Práctica 1

Práctica 1
Determinación del efecto de la concentración de sal en la
fermentación láctica de hortalizas encurtidas
Introducción
El procedimiento de encurtir los vegetales con sal tiene como objetivo principal
la conservación de la calidad nutritiva del producto. Los alimentos pierden agua
al establecerse un equilibrio osmótico con la salmuera. Simultáneamente, penetra
la sal a los tejidos celulares y salen carbohidratos, compuestos nitrogenados,
minerales y otras sustancias que son utilizadas durante la fermentación (Prescott
y Dunn,1959). En la salmuera se desarrolla una flora microbiana mixta,
predominando las bacterias lácticas. Éstas acidifican el medio y bajan el pH lo
suficiente para prevenir el desarrollo de microorganismos patógenos y de los que
deterioran al vegetal. El tratamiento se completa sustituyendo la salmuera de
fermentación con la de cobertura, a la cual se le añaden vinagre y condimentos
(Escamilla et al., 1987; Fuselli et al., 1992; Pederson, 1979; Prescott y
Dunn,1959). Durante el proceso hay cambios de sabor, textura y color en la
hortaliza, modificando ligeramente sus propiedades nutritivas (Belatsouras et al.,
1983; Ruíz y Jiménez, 1994, Weinberg et al., 1993).
Existen tres grupos microbianos que pueden aparecer en el proceso fermentativo
(Carr, 1975; Fernández et al., 1993; Pederson y Albury, 1969; Prescott y
Dunn,1959):
Bacterias lácticas. Generalmente prevalecen desde el inicio sobre otros
grupos microbianos. Este grupo puede fortalecerse con una apropiada
inoculación.
Enterobacterias. Estas provienen de la tierra y del agua. Se observan en
baja concentración al inicio de la fermentación.
Levaduras. En la última etapa del proceso aparecen bajas concentraciones
de levaduras fermentativas. Las levaduras aerobias son indeseables porque
forman películas en la superficie, disminuyen la acidez y deterioran el producto.
Se evita su desarrollo cubriendo la superficie de la salmuera con plástico.
Para preparar los encurtidos vegetales se añade sal directamente a las hortalizas
foliares (col, brócoli, etc.) en una concentración entre 2.5 -3%, y se espera a que
se libere agua de ellas para formar una salmuera. Si las hortalizas son frutos,
raíces o tallos, éstas se sumergen en una salmuera preparada con antelación, en
un rango de concentración de NaCl que fluctúa entre 7 - 16%, y considerando
generalmente una relación en peso entre NaCl/hortaliza de 9:100. Para expresar
la concentración de NaCl en la salmuera se usan los GRADOS SALINOS,
considerando la siguiente equivalencia (Carr, 1975; Prescott y Dunn, 1959):
1o S = 0.265 % de NaCl, a 20o C
Las hortalizas duras pueden ser sometidas a un pre-tratamiento con cal para
ablandar los tejidos. Cuando el vegetal no aporte el nivel apropiado de
carbohidratos a la fermentación puede añadirse azúcar a la salmuera. En
ocasiones se añade un poco de ácido acético al inicio del proceso para disminuir
el pH y favorecer el desarrollo de las bacterias lácticas (Carr, 1975; Pederson,
1979; Prescott y Dunn,1959; Ruíz y Jiménez, 1994).
Objetivo
Determinar el nivel apropiado de concentración de sal en la salmuera que
favorezcan la fermentación láctica y la conservación de las hortalizas.
Materiales y reactivos (por equipo)
1 asa bacteriológica
1 barra de agitación magnética
1 charola profunda
2 espátulas pequeñas de acero inoxidable
4 frasco de 120 ml de capacidad nominal con tapa de rosca
1 frasco de vidrio de 3.5 l (1 galón), con tapón de rosca.
