DIAGNOSTICO DE PSEUDOMONAS SYRINGAE PV.

Instructivo Tecnlco para el muestreo y dlaqnosttco de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
C6digo: D-PD-PE-OOS
INSTRUCTIVO TECNICO PARA El MUESTREO Y
DIAGNOSTICO DE PSEUDOMONAS SYRINGAE PV.
ACTINIDIAE (PSA) EN El MARCO DEL CONTROL
OfICIAl DE lA PlAGA EN KIWI
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Instructivo Tecnlco para el muestreo y diaqnosfico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
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verston.oz
TABLA DE CONTENIDOS
CONTENIDO
PA.GINA
1
OBJETIVOS y ALCANCE
4
2
REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS
4
3
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
5
4
REQUISITOS PARA LA AUTORIZACION
6
4.1
Requisitos de personal de laboratorio
6
4.2
Requisitos del personal para muestreo
7
4.2.1 Equipo de Muestreo:
7
4.3
Requisitos de infraestructura, equlpos, materiales y reactivos
8
4.4
Requisitos Especificos
12
4.5 Medios de verlflcaclon de requisites
5
12
ANAuSIS/ENSAYO
5.1
13
Condiciones previas para el muestreo
13
5.1.1 Condiciones previas para muestreo de plantas madres
13
5.1.2 Condiciones previas para el muestreo de huertos
14
5.1.3 Incorporaclon del laboratorio autorizado como usuario del Sistema de
de informacion de Sanidad Vegetal (SISVEG)
14
Captaclon y envio de muestras
14
5.2,1 Muestras de plantas madres de kiwi
14
5.2,2 Muestras de huertos para conocer sltuaclon fitosanitaria
14
5.2
5.2.3 Envio de muestras
,
,
,
,.."
,
16
5.3 Recepcion de la muestra y manejo de la muestra/contramuestra
16
5.3.1 Recepclon de la muestra
16
5.3.2 Manejo de la contramuestra
16
5.4
Metodologfa,
,
17
5.5 Calculo y Expresion de Resultados
17
5.6 Esterilizacion y elirnlnaclon de material de desecho
17
5.7
17
Varlaclon de la metodologfa
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Instructivo Tecnlco para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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Versi6n:02
6
REGISTRO Y ENVio DE LOS RESULTADOS
17
7
SUPERVISION DE LOS LABORATORIOS AUTORIZADOS
18
8
OBLIGACIONES
18
9
ANEXOS
19
9.1
MUESTREO PLANTAS MADRES KIWI
19
9.1.1 Perfodo de muestreo
19
9.1.2 Proceso de muestreo
19
9.1.3 Condiciones del muestreo de plantas
9.1.4
0
cuarteles madres de kiwi
Especificaciones sobre las muestras
19
20
9.1.5 Plantas con sintomatologla a bacteriosis
20
9.1.6 Plantas sin slntornatoloqia de bacteriosis
21
9.1.7 Muestra compuesta
21
9.1.8 Identificaci6n de las plantas madres
21
9.1.9 Envlo de Muestras al Laboratorio
21
9.1.10 Reqlstro de la informaci6n
22
9.2
METODOLOGiA DE DIAGNOSTICO
23
9.2.1 Esquema Anallsls
23
9.2.2 Toma submuestra a analizar
25
9.2.3
25
Aislamiento y PCR
9.2.4 PCR directo
33
9.2.5 PCR en tiempo real.
38
9.2.6 PCR en tiempo real alternativos
42
9.2.7 Formulaci6n medios de cultivo y tampones
44
9.3
FORMULARIOS
46
9.3.1 Formulario de identificaci6n de personai que conforrna equipos de
muestreo y de analista(s) del laboratorio vinculado(s) al diagn6stico
46
9.3.2 Dedaraci6n jurada para la designaci6n del laboratorio autorizado que
prestara servicios al vlvero de kiwis
47
9.3.3 Formulario modelo de Dedaraci6n de plantas madres
.48
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Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnostlco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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Version :02
1 OBJETIVOS Y ALCANCE
EI objetivo de este documento es establecer 105 requisitos y procedimientos que
deberan cumplir los(as) interesados(as) que, voluntariamente, postulen ante el
SAG, para operar como laboratorio autorizado en la ejecuclon de la toma de
muestras vegetales y del diaqnostlco de la bacteria Pseudomonas syringae pv.
actinidiae (Psa) en muestras provenientes de huertos, para conocer la sltuacion
fitosanitaria, y de plantas madres de viveros de kiwi (Actinidia spp.) para obtener
la autortzaclon de propaqacion de tal material vegetal. Se especifican cuatro
procedimientos de dlaqncstlco distintos, pudiendo el laboratorio optar por mas
de uno, en la solicitud.
Asimismo, este documento entrega las directrices para que estos laboratorios, una
vez que obtengan su autorlzaclon ante el SAG, realicen el muestreo y diaqnostico de
la bacteria antes sefialada.
Sin perjuicio de 10 anterior, en caso de que el Servicio 10 requiera, podra ampliar el
nurnero tecnlcas dlaqnostlcas que forman parte del alcance de esta autorlzaclon SAG,
frente a 10 cual, 105 laboratorios que deseen mantener su autorizaclon en esta
categoria, deberan postular a la arnpllaclon de su autorlzaclon, de acuerdo al
procedimiento descrito en el numeral 13 del Reglamento especifico de autorizaclon
de laboratorios de anallsts/ensayos.
Las actividades relacionadas al proceso de muestreo, para la reallzacion de las
laboratorio,
son
la
toma,
conservacion,
tecnicas
de dlaqnostico de
almacenamiento, envio y entrega de las muestras al laboratorio, las cuales
deberan ser desarrolladas de acuerdo a 105 metod 05 y procedimientos especificos
establecidos por el SAG en el protocolo de muestreo en el marco del control
obligatorio de Pseudomonas syringae pv. actinidiae. (Anexo 9.1).
Esta autorizaclon se otorqara con caracter nacional, aun cuando las actividades
involucradas son ejecutadas en zonas qeoqraftcas definidas por el SAG.
Las disposiciones del presente instructivo seran aplicables a todas las personas que
voluntariamente postulen a la autorlzaclon referida en este documento.
2 REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS
Servicio Agricola y Ganadero. 2013. Resoluclon Exenta del Director Nacional NO
2.151 de abril del 2013. Establece medidas fitosanitarias para el control obligatorio
de la plaga Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa), en las areas reglamentadas
y deroga la Resoluclon N° 5.655 del 201l.
