aprobado por el Comité del Fondo de Desarrollo e Investigación de la Universidad Mayor y cada participante firmó un consentimiento informado. Método a) Extracción del DNA: a partir de 5ml de sangre con EDTA como anticoagulante y usando una modificación de la técnica de Lahiri y Nurnberger (21), se extrajo DNA genómico a partir de 1ml de concentrado leucocitario mezclado y centrifugado a temperatura ambiente a 2.200 rpm por 10 minutos en 5 ml de buffer TKM1 (Tris‐Hcl 10 mM, pH 7,5; KCl 10mM; MgCl2 10 mM; EDTA 2 mM) y 125 μL de Tritón X‐100. El pellet nuclear fue lavado nuevamente en 5ml de buffer TKM1 y centrifugado a 2.200 rpm por 10 minutos. El pellet producido fue resuspendido en 800 μL de buffer TKM2 (Tris‐Hcl 10mM, pH 7,6; KCl 10mM; MgCl2 10 mM; EDTA 2 mM; NaCl 0,4 M) y 50μL de SDS al 10% e incubado a 55ºC por 10 minutos. Para la precipitación de proteínas se agregó 300 μL de NaCl 6N y centrigugó a 3.500 rpm durante 15 minutos. Todos los DNA obtenidos fueron resuspendidos en buffer TE pH 8 y almacenados a ‐70ºC. Su concentración y estado fue evaluado realizando electroforesis de geles de agarosa 0,7%, usando como estándar de tamaño molecular al fago λ digerido con Hind III. Diluciones en agua destilada estéril del stock fueron cuantificadas en espectrofotómetro, leyendo a 260nm. b) Técnica PCR: se realizó un PCR anidado para cada enzima, utilizando partidores descritos por Hersberger et al. (Tabla 1) (15). (i) detección de CYP2D6*4: se realizó una reacción de 50 μL que contenía: 25 pmoles de Primer 1new, Primer 2new, Primer 7 y Primer Bmut, 1U de Taq DNA polimerasa, el tampón suministrado con la enzima (Kcl 50mM; Tris‐Cl 10 mM; Tritón X‐100 0,1%; MgCl2 2,5 mM), cuatro desoxinucleótidos (200 mM cada uno), agua destilada estéril y 100 ng de DNA genómico. Se realizó PCR anidado en 20 ciclos de 45 segundos de denaturación a 94ºC, 45 segundos de alineamiento a 61ºC y 60 segundos de extensión a 72ºC, luego 27 ciclos de 30 segundos de Rev. Farmacol. Chile (2011) 4(1): 10 denaturación a 94ºC, 30 segundos de alineamiento a 51ºC y 60 segundos de extensión a 72ºC. Para identificar el alelo CYP2D6*4, se uso un PCR anidado. Con el fin de mejorar la especificidad del proceso, primero se amplificó una región de 750 pb correspondiente a la CYP2D6 (con los partidores 1new y 2new) para luego obtener de una segunda reacción (con los partidores Bmut y 7), un producto de PCR de 217 pb para al alelo *4 y otro de 560 pb para el alelo natural (wt) (Figura 1). El producto de PCR fue separado usando electroforesis en gel de agarosa al 2%. (ii) detección de CYP2D6*6: se realizó una reacción de 50 μL que contenía: 25 pmoles de Primer 1new, Primer 2new, Primer 11 y Primer Tmut, 1U de Taq DNA polimerasa, el tampón suministrado con la enzima (Kcl 50mM; Tris‐Cl 10 mM; Tritón X‐100 0,1%; MgCl2 2,5 mM), cuatro desoxinucleótidos (200 mM cada uno), agua destilada estéril y 100 ng de DNA genómico. Se realizó PCR anidado en 20 ciclos de 45 segundos de denaturación a 94ºC, 45 segundos de alineamiento a 61ºC y 60 segundos de extensión a 72ºC, luego 27 ciclos de 30 segundos de denaturación a 94ºC, 30 segundos de alineamiento a 51ºC y 60 segundos de extensión a 72ºC Para detectar el alelo CYP2D6*6 se uso la misma técnica de PCR ya descrita. Al igual que en el caso anterior, primero se obtuvo un amplificado de 750 pb (partidores 1new y 2new). Luego, usando los partidores Tmut y 11, se obtiene un segmento de 356 pb en el caso de la mutación *6 y otro segmento de 421 pb para el alelo natural (wt) (Figura 2). El producto de PCR fue separado usando electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los productos de PCR obtenidos se resolvieron en electroforesis de gel de agarosa 2% en