~EC :~R~ 1 ~:~NE: N EL B :I:U~~ GD

1991 . 8
OOD. No. 084786756
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DET!ERMINACION DE LOS NIVELES DE INTERLEUCIN.A 4 (IL · 4)
EN SOI;JRENAD,AJNTES DE CULTIVOS DE LINFOCITOS T Y EN!
SUEROS DE PACIENTES CON LEPRA LEPROM¡ATOSA.
TESIS PROFESIONAL
~
~~EC :~R~ ~:~NE:
1
NEL B
~~ P R E S E
N ~ W 'MARIA DEL ROSARIO
\~ úK¡ f/ GUADALAJARA, JAL.,
flll0:
\J'.. """\1! LR .
'\
~\)~
:I:U~~ GD~ ~
N
HUIZAR
T
A:
LOPEZ
1994
Expediente .................. .
UNIVERSIDAD DE GUADAI.AJARA
Número .................... .
lFaculítad de Ciencias Biológicas
Sección ..................... .
C. MARIA DEL IaiARIO Wl7AR IDPEZ
PRESENTE.-
Manifestarros a usted, que con esta fecha ha sido aprobado
el tema de tesis "DETERMINACIOO DE LCS NIVELES DE INTERLEUCINA 4 ( IL-4) EN
SOBRENADANTES DE OJLTIVOS DE LINFOCI'IOS T ACTIVAroS Y EN SUERCS DE PACIENTES
COO LEPRA LEPR:lMA'IOSA"
para obtener la Licenciatura en Biologia.
Al misrro tiempo le info:rmarros que ha sido aceptado caro
Director de dicha Tesis el M. en C. Alfonso Islas Rodriguez.
ATENTAMENTE
"PIENSA Y TRABAJA"
Las Agujas
1994
FACUlTAD DE
CIENCIAS BICI OGICAS
EL SECREI'ARIO
c.c.p.- M. en C. Alfonso Islas Rodriguez, Director de Tesis.-pte.
c.c.p.- El expediente del alumno
~~c.Ák\tiás,
Nextlpac, Zapopan, Jalisco, México.
Tel. celular 90 (3) 6n.79-36
~-.
¡_;;.
.,.
c.
Dr. Bulogio PiDlienta Barr±os.
Director de la Fa~ultad de Ciencia¿ B;ol6gicas
.de-la Universidad de Guadalajara
F;RES.¡::NTE.
Por medio de la presente, nos permitimos informar a
Usted, que habiendo revisado el trabajo de tesis que reali26 el
<la) -F'ase:.nte Ma,. Del Rosario Huizar Lónez
.
_____ _
e ti di qo nüme r· ;;--:o478""6'75b-=------:-i.P-;,-~:¡---:t-¡t-;;-1 o _pe~~~-~ÓD,_~~Ll.O S
1!1..1 veles
de ilfterTei:i'crñii--4-cTL:..4J en sobrenadan tes de cultivos de
~!_?=_Ei_~ó~c~~~~_::~a-~!-~!!.~~~--5C~~-=~~~!9~::~¡f.~~j)~~~~=~~~?- e on ~~-:r:a L_~2i.Qma tos'" .
quiE-
con'::;idL.'r'tültCJS
-de
le..
1T:1~;ma
p¿~;-a -la impresiO:-;
los e>:~~menes
~t-o-fe_sionc..les
los.; mt.:-r·it.os nect.:·SG:"lrios
r·E·Üne
y la
t·eali2<:1ción
de
r·espe;•ct i vos.
Comunic¿\mos
lo
ant<?r·_ior· pc•r·a
los fines a
qLit2
1 UCJBt'.
A T E N~ A ME N T E
Guadalajar·a,
Jal.
a
4 d~·
Enero
SINODALES
1 ... -~-~~~__Q_. __ Qa_rlo_s_.b..l.::m.r.e.z. .M.o~.
Nombt-e cDmpls-to
_______ --·
2. ___Q.E__.J}.._.Fa.sa_Ma.rla ..Pomi.lmgu.az..._.. Ar.ia.s_ ..
Nombt·r2 completo
:;. ___ P.r..• _:Cduardo _ Vazqu.ez -·- Valls
r.).J(i:tJ:-c.:
.:_-c.¡l¡p ~-
.:·t
c1
:>99
4
hay~.
Esta tesis fué realizada en el Instituto
Dermatologico de Guadalajara 1 Centro de
Investigación en Inmunolog1a y Dermatología.
DETERMINACION DE LOS NIVELES DE
INTERLEUCINA
4
(IL-4)
EN
SOBRENADANTES DE CULTIVOS DE
LINFOCITOS T Y EN SUEROS
DE
PACIENTES
CON
LEPRA
LEPROMATOSA.
DEDICATORIAS
A mis padres J. Jesús Huizar y Ma. del Pilar López
por sus palabras de aliento en los momentos más
díficiles. por su esfuerzo. confianza y apoyo
incondicional, espero no haberlos defraudado.
A todos mis hermanos por su apoyo que simpre me
han brindado.