Servicio Agricola y Ganadero. 2013. Resoluclcn Exenta del Director Nacional N°
2.152 de abril del 2013. Establece medidas para combatir la dispersion de la plaga
cuarentenaria bajo control obligatorio Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa),
fuera de las areas reglamentadas.
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Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
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Servicio Agricola y Ganadero. 2012. Resolucion Exenta del Director Nacional del
SAG N° 529, del 30 de enero del 2012, que norma el Sistema Nacional de
Autorlzaclon de Terceros.
Servicio Agricola y Ganadero. Reglamento Espedfico para la Autorlzaclon de
Laboratorios de Analisis/Ensavos, version vigente.
Donoso, E. 2013. Presentacion "Avances en estudios de epidemiologia de Psa en
Chile y Tecnlca de Monitoreo en huertos", en el marco del Proyecto FIA
"Desarrollo de un modelo de determinacion de riesgo de lnfeccion de la
bacteriosis del Kiwi causada por Pseudomonas syringae pv. ectinidiee'', Taller
Tecnico "Sltuaclon actual y estrategias en relaclon a Psa en Chile. 24 de mayo de
2013, Curico ,
•
L1oop, P.; Caruso, P.; Cubero, J.; Morente, C.; Lopez, M.M. 1999 A simple
extraction procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant
material by polymerase Cain reaction. J. Microbiol. Meth. 37:23-31.
•
Ministry of Agriculture and Forestry (MAF) 2011. Diagnostic Protocol for Detection
of Pseudomonas syringae pv. Actinidiae (Psa) in Leaf Samples. MAF Biosecurity
New Zealand. Protocol Version: 18 March 2011, 16p.
III
Rees-George, J.; Vanneste, J.; Cornish, D.; Pushparajah, L; Yu, J.; Templeton, M.;
Everett, K. 2010 Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae using
polymerase chain reaction (PCR) primers based on the 16S-23S rDNA
intertranscribed spacer region and comparison with PCR primers based on other
gene regions. Plant Pathology 59:453-464.
•
Schaad, N.W.; Jones, J.B.; Chun, W. 2001 Laboratory Guide for Identification of
Plant Pathogenic Bacteria Third Edition. APS PRESS. 2001. 373p.
•
Takikawa, Y.; Serizawa, S.; Ichikawa, T.; Tsuyumu, S.; Gato, M.
1989
Pseudomonas syringae pv. actinidiae pv. Nov.: The Causal Bacterium of Canker of
Kiwifruit in Japan. Ann. Phytopath. Soc. Japan. 55:437-444.
3 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Analista
Persona designada por el laboratorio autorizado, para
desempefiarse en temas tecnlcos asociados a su
actividad y que cumple con el perfil definido por el SAG
para este cargo.
Autortzaclon
Acto mediante el cual el Servicio autoriza a un tercero
para que ejecute una 0 mas actividades en el marco de
programas oficiales del Servicio, bajo condiciones
definidas en el Reglamento espedfico de autortzacion
de cada actividad.
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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BPL 0 Buenas Pnlcticas de
Laboratorio
Buenas Practlcas de Laboratorio. Conjunto de normas
referente a la orqanlzaclon y condiciones sobre las que
los trabajos de
laboratorios son
planificados,
realizados, monitoreados, registrados e informados.
Laboratorio Autorizado
Persona naturai 0 jurfdica reconocida y aprobada por el
Servicio para ejecutar uno 0 mas anallsls/ensavos
determinados, en el marco de programas oficiales del
SAG, bajo condiciones definidas por el Regiamento
especifico
de
autorlzacion
de laboratorios
de
anallsls/ensavos y los correspondientes instructivos
tecnlcos.
PCR 0 Polymerase
Reaction.
Reaccion en cadena de la polimerasa
Chain
Plantas mad res:
Psa
Planta a partir de la cual se obtiene material de propaqaclon,
previa mente autorizado por el Servicio, para producir
plantas de vivero 0 para obtener nuevas plantas.
Pseudomonas syringae pv. actinidiae
Pss
Pseudomonas syringae pv. syringae
Servicio/SAG
Servicio Agricola y Ganadero
SISVEG
Sistema de Informacion de Sanidad Vegetal.
4 REQUISITOS PARA LA AUTORIZACION
4.1
Requisitos de personal de laboratorio
EI postulante debe contar con el siguiente personal para las labores de dlaqnostico:
4.1.1
RESPONSABLE TECNICO
EI laboratorio debera designar unj a) responsable tecnlco, quien sera la contraparte
ante el SAG en temas tecnlcos asociados a su actividad como laboratorio autorizado y
debera cumplir con los siguientes requerimientos:
•
Poseer titulo profesional otorgado por una entidad reconocida por el Estado,
correspondiente a una carrera de las ciencias silvoagrfcolas, bioquimicas,
blotecnoloqlcas 0 bloloqicas, de una duraclon equivalente a 10 semestres
acadernlcos, como minimo. En caso de titulo obtenido en el extranjero, este
debera estar revalidado sequn procedimiento establecido por el Ministerio de
Educacion.
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•
Experiencia laboral en el area de laboratorios de ai menos dos (2) afios.
•
Tener competencia tecnlca 0 experiencia laboral (de al menos 1 ana)
comprobable en dlaqnostlcos de fitopatologia, bacteriologia y/o tecnlcas
moleculares, sequn la metodologia de dlaqnostlco a autorizar.
4,1.2 ANALISTAS
EI laboratorio debera contar con analistas en nurnero adecuado, de acuerdo a la
cantidad de anallsls a realizar, quienes deben cumplir el siguiente perfil:
•
Contar con titulo profesional 0
correspondiente al area bloloqica 0
superior reconocida por el Estado.
este debera estar revalidado sequn
Educaciori.
tecnlco 0 ser egresado, de una carrera
afin, impartida por una entidad de ansehanza
En caso de titulo obtenido en el extranjero,
procedimiento establecido por el Ministerio de
•
Tener competencia tecnlca 0 experiencia laboral (de al menos 6 meses)
comprobable en diaqnosttcos de fitopatologia, bacteriologfa y tecnlcas
moleculares, sequn la metodologfa de diaqnostlco a autorizar.
