AISLAMIENTO DEL GEN QUE CODIFICA PARA UN

AISLAMIENTO DEL GEN QUE CODIFICA PARA UN TRANSPORTADOR
ABCMdr1 EN Metarhizium anisopliae.
Barcena Romero, A.R. (1); Padilla Guerrero I. E. (2),
González Hernández, G.A. (2); Torres Guzmán J.C. (2)
(1)
Licenciatura en Biotecnología.
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Querétaro.
(2)
Instituto de Investigación en Biología Experimental.
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Guanajuato.
RESUMEN
En este trabajo se reporta el aislamiento parcial del gen que codifica para un transportador
ABCMdr1 de Metarhizium anisopliae empleando la técnica de SiteFinding para amplificar
regiones flanqueantes a un fragmento conocido de 1014pb.
INTRODUCCIÓN
En mayor grado, el control de plagas depende de la aplicación de pesticidas. Sin embargo,
este tipo de control tiene sus desventajas, como la resistencia que desarrolla el insecto hacia la
sustancia, efectos tóxicos contra todos los seres vivos con los que entra en contacto
incluyendo el hombre, acumulación de residuos tóxicos y contaminación del medio ambiente.
Esto lleva a buscar nuevos métodos de control más seguros, entre los que está el control
biológico como uno de los más prometedores (Nguyen y col, 2005). Por éste método se
enfrenta al insecto con sus enemigos naturales, convirtiéndolo en blanco y huésped; para esto
se puede hacer uso de entomopatógenos (virus, bacterias, hongos) que poseen especificidad al
huésped, alta patogenicidad, y que no contaminan el medio ambiente.
Existen aproximadamente 750 especies de hongos distribuidos en 56 géneros, que infectan
artrópodos. Como los virus, los hongos entomopatógenos son ubicuos y en el huésped
apropiado son capaces de reciclarse naturalmente. A diferencia de otros antimicrobianos,
causan infección por penetración directa de la cutícula del huésped, sin necesidad de ser
ingerido. Así en un ambiente adecuado el hongo está en condiciones de infectar y
multiplicarse (Pell y col, 2007).
Metarhizium anisopliae es un hongo entomopatógeno ampliamente utilizado en el control
biológico de plagas por tener un amplio rango de hospederos, se tiene poca información del
proceso de infección a nivel molecular, por lo que es importante el estudio de su genoma, con
el fin de producir cepas más eficientes como bioinsecticidas.
En este sentido, en trabajo previo en el Laboratorio de Genética Molecular de Hongos,
Padilla-Guerrero (2) aisló un fragmento de 1014 pb el cual mediante análisis BLAST presenta
una homología del 67% y 66% con genes que codifican para transportadores ABC de los
hongos Podospora anserina (E 4.1e-116 ) y Neurospora crassa (E 5.4e-114). Se ha descrito
que los transportadores ABC (cassette de unión-ATP) son proteínas integrales de membrana
que activan el transporte químico de diversas sustancias a través de la membrana celular,
dependiendo de la hidrólisis del ATP. Se ha descrito que esta superfamilia de transportadores
juega un papel importante en la patogénesis hongos fitopatógenos como en Magnaporthe
grisea, donde la deleción del gen ABC4 genera mutantes que no forman un apresorio
funcional y por tanto no son patógenos (Archna y col, 2008); además los transportadores
multidrogas (Mdr) de la familia ABC en bacterias facilitan la exportación de diversos
sustratos, incluyendo drogas y antibióticos, a través de la membrana celular; sugiriendo su
participación en procesos de resistencia a drogas y antibióticos (Dawson y col, 2006).
1
Por lo que, en el presente trabajo se buscará aislar el gen de Metarhizium anisopliae que
codifica el transportador ABCMdr1 a partir del fragmento conocido de 1014 pb mediante la
técnica de SiteFinding descrita por Guihong y col (2005). Esta técnica se basa en amplificar
fragmentos de ADN genómico al azar usando una rampa de temperatura y un oligo
denominado SF1 (SiteFinder) seguida de una amplificación específica empleando el oligo
SF1 y un oligo derivado de la secuencia conocida. Finalmente para asegurar una
amplificación específica se realiza un PCR anidado utilizando un oligo más interno
denominado SF2 y el oligo derivado de la secuencia conocida.
