dinámica de poblaciones en un proceso de lodos

DINÁMICA DE POBLACIONES EN UN PROCESO DE LODOS ACTIVADOS DURANTE LA
ACLIMATACIÓN A COMPUESTOS FENÓLICOS
González Ariel, Moreno Gloria, Buitrón Germán*
Coordinación de Bioprocesos Ambientales Instituto de Ingeniería, UNAM.
Apdo. Postal 70-472, Coyoacán C. P. 04510 México, D. F. Fax 616 21 64.
RESUMEN
Se presenta la dinámica de poblaciones de los lodos activados en el proceso de aclimatación a una mezcla, a
proporciones iguales, de compuestos fenólicos: fenol, 4-clorofenol, 2,4-diclorofenol y 2,4,6-triclorofenol. La
aclimatación se llevó a cabo en un reactor funcionando en un modo discontinuo secuencial (SBR), durante 63
días. El lodo de inóculo se caracterizó en cuanto al número de bacterias viables (UFC/g SSV). La identificación
de las cepas puras de bacterias se llevó a cabo mediante el sistema API 20E. La mezcla de clorofenoles fue
degradada con porcentajes de eliminación superiores a 75 %. Durante el periodo de aclimatación se
seleccionaron las bacterias Gram negativas Chryseomonas luteola, Aeromonas sp, Pseudomonas sp y
Flaviomonas oryzihabitans. Las especies de protozoarios que prevalecieron hasta el día 63 de operación fueron
Proales sp y Vorticella convallaria. Las poblaciones de nemátodos, hongos y algas se observaron hasta los 50,
57 y 61 días respectivamente. Se realizaron cinéticas de degradación para las cepas puras aisladas e
identificadas al final del periodo de la aclimatación para comprobar la degradación de cada uno de los
compuestos fenólicos. Las tasas específicas de eliminación de fenoles obtenidas para el consorcio de los lodos
activados aclimatados fueron: 407 mg fenol/gSSV -d, 784 mg 4-clorofenol/gSSV -d,
610 mg 2,4diclorofenol/gSSV -d, y 457 mg 2,4,6-triclorofenol/gSSV -d.
Palabras clave: dinámica de poblaciones, biodegradación, tóxicos, aclimatación, fenoles, Chryseomonas
luteola, Aeromonas sp, Pseudomonas sp, Flaviomonas oryzihabitans
INTRODUCCIÓN
Muchos han sido los microorganismos reportados en la literatura por su capacidad de biodegradar compuestos
orgánicos específicos, ya sea dentro de un sistema de lodos activados, o bien aisladamente. Sin embargo,
poco se sabe de las comunidades microbianas que actúan sobre los compuestos orgánicos tóxicos a altas
concentraciones. De la misma manera poco se sabe acerca de las condiciones óptimas para la estimación
cuantitativa de los microorganismos que participan en la biodegradación de los tóxicos. En efecto, las técnicas
descritas en la literatura generalmente se aplican para la enumeración de los microorganismos presentes en las
aguas residuales domesticas, al aclimatar las poblaciones bacterianas su metabolismo cambia y no es seguro
que se reproduzcan óptimamente en los medios generalmente utilizados para la enumeración.
La intención de este trabajo fue estudiar la dinámica de poblaciones en un sistema de lodos activados ocurrida
durante el periodo de aclimatación a compuestos fenólicos, así como establecer un protocolo de investigación
para cuantificar e identificar bacterias aclimatadas a compuestos fenólicos. La dinámica de poblaciones
microbiana se define como una rama de la ciencia y tecnología del agua que describe las interacciones entre
los microorganismos de un consorcio microbiano complejo (Wanner, 1994).
METODOLOGÍA
Aclimatación de microorganismos a fenoles.