EI laboratorio previendo una eventual ausencia del responsable tecnlco 0 del 0 los
analistas, podra postular a otras personas para que actuen en ausencia del 0 los
titulares, en calidad de subrogante. En tal caso, el laboratorio debera solicitarlo por
escrito, presentando al Servicio la docurnentaclon que demuestre que ese personal
cum pie con el perfil para desernpefiar el cargo.
4.2
Requisitos del personal para muestreo
EI postulante debera contar con el siguiente personal para las labores de muestreo:
4,2.1
Equipo de Muestreo:
Debera contar con lomas equipos de muestreo, los cuales estaran conformados por a
10 menos 2 personas, a saber:
a) Jefe de equipo, qulen debera cumplir con el siguiente perfil:
Poseer titulo profesional otorgado por una entidad reconocida por el Estado 0,
en caso de extranjeros, revalidado sequn procedimiento establecido por el
Ministerio de Educaclon, correspondiente a una carrera de alguna de las areas
de las Ciencias Agricolas de una duraclon equlvalente a 10 semestres
acadernlcos como minimo, en cuva malla curricular se incluya fundamentos de
fruticultura 0 fruticultura general, entomologfa agricola y fitopatologfa
agricola.
Haber aprobado un curso de adiestramiento para postulantes, dictado por el
SAG u otra lnstltuclon aceptada por este, en materias referentes a la
ejecuclon de las actlvidades oficiales comprendidas en este instructivo.
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b) Personal de apoyo, que debera cumplir con 10 siguiente:
Poseer titulo profesional/ tecnlco 0 ser egresado de una entidad reconocida
por el Estado 0, en caso de extranjeros, revalidado sequn procedimiento
establecido por ei Ministerio de Educaclon, de una carrera del area agricola.
Haber aprobado un curso de adiestramiento para postulantes, dictado por el
SAG u otra instituclon aceptada por este, en materias referentes a la
ejecuciori de las actividades oficiales comprendidas en este instructivo.
Requisitos de infraestructura, equipos, materiales y reactivos.
4.3
4.3.1 REQUISITOS DE INFRAESTRUCTURA
EI laboratorio debe contar con una infraestructura tal que garantice el correcto
desarrollo de la metodologia de anallsls a realizar, disponiendo de areas con suficiente
espacio para desarrollar en forma optima las actividades.
En todos los casos debe existir una separaclon efectiva entre las areas vecinas, ya sea
mediante paneles 0 piezas separadas, en donde se efectuan actividades incompatibles,
para evitar contarnlnaclon cruzada.
Las superficies de muros, cielos, pisos y mesones deben ser Iisas, de facll limpieza e
impermeables.
Adernas, dependiendo del tipo de analisls que se solicite autorizaci6n, el laboratorio
debera contar con 10 siguiente: se debera cumplir con los siguientes requisitos:
•
Aislamiento y PCR: salas separadas de preparaclon de muestras, lavado y
esterlllzaclon, siembra, preparaci6n de muestras (extracclon de ADN), de
arnpllficacion ylo electroforesis.
•
PCR directo: salas separadas de preparaci6n de muestras (extracclon de
ADN), de arnpliflcaclon yelectroforesis.
•
PCR en tiempo real: salas separadas de preparaclon de muestras (extraccion
de ADN) y de ampllflcaclon.
•
PCR en tiempo real alternativo: salas separadas de preparaclon de muestras
(extracci6n de ADN) y de arnpllficacion,
Respecto del muestreo, debe contar con infraestructura destinada a:
instalaciones
•
Disposici6n de equipos
•
Mantencion de registros documentales
0
4.3.2 REQUISITOS DE EQUIPAMIENTO
EI laboratorio debe contar con los equipos necesarios, acordes al volumen de
muestras, que garanticen el correcto desarrollo de ia metodologia de analisls a
realizar. Deben contar con su certificado de mantenci6n Ylo callbracion al dia,
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efectuado a 10 menos una vez cada 2 afios por una empresa pertlnente y reconocida en
el area.
A contlnuaclon se detalla el equipamiento minimo que se debe considerar:
Sensor de temperatura que permita verificar la temperatura de las muestras al
momenta del ingreso, el range de trabajo debe ser de a a 30°C, con una division de
1°C Y un error maximo de 0,5°C.
Balanza analitica con una resoluclon de 0,001 gramo.
Estufa de lncubaclon a 28±1°C (solo para aislamiento).
Micropipetas de 10, 100 Y 1000 IJI, 0 equivalente.
Peachimetro.
Agitador rnaqnetlco.
Freezer que alcance temperaturas de -20°C 0 menores.
Refrigerador que alcance una temperatura de 6±2°C.
Conservadora de muestras que alcance una temperatura de 6±2°C.
Autoclave para esterllizaclon de material.
Autoclave para esterillzacion de medios y tampones.
Camara de flujo laminar 0 gabinete de bioseguridad Clase II.
Micro-Centrifuga (hasta 14000 r.p.m.).
Bafio de agua termoregulado.
Agitador de tubos 0 Vortex.
Termociclador para PCR convencional 0 tiempo real.
Fuente de poder (solo PCR convencional).
Camara de electroforesis horizontal (solo PCR convencional).
Transiluminador UV (solo PCR convencional).
Sistema fotogrMico para registro de geles (solo PCR convencional).
Campana extracclon de gases.
Larnpara UV (solo para aislamiento).
Asimismo, para las labores de muestreo se debe contar con 10 siguiente:
Vehfculo adecuado para las labores relacionadas al muestreo.
Computador.
GPS, uno por cada equipo de muestreo.
Equipo e instalaciones de refrlqeraclon de uso exclusivo.
Conservadora de muestras que alcance una temperatura
exclusivo para terreno).
de 6±2°C (de uso
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4.3.3 REQUISITOS DE MATERIALES y REACTIVOS
EI laboratorio debe contar con los materiales, reactivos necesarios y materiai de
referencia acordes al volumen de muestras (stock suficiente para ios anallsls de la
temporada) y que garanticen el correcto desarrollo de la tecnlca de anallsls a realizar.
A contlnuaclon se detallan los materiales, reactivos y medios de cultivo que se deben
considerar como minimo:
Generales de laboratorio:
o
Boisas plastices de polietileno transparentes, selladas de fondo, de 200 micras
de densidad.
o
Etanol 95%.
o
Hipoclorito de sodio.
o
Agua destilada.
o
Controles positivos de referencia.
o
Puntas para micropipetas con y sin filtro.
