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Recomendaciones para la Medición de Hormonas Gladys Laverde de Arbeláez Directora Científica Laboratorio de Investigación Hormonal Miembro de ACEP - ACE I REUNIÓN NACIONAL ANUAL DEL Programa para la Evaluación Directa del Desempeño en Química Clínica y Hematología Septiembre 2 /2016 Inmunoanálisis Laboratorio Endocrinología Objetivos Introducción Definiciones Inmunoensayo – Marcadores Conceptos básicos Ventajas IE Reseña histórica Evolución técnicas IE Clasificación Métodos Validación de métodos Control de calidad Recomendaciones Introducción • Es necesario el respaldo de un laboratorio de alta calidad para lograr un diagnóstico preciso, un manejo efectivo y a un costo razonable de los problemas tiroideos. • En la presencia de una masa tiroidea de crecimiento rápido, las pruebas de laboratorio simplemente confirman la sospecha clínica. • Los síntomas son tan sutiles que la patología sólo se puede detectar mediante una evaluación bioquímica o citopatológica. • DETERMINACIONES HORMONALES • Estructura • Patrón de secreción, (interferencias otras patologías). • Diversidad de metodologías • Diferencia en valores de referencia INMUNOENSAYOS Definición: • Conjunto de técnicas analíticas que usan anticuerpos para la determinación selectiva de ciertos componentes de interés presentes en muestras biológicas. • Ensayos altamente selectivos, sensibles de bajos límites de detección. • Los IE constituyen los métodos de elección para múltiples patologías endocrinas. INMUNOENSAYO • Unión competitiva y especifica de un Ag presente en la muestra del paciente, estándares o controles y un Ag* marcado, compitiendo por los sitios de unión con un Ac especifico, posteriormente una etapa de incubación y separación de las fracciones libres y ligadas Antígeno Anticuerpo MARCADORES Definición: Sustancia conocida e identificable que puede ser medida en el curso de un procedimiento que implique una reacción biológica o inmunoquímica. EVOLUCION- TECNOLOGIAS DE INMUNOENSAYO RIA: La base. Buena sensibilidad Largos tiempos para la determinación Problemas por la radiación Imposibilidad de automatizar RADIOINMUNOANALISIS (RIA) El antigeno se marca con radioisótopos I125 INMUNORRADIOMETRIA (IRMA) El anticuerpo se marca con radioisótopos I125 Reseña histórica • En 1928, Abrech descubrió las propiedades del luminol un componente que al oxidarse por medio de peróxido de hidrógeno emite luz como fotones individuales • RIA: 1960 Rosalyn Yalow y Solomon Berson cuantificación de Insulina. • El primer ensayo de quimioluminiscencia fue descrito en 1976 con un reporte de Schroeder et. al.; reportaron el desarrollo de un ensayo quimioluminiscente, este ensayo utilizó como indicador el isoluminol • ELISA: 1980´S • FIA: 1980´S FPIA. Primer método semiautomatízado Evolución en técnicas de Inmunoensayo RIA Radioimmunoassay EIA Enzyme Immunoassay FIA / LIA Fluorescence / Luminescence Immunoassay ECLIA Electrochemiluminescence Immunoassay CLASIFICACION INMUNOANALISIS TECNICA RIA IRMA MARCADOR - SUSTRATO Ag – I-125 AC – I-125 Ag o AC- ENZIMAS ELISA FOSFATASA ALCALINA PEROXIDASA DE RABANO DETECTOR CONTADOR DE RAYOS GAMA CONTADOR DE RAYOS GAMA LECTOR DE MICROELISA CLASIFICACION INMUNOANALISIS TECNICA Fluroinmunoanálisis IFD IFI FIA MEIA FPIA Luminoinmunoanálisis LIA Quimioluminiscencia QLIA ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA EQLIA MARCADOR - SUSTRATO Ag – Fluoresceina AC – Fluoresceina Ag o Ac – Europio Ac – FAL ⇨ 4 metil umbeliferil fosfato Ag - fluoresceina DETECTOR Microscopio F Microscopio F Fluorómetro Lámpara de Mercurio Lámpara halógena de tungsteno (luz – polarizada) Ag o AC Luminol Isoluminol Esterés de acridino Luminómetro Ag o Ac – FAL ⇨ Dioxetano - P Luminómetro Rutenio,Osmio,Renio Microparticulas magneticas Analizador inmunoensayos ECL INMUNOENSAYOS b Homogéneos b Heterogéneos INMUNOENSAYO HOMOGENEO otras fracciones Ac fase sólida Ag No hay separación