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TÉCNICAS POLAROGRÁFICAS: DETERMINACIÓN DE FOTOSÍNTESIS Y
RESPIRACIÓN EN SUSPENSIONES CELULARES DE CIANOBACTERIAS
1. BASES TEÓRICAS
MEDIDA DE LOS INTERCAMBIOS DE OXÍGENO EN FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN
MEDIANTE UN ELECTRODO DE OXÍGENO.
En la fotosíntesis, la energía de la luz se absorbe por la clorofila y se usa para reducir el CO2
a carbohidratos, desprendiéndose además O2. Por lo tanto, si a una suspensión celular de
cianobacterias se la ilumina y se la suministra CO2 o bicarbonato, se desprenderá oxígeno que nos
permitirá valorar el proceso fotosintético.
El proceso respiratorio, por el contrario, da lugar a un consumo de oxígeno en la oscuridad.
El oxígeno que se acumula durante la fotosíntesis o el que se consume durante la respiración se
puede detectar polarográficamente por un electrodo tipo Clark. La versión Hansatech del típico
electrodo Clark consiste en un cátodo de platino y un ánodo de Ag-AgCl (entre los cuales se
establece un voltaje constante de -0.65 V) inmersos en una solución saturada de KCl y separados de
la solución problema por una membrana de teflón permeable al oxígeno, que se reduce en el cátodo.
La membrana también atrapa una pequeña capa del electrolito sobre la superficie de los electrodos.
Un papel espaciador se coloca por debajo de la membrana para proveer una capa uniforme de
electrolito entre el ánodo y el cátodo.
La intensidad de la corriente generada entre los electrodos es proporcional a la
concentración de oxígeno en la solución. La corriente generada se convierte en una señal externa de
voltaje por la caja de control en la que se sitúa el electrodo. La señal de medida es lo
suficientemente grande para poder medirse en el rango de 1 voltio. La caja de control está, a su vez,
conectada a un registrador u ordenador.
1.1.1. Diseño del electrodo
La figura 1 muestra un diagrama del electrodo de Clark. El sensor (disco del electrodo) está
localizado en la parte inferior de una cámara de reacción termostatizada por agua circulante. Un
pequeño imán que agita la mezcla de reacción, rota directamente sobre el electrodo de platino
cubierto con una membrana. La cámara de reacción se cierra con un émbolo que se puede ajustar a
cualquier volumen entre 0.2 y 2.5 ml. Con una microjeringa se pueden añadir o eliminar soluciones
desde la mezcla de reacción sin producir perturbaciones en el trazo del registrador. El disco del
electrodo se puede quitar fácilmente para cambiar la membrana.
Figura 1. Esquema del electrodo de oxígeno tipo Clark
1
1.1.2. Preparación y ensamblaje del electrodo
Sobre el disco del electrodo limpio (la limpieza se lleva a cabo periódicamente frotándolo
con una solución muy densa de óxido de aluminio) se añade una gota de electrolito (2.4 M KCl). Se
coloca un papel espaciador de aprox. 2 cm2 sobre el electrodo empapado de electrolito. Este papel
espaciador (generalmente papel de fumar) se utiliza para proveer una capa uniforme de electrolito
entre el ánodo y el cátodo.
Figura 2. Ensamblaje del electrodo
Sobre el papel de fumar, se coloca un trozo de membrana PTFE de aprox. 2 cm2 y se
asegura la membrana y el papel de fumar en su posición correcta mediante un anillo de goma que
sirve para este propósito (Figura 2). Se debe revisar que la membrana no presente pliegues, arrugas,
roturas o burbujas. En cualquiera de estos casos, se debe de retirar dicha membrana y comenzar el
proceso de nuevo.
Una vez que se ha preparado el electrodo, éste se inserta y ajusta en el fondo de la cámara de
reacción. Tanto el electrodo como la caja de control y el registrador se han de encender 30 min
antes de las medidas para que se estabilicen. Durante las medidas, la suspensión celular se mantiene
en agitación y se controla la temperatura de la cámara de reacción mediante un baño de agua
termostatizada.