Especificas segun tecnlca diagnostica:
a. Aislamiento:
o
Placas de 90 mm. de dlarnetro (plastlcas
o
Tampon AFT.
o
Medio de Cultivo B de King
o
Medio de Cultivo CSGA.
o
Reactivos y materiaies para pruebas LOPAT.
o
Reactivo oxidasa.
o
Papel filtro.
o
Rastrillo siembra.
o
Mechero.
o
Tubos de ensayo con tapa.
o
Asa de platino.
o
Bistu ri.
o
Hojas de bisturi.
o
Guantes de latex.
0
de vidrio Petri).
b. peR convencional:
o
Isopropanol.
o
Tampon extracclon ADN (Anexo N° 9.2).
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o
10 X Buffer PCR.
o
Cloruro de Magnesio (MgCIz).
o
dNTP·s.
o
Taq polimersa platinum
o
Partidores especificos.
o
Tubos de PCR de 0.2mL libres de nucleasas.
o
Tubes eppendorf de 1.5mL libres de nucleasas.
o
Agua Libre de nucleasas.
o
Marcador de peso molecular 50 y 100pb.
o
Buffer TAE (Tris- acetato-EDTA).
o
Bromuro de Etidio (10 rnq/rnl)
o
Agarosa grado moiecular.
0
Codlqo: D-PD-PE-OOS
verstcruoz
similar.
0
Gel red.
c. PCR en tiempo real:
o
Eva Green reaction mix
o
Agua libre de nucleasas.
o
BSA.
o
Tampon CTAB.
o
Tampon InviMag Plant DNA.
o
Partido res especificos.
0
similar.
d. PCR en tiernpo real alternativos:
o
Debe ser presentado al SAG para su verificaclon. A la fecha de entrega de este
instructivo solo ha sido veriflcado el kit completo (extraccion y arnpllflcaclon) DNature.
Muestreo:
Se debe contar con los sigulentes materiales para el muestreo, como mlnimo:
o
Boisas plastlcas 25 X 15 cm.
o
Boisas plastlcas 50 X 75 ern.
o
Plurnon permanente.
o
Papel absorbente.
o
Corchetera / corchetes.
o
Caja conservadora.
o
Ice pack activos (congelados).
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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4.4
Codlqo: D-PD-PE-OOS
Version:02
•
Cinta de papel engomada de 1 em. de ancho a 10 menos.
•
Desinfectante de herramientas (cloro, alcohol, permanganato de potasio, etc.).
•
Serrucho.
•
Tljera de podar.
Requisitos Especificos.
A esta autorlzaclon podran postular los terceros que deseen ejecutar dlrectamente las
labores relaclonadas con el proceso de muestreo y dlaqnostico, en el marco del Control
Obllgatorlo de Psa, debiendo cumplir con los siguientes requisitos especificos:
-
EI laboratorio debe contar con un sistema de qestlon de calidad 0 aseguramiento de
calidad implementado basado en buenas practlcas de laboratorio. En este sentido,
debe contar con un manual de procedimientos que describa en forma detallada el
proceso de anallsls, el manejo de los controles, el manejo de las contramuestras, la
preparacion de las soluciones y la ellrnlnaclon de residuos.
Sin perjuicio de 10 anterior, el laboratorio tarnblen debera contar con los
procedimientos que consideren la metodologia a autorizar, indicada en el numeral
5.4 de este instructivo.
-
EI laboratorio debera contar con timbres en que consigne el nombre del laboratorio
para ser utilizados en el marco de la autorlzaclon,
-
Respecto de las labores relacionadas con el proceso de muestreo (toma,
conservacion, almacenamiento, envio y entrega de las muestras al laboratorio),
deberan seguir las actividades descritas en el Anexo 9.1 del presente instructivo.
4.5 Medios de verlflcaclon de requisitos.
De acuerdo a 10 dispuesto en el Reglamento especifico para la autorlzacion de
laboratorios de anallsls/ensavos, los interesados en autorizarse para realizar el
dlaqnostico de Pseudomonas syringae pv. actinidiae, en el marco del control oficial de
esta plaga, deben presentar, junto a la solicitud de autortzaclon, los documentos
que a contlnuaclon se detallan y que dan cuenta del cumplimiento de los requisitos
establecidos por el SAG:
1.
2.
3.
4.
5.
Los antecedentes generales del laboratorio que se establecen en el numeral 6.1
del
Reglamento
especifico
para
la autorlzaclon de
laboratorios de
analisis/ensavos.
Croquis del laboratorio, identificando usa de areas y ubicacion de equipos.
Lista de equipos, indicando nombre, marca, modelo, fecha de puesta en servicio y
capacidad cuando corresponda.
Lista de materiales, reactivos y material de referencia requeridos tanto para el
dlaqnostlco como el muestreo.
Formulario de identlflcaclcn del responsable tecnlco, sequn formate establecido
en el Anexo 2 del Reglamento especifico para la autorlzacion de laboratorios de
anallsls/ensavcs.
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6.
7.
8.
9.
10.
11.
Codigo: D-PD-PE-OOS
Version ;02
Formularlo de ldentltlceclon de analistas y personal de ios equipos de muestreo,
sequn Formato establecido en el formuiario F-PD-PE-023 de este instructivo.
Certificado de titulo del responsabie tecnlco Identlficado en el formulario
respectivo, en original 0 fotocopia legalizada.
Certlficado de titulo 0 de egreso de los/las analistas identlficados en el formulario
respectlvo, en original 0 fotocopia legallzada.
Documentos que garanticen la competencla tecnica y/o experiencia laboral del/Ia
responsable tecnlco en las areas de fitopatologia, bacteriologia y/o tecnlcas
moieculares sequn corresponda.
Documentos que acredlten la competencla tecnlca y/o experiencia laboral de
los/las analistas en las areas de fitopatologia, bacterlologia y/o tecnlcas
moleculares sequn corresponda.
Manual de procedimientos de acuerdo a 10 sefialado en el numeral 4.4 de este
instructlvo.
Sin perjuicio de 10 anterior, el cumpllmiento de los requisltos descritos tanto en el
Reglamento especiflco de autortzaclon como en este instructlvo, seran conflrmados por
el Serviclo en la visita de verlflcaclon. Aslmlsmo, en la visita de verlflcacion, el SAG
sollcltara al postulante, el anallsls de muestras control, mediante la ejecuclon de la 0
las tecnicats) solicltadas a autorizar ya sea por parte del responsable tecnlco 0 de uno
o mas analistas del laboratorio, sequn determine el verlficador.