entre la fracción libre y la fracción unida Ensayo Heterogéneo otras fracciones Ac fase sólida Ag otras fracciones b b LAVADO CENTRIFUGACION VERTICAL ESPECIFICIDAD El proceso de separación implica remover sustancias que puedan generar interferencia en la reacción Técnicas de Separación Método del doble anticuerpo Tubo o pozo recubierto Fase sólida Adsorción Precipitante Separación por columna ELISA + + Ac anti-TSH Ag (control, muestra) + INCUBACION LAVADO Sustrato fluorigénico cromogénico Conjugado Ac ANTI TSH ENZIMAS Ac-Ag-Ac MARCADO INCUBACION LAVADO SOLUCION STOP O INTENSIFICADORA *Marcaje mas estable *Rangos amplios de medida *Automatización FLUORESCENCIA Qué es Quimioluminiscencia? • Es la generación de radiación electromagnética en forma de luz como liberación de energía a partir de una reacción química. • La luz puede ser emitida en la región infrarroja, visible o ultravioleta. • Pruebas en Sistemas IMMULITE Principio de la prueba Centrifugación sobre el eje vertical LAVADO Anticuerpo Monoclonal Anti TSH B TSH B Luminescencia SUBSTRATO anti-IgG Humanos/ + + Fosfatasa Alcalina ciclo de incubación de 30 minutos Fosfatasa alcalina ( Emisión de luz prolongada ) Mayor sensibilidad Sensibilidad de las Pruebas Primera generación: 1 - 2 uIU/mL Segunda generación: 0.1 - 0.2 uIU/mL Tercera generación: 0.01- 0.02 uIU/mL PSA 1ra generacion detectan 0.1 -0.3 ng/mL. PSA 3ra generación detecta 0.01 ng/mL. Ensayos deTSH Características de un analizador automatizado de inmunoensayo • • • • • • • Acceso continuo al azar Fácil operación Capacidad de procesar urgencias Curvas standard estables Alto número de pruebas por hora Fácil sistema de eliminación de desechos Capacidad para comunicación con una interfase bidireccional ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL) Reactivos altamente estables Rápidos tiempos de reacción Alta sensibilidad Amplio rango de medida Gran variedad de analitos a determinar No utiliza enzimas Marcaje no isotópico r EVOLUCION- TECNOLOGIAS DE INMUNOENSAYO ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL) Definición: Proceso en el cual se generan especies altamente reactivas a partir de precursores estables, en la superficie de un electrodo (CLIA inducida por un proceso eléctrico) r Electroquimioluminiscencia CARACTERISTICAS DEL MARCADOR RUTENIO Quelato metálico estable, soluble en agua Bajo peso molecular Fácil acople con proteinas Alta estabilidad en reactivo líquido r VENTAJAS DE LAS MICROPARTICULAS MAGNETICAS Revestidas con estreptavidina Enlace covalente muy fuerte (baja pérdida de inmurreactividad) Alta estabilidad y reproducibilidad lote a lote de reactivos. r SISTEMA ELECSYS Características. Posibilidad de urgencias Sensibilidad incrementada -TSH: 0.005 uIU/ml -PSA: 0.005 ng/ml Linearidad e la HCG : 10.000 mIU/ml r QUE ES LO NORMAL? La secreción de T4 por TSH. TSH en hipófisis por hormonas tiroideas, retroalimentación negativa sensible que mantiene los niveles de T4 libre en r.normal estrecho. TSH hipotálamo TRH. Diagnóstico enfermedades tiroideas se basa: Hallazgos clínicos. Palpación de la tiroides. Mediciones Bioquímicas: TSH,T4L- T3L-Tg-Ac.tiroideos Imágenes. Causas de discordancia entre T4L y TSH en ausencia de enfermedad grave asociada Causas de discordancia entre T4L y TSH en ausencia de enfermedad grave asociada Factores iatrogénicos como la administración de medicamentos tiroideos y no tiroideos (por ejemplo: glucocorticoides, betabloqueantes), autoanticuerpos anti-hormonas tiroideas, anti-Tg, y anticuerpos heterófilos (HAMA) puede afectar la exactitud del diagnóstico al conducir a una interpretación errónea del resultado. Pruebas Diagnóstico y Seguimiento Tamización T4 total T4 Libre Hipotiroidismo TSH Ac TPO - Tg AntiTSHr T3 Total-L Hipertiroidismo Hormona Estimulante de la tiroides TSH Prueba ideal para diagnóstico de enfermedad tiroidea: Alta sensibilidad diagnóstica. No está afectada por proteínas séricas El T4 Libre se