1.1.3. Calibración rutinaria previa a la medida.
El electrodo produce una corriente proporcional a la concentración de O2. Para relacionar la
lectura en mV de la caja de control con la concentración de O2 (en micromoles), es necesario
calibrar el electrodo:
a. Ajuste a los niveles de saturación de O2 en agua destilada:
Para ajustar el electrodo a los niveles de saturación de O2 del agua destilada a una
determinada temperatura, se añade a la cámara del electrodo agua destilada que ha sido
2
agitada al aire y mantenida a la temperatura deseada durante unos minutos (agua saturada de
O2). Se observa que la lectura en mV se incrementa hasta que se estabiliza.
b. Ajuste del cero eléctrico:
Se añade agua destilada al electrodo y mientras se mantiene en agitación, se gasea con argón
que desplaza el oxígeno del agua. Se observa que la lectura de la caja de control comienza a
bajar rápido y después de 2 ó 3 min, la lectura se estabiliza en un valor que prácticamente
coincide con el cero eléctrico del registrador.
La tabla que aparece debajo muestra los niveles de saturación de O2 en agua destilada a
distintas temperaturas.
Temperatura
0
5
10
15
20
25
30
35
O2 (ppm)
14,16
12,37
10,92
9,76
8,84
8,11
7,52
7,02
O2 (μmol/ml)
0,442
0,386
0,341
0,305
0,276
0,253
0,230
0,219
3
2. PRÁCTICA
La práctica consiste en medir la actividad fotosintética (total y de cada uno de los
fotosistemas) y actividad respiratoria, así como el contenido en pigmentos fotosintéticos (clorofila a
y ficobiliproteínas) de cultivos de la cianobacteria filamentosa Anabaena sp. PCC7120. La práctica
se llevará a cabo en dos sesiones (en días consecutivos) en grupos de 2-3 alumnos:
I. Sesión 1:
• Se medirá la actividad fotosintética de los cultivos de Anabaena sp. utilizando
distintas calidades de luz.
• Se medirá la actividad respiratoria de los mismos cultivos.
• Se determinará el peso seco de los cultivos.
• Se realizará la extracción de la clorofila a
• Se realizará la extracción y cuantificación de la ficobiliproteína ficocianina.
• Se realizarán espectros in vivo de los cultivos de las cianobacterias.
II. Sesión 2:
• Se medirá el contenido de clorofila a extractos realizados en la sesión 1.
• Se medirá la actividad de cada uno de los fotosistemas de los cultivos de Anabaena
sp. PCC7120.
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA
La actividad fotosintética se determina como desprendimiento de O2. Una vez calibrado el
electrodo, podemos medir el desprendimiento de O2 de suspensiones celulares de cianobacterias:
1. Se añaden 2 ml del cultivo a la cámara del electrodo y se gasea con argón para bajar
la saturación del O2.
2. La medida se inicia iluminando la muestra con luz saturante (300 μE m-2s-1) a partir
de una fuente de luz fría; por lo general, el CO2 en la muestra es saturante pero si es
preciso se añade bicarbonato sódico ó potásico a una concentración final de 20 mM
(añadir 40 μl de la solución de bicarbonato 1 M a la muestra en la cámara del
electrodo).
3. Se sigue la evolución del desprendimiento de O2 al menos durante 5-10 min. El
electrodo da los valores como una tasa expresada en nmoles de O2/minuto.
4. La tasa fotosintética se expresa como μmoles de O2 desprendidos por mg de clorofila
y por hora.
MEDIDA DE LA FOTOSÍNTESIS CON DISTINTAS CALIDADES DE LUZ.
Se determinará la actividad fotosintética siguiendo el protocolo descrito en el apartado 2.1.
utilizando, en lugar de luz blanca, luz roja y luz de 620nm (naranja)(Figura 3) utilizando filtros
específicos que se situarán en la fuente de luz fría.