A Dios por haberme dado la fortaleza necesaria para
lograr mi objetivo.
AGRADECIMIENTOS
Aqradezco muy especialmente a mi directo'\tiidk::t~-¡~
en C. Alfonso Enrique I~las Rodríguez por su
valioso apoyo y dedicación para la realización
de este trabajo.
M~
:j¡~::::L.~/:,_1:
Agradezco también a M. en C. Fernando Alfaro Bustamante
a la M. en C. Mary Fafutis Morris y a la Q.F.B. Cecilia
Magdalena Guillen Vargas, por su valiosa cooperación.
A todos y a cada uno de mis amigos del CIINDE que de
alguna manera contribuyeron a la elaboración de esta
tesis.
I ND I C E
Pag.
I.
INTRODUCCION
I.1
I.2
I.3
I.4
I.5
Epidemiolog1a de la Lepra
Agente causal
Aspectos cl1nicos
Respuesta inmune
La Lepra y la respuesta inmune
3
5
8
II.
JUSTIFICACION
9
III.
HIPOTESIS
10
IV.
OBJETIVO GENERAL
11
V.
OBJETIVOS PARTICULARES
12
VI.
MATERIAL Y METODOS
13
VII.
RESULTADOS
17
1
1
2
VIII. DISCUSION
19
IX.
21
BIBLIOGRAFIA
INTRODUCCION
-------------------------------------------------------------------
I.INTRODUCCION
I.I. Epidemiologia de la Lepra.
La
enfermedad de
causada por
total de
Hansen CLepra)
es una
Mycobacterium leprae. Se
enfermos con
Lepra
ha estimado que
en el
mundo
encontrandose la mayoría de los casos
(1,2). En Ame1·ica
Estados
piensa
solo
Unidos
se presenta
es de
que puedan existir entre
millones,
en pa1ses de Africa y Asia
excepto
50 y 100
registrados de
el numero
12
ésta enfermedad desde
hasta Argentina.
se encuentran
infección crónica
Chile.
el sur
de
En México
se
mil pacientes. aunque
15 a
20 mil.
Existen casos
reportados en todo el país. sin embargo predorrtinan 3 regiones con
un índice mayor de
occidental.
que
casos reportados: la principal es
comprende
Guerrero.
Guanajuato.
Querétaro,
Estado
peninsular incluye
por Nuevo
casos
prevalencia
Aguascalientes.
México
y
Jalisco.
Zacatecas.
Distrito
Yucatán y Campeche; y
León y Tamaulipas (3J.
primer lugar
(3193
de
Sinaloa. Nayarit,
la centro-
Federal.
Colima.
Durango.
La
región
la nQroriental formada
El estado de Jalisco
tiene el
en el país con el mas alto número absoluto de casos
registrados).
de 0 .. 48
x 1000.
En
1991
lo cuál
Jalisco
lo sitúa
presentó
en el
después de Sinaloa. Colima. Nayarit y Guanajuato (4).
una
5o lugar
En general
se considera al pais como de mediana endemia. con una prevalencia
de menos de 0.5 x 1000 (3).
1
-------------------------------
La
Lepra se
presenta en
especialmente en
regiones tropicales
-
y semitropicales.
paises subdesarrollados. aunque
la prevalencia
de la enfermedad varia marcadamente de un pa1s a otro 151.
La enfermedad se expresa predominantemente en humanos.
se
ha
observado la
infección
natural
en armadillos
pero
salvajes
(Dasypus novemcinctus). Casos espontaneos de Lepra también se han
descrito
en
dos
monos
mangabey
(Cercocebus
a tys)
además .
experimentalmente se ha transmitido a monos rhesus <1.6,7).
I.2. Agente causal.
Mycobacterium
Leprae:
parásito obligado
mononucleares.
{35 Cl
bacilo
tiene
cojinetes
mucosas
alcohol
se
y
acido-resistente,
multiplica en
células
de
que
cultivarse
plantares
de
cultivar la bacteria
in
ratones
vivo
y
en
en
~
leprae
in vitro.
tejidos
armadillos
Tiene
de los 37'C
mayor impedimento para el estudio de
incapacidad de
fagocitos
Schwann.
temperaturas ligeramente por debajo
(1.81. El
radica en la
un bacilo
intracelular que
piel.
preferencia por
es
de
El
ratas.
infectados
experimentalmente. También crece en nódulos de la piel de humanos
con la enfermedad (1.81.
Se clasifica como micobacteria
en base a los con¡tituyentes
de su pared celular. como son: ácido micólico, arabinogalactano y
glicolipido fenólico.