La aclimatación se llevo a cabo en un reactor de vidrio de dos litros con un aireador en el fondo. El reactor se
operó en un modo discontinuo secuencial (SBR) y se inoculó con biomasa del proceso de lodos activados de la
planta de tratamiento de aguas residuales de Ciudad Universitaria. La alimentación consintió en una mezcla, a
proporciones iguales de: fenol, 4-clorofenol, 2,4-diclorofenol y 2,4,6-triclorofenol a una concentración de 40 mg
de fenoles totales/l, adicionado además con nutrientes y oligoelementos.
Técnicas analíticas.
Durante todo el periodo de aclimatación se realizaron las siguientes técnicas para análisis de aguas:
temperatura, pH, sólidos suspendidos totales (SST), índice volumétrico de lodo (IVL), demanda química de
oxígeno (DQO), carbón orgánico total (COT), determinación de cloruros y cada 2 días conteo heterótrofo en
placa descritas por APHA (1992). Los fenoles se analizaron por medio de cromatrografía líquida (Buitrón y
González, 1996).
Dinámica de poblaciones del proceso de lodos activados.
El seguimiento de la dinámica de poblaciones bacteriana se realizó mediante la técnica de conteo heterótrofo en
placa, aislando e identificando las poblaciones de bacterias en un inicio y cada 2 días durante los 63 días que
duró el periodo de aclimatación. La dinámica de poblaciones de protozoarios se realizó mediante observaciones
diarias a un microscopio óptico (Ernst Leitz Wetzlar GMBH) a diferentes aumentos (10x, 25x, 40x y 100x). La
identificación de los géneros de protozoarios se realizó mediante la descripción de lodos activados de Verdy
(1977). En el caso de los hongos, algas y nemátodos el registro fue cualitativo (presencia o ausencia).
Aislamiento e Identificación de bacterias.
Se utilizó el medio de cultivo de peptona de caseína adicionado con una concentración de 0.1 mg/l de la mezcla
de los fenoles. Este medio de cultivo sirvió para la estimación cuantitativa y el aislamiento de bacterias
aclimatadas a compuestos fenólicos. Para el aislamiento de las poblaciones bacterianas se utilizó la técnica de
conteo heterótrofo en placa. El número de bacterias viables se estimó bajo el término de unidades formadoras
de colonias (UFC). Para la identificación de cepas puras de bacterias se utilizó la técnica de tinción de Gram y
observaciones al microscopio óptico, ya que no se encontraron bacterias Gram positivas se utilizó el sistema
API 20E, que sirve para identificar Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos, descrita por API (1990).
Cinéticas de degradación.
Las cinéticas de degradación se realizaron con el consorcio de los lodos activados aclimatados (LAA) y con
cepas puras de bacterias a partir de aislamientos del consorcio de los LAA. Con las cepas puras se procedió a
incrementar la biomasa en matraces de 250 ml con un medio nutritivo líquido de peptona de caseína (sin agar),
adicionado con 10 mg/l de la mezcla de los compuestos fenólicos más nutrientes. La incubación duro 7 días a
una temperatura de 30 °C, con agitación constante de 230 r.p.m. Una vez obtenida la biomasa necesaria para
cada cepa, estas se centrifugaron 3 veces y se lavaron con agua mineral esterilizada (fosfatos y sales de
amonio), todo el contenido de los matraces, durante 3 minutos a 4,000 r.p.m., con la finalidad de eliminar el
carbón orgánico sobrante del medio y utilizar únicamente la biomasa para las cinéticas de degradación.
La biomasa se colocó en matraces de 1000 ml, conteniendo 500 ml de agua destilada esterilizada, 40 mg/l de
la mezcla de los compuestos fenólicos y nutrientes. Los matraces se sellaron con tapones de hule para evitar la
contaminación del medio. Se montó un sistema de purificación de aire que tenia un filtro de carbón activado y un
filtro de membrana de 0.2 µ, este sistema repartía el aire por medio de mangueras de sílicon, que atravesaban
los tapones de hule conectados con un aireador en el fondo de cada matraz.
