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MICROWELL ELISA
FOLLICLE-STIMULATING HORMONE
(FSH) ENZYME IMMUNOASSAYTEST KIT
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de la concentración de la
hormona folículo estimulante (FSH) en suero humano.
Uso
Para la determinación cuantitativa de la concentración de la hormona folículo
estimulante (FSH) en suero humano.
Introducción
La hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH) están
profundamente involucradas en el control del crecimiento y actividades reproductivas de
tejidos gonadales, los cuales sintetizan y segregan hormonas sexuales masculinas y
femeninas. Los niveles circulantes de FSH y LH son controlados por estas hormonas
sexuales a través de una relación de retroalimentación negativa.
La FSH es una glicoproteína secretada por las células basófilas de la pituitaria anterior.
La liberación de la hormona gonadotropina (GnRH), producida en el hipotálamo, controla
la liberación de FSH por la pituitaria anterior. Como otras glicoproteínas, como LH, TSH y
HCG, la FSH consiste en subunidades designadas como alfa y beta. Hormonas de este tipo
tienen subunidades alfa que son muy similares estructuralmente, por lo tanto las
propiedades biológicas e inmunológicas de cada una son dependientes de la única
subunidad beta.
En las mujeres, La FSH estimula el crecimiento y la maduración de los folículos
ováricos actuando directamente sobre los receptores localizados en las células granulosas;
la esteroidogénesis folicular se promueve y la producción de LH es estimulada. La LH
producida, luego, se une a las células Teca y estimula la esteroidogénesis. Un incremento
en la producción de estradiol intra-ovárico ocurre a medida que la maduración avanza,
luego estimula el aumento de la actividad del receptor de FSH y los sitios de unión de la
FSH folicular. La FSH, LH y estradiol están, por lo tanto, profundamente relacionadas en el
reclutamiento y maduración del ovario en la mujer.
Los niveles de FSH se elevan después de la menopausia, esterilización y en insuficiencia
ovárica prematura. Los niveles de FSH pueden ser normalizados a través de la
administración de estrógeno, el cual demuestra un mecanismo de retroalimentación
negativa. Relaciones anormales entre la FSH y la LH. Y entre la FSH y el estrógeno han
sido vinculados a anorexia nerviosa y síndrome poliquístico ovárico. Aunque hay
excepciones significativas, insuficiencia ovárica se indica cuando aleatoriamente las
concentraciones de FSH exceden los 40 mIU/ml.
El crecimiento de túbulos seminíferos y el mantenimiento de la espermatogénisis en
hombres son regulados por la FSH. Sin embargo, los andrógenos, a diferencia del
estrógeno, no reducen los niveles de FSH, por lo tanto se puede demostrar una reacción de
retroalimentación solamente con LH suero. Por razones conocidas a plenitud, hombres
azospermicos y oligospermicos usualmente presentan niveles elevados de FSH. Tumores en
los testículos generalmente merman las concentraciones de FSH en el suero. Niveles altos
de FSH en hombres pueden ser encontrados en insuficiencia testicular primaria y síndrome
de Klinefelter. Elevadas concentraciones también están presentes en casos de inanición,
insuficiencia renal, hipertiroidismo y cirrosis.
Principio de la Prueba
El kit de prueba cuantitativa FSH se basa en el principio de un ensayo
inmunoabsorbente enzimático unido a una fase solida. El sistema de análisis utiliza un
anticuerpo policlonal anti-FSH inmovilizado en la fase sólida (pozos de microtitulación) y
un anticuerpo monoclonal de ratón, anti-FSH en la solución de conjugado de anticuerpoenzima (peroxidasa de rábano picante). La muestra de prueba se le permite reaccionar
simultáneamente con los anticuerpos, dando como resultado que las moléculas de FSH
queden en sandwich entre la fase sólida y los anticuerpos enzimáticos unidos. Después de
60 minutos de incubación a temperatura ambiente, los pozos son lavados con agua para
retirar los anticuerpos no unidos. Una solución de TMB es añadida e incubada por 20
minutos, dando como resultado el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color es
detenido con la adición de HCL 2N, el color cambia a amarillo y es medido
espectrofotométricamente a 450 nm. La concentración de FSH es directamente
proporcional a la intensidad del color de la muestra.
Materiales y Componentes
Materiales Proporcionados con los Kits de Prueba
-
Pozos de microtitulación recubiertos de anticuerpos.
Set de estándares de referencia, que contienen: 0, 7.5, 25, 60, 120 y 240 mIU/ml
(WHO, 2nd IRP, HMG) FSH humano, líquido, listo para usar.
Conjugado enzimático, 12 ml.
Substrato (TMB), 12 ml.
Solución de parada.
Materiales Requeridos, pero no Proporcionados
-
Pipetas de precisión: 0.05, 0.1, 0.2 y 1.0 ml.