Posee
micobacterias como
de
propias
características
L-alanina
sustitución
peptidoglicano
puede estar
a
la
la
peptidoglicano
de su
asociada con
desecación).
arabinogalactanmicólico.
otras
glicina en lugar
pared
celular. esta
la patogenicidad
Unido
encuentra
se
de
distinguen
la presencia del aminoácido
en el
resistencia
que
<por su
covalentemente
complejo
el
al
acido
el cual constituye el 70% de la masa de
la pared celular 111. La molécula glucolipidica mas notable de la
pared celular de
que
~
leprae es el glucolipidico fenólico
ha resultado ser un
familia
es
altamente
la
buen inmunogeno. Otra
lipoarabinomanana
inmunogénica.
y
por
B
lo
(LAM-BJ.
tanto
(PGL-IJ.
molécula de ésta
que
también
provoca
una
es
fuerte
respuesta de anticuerpos humorales.
!.3. Aspectos clínicos.
La
Lepra
periféricos
afecta
predominantemente
y mucosas. La trasmisión
la
piel.
es de persona
nervios
a persona y
hay evidencias de que puede ocurrir por inhalación y depósito del
bacilo dentro de
la mucosa nasal
intacta o a través
de heridas
producidas por picaduras y mordeduras de artrópodos (1).
Las manifestaciones
respuesta
normalmente
inmune
se cura
del
de la
Lepra estan relacionadas
individuo:
espontáneamente,
la
Lepra
y sólo
indeterminada
en algunos
progresa hacía unos de los polos extremos de la enfermedad:
3
con la
casos
la Lepra Tuberculoide (LTl o Lepra Lepromatosa (LLJ
En la
Celular
LT,
(RICJ.
detectables en
los pacientes
hay
pocos
se
anticuerpos
los
En la LL
encuentra
suprimida.
circulando
y
secreciones (1.8,9).
leprae
bacilos
gran
Debido a
anticuerpos
de
los
ácido-resistentes
cuales producen pocos
La RICa los
poseen
de
t:itulos
bacilos
la naturaleza intracelular
no
son
importantes
de
sus
en
de~
en
la
pero participan en la patogén.esis
las reacciones del eritema nodoso leproso (1).
con Lepra
de~
antígenos
altos
cantidad
humorales
resistencia a la micobacteria,
Respuesta Inmune
alcohol
tejidos y secreciones.
anticuerpos circulantes.
leprae
tienen una buena
(9).
tienden a desarrollar distintas
reactivos", que se caracterizan por
Los pacientes
reacciones o "Estados
una respuesta de su
sistema
inmune que curiosamente. perjudica a sus propios tejidos. Existen
basicamente 2 tipos: l.
con LT. se
reacción reversa que afecta
caracteriza por edemas y eritemas
a pacientes
preexistentes, las
manifestaciones cutáneas son alarmantes. pero es raro que generen
lesiones
permanentes.
perjudicadas
reacción es
las fibras
una
de
las
en
cambio
pueden
nerviosas,
por lo
principales causas
deformidad en el paciente con Lepra.
quedar
que
de
gravemente
esta clase
incapacidad
de
y
2.
eritema nodoso
leproso.
se presenta
debido a una combinacion de antígenos de
en
~
pacientes con
LL,
leprae y anticuerpos,
formando inmunocomplejos provocando dahos a sus
propios tejidos,
produciendo nódulos con dolor continuo sobre la piel de brazos,
piernas,
tronco y cara, además de fiebre, pérdida de peso. dolor
en articulaciones. pudiendo afectar ojos, mucosa nasal y producir
complicaciones renales (1,2).
!.4. Respuesta inmune.
En condiciones normales las células accesot·ias (macrofagos o
monocitos)
factor
producen interleucina
activador de
interleucina
IL-2
1
linfocitos,
CIL-21
antígenos especlficos in
en
fitohemaglutinina (PHAJ y la
cofactor de
las
vivo o
(IL-ll antes
células
in vitro por
T
conocida como
la producción
de
estimuladas
por
lectinas como
concanaval ina (Con Al
<10).
mediada por los linfocitos
T. requieren de la interacción
IL-2 con
su adecuada proliferación.
su receptor para
Coffman. desde 1986. reportaron
tipos de células T
la
La RIC
de la
Mossman y
en lineas celulares murinas, dos
cooperadoras CD4+ basándose principalmente en
el tipo de linfocinas secretadas. Estos subconjuntos de células T
CD4+ murinas clonadas y no clonadas se denominaron THl y TH2.
La primera característica encontrada
su
en las células CD4+TH2. fué
especial producción de IL-4 y su cooperación con linfocitos B
para la sintesis de anticuerpos.
5
Posteriormente se encontró
que producian también interleucina
5
CIL-51. interleucina 6 CIL-61 e interleucina 10 (IL-101, mientras
que la subpoblacion CD4+TH1 se caracterizaba por
IFN-gamma
y
su
inflamatoria.
función
la
se
correlacionaba
cooperación a
hipersensibilidad
retardada.
fenómenos
patógenos intraceluJares
una
cruzada
regulación
entre
estas
con
la
como la
pal'a
requeridos
efectiva contra
producir IL-2 e
lisis
una
111). Se
dos
respuesta
y la
inmunidad
ha observado
subpoblaciones:
las
células TH2 por medio de la IL-10 y probablemente la IL-4 inhiben
la proliferación de
IFN-gamma
una
células THl. las que a su
inhiben la proliferación de TH2 (12,
glicoproteina de 15.5
asesinas
naturales tNKl
como
factor de
un
celulas
T. además
puede activar
KD producida
y
crecimiento
induce la
proliferación de
y
producción de IL-4
col.