Se determinaron los SST, CHP y estriado en placa en un inicio y al final de las cinéticas de degradación, con la
finalidad de poder estimar la biomasa y comprobar la pureza de las cepas utilizadas. Para los lodos activados,
la toma de muestras se realizó cada 15 minutos hasta eliminar el 85 % del carbón orgánico total, mientras que
para las cinéticas de degradación de cepas puras el muestreo se realizó cada día durante 9 días seguidos (este
tiempo se ajusto según el desarrollo de la cinética). Las muestras obtenidas durante las cinéticas se filtraron
con un filtro de membrana de nitrato de celulosa de 0.45 µ (Whatman) y se refrigeraron posteriormente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se aislaron e identificaron 10 géneros de bacterias en el lodo de inóculo, previo al periodo de aclimatación (tabla
1). Las bacterias identificadas se encuentran en ambientes acuáticos como son cuerpos de agua
epicontinentales. Los géneros de Serratia, Aeromonas, Erwinia, Proteus, se tienen bien identificados en
estudios sobre metabolismo, ya que son causantes de enfermedades gastrointestinales tanto en el hombre
como en animales (figura 1).
Tabla 1.- Bacterias Gram negativas identificadas y porcentajes de identificación
del sistema Api 20E.
Bacterias aerobias
Serratia sp
Aeromonas salmonicida
Erwinia sp
Sphingomonas paucimobilis
Pasteurellas sp
Proteus penneri
Flaviomonas oryzihabitans
Pseudomonas pseudomallei
Chryseomonas luteola
Enterobacter agglomerans
Porcentaje de identificación
(Api 20 E)
Aceptable identificación
82 %; T= 0.77
Buena identificación
95 %; T= 0.76
Buena identificación
98.3 %; T= 0.80
Buena identificación
90 %; T= 0.76
Baja identificación
75 % ; T= 0.72
Buena identificación
89 %; T= 0.72
Aceptable identificación
81.3 %; T= 0.97
Buena identificación
82.7 %; T= 0.70
Buena identificación
96 %; T= 0.78
Aceptable identificación
87.4 %; T= 0.67
En los últimos días del periodo de aclimatación las poblaciones de bacterias identificadas fueron Chryseomonas
luteola, Aeromonas sp, Pseudomonas sp y Flaviomonas oryzihabitans. El porcentaje de distribución para
cada una de las cepas puras estuvo distribuido de la siguiente manera: Chryseomonas luteola 15 %,
Aeromonas sp 20 %, Pseudomonas sp el 30 %, Flaviomonas oryzihabitans 20 % y 15 % micobacterias. Los
géneros de Chryseomonas y Flaviomonas tienen importancia medica por ser bacterias patógenas causantes de
diversas infecciones intestinales (Kostman et al, 1991).
La dinámica de poblaciones de protozoarios durante el periodo de aclimatación a fenoles se muestra en la figura
2. Las especies de protozoarios dominantes durante este periodo fueron Vorticella convallaria y Proales sp.
Dentro de la cadena trófica del sistema estas especies son depredadoras de bacterias.
S e r r a t i a sp
Aeromonas sp
Erwinia sp
Sphingomonas paucimobilis
P a s t e u r e l l a s sp
Proteus penneri
Flaviomonas oryzihabitans
Pseudomonas sp
Chryseomonas luteola
Enterobacter agglomerans
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Días
Figura 1 Dinámica de población bacteriana, en el periodo de aclimatación a fenoles
Proales
sp
Euglypha sp
B o d o sp
E u p l o t e s sp
Aspidisca costata
Vorticella convallaria
Vorticella allongée
Vorticella microstoma
O p e r c u l a r i a sp
E p i s t y l i s sp
P a r a m e c i u m sp
Chilodenella
sp
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Días
Figura 2 Dinámica de poblaciones de protozoarios
A los dos días del periodo de aclimatación se observaron los primeros protozoarios muertos: Euplotes sp,
Euglypha sp, Chilodonella sp. Los géneros de Chilodonella sp, Paramecium sp, Monostyla, Ceratium sp,
Euglena sp, Euglypha sp, Euplotes sp y Aspidisca costata se vieron afectados por la mezcla de fenoles en el
sistema. Los protozoarios no presentan una actividad enzimática capaz de reconocer el compuesto orgánico
tóxico, como las bacterias, por lo que las poblaciones de protozoarios disminuyen conforme el compuesto
orgánico esta presente en el sistema. Los géneros de Vorticella sp y Epistylis sp representan una buena
oxigenación y un funcionamiento estable en el reactor. La presencia de Euplotes sp en el medio acuoso
representa una deficiente eliminación de carbono (Madoni 1994; Duchene y Cotteux, 1993).