MATERIALES Y MÉTODOS
Organismos y Condiciones de Cultivo.
Metarhizium anisopliae, cepa CARO19 (C19). Sembrada y conservada en placas de medio
mínimo (MM), incubando a 28ºC. Se inocularon 100mL de MM líquido con 1x108e/mL de
esporas de Metarhizium anisopliae. Incubando con agitación a 28ºC 48h, para obtener
crecimiento micelial. El micelio fue recuperado por filtración y conservado a -70ºC.
Templado de ADN y oligonucleótidos.
Se realizó extracción de ADN por fricción siguiendo protocolos estándares (Sambrook y
Russell, 2001); del micelio filtrado, se cuantificó el ADN obtenido y se trabajó con una
dilución de 100 ng/µL. A partir del fragmento conocido de 1014 pb se diseñaron los
oligonucleótidos: ABCMdr1 SEN 5´-TTC GGC CTT GGC AAG GTG CTT GTC ATA T-3´,
Tm 74 ºC para avanzar río arriba del fragmento conocido, y el oligo ABCMdr1 ANTI 5´TCA GCG CCA AGA TTC GCG AGC ATT ATC-3´, Tm 75º para avanzar río abajo del
fragmento conocido de 1014 pb.
SiteFinding.
Reacción al azar Site Finding: Se realizó de acuerdo a la técnica de Guihong y col (2005). La
mezcla de PCR incluía 2µL ADN C19 como cadena patrón, 1µL del iniciador SiteFinder
SFP1 (10pmol), 20µL PCR SuperMix High Fidelity. Invitrogen ((2.5mM dATP, dTTP,
dCTP, dGTP), 0.5U ADN Taq polimerasa, 10x long ADN Taq polimerasa buffer), y con agua
Milli-Q se llegó a un volumen final de 24 µL, luego se corrió un ciclo de PCR, de acuerdo a
las condiciones establecidas. (Tabla 1)
PCR Primario y Secundario: Para la primera ronda de PCR se tomaron 5 µL de la reacción al
azar para usarlo como cadena patrón. Se añadió 1 µL de cada iniciador; SFP1 50pmol y el
oligo especifico ABCMdr1 SEN o ABCMdr1 ANTI dilución 1:10, y 45 µL PCR SuperMix
High Fidelity. Se corren los ciclos de PCR de acuerdo a la Tabla 1. Para la reacción
secundaria (PCR anidado), se toma 1 µL del PCR Primario, 1 µL del oligo especifico
ABCMdr1 SEN o ABCMdr1 ANTI dilución 1:10, 1 µL SFP2 y 45 µL PCR SuperMix High
Fidelity. Se corren los ciclos de PCR anidado de acuerdo a la Tabla 1. Finalmente, los
productos son separados en gel de agarosa 1%, con bromuro de etidio.
Tabla 1. Condiciones utilizadas para los ciclos del SiteFinding-PCR
Reacción
Ciclos
Condiciones
1
95º 4min, 95º 1min, 25º 1min rampa
SiteFinding
hasta 68º 3min, 68º 10 min
1
95º 2min
Primario
30
95º 10s, 68º 6min
1
72º 5min
1
95º 3min
Secundario
30
95º 20s, 72º 6min
1
72º 5min
2
Purificación de productos de PCR.
Los productos de PCR se separan mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%, Se
recortan las bandas de ADN de interés y se purifican siguiendo las instrucciones del
fabricante con el Purelink Quick gel extraction Kit, de Invitrogen.
Clonación y Secuenciación.