Las cianobacterias tienen dos complejos antena, uno para el fotosistema I y otro para el
fotosistema II. El complejo antena del fotosistema I está compuesto fundamentalmente por clorofila
a que absorbe la luz roja (665 nm) y la luz azul (435 nm) (Figura 4). El complejo antena del
fotosistema II está compuesto por los ficobilisomas, formados por pigmentos (ficobilinas:
aloficocianina, ficocianina y ficoeritrocianina) asociados a proteína (ficobiloproteinas) acopladas
como se aprecia en figura 5; los máximos de absorción de la ficobiliproteinas también se muestran
en la figura 4: 650-655 nm (aloficocianina), 615-640 nm (ficocianina) y 565 nm (ficoeritrocianina).
4
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD RESPIRATORIA
La actividad respiratoria se determina como consumo de O2. Las medidas se realizan de
manera análoga a las de desprendimiento de O2 pero la cámara del electrodo se mantiene en
oscuridad. Los datos obtenidos se expresan como μmoles de O2 consumidos por mg de clorofila y
por hora.
Filtro rojo
Filtro 620nm
Figura 3. Espectros de transmitancia de los filtros de la fuente de luz.
Figura 4. Espectros de absorción de clorofilas (A), ficobiliproteínas y carotenoides (B)
A
B
Figura 5. Disposición del ficobilisoma en la membrana tilacoidal (A) y la composición y distribución de las
ficobiliproteínas dentro del ficobilisoma (B).
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DETERMINACIÓN DEL TRANSPORTE ELECTRÓNICO FOTOSINTÉTICO: MEDIDAS
DE LAS ACTIVIDADES DE LOS FOTOSISTEMAS I Y II EN CÉLULAS INTACTAS DE
CIANOBACTERIAS
Las membranas tilacoidales de cloroplastos de plantas, algas verdes y cianobacterias,
pueden llevar a cabo las reacciones de oxido-reducción fotosintéticas, si están en presencia de
aceptores y donadores de electrones, que tienen como misión la transferencia de electrones al
NADP+, utilizando la energía de dos cuantos de luz por electrón. Los electrones son "activados"
mediante dos fotorreacciones, sensibilizadas por los fotosistemas I y II (PS I y PS II), que están
conectados por una cadena de transportadores electrónicos. El uso de diversos compuestos
artificiales (aceptores y donadores de electrones) que son capaces de interaccionar a distintos
niveles con la cadena de transporte de electrones fotosintética, nos permitirá separar las dos
fotorreacciones citadas (Fig. 6).
DCMU
Figura 6. Esquema de las reacciones de oxido-reducción fotosintéticas en el que aparecen los algunos de los muchos
inhibidores que afectan a la cadena fotosintética de electrones (PBQ: p-benzoquinona, DCMU: diclorometilurea, Asc:
Ascorbato sódico, DPIP: diclorofenol-indofenol y MV:metilviológeno)
Para la realización de las medidas de ambos fotosistemas, se necesita concentrar las células
hasta conseguir 10-15 µg de clorofila por ml de cultivo y para esta parte del experimento se van a
necesitar 10 ml de cultivo concentrado (100-150 µg de clorofila totales). Para ello, conociendo la
concentración de clorofilas del cultivo, se realiza el cálculo pertinente y se toman los mililitros
necesarios de éste para obtener la cantidad de clorofila indicada, se centrifuga a la máxima
velocidad durante 10-15 minutos y se resuspende en tampón Hepes 25 mM pH 7.5 hasta los 10 ml
finales necesarios.
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2.4.1. Actividad del Fotosistema I (PS I)
En este caso, se utiliza como donador artificial de electrones al fotosistema I el par Ascorbato
(Asc)-diclorofenol-indofenol (DPIP), y como aceptor final de electrones el metilviológeno,
produciéndose consumo de oxígeno. Para inhibir el Fotosistema II, se añade el inhibidor específico
DCMU; de este modo, esta reacción es dependiente de la cadena transportadora de electrones
íntimamente asociada con el PS I (Fig. 6).
