Luminometría y ATP

Luminometría.
Octubre de 2014
Autor: Nicolás Antonio Di Lalla, Lic. en Cs. Químicas (UBA) MN 9833, Director Técnico de
Covidex SRL
Introducción.
La luminometría es una técnica utilizada para la determinación de un
compuesto químico mediante la cuantificación de energía lumínica que el
mismo emite en determinadas condiciones. Esta energía generalmente es
emitida como luz visible o UV.
Existen unas pocas reacciones químicas en las cuales se forman compuestos
inestables que tienen exceso de energía en sus orbitales moleculares. Los
electrones que forman el enlace pueden espontáneamente decaer a un estado
de menor energía (más estable), este proceso va acompañado de la emisión
de un fotón por cada electrón involucrado. La frecuencia (ν) y por lo tanto la
longitud de onda (λ) del fotón emitido están relacionadas con la diferencia de
energía por la constante de Planck (h).
∆E = ν . h = c / λ . h
c: velocidad de la luz en el vacío
Existe una reacción muy conocida y estudiada entre la luciferina y la enzima
luciferasa, la misma no está termodinámicamente favorecida pero en presencia
de ATP produce un compuesto que emite luz visible. Esta reacción aparece en
la naturaleza, por ejemplo es la causa de la luminosidad de las luciérnagas.
ATP
Luciferina + Luciferasa
Luz visible
Esta reacción permite una determinación muy precisa de ATP mediante
luminometría.
ATP.
El ATP (adenosín trifosfato) es una molécula que está presente en todo tipo de
material biológico y es la unidad de energía universal utilizada por las células
vivas. El ATP se produce en los procesos metabólicos que tienen lugar en los
seres vivos: la fotosíntesis en las plantas, la contracción de los músculos en los
animales, la respiración en los hongos y la fermentación de las levaduras.
Las uniones de tipo anhídrido entre los grupos PO4 son de alta energía, el ATP
puede hidrolizarse y dar como productos ADP (adenosín difosfato) y fosfato
inorgánico PO43- (Pi) liberando energía.
ATP
ADP + Pi + Energía
Esta energía es la que impulsa reacciones que en principio no serían posibles.
Cuando en una célula se producen reacciones que liberan energía, ésta se
“guarda” en los enlaces tipo anhídrido del ATP mediante la reacción inversa:
ADP + Pi + Energía
ATP
De esta manera, se puede afirmar que el ATP funciona como “dinero” en las
células vivas, sirve para llevar a cabo procesos “costosos” y es el modo de
ahorrar energía que proviene de procesos “productivos”. Su presencia es
universal, desde bacterias hasta células humanas lo utilizan.
Determinación y cuantificación de ATP.
Cuando se quiere comprobar la ausencia de microorganismos, restos de tejido
o de células humanas o material de origen biológico en general, puede
utilizarse la propiedad del ATP de liberar energía lumínica en presencia de
luciferina y luciferasa. La luminosidad resultante, a pesar de ser sumamente
baja, puede ser transformada en impulso eléctrico que amplificado puede
convertirse en una señal analógica. Esta señal se corresponde con la cantidad
de moléculas de ATP detectadas y resulta en un valor de “unidades relativas de
luz” que indica la pantalla del equipo.
El instrumento utilizado se denomina Luminómetro, aunque sería más preciso
el término ATP-metro.
Descripción del equipamiento para determinar ATP.
La toma de muestra y su preparación son fundamentales a efectos de obtener
resultados confiables y precisos. Para esto, generalmente, junto con el equipo
se proveen hisopos especiales para el muestreo. Los mismos son estériles y
vienen herméticamente cerrados en un envoltorio; mediante una sencilla
maniobra se rompe el compartimento que los protege y quedan en contacto
con una solución en la cual se embebe el extremo que se utilizará para
recolectar la muestra.
La solución contiene luciferina y luciferasa además de un detergente especial
que facilita la penetración del líquido al interior de las células enteras que estén
en contacto con el hisopo durante la toma de muestra. Esto es necesario para
que el ATP que está en el interior de la célula, ya sea en el citoplasma o en
alguna organela, quede disponible y entre en contacto con las sustancias
mencionadas.
Normalmente el fabricante indica el modo de muestrear superficies y en cuánto
tiempo hacerlo, también cómo introducir el hisopo con la muestra dentro del
instrumento. Por último se acciona algún dispositivo lector de luminosidad
generando el dato de RLU’s (unidades relativas de luz) que muestra la pantalla.
Interpretación de resultados.
La esencia de la técnica luminométrica aplicada al ATP es determinar el grado
de higiene de una superficie. La presencia de material biológico y,
eventualmente, microorganismos resultará en cantidades importantes de ATP
que a su vez producirán lecturas elevadas de RLU’s.
A bajas concentraciones, existe una correlación lineal entre concentración de
ATP y RLU’s, por lo tanto se puede establecer un rango de contaminación (o
de limpieza) de la superficie testeada, por ejemplo de la siguiente manera:
RLU’s
0 -10
11 – 29
30 ó más
Nivel de limpieza
Correcto
Aceptable
No aceptable
La utilización correcta de la técnica puede ser la base de un monitoreo de
condiciones higiénicas en un ámbito de elaboración y/o manipulación de
alimentos, de producción de medicamentos o de una institución hospitalaria.