5 ANAlISI5/ENSAYO
5.1
Condiciones previas para el muestreo
Todos los cuarteles de kiwi que se muestreen deben georreferenciarse tomando ia
coordenada de una punta (x,y) en el centro del cuartel, mediante GPS,
correspondiente a la coordenada este y norte, y deberan expresarse en unidades UTM,
Indicando el Huso en el que fue capturado.
En el ingreso a huertos y viveros de kiwi, deberan adoptarse las medidas de profilaxis
y seguridad necesarlas para mltigar el riesgo de dispersion de ia piaga.
5.1.1 Condiciones previas para muestreo de plantas madres
EI viverista debe realizar una declaraclon de plantas mad res de kiwi a muestrear, a
mas tardar el 30 de septiembre de cada afio. Dlcha declaracion debe ser presentada
por un medio escrito (via correo electronlco, fax u otro), en la Oflcina SAG sectorial en
cuya jurlsdlcclon se ubica ia oflcina comercial de la empresa, Informando adernas, ei
laboratorio autorizado que tornara las muestras y reallzara los anal isis
correspondientes. Este aviso debera enviarlo a la Oficina SAG correspondiente a la
ublcacion de las plantas mad res, utillzando el formulario de declaracion, anexado a
este instructivo, y debera ser firmado tanto por los propletarios 0 representantes del
vlvero como del iaboratorio autorizado. Se debera completer un formulario por cad a
iaboratorio autorizado que el viverista eiija para ei muestreo y dlaqnostico de Psa y por
cada predio donde se encuentren las plantas mad res.
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Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnostlco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
Codtqc: D-PD-PE-DDS
Versi6n:02
5.1.2 Condiciones previas para el muestreo de huertos
EI particular que desee conocer la sltuaclon fitosanitaria de un huerto y obtener un
resultado oflclal sobre Pseudomonas syringae pv. actinidiae, debera contratar los
servicios, para el muestreo y el dlaqnostlco, de un laboratorio autorizado por el
Servicio, los que tendran un caracter oficial si se realizan bajo los parametres
establecidos en este instructivo.
Cabe destacar que la informacion de los resultados obtenidos por un muestreo oficial
deben ser puestos en conocimiento inmediato al Servicio, sea cual sea su resultado.
Los resultados negativos a Psa, en muestras provenientes de huertos de kiwi, no seran
condlcion suficiente para permitir la rnultipllcaclon de taies plantas, si es que estas no
fueron declaradas para tal uso y muestreados bajo los estandares establecidos para
este tipo de plantas.
5.1.3 rncorporacton del laboratorio autorizado como usuario del Sistema de
de informacion de Sanidad Vegetal (SISVEG)
EI SAG incorporara en el SISVEG u en otro sistema lnforrnatlco que el SAG determine,
al laboratorio autorizado y Ie proporclonara nombres de usuarios y contrasefias para la
gest'lon del ingreso y seguimiento de las muestras y para el ingreso y autorlzaclon de
los diaqnostlcos.
5.2
captaclon y envio de muestras
5.2.1 Muestras de plantas madres de kiwi
Las plantas postulantes a plantas mad res se presentan con el fin de propagar
multiplicar el material vegetal, si los resultados obtenidos son negativos a Psa.
0
EI muestreo en plantas mad res sera realizado por el laboratorio autorizado, de acuerdo
a los procedimientos establecidos e instruidos por el Servicio, por 10 tanto es una
actividad de competencia de los laboratorios autorizados en esta categoria.
En el caso de declarar un cuartel
0
huerto completo, se debe muestrear de acuerdo a
10 descrito en el Anexo 9.1 del presente instructivo.
5.2.2 Muestras de huertos para conocer sltuacion fitosanitaria
EI muestreo oficial para conocer la condlcion fitosanitaria respecto de Psa, sera
realizado por el 0 los equipos de muestreo del laboratorio autorizado, cumpliendo las
condiciones y procedimientos establecidos por el SAG, por 10 tanto es una actividad de
competencia de los laboratorios autorizados en esta categoria.
a.
Huertos con sintomas:
Las muestras deben colectarse de plantas con sintomatologia. Se deben enviar a
laboratorio los siguientes orqanos vegetales:
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Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
C6digo: D-PD-PE-OOS
Versi6n:02
Follaje, con sfntomas de puntuaciones necrotlcas rodeadas de halo clorotlco, en
brotes de 30 em. Con un numero de entre 10 y 15 hojas, de un mismo arbcl.
Madera, con zona de avance de ataque bacteria no, exudaclon rojiza en madera
y/o presencia de cancros, ramas entre 40 y 60 em. considerando 2 a 4 ramas
por muestra, de un mismo arbol,
Cada organa vegetal constituye una muestra independiente y se lnqresare al SISVEG 0
al sistema inforrnatico vigente, bajo un mismo folio, con distintos nurneros correlativos
de muestras.
Las muestras de madera deben ser puestas en bolsas de plastlco y las de foliaje deben
ser envueltas en papel absorbente, previa mente, antes de colocar en las bolsas. Todas
ias muestras deben ser identificadas con el codiqo de barras que antreqara el SISVEG
al momento de ingresar la muestra en ei sistema.
Las plantas muestreadas deberan ser identificadas con pintura indeleble 0 indicar el
numero de hilera y pianta, en los documentos de muestreo.
b.
Huertos sin sintomas:
Si el cuartel es hornoqeneo en manejo aqronornlco, de una misma especie y variedad,
se deberan colectar muestras al azar, slguiendo un recorrldo en zigzag, esto es
avanzando en diagonal entre las hileras del cuartel, y se debera colectar muestras
cada 3 plantas. En una unidad hornoqenea de aproximadamente 4 ha. se requiere
tomar muestras de al menos 10 plantas, para determlnar la presencia de 1 planta
positiva a Psa (Donoso, 2013).
La cantidad de muestras a colectar, sequn la superflcie de los cuarteles se indica en la
siguiente tabla:
Tabla 1: Muestreo en huertos aslntcrnatlcos.