La estimación del consumo de O2 se realiza polarográficamente en el electrodo de O2,
situando 3 ml de mezcla de reacción (indicada en la tabla I) en la cámara del electrodo modelo Clark
(Hach) a temperatura constante de 30 ºC, en agitación e iluminación saturante continua.
Protocolo:
1. A un tubo de ensayo añadir 2.5 ml de las células previamente concentradas.
2. Añadir el DCMU, el Hepes y el KCl y mezclar bien.
3. Añadir a la mezcla celular del tubo de ensayo, el metilviológeno y la solución de DPIP y
ascorbato y agitar.
4. Encender inmediatamente la luz y comenzar a registrar el consumo de O2.
El consumo de O2 se estima como μmol de O2 consumido x mg Cl-1 x h-1.
Tabla I. Compuestos y cantidades utilizados para la medida de la actividad del PS I
[Stock]
[Final]
Células (10-15 µg clorofila/ml)
Volumen Final
(3ml)
2.5 ml
DCMU 0.6 mM
10 μM
50 µl
Hepes pH 7.5 0.5 M
25 mM
150 μl
KCl 1.5 M
50 mM
100 μl
Metilviológeno 2.5 mM
83 μM
100 μl
DPIP 1.5 mM y Ascorbato Na
150 mM
50 μM/ 5 mM
100 μl
2.4.2. Actividad del Fotosistema II (PS II)
Se utiliza como donador de electrones el agua y como aceptor artificial la quinona pbenzoquinona (PBQ). Se añade ferricianuro potásico para tener a la quinona en la forma oxidada.
La reducción de la quinona junto con la liberación de oxígeno es absolutamente dependiente del PS
II, no mostrando ningún requerimiento del PS I o de un acoplamiento redox entre los dos
fotosistemas (Fig. 6).
Se estima la actividad del PS II como desprendimiento de O2 utilizando el electrodo de O2;
para ello, se sitúan 3 ml de mezcla de reacción (indicada en la tabla II) en la cámara del electrodo
modelo Clark (Hach) a temperatura constante de 30 ºC, en agitación e iluminación continua.
La liberación de O2 se estima como μmol de O2 liberado x mg Cl-1 x h-1.
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Protocolo:
1. A un tubo de ensayo añadir 2.5 ml de las células previamente concentradas.
2. En el tubo de ensayo mezclar (muy bien) las células con el Hepes y el KCl.
3. Poner esta mezcla celular en la cámara del electrodo, gasear con argón para disminuir los
niveles de O2.
4. Añadir en la cámara el ferricianuro y en último lugar la PBQ.
5. Inmediatamente, encender la luz y comenzar a registrar el desprendimiento de O2.
Tabla II. Compuestos y cantidades utilizados para la medida de la actividad del PS II.
[Stock]
[Final]
Células (10-15 μg clorofila/ml)
Volumen Final
(3ml)
2.5 ml
Hepes pH 7.5 0.5M
25 mM
150 μl
KCl 1.5M
50 mM
100 μl
Ferricianuro K 25 mM
0.42 mM
50 μl
PBQ 30mM
2mM
200 μl
*La solución de ferricianuro se prepara en el momento en agua. La solución de PBQ (metanol) y la de DPIP y
ascorbato (agua) también se preparan en el momento.