La sucesión de las poblaciones de protozoarios, nemátodos, algas y hongos durante el periodo de aclimatación
a fenoles se muestran en la figura 3. Estas poblaciones están relacionadas con las características morfológicas
del flóculo como son: el tamaño, color, y tipo de agregaciones de microorganismos. El color del flóculo cambió
a los 4 días de la aclimatación, pasó de un color café obscuro a café claro. El tamaño del flóculo fue mediano a
los 3 días del comienzo del periodo de la aclimatación. Al término de los 15 ciclos que se mantuvo la
aclimatación, el color del flóculo fue café claro, disperso y con apariencia amorfa. Se encontró la presencia de
Proales sp y Vorticella convallaria fija al flóculo.
ALGAS
HONGOS
NEMÁTODOS
PROTOZOARIOS
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Días
Figura 3 Dinámica de poblaciones de algas, hongos, nemátodos y
protozoarios
La población de nemátodos estuvo representada por un solo microorganismos que se observó hasta el día 51 de
operación del reactor. Duchene y Cotteux (1993) relacionan el incremento de la densidad de nemátodos (mayor
a 3x103 microorganismos/l), con la aireación baja o por una decantación estática en periodos estacionales, en
nuestro caso la aireación en el reactor fue adecuada. La población de hongos se observó hasta el día 57 de
operación del reactor. Las poblaciones de hongos participan de manera semejante a las bacterias en la
biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos (Field et al, 1993). La mezcla utilizada de compuestos
fenólicos presentó un efecto tóxico sobre las poblaciones de hongos dentro del reactor.
Se estudió la cinética de degradación sobre los lodos activados aclimatados y sobre cada una de las cepas
puras aisladas al final del periodo de aclimatación. Se encontró que la degradación de los fenoles fue
secuencial: el fenol y el 4-clorofenol fueron los primeros en ser degradados, seguidos del 2,4-diclorofenol y
finalmente del 2,4,6-triclorofenol (figura 4), para el caso de los lodos activados. Además si se compara el tiempo
de degradación, se observa que el consorcio de lodos activados fue más eficiente que cada una de las cepas
por separado (figura 5).
Concentración, mg/l
30
Fenol
25
4-CF
20
2,4-DCF
15
2,4,6-TCF
10
5
0
0
5
10
15
20
Horas
Figura 4 Lodos Activados Aclimatados, X o = 183 mg SSV/l;
7
25
8
Xprom = 201 mg SSV/l; Xov = 8.2 x 10 UFC/l; XFV = 1.2 x 10 UFC/l.
40
Concentración, mg/l
35
Fenol
4-CF
30
2,4-DCF
2,4,6-TCF
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4 Días 5
6
7
8
9
Figura 5 Pseudomonas sp, Xo = 120 mg SSV/l; XF = 153 mg SSV/l;
Xprom = 136 mg SSV/l; Xov = 5 x 107 UFC/l; XFV = 8.9 x 107 UFC/l.