Superflcie del cuartel (hal
< 1
1,1 - 2 5
2,5 - 4 5
4,5 - 10
N° plantas muestras
3
5
10
15
Para cuarteles con superficie superior a 10 ha. se debera subdividir en lotes menores 0
igual a 10 ha. y aplicar la tabla anterior.
Cada muestra debe estar compuesta 10-15 hojas por planta, mas 2 trozos de madera,
uno de cada braze, esto hasta completar las muestras requeridas por cuartel. Cada
planta muestreada debera ser identificada con pintura indeleble 0 indlcar el nurnero de
hilera y planta, en los documentos de muestreo.
Las plantas muestreadas deberan ser identificadas con pintura indeleble 0 indicar el
nurnero de hilera y planta, en los documentos de muestreo.
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Instructivo Tti!cnico para el muestreo y dlaqnostlco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
Ccdiqo: D-PD-PE-OOS
verstcn.uz
5.2.3 Envio de muestras
EI despacho de la(s) muestra(s) sera de responsabilidad del laboratorio autorizado a
cargo del muestreo. Sin perjuicio de 10 anterior, podra utilizar los servicios de una
empresa de transporte de encomiendas 0 courier reconocida a nivel nacional y
establecida legal mente y que garantice el envio en el tiempo y las condiciones de
temperatura adecuados (rnantenclon de cadena de frio de ser necesario), sequn los
requerimientos especificos establecidos en el presente instructivo.
EI laboratorio autorizado debera ingresar, recepcionar e informar los resultados de los
anallsis de las muestras, las cuales seran identificadas con un codlqo de barras, al
ingresar muestras en el SISVEG 0 el sistema de qestlon de muestras y resultados
vigente, indicando el afio-follo-correlatlvo.
5.3 Recepcion de la muestra y manejo de la muestra/contramuestra
5.3.1 Recepcion de la muestra
EI laboratorio debera verificar al momenta del ingreso de la muestra, que esta se
encuentre en condiciones adecuadas de embalaje y que el tiempo entre el muestreo y
la recepclon en el laboratorio sea menor 0 igual a 7Z horas.
Posteriormente, el responsable tecnlco debera evaluar la aptitud de la muestra para el
analisis, conslderandose como muestra apta, aquella que no presenta signos evidentes
de deshldrataclon y/o descornposlcion, adernas de ser representativa en cantidad y
tarnafio.
Si la muestra presenta condiciones de embalaje inadecuadas 0 no apta para anallsls,
esta debe ser rechazada.
Una vez que el laboratorio autorizado ha verificado 10 anterior y considerado que la(s)
muestra(s) son apta(s) para su anallsls, debe aceptarlas lnqresandolas al sistema
SISVEG en el modulo laboratorlo/recepclon de muestras.
Las muestras deberan ser conservadas,
temperatura de 6±Z°C.
hasta el momenta del
anal isis,
a una
5.3.2 Manejo de la contramuestra
EI laboratorio autorizado debera mantener al menos Z tubes (1,5 0 Z ml) con tejido de
la muestra, macerado en tampon de extracclon, por al rnenos 6 meses, luego del
anallsls. Esta conservaclon debera reaiizarse a una temperatura de -ZO±Z°c. Adernas,
para las muestras positivas se debera conservar tejido sin macerar y sin buffer, a
durante, al menos 3 meses posteriores a la recepclcn de la muestra.
-zooe
Adernas, para el caso de autorlzacion mediante la tecnlca aislamiento, se debera
mantener un cepario en forma indefinida, tanto para las muestras positivas a Psa como
a Pss.
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Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnoatlco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
5.4
C6digo: D-PD-PE-OOS
verston.oz
Metodologia.
Para determinar la ausencia 0 presencia de Psa se procedera a desarrollar una 0 mas
metodologias de analtsls, de acuerdo a la tecnlca autorizada, las cuales se describen en
el Anexo 9.2.
EI material vegetal no utilizado en el anallsls se debe guardar como contramuestra a
6±2°C.
5.5 calculo y Expresion de Resultados
EI calculo y expreslon de resultados para las metodologias de dlaqnostlco, y los
lineamientos para considerar una muestra positiva 0 negativa a Psa, estan indicados
en el Anexo 9.2. del presente instructivo.
5.6 Esterilizacion y ellminaclon de material de desecho
Todo material utilizado en las diferentes eta pas de la metodologia de diaqnostlco debe
ser esterilizado mediante autoclavado. EI material que no se pueda reutilizar, debe ser
autoclavado y desechado en bolsas clara mente identificadas, para su posterior
inclneracion.
EI material vegetal, suelo y/o sustrato de desecho, tarnblen debe ser autoclavado y
desechado en bolsas c1aramente identlficadas, para su posterior lnclneracton.
5.7
Variacion de la metodologia
En el caso de utilizar reactivos diferentes a los indicados en los procedimientos de
anallsis definidos en el numeral 5.4 del presente instructivo, estes quedaran sujetos a
la evaluaclon por parte del Servicio.
No obstante 10 anterior, los laboratorios podran presentar para la evaluacion, por parte
del Servicio, otras metodologias 0 variantes de las indicadas en este instructivo, las
que una vez aprobadas podran ser implementadas por los laboratorios autorizados.
6 REGISTRO Y ENVio DE LOS RESULTADOS
Los resultados obtenidos del anallsls de muestras tanto procedentes de viveros como
huertos de kiwi, deberan ser ingresados al sistema de informacion de sanidad vegetal
SISVEG u otro, en un plazo maximo de 15 dias hablles, desde la fecha de recepcion de
la(s) muestra(s) por parte del laboratorio autorizado.
Cualquier atraso en el tiempo de respuesta, debera ser informado por el responsable
tecnlco del laboratorio autorizado, con 24 horas de anticipaclon a la fecha limite de
respuesta, via correo electronlco, FAX u otro, al Encargado de Supervision SAG de ese
laboratorio.
La autortzaclon de resultados, en el sistema, sera por parte del responsable tecnlcc,
quien los dejara disponibles para el sistema en caso de ser negativos, 0 en calidad de
Reservados, en caso de ser posltlvos a Psa.
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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Version:02
Los informes fitosanitarios con muestras negativas a Psa pueden ser impresos
almacenados como archivo digital y ser enviados al usuario que contrato el servicio.