1 mechero fisher con manguera
1 mechero bunsen con manguera
1 piceta
1 pinzas para crisol
2 pipetas graduadas de 1 ml
5 pipetas graduadas de 10 ml
1 probeta de 250 ml
1 probeta de 2000 ml
1 recipiente metálico de 15-20 cm de altitud y 18-22 cm de diámetro
1 salómetro
4 tubos de cultivo medianos con tapón roscado
1 tubo en T de vidrio con manguera
2 vasos de precipitados de 50 ml
1 vaso de precipitados de 2000 ml
Algodón, bata, cerillos o encendedor, cinta adhesiva tipo masking, cuaderno de
registros, cubrebocas, detergente, papel aluminio, papel sanitario, papel estraza,
plástico (película de polietileno), pluma, plumón marcador negro, reloj, tela pañalina o
gasa, tijeras, toallita para las manos y trapo de franela.
Reactivos:
Ácido acético concentrado
H2O destilada o desionizada
Glucosa
NaCl
Soluciones amortiguadoras de referencia, pH 4.0 y 7.0
Solución de fenol al 1 % *
Solución de fenol al 5 % *
Solución de H2SO4 al 10 % *
Solución de NaOH al 10 % *
Un tubo con cultivo axénico de 48 h de una cepa de Lactobacillus plantarum, en
medio complejo sólido.
Hortalizas
(*) Preparadas previamente según el ANEXO A.
Para análisis:
Se deben considerar los materiales, reactivos y equipo necesarios para realizar
los análisis, según las indicaciones de los ANEXOS A, B y C.
Equipo (para el grupo):
Autoclave, balanza granataria digital, balanza con capacidad para 2 Kg, campana
de flujo laminar, parrillas de agitación y calentamiento electrorregulables,
potenciómetro, refrigerador, salómetro.
Diseño de la práctica
Se evaluarán dos niveles de concentración de sal en la fermentación láctica
dentro del rango normal que se utilice en la industria de elaboración de hortalizas
encurtidas. Cada equipo de alumnos preparará su salmuera, sus vegetales y el
inóculo. Después, llevará a cabo una fermentación de 3 – 4 semanas,
muestreando y realizando los análisis semanalmente. Después realizar los
cálculos, se compararán los resultados de dos equipos, cada uno con la misma
hortaliza y con un nivel diferente de concentración de salmuera. Cada equipo
presentará un informe con los resultados de ambos equipos y su discusión. Los
resultados se discutirán en una sesión global.
Se proponen dos niveles para evaluar el efecto de la concentración de sal en esta
fermentación láctica con Lactobacillus plantarum, de acuerdo al Cuadro 2.1. Los
parámetros evaluados serán los cambios en la concentración de ácido láctico y
pH. Además, se observará cuáles grupos microbianos predominan en las
diferentes etapas del cultivo.
CUADRO 2.1 Niveles de concentración de sal para la
fermentación láctica de hortalizas encurtidas
_____________________________________________________________________________________
No. Fermentador
Conc. inicial de sal*
(oS )
Conc. final de sal*
(oS )
_____________________________________________________________________________________
1
15
30
2
30
60
_____________________________________________________________________________________
* 1 grado salino (°S) = 0.265 % NaCl
La concentración de sal en la salmuera se incrementa a 1.5 veces la
concentración inicial a la primera semana, para favorecer la actividad de
Lactobacillus plantarum durante la última semana. Una semana antes del
término de la fermentación, la concentración será el doble del valor inicial.
Durante el reposo de 2 semanas, la salmuera se diluye porque la hortaliza libera
agua. Cada semana debe medirse la concentración salina y ajustarla al nivel
deseado.
Cultivo del inóculo
Preparación de
materiales de muestreo
L. plantarum en caldo MRS,
cultivo a 30°C, 48 h, 200 rpm.
Pipetas, frascos de muestreo y
frasco fermentador.
Preparación de la
salmuera
Ajustar sal en base al Cuadro 2.1
(15 o 30°S) y ajustar a pH 5.
Preparación de
hortalizas
Lavar, cortar pedúnculo o pelar o
hervir.