tampón TBE 1%. Como estándar de tamaño molecular se utilizó un ladder de 100 pb (GIBCO‐BRL). La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 70 a 100 volts por aproximadamente 2 horas. La fluorescencia emitida al teñir el gel con bromuro de etidio se observó en un transiluminador UV (Figura 1). El DNA amplificado fue purificado directamente, utilizando el kit comercial QIAGEN QIAquik PCR Purification, siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis estadístico se realizó usando un test de hipótesis de comparación de proporciones, con un nivel de confianza de un 95%. Tabla 1: Partidores Usados en Este Estudio RESULTADOS Se identificaron 3 alelos CYP2D6*4 de entre los 40 individuos estudiados, lo cual corresponde a una frecuencia allelica de 3,75%. Para la isoenzima CYP2D6*6, se encontró solo un alelo dentro de la muestra, lo que corresponde a una frecuencia alélica del 1,25%. Al observar la Tabla 2, podemos comparar estos resultados con otros estudios realizados en diferentes etnias. Al analizar lo obtenido por Hersrberger y col. (15) en una muestra de 57 individuos caucásicos, podemos ver que la prevalencia de la isoenzima CYP2D6*4 es mayor en esta población, siendo la diferencia estadísticamente significativa (Z= 3,080). Por otro lado, para la variante CYP2D6*6, no existe una diferencia significativa (Z= 0,625). Si observamos los resultados descritos por Ling Ji y cols. (17) en una población asiática compuesta por 223 individuos, podemos ver que la prevalencia de la CYP2D6*4 es menor que en nuestra población, siendo esta diferencia, estadísticamente significativa (Z= ‐0,608), lo cual no se repite para la CYP2D6*6, en donde no se encontró ningún alelo dentro del grupo de individuos analizados. Tabla 2: Prevalencia de alelos en diversas poblaciones. A su vez, al comparar nuestros resultados con un estudio realizado en Chile en una población Mapuche (13), observamos que la diferencia en la frecuencia alélica de la variante 2D6*4 no es estadísticamente significativa (Z= 0,73). En este estudio no se describe la prevalencia de la 2D6*6. DISCUSIÓN La población chilena está compuesta de una mezcla de genes caucásicos y aborígenes (como por ejemplo mapuches, los cuales presentan a su vez, un componente asiático). Por lo tanto, puede presentar diversos patrones de las isoenzimas de la CYP450, dependiendo básicamente de la penetrancia de las diferentes etnias. La frecuencia encontrada en esta muestra chilena para la CYP2D6*4 no difiere significativamente a la descrita para la Rev. Farmacol. Chile (2011) 4(1): 11 población mapuche (18). La CYP2D6*4 es común en caucásicos (28%) (15,16) y está casi ausente en población asiática (2%) (17). Nuestros resultados nos sitúan en una situación intermedia entre ambas poblaciones, lo que apoya la hipótesis planteada, a pesar de que nuestra muestra no arrojó una diferencia estadística significativa con la población mapuche. Respecto a la CYP2D6*6, hay menos antecedentes en la literatura y la frecuencia obtenida (1,25%), es mayor a la descrita para este alelo en la población caucásica (0,9%) (15) y asiática (ausente) (17). en donde el allelo 3 y 4 están prácticamente ausentes. En cambio, en la población asiática, los fenotipos con metabolización lenta están dados en gran parte por la variante CYP2D6*10 (12,14). Es interesante considerar que a pesar de que se encuentra en forma frecuente dentro de la población asiática, la variante CYP2D6*10 es poco prevalente en la población mapuche, diferencia que podría deberse a la penetración de otras etnias dentro de este grupo (18). Considerando estos antecedentes y nuestros resultados, la genotipificación de la CYP2D6*4 sería de utilidad para determinar el fenotipo