8
CÁLCULO DEL PESO SECO
Se mide la densidad óptica del cultivo a 750 nm y se aplica la siguiente fórmula:
mg Peso Seco/ml = 0.396 X DO750nm – 0.004
EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
2.5.1. Determinación del contenido en clorofilas
Se centrifuga 1 ml de cultivo en una centrífuga eppendorf durante 10 min a máxima
velocidad. Se descarta el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 1 ml de metanol puro. Se
agita bien la mezcla y se mantiene 24 h a 4ºC en oscuridad. Tras ello, se centrífuga 5 min a la
máxima velocidad y se recoge el sobrenadante. Se mide la D.O. del sobrenadante a 665 nm en un
espectrofotómetro, usando como blanco metanol. Para calcular la concentración de clorofila, se
aplica la fórmula de Marker, midiendo la concentración de clorofila en µg/ml a partir de la siguiente
ecuación:
µg Clorofila/ml = 13.14 X DO 665nm
2.5.2. Determinación de la ficobiliproteína ficocianina
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Se parte de un volumen inicial de 1,5 ml de cultivo.
Se centrífuga 10’, y se retira todo el sobrenadante.
Resuspender las células en 1,5 ml de agua destilada.
Añadir 50 μl de tolueno.
Agitar vigorosamente en vortex durante al menos.
Dejar reposar un tiempo mínimo de 30’ en oscuridad.
Se centrífuga 10’, se observa el sedimento, el sobrenadante y una fase superior de
tolueno con algunos restos celulares.
8. Se recoge 1 ml del sobrenadante con las ficocianinas (color azulado), procurando no
coger ni sedimento ni la fase superior de tolueno para evitar restos celulares (utilizar una
punta de pipeta por muestra).
9. Se mide en el espectro, tomando como blanco agua destilada.
10. La concentraciones de la ficocianina se obtendrá de la siguiente fórmula:
µg Ficocianina/ml = 135 x DO620nm
2.5.3. Obtención de espectros in vivo
Se recogerán 3 ml de cultivo y se realizará, usando un espectrofotómetro, un barrido de
longitudes de onda desde 400nm hasta 750 nm para determinar el espectro de acción de las
diferentes cepas de cianobacterias debido a la presencia de los pigmentos fotosintéticos.
9
Figura 7. Esquema resumen de los transportes electrónicos fotosintéticos lineal y cíclico en cianobacterias (adaptado de
http://www.genome.ad.jpg/kegg/pathway/map/map00195.html).
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Figura 8. Esquema de los transportes electrónicos fotosintético y respiratorio en Synechocystis sp. PCC 6803 (adaptado de Pils y Schmetterer,
2001). Se encuentran representados los lugares de acción de los inhibidores HQNO (2-heptyl-4-hydroxy-quinoline-N-oxide), PCP (pentaclorofenol),
CN (KCN) y Azida. MP (membrana plasmática), MT (membrana tilacoidal).
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MEDIDAS DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO
MEDIDAS DE CONTENIDO CELULAR DE PIGMENTOS
A.PESO SECO
mg PS/ml
B.CLOROFILAS
μg Cla/ml
C.FICOCIANINAS
μg FC/ml
D.CONT. CLOROFILAS
μg Cla/ mg PS
E.CONT.
FICOCIANINAS
μg FC /mg PS
F.CONT.
FICOCIANINAS
μg FC / μg Cla
0,396xDO750nm-0,004
13,14xDO665
135xDO620
B/A
C/A
C/B
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CÁLCULOS TASA FOTOSINTÉTICA, RESPIRATORIA, FOTOSISTEMA I Y FOTOSISTEMA II
G.TASA DE O2
BRUTA
nmol O2/ml·min
H. TASA DE O2
BRUTA
nmol O2/ml·h
I. CLOROFILAS
Dato electrodo
Gx60
mg Cla/ml
J.TASA FOT, RESP,
FSI, II
nmol O2/mg cl·h
K.TASA FOT,
RESP, FSI, II
μmol O2/mg cl·h
Bx10-3
H/I
J/103
FOTOSÍNTESIS
LUZ BLANCA
FOTOSÍNTESIS
LUZ ROJA
FOTOSÍNTESIS
LUZ 620 nm
RESPIRACIÓN
*FOTOSISTEMA I
*FOTOSISTEMA II
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