Fermentación
Acomodar de hortalizas, inocular
con 30 ml del inóculo de 48 h e
incubar a temperatura ambiente
por 2 semanas.
Muestreo
Se muestrea en el t = 0 días y
cada semana, tomando 15 ml.
Ajuste de sal
Adición de sal en la primera
semana.
Análisis de la
fermentación
Morfología
acidez.
Informe de resultados
microbiana,
pH
y
Cálculos, gráficas, tablas y dibujos;
discusión y conclusión.
Figura 2.1 Diagrama de actividades para el desarrollo de la práctica. “Determinación
del efecto de la concentración de sal en la fermentación láctica de hortalizas
encurtidas”.
1a Actividad: Cultivo del inóculo
Estructura
Se verifica la pureza de la cepa de Lactobacillus plantarum que se ha
desarrollado previamente en un tubo con agar inclinado, realizando un frotis
teñido con la técnica de Gram (ANEXOS A y C). El caldo de M.R.S. se inocula
con una asada de la bacteria en condiciones asépticas y se incuba durante 48 h, a
30oC, con agitación.
2a Actividad: Preparación de materiales de muestreo
Estructura
Estas actividades se realiza antes de la fermentación principal.
Se envuelven con papel estraza 4 pipetas graduadas de 10 ml. Se prepara en un
matraz erlenmeyer caldo M.R.S., siguiendo el procedimiento indicado en el
ANEXO B, y se esterilizan en autoclave a 121oC, durante 15 min.
En casa se hierven en baño maría los frascos de muestreo (120 ml), durante 30
min. Después se retiran del agua con precaución, se escurren, se cierran y se
dejan enfriar lentamente. En el laboratorio se lava cuidadosamente un frasco de
vidrio de 3.5 L con su tapa, dando un último enjuague con agua destilada, se deja
secar y se cierra.
3a Actividad: Preparación de la salmuera
Estructura
La base de cálculo para todos los componentes de la salmuera indicados en el
Cuadro 2.2 será un volumen de 1500 ml. Se vierten aproximadamente 1200 ml
de agua destilada en un vaso de precipitados de 2 L. Se añaden la sal de mesa y
la glucosa, calculadas para 1500 ml. Las soluciones se mezclan con un agitador
magnético sobre una parrilla eléctrica. El pH de la salmuera se ajusta a 5.0 con
soluciones de H2SO4 o NaOH al 10%, con ayuda de un potenciómetro, calibrado
previamente. Se mide el volumen de la salmuera con una probeta, se ajusta con
agua destilada a un volumen de 1470 ml y se regresa al vaso. Esta salmuera debe
prepararse el mismo día de la fermentación.
Cuadro 2.2 Componentes de la salmuera para la
fermentación láctica de hortalizas encurtidas
Ajuste de concentración
Componentes
Concentración inicial
a la 1ª semana
NaCl (°S)
15 ó 30
22.5 ó 45
Glucosa (%)
0.5
Inóculo (%)
2.0
4a Actividad: Preparación de las hortalizas
Estructura
Se utiliza un solo tipo de hortaliza para dos equipos. De un peso inicial de 1.5 Kg
se seleccionan los mejores ejemplares maduros y frescos. Pueden emplearse
chiles jalapeños, calabacitas, cebollas de cambray, etc. Las hortalizas se preparan
dependiendo de lo que requieran. A los chiles, calabacitas y cebollas se les
cortan los pedúnculos con un cuchillo; los nopales se hierven. Después se lavan
las hortalizas en un escurridor de plástico. Para cada fermentador se utilizan 1.2
Kg de hortalizas preparadas.
5a Actividad: Fermentación y muestreo
Estructura
Se verifica la pureza del inóculo de Lactobacillus plantarum por medio de la
observación al microscopio de un frotis teñido con la técnica de Gram
(ANEXOS A y C), se adiciona el inóculo (2% de 1500 ml) a la salmuera que está
en el vaso en una zona estéril, utilizando una pipeta estéril, se mezcla con un
agitador magnético. Las hortalizas (1.2 Kg) se acomodan en el interior del frasco
sin salmuera, se adicionan los 1500 ml de salmuera inoculada al frasco
fermentador sobre las hortalizas. Inmediatamente después se toma una alícuota
de 15 ml con otra pipeta estéril, en condiciones asépticas, la cual se van a
analizar el mismo día. Se debe anotar la fecha y hora del inicio de la
fermentación.