de acetilador en nuestra población. Por otra parte, el estudio de la CYP2D6*6 no ofrecería grandes beneficios al momento de clasificar a un determinado individuo según su estado metabolizador dentro de un contexto clínico. Figura 1: Análisis del alelo CYP2D6*4. A la izquierda se muestra un homocigoto para el alelo nativo de 560 pb (wt). A la derecha se muestra un heterocigoto, compuesto de un alelo nativo (wt) y un alelo 2D6*4 de 217 pb (wt/*4). En ambos casos se puede apreciar el pre‐amplificado de 750 pb correspondiente al segmento CYP2D6, usado para aumentar la especificidad de la prueba. Los resultados obtenidos para el alelo mutante CYP 2D6*4 confirman la hipótesis. Ellos revelan que la población estudiada presenta una prevalencia intermedia entre la población caucásica y la asiática. Esto guarda relación con lo ya estudiado en otras vías de metabolización de fármacos (acetilación) (22) y con la distribución del grupo ABO sanguíneo (23). En caucásicos, el fenotipo de metabolizador lento esta dado principalmente por los isotipos 3, 4 y 5 de la CYP2D6, a diferencia de lo que se ha visto en poblaciones asiáticas Figura 2: Análisis del alelo CYP2D6*6. A la izquierda se muestra un homocigoto para el alelo nativo de 421 pb (wt). A la derecha se muestra un heterocigoto, compuesto de un alelo nativo (wt) y un alelo 2D6*6 de 356 pb (wt/*6). En ambos casos se puede apreciar el pre‐amplificado de 750 pb correspondiente al segmento CYP2D6, usado para aumentar la especificidad de la prueba. Sería importante ampliar el número de individuos estudiados y completar el estudio de otras variantes alélicas presentes en estas poblaciones, como por ejemplo la CYP2D6*10. También sería de ayuda poder caracterizar a otras poblaciones aborígenes de nuestro país. Rev. Farmacol. Chile (2011) 4(1): 12 Con respecto a la técnica implementada, genotipificar para determinar el “estado metabolizador” tiene el atractivo de ser un simple procedimiento que no requiere de la administración de un fármaco y no es influenciado por la ingesta concomitante de otros medicamentos. Esta técnica permite clasificar a un individuo en 2 días, lo que abre el camino para un futuro uso de la genotipificación en la práctica clínica diaria. Estudios prospectivos serán necesarios para evaluar si el uso de datos genéticos y fenotípicos proporcionará guías para la selección del fármaco y dosis en los pacientes para mejorar la eficacia y seguridad del tratamiento. AGRADECIMIENTOS * Jacqueline Marti‐Jaun. Institute of Clinical Chemistry, University Hospital Zurich, Switzerland. * Emilio Decinti. Profesor de Bioestadística, Universidad Mayor. * Juan Francisco Miquel y Valeska Vollrath. Departamento de Gastroenterologia, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Santiago. BIBLIOGRAFÍA: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. ROSES AD. Pharmacogenetics and future development and delivery. The Lancet 2000; 355:1358‐1361. WILKINSON GR. Drug Metabolism and Variability among Patients in Drug response. N Engl J Med. 2005; 352: 2211‐2213. DE LEON J. The crucial role of the therapeutic window in understanding the clinical relevance of the poor versus the ultrarapid metabolizer phenotypes in subjects taking drugs metabolized by CYP2D6 or CYP2C19. J Clin Psychopharmacol. 2007; 27:241‐245. BRADFORD LD. CYP2D6 allele frequency in European Caucasians, Asians, Africans and their descendants. Pharmacogenomics 2002; 3:229‐243. ZHOU H, KOSHAKJI R, SILBERSTEIN D. Racial differences in drug response. N Eng J Med 1989; 320:565‐570. EVANS WE, MCLEOD HL. Pharmacogenomics‐Drug disposition, drug targets, and side effects. N Eng J Med. 2003; 348:538‐549. 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