0
Los informes fitosanitarios con muestras posltivas a Psa deben ser informados en un
plazo maximo de 24 hrs, via correo electronico, FAX u otro, al Encargado de
Supervision SAG de ese laboratorio. Estos Informes tienen el caracter de confidencial
entre el laboratorio autorizado y el SAG y no pueden ser impresos 0 aimacenados
como archivo digital, y tampoco pueden ser enviados 0 informados al usuario de las
muestras. En caso de no respetarse 10 anterior, sin previa autcrlzaclon del Servicio,
sera considerado como una no conformidad critica y causal de suspension inmediata de
la autorlzaclon,
7 SUPERVISION DE LOS LABORATORIOS AUTORIZADOS
Todo laboratorio autorizado sera supervisado mediante visitas, al menos una vez al
afio. Sin embargo, debera estar dispuesto a recibir supervisiones adicionales, en
cualquler momento. Asimismo, podra recibir supervisiones del personal del SAG de
Regiones 0 del Nivel Central, durante la ejecucion del muestreo, al menos 1 vez por
Oficina SAG, en cuya jurisdlcclon se encuentre el predio muestreado.
EI Encargado de Supervision SAG del laboratorio autorizado, podra solicitar a este
ultimo, en cualquier momento, el envio de contramuestras, ya sea ADN y/o cepas,
para ser analizados oficialmente por el SAG. En el caso de no haber concordancia con
los resultados, se proqrarnara una visita de supervision para verificar la conducclon del
ensayo.
EI Encargado de Supervision SAG del laboratorio autorizado, podra solicitar a este
ultimo, en cualquier momento, analizar un set de muestras, tanto positivas como
negativas a Psa, para verificar la conduccion del ensayo.
Si producto de las acciones de supervision, el Departamento de Laboratorios y
Estaciones Cuarentenarias 0 el personal del SAG que supervise las actividades de
muestreo, detectan faltas en el desempefio del Laboratorio Autorizado, el SAG, de
conformidad con 10 dispuesto en la cleusula sexta del correspondiente convenio de
autorlzaclon, podra instruir al Laboratorio Autorizado, mediante una carta suscrita por
el/la Jefa del Departamento Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias 0 un Director/a
Regional 0 un Jete/a de Oficina, el cese inmediato de prestaciones de servicios
ejecutados en el alcance de su autorlzaclon.
8 OBLIGACIONES
Sin perjuicio de las obligaciones estipuladas en el capitulo VII del Reglamento
espedfico de autortzaclcn de laboratorlos de anallsls/ensavos, el laboratorio autorizado
debera cumplir con 10 siguiente:
-
No podra ejercer como laboratorio autorizado cuando el representante legal, socios,
directores, accionistas, gerentes, responsable tecnlco 0 analistas tengan un lnteres
directo con la activldad para la cual el laboratorio esta postulando u otras que
determine el Servicio.
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Instructivo Tecnlco para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
Ccdtqo: D-PD-PE-OOS
Version :02
9 ANEXOS
9.1
MUESTREO PLANTAS MADRES KIWI
9.1.1 Periodo de muestreo
EI muestreo de plantas mad res debe realizarse desde el 1 de septiembre hasta el 30
de noviembre. Se podra conslderar una epoca diferente para muestreo, si las tecnlcas
de dlaqnostlco vigentes y las estructuras vegetales disponibles, permiten lograr un
dlaqnostlco confiable y previa autorlzaclon de la declaraclon de muestreo.
9.1.2 Proceso de muestreo
EI viverista debera declarar a la Oficina SAG correspondiente a la jurlsdlcclon del
vivero, el nurnero y ublcaclon de las plantas madres a muestrear, mediante un
formulario de declaraclon de plantas madres para multiplicar plantas de kiwi,
sequn Formato establecido en el anexo 9.3.3.
Esta informacion debe ser enviada por fax/correo electronlco con fecha limite el 30
de septiembre del afio a muestrear.
No se podra iniciar el muestreo, si la declaracion no ha sido autorizada por el Servicio.
9.1.3 Condiciones del muestreo de plantas
•
0
cuarteles madres de kiwi
En el cuartel 0 huerto
EI cuartel 0 huerto debera estar con todas las condiciones que permitan
realizar las iabores asociadas al proceso de muestreo, permitiendo el Iibre
desplazamiento del equipo muestreador, asi como un acceso integral a la
planta que sera sometida a muestreo, de manera de facllitar su
ldentiflcaclon, marcaje y extracclon de la muestra de acuerdo a las
disposiciones establecidas por el SAG.
No se debera ingresar a un cuartel en el cuai se esten realizando
aplicaciones de plaguicidas 0 se encuentre sin cumplir el periodo de reingreso
de estos .
• En la planta(s) madre(s)
Debe estar incluida en la declaracion de muestreo.
Debe corresponder a la especie, variedad (si esta informacion se encuentra
incluida
en la declaracion) y ubicacion, indicada en la declaraclon de
muestreo.
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Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
Codiqo: D-PD-PE-005
Version :02
Debe estar libre de problemas fitosanitarios evidentes que puedan ser
transmitidos por material de propagaci6n, adernas de NO mostrar
sintomatologfa sospechosa a bacteriosis.
Debe disponer
muestra.
•
del
crecimiento vegetativo suficiente para
conformar la
En la muestra
Debe estar libre de problemas fitosanitarios (artr6podos, hongos, u otros).
9.1.4
Especificaciones sobre las muestras
Para la realizaci6n del muestreo en cada planta, se debera proceder en primer
lugar, a detectar sfntomas asociados a bacteriosis; si estes se encuentran presentes,
no se debe efectuar el muestreo y el viverista debera considerar el muestreo de otro
cuartel, huerto 0 planta sequn sea el caso; de 10 contrario, sl las plantas no
presentan sintomas, se debera colectar una muestra aslntomatlca, en nurnero de
acuerdo a 10 indicado en Tabla 2.
TABLA 2: Muestreo en plantas madres
N° DE PLANTAS DECLARADAS
1-10
11-100
101-1000
Mas de 1000
% DE PLANTAS A MUESTREAR
100
20
5
2 (de cada cuartel, en el caso de haber
mas de dos en un mismo huerto)
9.1.5 Plantas con sintomatologia a bacteriosis
Los sintomas asoclados a bacteriosis deberan ser verificados en todos los 6rganos
vegetales susceptibles de ser afectados (si se encuentran presentes al momenta del
muestreo), las cuales constituyen una causal de rechazo de las plantas
declaradas para muestreo.