El producto de PCR purificado fue clonado en el vector pCR2.1TOPO de acuerdo a la técnica
del kit TOPO TA Cloning. Five-minute Cloning of Taq polymerase – amplified PCR
products, de Invitrogen. El producto de la ligación se introdujo a E. coli mediante
transformación química, sembrando las células en medio selectivo LB-ampicilina-XGal-IPTG
y se incuban toda la noche a 37 °C. Se seleccionaron las colonias blancas y se inocularon en
medio líquido LB-ampicilina incubando toda la noche a 37 °C. Finalmente se extrajo el ADN
plasmídico por lisis alcalina (Sambrook y Russell, 2001).
Patrón de Restricción.
Entre 300 y un μg de cada plásmido se corta con la enzima de restricción EcoRI en el
regulador y a la temperatura indicada por el fabricante durante 2 h. En seguida los productos
de la restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%, con syber-safe.
El ADN se visualiza en el transiluminador capturando la imagen para su análisis.
Aislamiento de ADN plasmídico de alto grado de pureza para su secuenciación.
Las células de las transformantes se propagan en medio selectivo LB-ampicilina incubando
toda la noche a 37 °C, 3 mL del cultivo se procesan según las instrucciones del fabricante del
QIA prep Spin Miniprep Kit Protocol, de Qiagen.
RESULTADOS
Aislamiento de regiones flanqueantes del fragmento de 1014 pb del gen ABCMdr1 de M.
anisopliae mediante SiteFinding: Al contar con un fragmento conocido de 1014 pb, se
diseñaron los oligonucleótidos ABCMdr1 SEN y ABCMdr1 ANTI para mediante la técnica
de SiteFinding, poder amplificar las secuencias flanqueantes río arriba y río abajo, desde la
región delimitada por los oligonucleótidos específicos hasta sitios de corte para Notl, que es
donde el SiteFinder de secuencia conocida, se acopla, amplificándose la región intermedia.
Para ello se purificó el ADN genómico de la cepa C19 el cual se usó como cadena patrón en
las reacciones del SiteFinding (ver Material y Métodos). En la Fig.1a, en el segundo carril
observamos la amplificación de una banda de aproximadamente 1400 pb, que resulta de
interés para el estudio, al ser un fragmento situado hacia el extremo 3´, de acuerdo al diseño
de oligonucleótidos, por lo que se procedió a su purificación y clonación en el vector
pCR2.1TOPO. Se seleccionaron 8 colonias blancas (posibles recombinantes), se purificó el
ADN plasmídico por lisis alcalina de cada una de ellas y se procedió a identificar el
recombinante cortando con la enzima de restricción EcoRI.
En la Fig.2b se observó que las clonas 5 y 7 liberaron el fragmento esperado de 1400 pb
además del vector de 4000 pb. Las dos clonas se analizaron mediante una reacción de PCR
empleando iniciadores internos confirmándose la construcción. Se recuperó ADN plasmídico
de alta pureza de estas dos clonas (ver Materiales y Métodos), para su posterior
secuenciación. Estos plásmidos se denominaron pGG444 y pGG445.
El análisis de la secuencia mediante el programa MEG ALIGN del paquete de programas
DNA STAR, mostró que el fragmento secuenciado de 1413 pb y el fragmento conocido de
1014 pb se empalman en el extremo 3’ del segundo fragmento como se muestra en la Fig. 3a,
observando que pudimos avanzar 718 pb río abajo del fragmento de 1014pb ensamblándose
en un segmento de 1732 pb de longitud. El análisis BLAST de esta secuencia indica que éste
gen tiene una identidad de 73% y 71% con genes que codifican para transportadores ABC de
3
los hongos Podospora anserina (E 0.0) y Neurospora crassa (E 0.0) como se aprecia en la
Fig. 3b.
Figura 1. Amplificación mediante SiteFinding de una región hacia 3’ del gen ABCMdr de M. anisopliae. a.