Puntas desechables para pipetas.
Agua destilada.
Mezclador vortex o su equivalente.
Papel absorbente o toallas de papel.
Lector de placas de microtitulación.
Papel milimetrado.
Lector de pozos de microtitulación.
Preparación de las Muestras
El suero debería ser obtenido de una muestra de sangre obtenida con técnicas médicas
aceptables. Este kit está destinado a ser usado solamente con muestras de suero sin aditivos.
Almacenamiento de los Kits de Prueba e Instrumentación
Los Kits de prueba no abiertos deberían ser almacenados a una temperatura de 2-8 °C y
de acuerdo a la fecha de recepción. La placa de microtitulación debería ser almacenada de
2-8 °C, en una bolsa sellada con desecantes, para disminuir la exposición a la humedad del
aire. Kits de prueba abiertos permanecerán estables hasta la fecha de expiración indicada
siempre y cuando sean almacenados como se indicó anteriormente. Un lector de placa de
microtitulación con un ancho de banda de 10nm o menos y un rango de densidad óptica de
0-2 o mayor a 450nm de longitud de onda es aceptable para ser usado en la medición de la
absorbancia.
Preparación de los Reactivos
Todos los reactivos deberían ser llevados a temperatura ambiente (18-22 °C) antes de su
uso.
Procedimiento de Análisis
1234-
Asegure el número deseado de pozos recubiertos en el mezclador.
Dispense 50 μl de estándares, muestras y controles en los pozos apropiados.
Dispense 100 μl de reactivo de conjugado enzimático en cada pozo.
Mezcle por 30 segundos. Es muy importante tener una mezcla completa en esta
etapa.
5- Incube a temperatura ambiente (18-22°C) por 60 minutos.
6- Retire la mezcla de incubación vaciando el contenido de la placa en un contenedor
de desperdicios.
7- Enjuague y vacíe los pozos de microtitulación 5 veces con agua del grifo o agua
destilada.
8- Agite los pozos sobre el papel absorbente o toallas de papel para retirar todas las
gotas residuales de agua.
9- Dispense 100 μl de solución de TMB en cada pozo. Mezcle suavemente por 5
segundos.
10- Incube a temperatura ambiente, en la oscuridad por 20 minutos.
11- Detenga la reacción añadiendo 100 μl de solución de parada en cada pozo.
12- Mezcle suavemente por 30 segundos. Es importante asegurarse de que el color azul
cambie completamente a amarillo.
13- Lea la densidad óptica a 450nm con un lector de microtitulación dentro de los
siguientes 30 minutos.
Nota Importante:
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente resultará en una precisión
pobre y lecturas de absorbancias falsamente elevadas.
Cálculo de los Resultados
Calcule el valor de la media de la absorbancia (A450) para cada grupo de estándar de
referencia de FSH, controles y muestras de los pacientes. Construya sobre papel
milimetrado una curva de calibración graficando la media de la absorbancia obtenida de
cada estándar de referencia contra su concentración en mIU/ml, con los valores de la
absorbancia en el eje vertical (Y) y las concentraciones en el eje vertical (X). Use los
valores de la media de la absorbancia de cada muestra para determinar la concentración
correspondiente de FSH en mIU/ml de la curva de calibración.
Ejemplo de Curva de Calibración
Resultados de corrida estándar típica con lectura de densidad óptica a 450nm reflejados
en el eje Y contra concentraciones de FSH reflejados en el eje X. Esta curva de calibración
es solamente para propósitos de ilustración y no debería ser usada para calcular incógnitas.
Cada usuario debería obtener sus propios datos y curva de calibración.
FSH (mIU/ml)
0
7.5
25
60
120
240
Absorbancia (450 nm)
0.007
0.095
0.286
0.669
1.307
2.584
Valores Esperados y Sensibilidad
Es importante que cada laboratorio establezca los límites de rangos normales. El
siguiente rango normal debería ser considerado solamente como una guía:
Folicular en mujeres
Ciclo medio
Lútea
5~20 mIU/ml
15~30 mIU/ml
5~20 mIU/ml
Post menopáusico
Masculino
40~200 mIU/ml
5~20 mIU/ml
Se estima que la concentración mínima detectable de FSH por este ensayo sea de 2.5
mIU/ml.
Referencias
1. Marshall J.C. Clinic in Endocrinol. Metab 1975; 4:545
2. Cohen K.L. Mtabolism 1977; 26:1165
3. Rebar R.W. , Erickson G.F. and Yen S.S.C. Fertil. Steril.1982; 37: 35
4. Abraham G.E.. Ed. Radioassay Systems in Clinic. Endocrinol. Marcel Dekker, Inc, New
York (1981)
5. Uotila M., Ruoslahti E and Engvall E.J.Immunol. Methods 1981; 42: 11
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ISO 13485-2003
Fecha de Revisión: 10/4/06