Se corta un círculo de una película de polietileno, cuyo perímetro exceda
aproximadamente 10 cm al perímetro del frasco. Con él se cubre la superficie del
líquido, tocándola y sin dejar burbujas de aire. Sobre el plástico se colocan de 8 a
10 canicas de vidrio, a fin de garantizar que ésta no se levante con el gas que se
formará posteriormente. La superficie del líquido nunca debe quedar expuesta al
aire porque ahí se formarán natas. Después se tapa el frasco con la tapa de rosca,
sin apretar. Los fermentadores se mantienen a temperatura ambiente durante un
período de 2 semanas.
Se toma una muestra cada semana para lo cual se transporta el fermentador con
cuidado a una zona limpia; ahí se abre el frasco, se retira la película plástica y se
lava. Si se observa una nata superficial, ésta se retira con una espátula limpia y se
realiza un frotis. Después, se vacía la salmuera en una probeta de 2 litros para
medir el volumen y se regresa al vaso de 2 L. Se retira una alícuota de 15 ml con
una pipeta estéril, para realizar los análisis el mismo día. Posteriormente, se
vierten 250 ml de salmuera a una probeta de vidrio de esa capacidad, se
introduce un salómetro y se sigue el procedimiento indicado en el ANEXO C
para la medición del grado salino. El contenido de esa probeta se regresa luego al
vaso de precipitados que contiene el resto de la salmuera.
Se añade la cantidad de sal calculada para incrementar el grado salino al valor
que le corresponda. La sal se mezcla con un agitador magnético y una parrilla
eléctrica. Después se regresa la salmuera al fermentador, y se colocan la película
plástica limpia y las canicas recién lavadas en la superficie. Finalmente, se tapa
el frasco y se deja en reposo.
6a Actividad: Análisis de la fermentación
Estructura
Los siguientes análisis se realizan en las muestras de 15 ml de salmuera el
mismo día de cada muestreo: observación de la morfología de los diversos
grupos microbianos con tinción de Gram de frotis elaborados de la salmuera y de
la nata superficial (si se formó), medición de pH y determinación de acidez
titulable con NaOH 0.05N. Los análisis se realizan de acuerdo a las técnicas que
se presentan en el ANEXO C, pero considerando la acidez como ácido láctico.
7a Actividad: Informe de resultados
Estructura
El informe debe constar de una carátula con los datos de la práctica y del equipo.
En la segunda página se escribe el objetivo de la práctica y la sección de
Métodos, en donde se indican las concentraciones de sal asignadas a cada equipo
que se reporta así como el vegetal que se sometió. También debe incluirse en
esta sección cualquier actividad que haya sido realizada de manera diferente a lo
indicado en el protocolo. Después vienen las secciones de Resultados, Discusión
y Conclusiones, los cuales se detallan más adelante. Para terminar se incluye la
Bibliografía.
Cuadros de resultados
En cada cuadro se escribirá el título con el número correspondiente, los
parámetros que se presentan, el factor que se estudia, el microorganismo y el tipo
de medio. Cada fila y columna quedarán bien identificadas y con unidades.
Cuadros de resultados No. 1 y 2. Se cuentan los vegetales de cada
condición de cultivo (°S) que esté reportando. Cada lote se clasifica en 3
categorías: buenos, regulares y malos, anotando el porcentaje correspondiente de
cada categoría, con respecto al total del lote. Posteriormente se describe la
apariencia de los mismos (cambio de color, firmeza, etc.).