(14l.
La
IL-4 fue
Los
actúa
diferenciación autocrino
células B
genes
descrita
que
de
y NK.
(12). La Respuesta
interleucina 4 (IL-4) con su
adecuada proliferación.
Paul
y
La IL-2 es
granulares (LGLsJ.
cRIH), mediada por los linfocitos
la interacción de la
William
linfocitos
13).
por células IT. células
macrófagos y oligodendrocitos
Inmune Humoral
su
vez por medio del
B requieren de
receptor para
en 1982
codifican para
junto con varias citocinas como
por
la
la IL-3 y la
IL-5 se encuentran en el cromosoma humano número 5 (10, 12. 13 ).
6
Al principio fué llamada factor estimulador de células B (BSF-1) o
Se
trata de una glicoproteina de
por
células
TH2
20 KD producida principalmente
algunos
y
mastocitos.
descubierta como un coestimulador
B
tratadas
con
anticuerpos
fué
inicialmente
en la proliferación de células
anti
IgM.
juega
un
papel
muy
importante en
la· producción de Inmunoglobulinas especialmente el
isotipo IgG 1
y
en
tiempo suprime
murinas
13. 15)
mayores concentraciones
la IgM
y algunos isotipos
la IgEo
de IgG en
células B
(12.
o
estudios con células B
humanas se ha
IL-4 es un regulador critico en la
en combinación con esteres de
encontrado que la
producción de IgE y de IgG. y
forbol o anticuerpos CD40
la producción específica de IgG4
linea hematopoyética; actúa de
en macrófagos estimula
II
del
complejo
similares en células Bl.
macrófagos de
inducen
así como de la IgE (13) o Además
la IL-4 regula la función de otros tipos de células
en
mismo
estimuladas con lipopolisacáridos bacterianos (LPS)
En
clase
Al
dentro de la
manera autócrina sobre células T.
la expresión
mayor
de
de CD23 y
antígenos de
la
histocompatibilidad (efectos
induce la estimulación de citotoxicidad
médula ósea
y suprime
la producción
de IL-1
estimulados por LPS.
Se
ha demostrado
su actividad
sobre granulocitos,
preculsores de eritrocitos y megacariocitos (12. 13) o
7
mastocitos.
La IL-4 también
inhibe la produccie>n de
mononucoleares humanos o
citocina
en la
antimicrobiana
esto implica un papel
regulación
de la
(16) o El receptor
distintos tipos
superóxido en fagocitos
importante de esta
respuesta antiinflamatoria
d~
y
IL-4 (140 KDJ se presenta en
B (200 a
celulares, incluyendo células
500 por
celula), T y otras líneas de células hematopoyeticas o 1
I.5. La Lepra y la Respuesta Inmune.
La
mayor1a de las personas resisten la infección a
~
leprae
aún en areas altamente endémicas. se piensa que de 200 individuos
que llegan a infectarse solo un caso se desarrolla y
detecta.
Como se ha mencionado anteriormente los pacientes con LL muestran
un estado
de depresión en
su RIC
responder a
los antígenos de
por
grupo
nuestr~
efectivamente
y
por otros
a
la
son incapaces
de
leprae. En_ estudios publicados
autores
en dichos pacientes
se ha
demostrado
que
se encuentran concentraciones
T cooperadores y un
disminuídas de linfocitos
linfocitos
~
por lo que
incremento en los
T supresores 117, 181 y que este transtorno es debido
subproducción de
IL-2
que causa
que
las
células T
no
proliferen adecuadamente (19) o
Se
cultivos
capacidad
que
las
ha
demostrado que
al
adicionar
IL-2
exógena
a
los
de linfocitos T de pacientes con LL. estos recuperan la
de proliferación.
células
T de
los
aclarandose con
pacientes
LL
estos experimentos
no producen
niveles
suficientes de IL-2 pero si poseen receptores para IL-2 119, 20).
8
JUSTIFICACION
r
'.
II. JUSTIFICACION
Debido
a que los pacientes LL
cursan con ínmunodefícíencia. que
incluye la baja
proliferación de sus linfocitos T ante estimules
antigénicos
mitogénicos.
producción
y
de
IFN-gamma
concentración
de
subpoblaciones
baja
producción
( 21 l
asi
como
anticuerpos
(1)
se puede
THl y TH2
de
una
participan de manera
IL-2.
baja
relativa
alta
pensar
que
las
importante en la
patogenia de la LL. La subpoblacíón THl estar1a produciendo bajos
niveles
de
propiciando
IL-2
e
IFN-gamma
que los
y
linfocitos B
la
subpoblacion
TH2 estaría
produjeran altos
niveles de
anticuerpos observados en la LL.