Las tasas de degradación fueron mayores para el caso de los lodos activados aclimatados que para las cepas
puras (tabla 2). Para degradar la misma cantidad de sustrato, y con concentraciones similares de biomasa
viable, el consorcio degradó los fenoles en 25 horas, mientras que cada una de las cuatro cepas puras lo hizo
en 9 días. Chryseomonas luteola prácticamente no degradó el 2,4,6-triclorofenol.
Tabla 2.- Tasas específicas obtenidas para la eliminación de compuestos fenólicos.
qx = mg/g SSV/d
Lodos activados aclimatados
Chryseomonas luteola
Aeromonas sp
Pseudomonas sp
Flaviomonas oryzihabitans
Fenol
407
39
54
19
44
4-CF
784
39
47
37
30
2,4-DCF
610
26
33
38
40
2,4,6-TCF
457
8
47
58
44
2,4-DCF
1235
4.4
38.6
101
45
2,4,6-TCF
920
1.4
53
156
44
mg de fenoles/UFC/d (x10-9)
Lodos activados aclimatados
Chryseomonas luteola
Aeromonas sp
Pseudomonas sp
Flaviomonas oryzihabitans
Fenol
820
6.5
61
86.3
49
4-CF
1530
6.6
47.6
101
34
La capacidad para degradar los compuestos orgánicos tóxicos, como son los fenoles, depende del proceso de
adaptación de las diferentes poblaciones que conforman los lodos activados. En el periodo de aclimatación es
necesario satisfecer los requerimentos microbianos presentes en el sistema, para poder mantener la máxima
actividad metabólica de cada población que constituyen los lodos activados.
CONCLUSIONES
El seguimiento de la dinámica de poblaciones ayudó a conocer el consorcio de los lodos activados para
establecer cuál es la participación de cada una de las poblaciones en la biodegradación de compuestos
orgánicos tóxicos. En este estudio, la mezcla de clorofenoles fue degradada con porcentajes de eliminación
superiores a 76 %. El consorcio bacteriano de los lodos activados aclimatados a fenoles, presentó las tasas de
degradación más elevadas para cada uno de los compuestos fenólicos que conforman la mezcla de los fenoles,
en comparación con las tasas de degradación para las cepas puras. Estos resultados remarcan la importancia
de la utilización de consorcios microbianos para la degradación de efluentes conteniendo compuestos tóxicos.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se realizó con el apoyo económico de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de
la UNAM (PAPIIT IN 500 794).
REFERENCIAS
APHA. AWWA. WPC.F. (1992). Standar methods for the examination of water and wastewater. Ed. Washington,
D. C. 18, Ed. 10-137 pp.
API (1990). Systeme d`identification des bacilles gram négatif non enterobactéries. 20 NE. Notice technique,
BioMérieux, S. A.
Buitrón, G. y González A. (1996). Characterization of the microorganisms from an acclimated activated sludge
degrading phenolic compounds. Memorias de la Water Quality International ´96, 18 th Biennial Conference
and Exhibition of the International Association on Water Quality, Singapore, June.
Duchene y Cotteux, E. D. (1993). Les éléments les plus significatifs de la microfaune des boues activées.
Cemagref. pags. 471-477.
Field, J., Jong, E., Feijoo, C. y Bont, J.A.M. (1993). Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons
in the aquatic hydrocarbons in the aquatic environment. Trends Biotechnol. Vol. 11. pags. 44-47.
Kostman, J., Solomon, F. y Fekete, T. (1991). Infections with Chryseomona luteola (CDC group VE-1) and
Flaviomonas oryzihabitans (CDC group VE-2) in neurosurgical patients. Journal Reviews of Infectious
Diseases. Vol. 13, No. 2. pags. 233-236.
Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of biological performance of activated sludge
plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. Vol. 28. No. 1. pags. 67-75.
Verdy, B. (1977). L’Analyse ecologique des boues activées. Ed. Christian Brucher Segetec (France), 125 pp.
Wanner, J. (1994). Activated sludge population dynamics. Wat. Sci. Tech. Vol. 30 No 11 pp. 159-169