Resultados del SiteFinding ABC Mdr1, en gel de agarosa 1%, con bromuro de etidio. Carril M, marcador de
peso molecular (2Log Cadder); carril 1, productos de la amplificación SiteFinding ABC Mdr1 SEN; carril 2,
productos de la amplificación SiteFinding ABC Mdr1 ANTI. La cabeza de flecha señala la banda de interés de
aproximadamente 1400pb. b. Comprobación de la purificación de la banda de interés, en gel de agarosa 1%, con
bromuro de etidio.
Figura 2. Clonación del fragmento de Site Finding de 1400 pb en pCR2.1TOPO . a. ADN plasmídico extraído
de las colonias transformantes, en gel de agarosa 1%, con syber-safe. b. Identificación del recombinante
mediante restricción. El plásmido recuperado de las colonias digerido con la enzima Eco RI se separó mediante
electroforesis, en gel de agarosa 1% con syber-safe. El asterisco señala los clones que liberan el fragmento del
tamaño esperado. c. Confirmación de la construcción mediante PCR de las clonas purificadas con los oligos
internos.
6 - Aspergillus clavatus - A1C9U8.pro
13 - Aspergillus fumigatus - O43121.p
20 - Aspergillus niger - A2R9K7.pro
5 - Aspergillus nidulans - Q9Y8G1.pro
7 - Aspergillus oryzae - Q2UTP2.pro
15 - Aspergillus terreus - Q0CA60.pro
1 - Podospora anserina - B2AWN6.pr
4 - Chaetomium globosum - Q2H981
2 - Neurospora crassa - Q7RVS1.pro
Secuencia ABC Mdr1 - 1732pb - ORF
3 - Magnaporthe grisea - A4RG70.pro
21 - Trichophyton rubrum - Q9HGT5.p
10 - Ajellomyces capsulata - A6R048
b)
49.5
45
40
35
30
25
20
Amino Acid Substitutions (x100)
15
10
5
0
Figura 3. Estructura y análisis del gen ABCMrd de M. ansiopliae a. Estructura del gen. b. Árbol filogenético.
4
CONCLUSIONES
Se logró avanzar 718 pb río abajo del gen de interés. El análisis de la secuencia obtenida
confirma que el gen codifica para un transportador ABC Mdr incrementándose incluso su
semejanza de un 66% inicial a un 73% considerando la nueva secuencia, indicando que
efectivamente contamos con 1732 pb del gen ABCMdr1 de Metarhizium anisopliae. A partir
de la nueva secuencia conocida, podrán diseñarse nuevos oligos más específicos que faciliten
el aislamiento del gen en su totalidad. Conocer la secuencia del gen completo permitirá
diseñar estrategias que conduzcan a descubrir su importancia en el proceso de infección a
nivel molecular.
REFERENCIAS BILBIOGRÁFICAS
Archna G. y Bharat B. C., “Functional analysis of a novel ABCtransporter ABC4 from
Magnaporthe grisea”. FEMS Microbiol Lett. 278, 22–28, 2008.
Dawson J., Roger P., y Locher P.K., “Structure of a bacterial multidrug ABC transporter”.
Nature. 443, 180-185, 2006.
Guihong T., Yin G., Miao S., Xinyue Z., Shanping H., Zhangliang C. y Chengcai A.,
“SiteFinding-PCR: a simple and efficient PCR method for chromosome walking”. Nucleic
Acids Research. Vol. 33, Nº 13, 2005.
Nguyen T. L. y Vo Thi B. C., “Efficacy of some new isolates of Metarhizium anisopliae and
Beauveria bassiana against rice earhead bug, Leptocorisa acuta”. Omonrice. 13, 69-75, 2005.
Pell J.K., Eilenberg J., Hajek AE. y Steinkraus D.S. “Biology, ecology and pest management
potential of Entomophthorales”. En: Nguyen T. L., Vo Thi B. C., “Biocontrol potential of
Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against Diamondback Moth, Plutella
xylostella”. Omonrice. 13, 83-96, 2007.
Sambrook J., et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor
Laboratory Press., New York., 2001.
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