En
este
trabajo
se
determinaran
sobrenadantes de cultivos de linfocitos
los
niveles
de
IL-4
en
T activados asi como
en
el suero. provenientes de pacientes LL. para deducir en
principi~
sí la pn:lpuesta arriba descrita basada en el esquema de Mosmann y
Coffman es correcta para la lepra.
9
HIPOTESIS
III. HIPOTESIS
Los pacientes
con Lepra
Lepromatosa poseen niveles
IL-4 producidos por la subpoblación de linfocitos TH2.
10
elevados de
OBJETIVOS
IV. OBJETIVO GENERAL
Determinar los niveles de
linfocitos T activados asi
IL-4 en sobrenadantes de cultivos
de
como en suero de pacientes 1 con Lepra
Lepromatosa.
11
V. OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Determinar
efecto
los niveles
de IL-4
tienen relación
causa-
en el eritema nodoso leproso.
2.- Analizar
causa de
si
preliminarmente
si
una posible desregulación
TH2.
12
los niveles
de IL-4
de las subpoblaciones
son
la
THl y
MATERIAL Y METODOS
VI. MATERIAL Y METODOS
SUJETOS DE ESTUDIO
Se
formaron tres grupos de
pacientes
con Lepra
clasificación
de
estudio. El primero
Lepromatosa.
Ridley
y
consistió en 25
diagnosticados en
Jopling
(9J
base a
el
en
la
Instituto
Dermatológico de Guadalajara. a 8 de ellos se les realizó cultivo
de linfocitos y al resto se les obtuvo suero.
El segundo
grupo consistió
en
6 individuos
sanos sin
relación con el paciente. apareados en sexo y edad (± 5
El tercer
grupo lo formaron 4
ninguna
a~os).
individuos contactos (familiares)
de pacientes LL.
OBTENCION DE CELULAS MONONUCLEARES
La sangre periférica heparinizada (20
UI/mll fué obtenida de los
sujetos por punción venosa. La sangre se separó por gradientes de
densidad según la técnica de
Se
separó el anillo rico
con
solución
resuspendieron
Co. ,St
Boyum <22l en Lymphoprep (Nycomed).
en células mononucleares
salina
balanceada
en medio
de cultivo
Louis MOl
suplementado con
de
Hank's
RPMI 1640
suero fetal
y se lavaron
<HBSSl.
se
(Sigma Chemical,
de
ternera 10%
inactivado. glutamina 2 mM. 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de
estreptomicina. Se ajustaron las células a una concentración de
2 X 1~
células/m!
(20).
13
ENSAYO DE LINFOPROLIFERACION
Se colocaro-n 2 x 10 5 celulas
de 96 pozos
y se les adicionó por sextuplicado:
suplementado (no
(PHAl
·e
en
en cada pozo de una caja de cultivo
estimuladas!. 10
ug/ml
de
medio RPMI 1640
fitoheJaglutinina
(estimuladas). se dejaron incubar las células
una atmosfera
humeda con 95% de
término de este
tiempo se obtuvo
cada
los
condición.
análisis.
y
cuales
adicionó a los pozos
co 2
5% de
el sobrenadante de 3
se congelaron
como indicador
y
aire
48 hrs. a 37
de
a
-20
·e
Al
pozos de
hasta
actividad mitogénica
restantes un pulso de timidina
.
su
se les
tritiada (1
uCi) y a las 24 hrs. se cosecharon para medir la incorporación de
timidina
tritiada en
un
contador de
centelleo beta
(PackardJ
( 20).
OBTENCION DE SUERO
La sangre periférica obtenida por puncion venosa. se centrifugó a
1 500 RPM durante 15 min .. se obtuvo el suero y se congeló
a -20'C hasta su análisis.
CUANTIFICACION DE IL-4 POR ELISA
La placa
se
de ELISA (Inter
test-4tm Human IL-4
ELISA kit GenzymeJ
cubrió con 100 ul de anticuerpo monoclonal anti-IL-4 humana a
4'C por 96 hrs.
14
para
constituir la fase
fosfatos
se
asi
sólida. se lavó
con buffer de
CPBSl tween 20 al 1% y Albumina pH 6.75. posteriormente
colocaron por duplicado 100
como los
finalidad
sueros
ul de
humana
en
hecho
se
(anticuerpo
policlonal
la
ambiente.
enseguida 100
ambiente,
de los
de capturar
temperatura
ul de
se
la
conejo.
incubándose
anti-IL-4)
con
anti-IL-4
se
(reactivo
amplificador)
ambiente.
se lavó
con
conjugada con
a
temperatura
Los complejos
de
100
enseguida se
min.
cromogeno ortofenilendiamina
antibiotina
temperatura
coloco
peroxidasa durante
marcado con biotina.
a
100 ul
40 min.
se lavo y
(OPDl, para el
color, esperando lO min. aprox., enseguida se detuvo
15
que se
hidrógeno
desarrollo de
la reacción
agregando a cada pozo 100 u! de H2sq 1M . Posteriormente se
en un lector de ELISA (Behring) a 492 nm (14).
de
por último se
colocaron 100 ul del sustrato que contiene peróxido de
y el
inmunes
anticuerpo
humana
con
45
a
adicionó
en cabra. marcada con
incubandose
PBS.