normaliza mas rápidamente que la TSH en pacientes sometidos a tratamiento. VARIABLES PREANALITICAS • Efectos fisiologicos. • Metodos de recolección y almacenamiento de muestras • Manipulación y transporte de las muestras. FACTORES FISIOLOGICOS: • Estrés físico –sicologico • Ejercicio.Cambios posturales. • Variaciones diurnas. • Variabilidad en el metabolismo. • Secreción episodica de las hormonas. VARIABLES PREANALITICAS FACTORES : La mayor parte de las variables pre-analíticas tienen poco efecto en la determinación de TSH. (Anticuerpos heterófilos HAMA) La presencia de sustancias interferentes en la muestra, pueden influir en la unión de las hormonas tiroideas a las proteínas plasmáticas, y así disminuir la exactitud de un diagnóstico basado en las determinaciones de hormonas tiroideas totales y libres más que en las de TSH Estabilidad de la muestra TSH -T4L -T3L Refrigerada 2-8ºC: 7 días Congelado -20ºC: 1 mes (una sola vez) Calcitonina Suero. AYUNO. Libre de lipemia. Centrifugar, separar y congelar inmediatamente en tubo plástico estéril. Congelada -20ºC: 15 días Valor de referencia: Mujeres: No Detectable – 11.5 pg/mL Hombres: No Detectable – 18.2 pg/mL TPO – AC. Tiroglobulina Refrigerada 2-8ºC: 3 días Congelada -20ºC: 1 mes V.R < 34 UI/mL V-R <115 UI/mL Tiroglobulina Refrigerada 2-8ºC: 24 horas Congelada -20ºC: 2 meses V.R 3.5 -77 ng/mL TSH Intervalo de medición: 0.005 – 100 uUI/mL Valores >100 dil 1/10 >1000 uUI/mL V.R 0.27 – 4.20 uUI/mL Limite inferior de detección: 0.005 uUI/mL Sensibilidad funcional:0.014 uUI/mL No reacciones cruzadas con LH- FSH-hGH-hCG. Anticuerpos Anti Receptor TSH Suero. AYUNO. Libre de lipemia. Refrigerada 2 - 8 °C: 3 días Congelada -20ºC: 1 mes Que es lo normal ? TENER en cuenta……… TSH T3 Discordantes TSH T4 T3 Heparina Amiodarona Dopamina AinesFurosemida Medicamentos y condiciones Glucorticoides Dosis elevadas Anticonceptivos Anticonvulsivantes Hipoferritinemia Macro TSH INTERFERENTES VARIABLES ANALITICAS FACTORES ANALITICOS: • Alto nivel de variaciones estructurales de hormonas (HCG) • Amplia disponibilidad de diferentes IEs tipo sandwich que usan diferentes combinaciones de Acs. • Estandarización inadecuada, por el uso de estándares de referencia impuros. • Temperatura • Tiempo de incubación VARIABLES ANALITICAS Variables analíticas: La variabilidad biológica inter- e intraindividuales sugiere que las magnitudes de las diferencias entre dos resultados de ensayos tiroideos sean clínicamente significativas, cuando se evalúa la respuesta de un paciente al tratamiento. Diferencia entre controles y muestras: la matriz es diferente y puede haber alteración en las pruebas. VARIABLES POSANALITICAS Error de valores de referencia. Transcripción y validación de resultados. Interpretación de lo medido. Tiempo de respuesta. No reportados. Efectos de la edad cronológica sobre los rangos de referencia de los ensayos tiroideos NEONATOS – INFANTES – NIÑOS: El eje hipotálamo-hipófisis-tiroideo madura durante la infancia hasta el final de la pubertad. Las concentraciones de TSH y T4L son más altas en niños, especialmente en la primera semana de vida y durante el primer año. No reconocer esto podría provocar la pérdida del diagnóstico o el subtratamiento de casos de hipotiroidismo congénito. Deberían usarse valores de referencia ajustados por edad para todos los ensayos. ADULTOS: A pesar de que ciertos estudios muestran diferencias leves entre individuos jóvenes y de mayor edad, no es necesario desarrollar rangos de referencia ajustados por edad en adultos, para hormonas tiroideas ni para TSH. LIH: Rangos de referencia para TSH y T4L EDAD Rangos de TSH mUI/L µUI/ml Rangos de T4L ng/dL Rangos de T3L pg/mL Recién nacidos a termino 0- 3 días 5.17 – 14.6 0.66 - 2.71 1.97 - 7.87 4 - 30 días 0.43 – 16.1 0.83 – 3.09 1.96 - 5.24 2 - 12 meses 0.62 – 8.05 0.48 – 2.34 1.55 – 6.38 2 - 6 años 0.54 – 4.53 0.85 – 1.75 1.96 – 5.95 7 - 11 años 0.66 – 4.14 0.90 – 1.67 2.68 – 5.16 