Cuadros de resultados No. 3 y 4. Anotar la morfología microscópica de los
diversos grupos microbianos observados en las muestras de salmuera y las de
nata de cada fermentador. También se mencionará en otra columna el orden de
abundancia de cada grupo microbiano. Presentar dibujos.
Cuadros de resultados No. 5 y 6. Para cada fermentador se presentan los
resultados de los análisis físicos y químicos directos del fermentador: volúmenes
medidos de salmuera; grado salino medido y grado salino ajustado (después de
añadir la sal); alícuotas y gastos de la determinación de acidez titulable en cada
muestra. Es importante no anotar en este cuadro ningún dato calculado.
Cuadro de resultados No. 7 y 8. Anotar los datos calculados para cada
muestra de los dos fermentadores con diferente nivel de sal: pH y acidez titulable
en dos tipos de unidades: a) concentración de ácido láctico en la salmuera, en %
(p/v), y b) acidez, en gAc.Lac./Kghort. Este valor se calcula considerando el peso
del ácido láctico (g) que hay en el volumen total de la salmuera en el
fermentador de cada semana, dividiendo entre el peso inicial de las hortalizas
(1.2 Kg).
Cuadro de resultados No.9. Anotar los resultados de la degustación de sus
vegetales encurtidos en comparación con productos comerciales.
Gráficas
Utilizando los datos calculados de los Cuadros de resultados No. 7 y 8 se
realizarán las gráficas indicadas en los siguientes incisos, con ayuda del
programa de computación Excel, para graficar los datos. El formato será de
dispersión x y, con puntos y líneas suavizadas, una gráfica por página.
En cada figura se escribirá el titulo con el número correspondiente, los
parámetros que se presentan, el factor que se estudia (°S), el microorganismo y el
tipo de medio. Cada curva y coordenada quedará bien identificado y con
unidades.
Gráficas por fermentador: En las Figuras 1 y 2 se presentan las gráficas
de cada fermentación. En la abcisas se indica el tiempo en días; y en las
ordenadas, el volumen de la salmuera, el pH y la relación entre Ác. Lác./ Peso
Hort., en g/Kg.
Gráfica de ácido láctico: En la Figura 3 se presentan las curvas de la
relación entre Ác. Lác./ Peso Hort., en g/Kg de los dos fermentadores, contra el
tiempo, en días.
Gráficas de pH: De manera similar, en la Figura No. 4, se grafican los
datos de pH contra el tiempo de los dos fermentadores.
Parámetros de velocidad del proceso
Con los datos que corresponden a la acidez de la tropofase de cada cultivo,
Gráfica 3 y los Cuadros de resultados No. 7 y 8, se calculan los valores de
productividad máxima y productividad total de ácido láctico. Los datos
utilizados en los cálculos, y los parámetros resultantes se escribirán en el Cuadro
No. 10 (PÁc.Lac. = gÁc.Lac./KgHort.*h).
Discusión
De acuerdo a los resultados obtenidos en los Cuadros 1 y 2 se puede analizar
cual es el mejor °S para ese vegetal, considerando sus características deseables
así como su porcentaje de conservación.
Se analizan los resultados de los Cuadros No. 7 y 8 y de las Figs. 1 y 2 para
diferenciar las diferentes etapas en la fermentación, identificando en qué fase se
presentan las mayores actividades de la fermentación láctica y la deshidratación
de las hortalizas.
Analizando las Figuras 3 y 4 y los parámetros cinéticos del Cuadro ) se puede
determinar el efecto de la concentración de sal en la velocidad y rendimiento del
ácido láctico y en el cambio de pH. Al comparar estos datos con las
observaciones de los grupos microbianos predominantes (Cuadros 3 y 4), se
deberá deducir y explicar la contribución de cada uno de ellos en las distintas
etapas de la fermentación, reforzando estos conceptos con la información de la
bibliografía.
Además, se comparan todos los resultados experimentales con los de la
bibliografía.
Conclusión
Declare brevemente si se cumplieron los objetivos planteados al inicio de este
protocolo y los aspectos más importantes aprendidos en esta práctica.
Bibliografía
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