PBS se
hrs.
-IL-4
incubaron
hrs.
policlonal anti-IL-4
2
PBS.
con la
incubó 2
con
placa
un segundo anticuerpo
lavó nuevamente
al complejo
y controles.
IL-4 presente.
se lavó
monoclonal
streptavidina
sobrenadante de cultivos
pacientes LL
inmunoglobulina G de conejo hecha
unió
3 veces
leyó
CURVA ESTANDAR DE IL-4
Para determinar la
concentración de IL-4 en los sobrenadantes de
los cultivos y sueros. sus lecturas de
absorbancia se compararon
con las obtenidas en una curva estándar. que se realizó
utilizando
concentraciones
seriadas de 3 a 0.045 ng/ml
conocidas
IL-4.
por
diluciones
<14).
Los resultados fueron evaluados estadisticamente por la prueba
T
de Student con el objeto de determinar diferencias significativas
entre los diferentes grupos.
16
RESULTADOS
VII. RESULTADOS
En la
tabla 1-A se puede
niveles de
IL-4
activados
de
observar que los promedios
en sobrenadantes
sujetos sanos.
no
de cultivos
(X) de los
de linfocitos
fueron significativamente
T
mas
elevados
{X= 0.30±0.044 ng/mlJ
que los promedios de los niveles
de
de los
de
IL-4
incubados
sobrenadantes
midieron
solamente {X=
con medio
manera semejante.
la
tabla '1
los niveles
de
linfocitos activados
presente
en
medio. no
ng/ml
los
VS
X=
en sobrenadantes
LL
sobrenadantes de
de
cultivos
de
(X=
. Por último.
cultivos
0.34±0.039
de
cultivos de linfocitos con
una
se
de cultivos
de
con la IL-4
de linfocitos
X=
con
0.36±0.013
la IL-4 presente en
linfocitos
ng/mll
pero
que cuando
de sujetos contactos comparado
0.34±0.008 ng/ml
. De
0.21±0.058 ng/ml)
significativamente diferentes;
sobrenadantes
pacientes
IL~4
mismos linfocitos
-B muestra también
los sobrenadantes
fueron
los
activados
comparados
con
medio solamente
de
los
(X=
0.29±0.040 ng/ml) no hubo diferencias significativas (Tabla 1-Cl.
Cuando se analizaron los niveles promedio de IL-4 en el
suero de
pacientes LL (0.30±0.015 ng/mll comparados con los niveles de IL-
4
presente en el suero de sujetos normales (0.37±0.010 ng/ml) no
se observó diferencia significativa.
En la tabla 3 se puede
de
Student
no
reveló
(Tabla 2).
observar que el analisis estadístico de t
diferencias
significativas
compararon los promedios de los niveles de IL-4 en los
17
cuando
se
sobrenadantes
de linfocitos
T
activados y
no activados
entre
todos los grupos arriba mencionados. excepto cuando se compararon
los
promedios de
cultivos
0.058
los niveles 'de IL-4
de linfocitos no
en los
activados de sujetos
sobrenadantes de
sanos (¡•0.21 ±
ng/mll comparados con los niveles de IL-4 de linfocitos no
activados de contactos (X=0.34 ± 0.008 ng/mll.
En la Fig. 1 se muestran los resultados (mencionados arriba en la
tabla 1) en
sobrenadantes
barras comparando
de
cultivos
la concentración de
de
linfocitos
activados de los diferentes grupos de estudio.
18
T
IL-4 en
activados
los
y
no
TABLA 1. DETERMINACION DE LOS NIVELES DE IL·4 EN SOBRENADANTES DE
CULTIVOS DE liNFOCITOS TDE SUJETOS SANOS, CONTACTOS Yll.
e
A CLIN SANOS 1 CONT
MEDIO
( ng/m!)
s1 < 0.045±0
s2 < 0.045±0
0.29 ±0.005
s3
s4
0.28 ±0.010
s5
0.31 ±0.005
ss
0.33 ±0.020
X1
SUJIETOS CON LL
MEDIO ( ng/ml)
PHA
0.070 ±0.015
0.31 ±0.015
0.42 ±0.010
0.32 ±0.020
0.32 ±0.000
0.34 ±0.005
0.21 ±0.058 0.30
±0.044
PHA
E1 < 0.045 ±O
E2
0.31 ±0.020
E3
0.31 ±0.005
E4
0.33 ±0.010
E5
0.35 ±0.015
ES
0.32 ±0.010
E7
0.35 ±0.0~0
ES
0.38±0.020
0.07
0.30
0.48
0.35
0.35
0.37
0.38
0.38
X3
0.34 ±0.03
±0.02;
±0.01
±0.01
±0.03
±0.00
±0.03
±0.02
±0.01
p N.S.