Adolecentes 12 - 19 años 0.53 – 3.59 0.93 - 1.6 2.28 – 5.01 Adultos Eutiroideos 0.27 – 4.2 0.93 – 1.7 2.0 – 4.4 Reference Range for Adults and children. Preanalitical Conditions ELECSYS® Thyroid Tests LIH: R.R para T4 Totales T3 Totales EDAD Rangos de T4 nmol/L Rangos de T3 nmol/L Recién nacidos a termino 1- 3 días 141- 270 1.54 – 11.4 1 - 4 semanas 105 - 214 1.4 – 4.6 1 - 12 meses 93 - 200 1.6 – 3.8 1 - 5 años 94 -193 1.6 – 4.1 5 - 10 años 82 - 171 1.4 – 3.7 Adolecentes 12 - 19 años 59 – 154 1.3 – 3.1 Adultos Eutiroideos 59 – 154 1.3 – 3.1 Reference Range for Adults and children. Preanalitical Conditions ELECSYS® Thyroid Tests Diagnóstico: Pruebas Tiroideas Hipotiroidismo T4 L T3 T-L Hipertiroidismo TSH Bajo TSH Alto Muy baja (<0.01 µIU/mL) HIPERTIROIDEO Medir T4 Libre T3 Libre Ligera Supresión TSH Normal TSH Borderline Estado Eutiroideo Medir T4 Libre T3 Libre No realizar màs pruebas Elevada TSH Hipotiroideo Sospecha Medir T4 Libre Hipotiroidismo Subclínico Hipotiroidismo TSH Alto T4 y T3 “Normales” Si sólo se modifica la TSH es subclínico Falla tiroidea leve o compensada Am Fam Physician. 2005 Oct 15;72(8):1517-24. Subclinical thyroid disease. Validación de métodos Objetivos específicos: 1. Verificar precisión y exactitud en las dos técnicas (diferencias?) 2. Error sistemático estadísticamente significativo? Concentraciones medicas importantes? 3. Verificar límite de detección 4. Verificar linearidad 5. Validar los valores poblacionales establecidos por el fabricante. Validación procedimiento Diseño de fase experimentales con el fin de: Verificar límite de detección Verificar linearidad Estimar imprecisión (%CV) bajo condiciones de repetibilidad. Estimar imprecisión (%CV) bajo condiciones de reproducibilidad Estimación de inexactitud o Sesgo entre los dos métodos (Comparación). Validación de métodos Materiales requeridos: Control de calidad interno (3ra opinión/independiente) Muestras de pacientes: con concentraciones que evalúen parte baja, media y alta de la curva de calibración. Mayor interés rango de decisión clínica. Calibradores o estándares de concentración conocida. CONTROL DE CALIDAD Todo estudio cuantitativo debe reunir una serie de requisitos que indican la confiabilidad de sus resultados y la posibilidad de practicarlo adecuadamente y bajo las condiciones que requieren el paciente , el médico y la normatividad legal. CONTROL DE CALIDAD INTERNO Tres niveles de control – bajo – medio – alto Procesar los controles como las muestras en todos los ensayos. Monitorear el desempeño de los métodos y la presición aplicando las curvas de LevyJennings y reglas de Westgard CONTROL DE CALIDAD EXTERNO Comprobación retrospectiva y objetiva de los resultados realizada por una organización externa. Establece comparación con otros laboratorios. Realización periódica. VERIFICAN EXACTITUD Tener en cuenta en CALIDAD • La reactividad cruzada se puede determinar efectuando distintas curvas con la sustancia en estudio y aquellas otras sospechosas de compartir propiedades antigénicas. • La falta de paralelismo de las curvas indica que las sustancias no son inmunológicamente similares. Para eliminar la inmunidad cruzada se debe disponer del anticuerpo con mayor afinidad por la molécula a medir. Recordar concepto ERROR TOTAL • Es el error máximo aceptable para una prueba sin invalidar su utilidad médica. • Es la sumatoria del error aleatorio (EA) mas el error sistemático (ES) ¿Qué es Seis Sigma? • Seis Sigma es una estrategia de mejora continua que busca identificar las causas de los errores, defectos y retrasos en los diferentes procesos, enfocándose en los aspectos que son críticos para el cliente. • La estrategia Seis Sigma se basa en métodos estadísticos rigurosos que emplean herramientas de calidad y análisis matemáticos, ya sea para diseñar productos y procesos o para mejorar los ya existentes. Seis sigma • Metodológicamente: Es una estrategia de mejora continua que busca encontrar