B
c1
c2
c3
c4
-
X2
0.34
0.34
0.37
0.32
±0.040
±0.015
±0.005
±0.025
0.32
0.36
0.39
0.38
±0.040
±0.015
±0.010
±0.005
0.34 ±0.008
o. 36
±O.ow N.S.
0.29 ±0.040
p N.S.
TABlA 2.
!DETERM~NAC~ON
DE lOS NIVELES
DE ~L-4 EN SUERO DE PACIENTES l l
NORMALES
PACIENTES
{ng/m~)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.37±0.003
0.40±0.01 o
0.37±0.020
0.28±0.015
0.28±0.000
0.40±0.005
0.30±0.015
0.22±0.025
0.30 ± 0.01 o
1o
11
12
13
14
15
16
17
0.22±0.025
0.30±0.01 o
0.24±0.025
0.26±0.01 o
0.27±0.005
0.41 ±0.01 o
0.28±0.005
0.24±0.075
1 0.35±0.030
2 0.38±0.015
X= 0.37±0.01 o
p
X= 0.30±0.015
N.S.
TABLA 3. ANAUSIS ESTADISTICO ENTRE LOS DIFERENTES
GRUPOS, DE LOS NIVELES DE ll-4 (ng/ml) EN LOS
SOBRENADANTES DE LOS CULTIVOS DE LINFOCITOS T
ACTIVADOS Y NO ACTIVADOS.
NO ACTIVADOS
SANOS X= 0.21
vs
PAC.
X= 0.29
p N.S.
SANOS
X= 0.21
vs
CON.
X= 0.34
p <0.05
CON.
X= 0.34
vs
PAC.
X=0.29
p N. S.
SANOS X= 0.30
vs
PAC. X = 0.34
p N. S.
SANOS X= 0.30
vs
CON. X= 0.36
p N.S.
CON.
VS
PAC. X 0.34
ACTIVADOS
X= 0.36
=
p N. S.
w
e
z
o
0 ~o.2
e(-.
a:: e»
¡¡... e
;NO ACTIVADOS
z-
IEJACTIVADOS CON PHA
w
o
z
o
o
0.1
p NO SIG
o~~~~~~~~~
SANOS
LL
CONTACTOS
FIG 1. CONCENTRACION DE IL-4 EN SOBRENADANTES DE
CULTIVOS DE liNFOCITOS T.
DISCUSION
VIII. DISCUSION
La
intención
principio,
de
obtener
realizar
datos
que
este
apoyaran la
subpoblaciones THl y TH2 en pacientes
Bloom
(Salgame y
este sentido
estudio.
Yamamura) habían
fué
existencia
desde
el
de
las
LL. Desde 1991 el grupo de
publicado sus
apoyando con sus datos Cque
resultados en
mostraban elevación de
la IL-4) la existencia de las dos subpoblaciones mencionadas. sin
embargo
ellos trabajaron con clonas y lineas de linfocitos T así
como con biopsias de las lesiones de pacientes con LL
En este
estudio se
utilizaron linfocitos de
mas accesibles para nosotros.
sino
que resulta
sangre periférica.
Por otro lado consideramos que
investigacion no se debe limitar a
otro.
( 23. 24).
la
un compartimiento biologico u
de interes
estudiar
y saber
que esta
pasando con los linfocitos de sangre periférica y así lo hicimos.
No
obstante
que los
datos
reportados
aqui son
preliminares.
podemos observar que la funcionalidad de las células THl y TH2 de
sangre
periférica
de
pacientes
cuestionada. Los resultados
con
lepra
indican que los
los sobrenadantes de cultivos de células T
pacientes LL
altos
no .fueron
como se esperaba
(Tabla 1, 3). Lo mismo sucedió
el suero de los
niveles de IL-4
está
en
activadas aislados de
significativamente más
cuando se midió la IL-4 en
mismos pacientes (Tabla 2).
19
lepromatosa
Por
supuesto hay que aumentar la muestra. pero si los resultados
se confirman,
se podr1an
invocar otros mecanismos
de supresión
diferentes a los sugeridos por Mosmann y Coffman (11)
el
propuesto recientemente por
que no debe
CDB+.
aún descartarse
Ottenhoff (251 en
la posibilidad de
~
tales como
el sentido de
que las
células
puedan ejercer supresión. ya que en ese trabajo se reporta
que por medio del anticuerpo anti IL-4. no fue posible inhibir la
actividad de clonas T supresoras.
aisladas de pacientes LL. Para
resolver esta pregunta son necesarios más estudios.
20
BIBLIOGRAFIA
IX. BIBLIOGRAFIA
1.- Hastings. R.C .. Gil lis. T.P .. Krahenbuhl. J.L. and
Franzblau, S.G. Leprosy. Clin. Microbiology Reviews I
330-348.
(1988)
2.- Me Dougall A.C. y Yawalkar S.J .. La lepra información básica
y tratamiento. Edit. CIBA-GEIGY. (1989) 42-60.
3.- Saul. A. Lecciones de Dermatología. Cap. II. Edit. F. Méndez
Cervantes (1986J 321 y 322.
4.- Manual de procedimientos operativos para el control de la
Lepra. Dirección general de medicina preventiva. Secretaria
de Salud. México. D.F. (1991J.
5.- Braude A.F. Enfermedades Infecciosas. Edit. Médica
Panamericana. Argentina. Buenos Aires (1988) 650-661.
6.- Walsh. G.P., Storrs. E.E .. and Burchfield. H.P. Leprosy like
disease ocurring naturaly in armadillos. Res. J.
Reticuloendothel. Soc. 18 (1985) 347-351.
7.- Walsh. G .. Meyers. W. and Binford C. Naturallyacquired
leprosy in the nine-babded armadillo: a decade of experience.
J. Leprosy Biol. 40 (1986) 645-656.
8.- Clark-Curtiss. J.E. Benefits of recombinan DNa technology for
the study of Mycobaterium leprae. Curr. Top. Microbio!.
Immunol. 138 (1988) 61-79.
9.-
Ridley. D.S. and Jopling. W.H. Classification of leprosy
according to immunity a five-group system. Int.
Lepr. 34 (19661 255-273.
10.- Meager. A. Cytokines Edit. Open Vniversity Press. Cap. 1
Great britain (1990J 115-125.
21
11
- Mosmann. T. R .. Cherwinski. M. W.. G1edlin M. A. and
Coffman R. L. Two types of murine t cell clone. I.
Definition according to profiles of cytokine activities and
secreted proteins. J. Immunol. 136 (1986) 2348.
12.- Male. D. Champión. B. Cooke A. Owen M. Advanced Immunology,
Edit. Gower Medica! Publishinq Ltd. Cap. 1 Citokines.
England (1991). 11.5-11.7.
13.- Isakson. P. Advances in Neuroimmunology. Vol. 2 Interleukin4 Edit. Pergamon press Ltd. Great Britain 11992) 55-65.
14.- Human IL-4 ELISA Test Kit. InterTest-4. Genzyme Corporation.
catalog number IT-4. f199ll 1-27.
15.- Hu-Li. J. Shevach E. M. B cell stimulatory factOl- 1
finterleukin-4) is a potent costimulant for normal resting T
limphocytes. J. Exp. Med. 165 (19871 157-172.
16.- Stuart L. A. and Galin.J. I. IL-4 inhibits superoxide
p1·octuct ion by human m•:>n-:>nuc l ear phagocytes. J. Immono 1. 144
(1990) 625-630.
17.- Bloom. B.R. and Mehra. V. Immunological unresponsiveness in
1eprosy. Immuno 1. Rev. 80 ( 1984 ¡ 5-28.
18.- Castellanos. C .. Islas. A. E .. González. A .. Zambrano. S.
and Ortiz-Ortiz. L. Lepromatous leprosy: Study of sorne
subpopulation of lymphocytes and its functional analysis.
Arch. Invest. Méd. (Méx.) 16 11985) 217-224.
19.- Islas. R.A .. Morales. O. R ..
and Ortiz. O. L. Deficiency
interleukin-2 and functional
in lepromatous leprosy. Int.
Fafutis M. M.. González M A ..
in the biosynthesis of
presence of the IL-2 receptor
J. Lepr. 55 (1987) 566-569.
20.- Fafutis, M.M., Mejia, S. A., González M. A. Detection of
interleukin-2 Receptor (!L-2R) by indirect
immunoflorescence with Anti- Tac monoclonal antibody on the
surface of T limphocytes from patients with lepromatous
leprosy. Int. J. Lepr. 58 (1990) 126-128.
21.- Nogueira. N .. Kaplan. G .. Levy. E .. Sarno. E.N .. Kushner.
P., Granelli-Piperno. A .. Vierira, L. Colomer Gould. V .•
Levis. W.. Steinman. R .. Yip. Y.K. and Cohn. Z.A. Detective
gamma-interferon production in leprosy; reversa! with
antigen and interleukin 2. J. Med. 158 (1983) 2165-2170.
22.- Boyum. A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes
from human blood. S Cand. J. Clin Lab. Invest. 21 Suppl. 197
(1988) 77-85.
23.- Yamamura. M.. Uyemu1·a.K. Deans. R.J ... Weinberg, K,, Rea,
T.H. Bloom. B.R.
and R.L. Modlin. R.L.
Defining protective
responses to pathogens: cytokine profiles in leprosy
lesions. Science. 254 (1991l 277-279.
24.- Salgame. P .. Abrams, J.S .. Clayberger, C .. Goldstein H ..
Convit, J. Robert L., Modlin, Bloom. B. R. Differ~ng
lymphokine profiles of f~nctional subsets of human CD4 and
CD8 T cell clones. Science. 254 (1991) 279-281
25.- Mutis. T., Kraakman. E .. Cornelisse Y., Haanen J. B., Spits
H .. De Vries R.R .. and Ottenhoff T. M. Analysis of cytokine
production by Mycobacterium-reactive T cells. J. Immunol.
150 (1993) 4641-4651.
23