y eliminar causas de errores o defectos en los procesos enfocándose en las variables de importancia crítica para los clientes. • Métricamente: Es una medida de la calidad. • Mientras más grande es el valor de sigma de un proceso, producto o servicio, su calidad es mejor • Seis sigma significa 3,4 defectos por millón de errores en un proceso. Seis sigma • Una de las principales diferencias entre la aplicación de sigmametría analítica y el control de calidad tradicional consiste en pasar de pensar los errores en términos de porcentaje (%), para pensarlos como defectos por millón de eventos u oportunidades (dpmo). • Un defecto seis sigma es definido como cualquier evento que lleve a un producto a que no cumpla con las especificaciones del cliente. Para nuestro caso en “calidad analítica” es un resultado que se encuentre por fuera del error total permitido. Métrica Seis Sigma • La letra griega “Sigma” (σ) es utilizada en estadística para denominar la desviación estándar (medida de dispersión de los datos respecto al valor medio). • Mientras más alto sea el “Sigma” es menor la desviación estándar, el proceso es mejor, más preciso y menos variable. Gráfica del cambio de un proceso con una calidad tres sigma a uno con calidad seis sigma MATRIZ DE CALIDAD ANALITICA 1 SATIS.= SATISFACTORIO EXCELE.= EXCELENTE MATRIZ DE CALIDAD ANALITICA 2 SATIS.= SATISFACTORIO EXCELE.= EXCELENTE Recomendación A pesar de los avances en los instrumentos de medición y las mejoras en la sensibilidad y especificidad de los ensayos actuales, todavía se observa variabilidad método a método y susceptibilidad a las interferencias. Integrar los aspectos técnicos de las pruebas bioquímicas con los criterios de comportamiento analítico necesarios para su óptima utilización clínica en un entorno global cada vez más sensible a los costos. Recomendación La importancia de la relación entre el laboratorio y los médicos. Actuar en forma conjunta y eficaz Informar introducción o cambio de método. Resultado discordante con la clínica del paciente Los laboratorios, a su vez, debemos definir, a partir de nuestros métodos, un perfil de eficiencia óptimo. Es importante solicitar a los fabricantes toda la información necesaria sobre sus productos para poder elegir el IE con el criterio más adecuado. Recomendaciones para la medición de hormonas La gestión de calidad en los laboratorios clínicos implica el control del proceso en su totalidad, incluyendo las fases preanalítica, analítica y postanalítica. La fase preanalítica corresponde a todos los pasos que se deben seguir en orden cronológico, partiendo desde la solicitud del examen por parte del clínico, preparación del paciente, toma de muestra, transporte hacia y dentro del laboratorio, y termina cuando se inicia el procedimiento analítico. La fase analítica involucra el análisis de la muestra o espécimen, realizado por personal competente. Fase posanalítica, la revisión del informe, la validación del resultado por parte del bacteriólogo correlación clínica debe interpretarse con los datos clínicos del paciente para la entrega al usuario y medico. Recordar Limitaciones en las Pruebas Tiroideas Diferencia entre controles y muestras: la matriz es diferente y puede haber alteración en las pruebas. Aspectos fisiológicos: Edad, Embarazo Medicamentos: glucocorticoides, dopamina, agonistas dopaminérgicos (cabergolina), amiodarona, colestiramina,estrógenos, tamoxifeno, etc. Tener en cuenta otros factores que afectan la determinación de hormonas tiroideas • En embarazo: evaluar cada trimestre en caso de hipotiroidismo. • Se deben reportar valores de referencia para cada trimestre. • OTROS FACTORES Medicamentos que disminuyen la TBG: Andrógenos, Danazol, Acido nicotínico. Medicamentos que aumentan la TBG: Estrógenos. TSH mUI/ L < 2.5 1er Trim <3 2do Trim <3 3er Trim RESUMEN La comunicación con el clínico es “Indispensable” SOLO HAY UNA OPORTUNIDAD PARA HACERLO BIEN Y A TIEMPO. Gracias.