•
•
•
Manchas angulares con halo cior6tico en hojas.
Dafio en brazos junto con exudaclones rojlzas
Atizonado de botones y flares.
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Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
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Versi6n:02
9.1.6 Plantas sin sintomatologia de bacteriosis
Atendiendo al tipo de especie a muestrear, se captara el siguiente tipo de material
vegetal, en ausencia de sintomas asoclados a Psa:
•
•
•
10-15 hojas completamente expandidas, en ramillas que tengan algo de
madera del afio anterior (tejido vascular).
EI tejido colectado debera presentar crecimiento activo y sin signos de
senescencia.
Colectadas alrededor de la canopia del arbol, tornandose de la zona media e
interior de cada rama de este.
9.1.7 Muestra compuesta
La muestra que se envle al laboratorio estara constituida de tres submuestras de
diferentes plantas, la cual correspondera a tres submuestras de igual tipo de organa
(ramilla con hojas).
9.1.8 Identificacion de las plantas mad res
La(s) Planta(s) Madre(s), que hayan sido muestreadas, deberan ser marcadas con
pintura indeleble ubicada en el eje central de la planta a una altura minima de 20
em. La marca debera rodear toda la circunferencia del eje central de la planta y
debera ser de una dimension que permita la facil ldentiflcaclon de la planta
muestreada.
9.1.9 Envio de Muestras al Laboratorio
•
Identificacion: Indicar localidad, empresa, nombre predio, cuartel, hilera y
numero de planta de hllera; Indicar adernas las coordenadas en UTM.
•
Envases: EI envase ideal es una bolsa plastics cerrable (ziploc
toalla de papel, no debe quedar agua Iibre dentro de la bolsa.
•
Ingreso de muestras al SISVEG: EI laboratorio autorizado creara en el
Sistema computacional
SISVEG un folio por cada sitio muestreado, y un
nurnero correlativo par cada muestra, la cual esta compuesta por tres
submuestras que provienen de 3 plantas mad res y son tomadas del mismo
sitio. Las muestras deben indicar la especie y variedad espedfica de kiwi que
corresponda, as! como tarnbien deben indicar la plaga espedfica Pseudomonas
syringae pv. actinidiae.
•
Condiciones de almacenamiento y despacho: Las muestras deben
almacenarse en frio hasta su anallsis, manteniendo temperaturas de entre
ro-c y 4°C, sin congelar.
0
similar), con
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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9.1.10 Registro de la informacion
EI laboratorio autorizado debera enviar un Programa de Toma de Muestras a cada
region, con al rnenos 5 dias habiles de antlcipaclon a la toma de muestras, y debera
actualizarlo cada vez que se produzcan cam bios e informarlo con al rnenos 1 dia habll
de anticipacion utilizando el formulario establecido en el anexo 9.3.4 del presente
instructivo. Este registro debera enviarse en forma electronlca al Encargado(a)
Regional Agricola y Forestal del Servicio Agricola y Ganadero, en cuya jurisdlccion se
encuentren ubicadas las plantas que seran objeto de muestreo. Adernas, debera ser
este registro debera ser mantenido en forma documental, en las dependencias del
tercero autorizado y debera estar disponible para las supervisiones que realicen los
inspectores(as) del Servicio.
Por otra parte, la informacion sobre la ldentlflcacicn de las muestras (folios) para
proceso en laboratorio, debe consignarse en la Declaraclon de Muestreo plantas
mad res, sequn formato establecido en el anexo 9.3.3 del presente instructivo.
Los muestreos realizados semanalmente deben ser informados (via fax 0 electronica)
a la(s) Oficina(s) SAG en cuya(s) jurtsdlcctonres) se hayan realizado los muestreos,
con copia al/la coordinador/a nacional del Programa.
Los registros seran: la Declaraclon de muestreo plantas madres (anexo 9.3.3) y
el resumen de muestreo de la temporada, que debera elaborar cada laboratorio,
con un formato a convenir con el Servicio.
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Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
9.2
Codiqo: D-PD-PE-OOS
verston.oz
METODOlOGIA DE DIAGNOSTICO
9.2.1 Esquema Analisis
EI esquema de analisls, tanto para muestras con
metodologia a autorizar, es el siguiente:
0
sin sintomas, de acuerdo a la
a) Aislamiento y PCR:
Aislamiento
Muestra
King B
hoja 0 madera ~
Cultivos
puros de colonias
sospechosas
PCR Presencia Genes
<Ill- Constitutivos cts y gyrB
p_K_1_--..J.....
'----..--------'
'--_y_E_fe_c_t_o_r_e_s_h_r_
Interpretacion resultados
Psa y Pss
Extraccion
ADN
<2>
(+ )
....
PCR
F1/R2
!
Pruebas
lOPAT
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Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnosfico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
Codlqo: D-PD-PE-DDS
Versi6n:02
b) PCR directo:
Muestra
hoja 0 madera
Extraccion
ADN
Interpretacion resultados
Psa
.-....l
~
l
PCR
Fl/R2
Secuenciacion
I
(+)
+-
PCR presencia genes
constitutivos cts y gyrB
y efectores hrpKl
c) PCR en tiempo real:
Muestra
hoja 0 madera
Extraccion
ADN
I nterpretaclon resultados
Psa
...-1
Amplificacion
Fl/R2
Secuenciacion
I+-
(+)
PCR presencia genes
constitutivos cts y gyrB
y efectores hrpKl
d) PCR en tiempo real alternativo:
Mu estra
hoja 0 madera
.........
Extraccion
ADN
Interpretacion Resultados
Psa-V
Amplificacion
Kit
(+)
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la pJaga en kiwi
e6digo:
D-PD-PE-005
Versi6n:02
9.2.2 Toma submuestra a anaJizar
a) Muestras con sintomas
Se analtzaran ias muestras de acuerdo a su sintomatologia en forma separada y sequn
el material vegetal a anallzar (brotes herbaceos, hojas a tejido lefioso).
Para el caso de brotes herbaceos y tejido lefioso, se tornaran seceiones de tejldos a
partir de la zona de avance de la lesion. Para el caso de las hojas, se tornaran las
manchas foliares completas, privilegiando las manchas incipientes.
Las secciones tomadas de los distintos tipos de tejidos se colocan en las balsas
plastlcas de polietileno transparente y se identifican can el correlativo de la muestra y
el tipo de tejido tomado.
b) Muestras sin sintomas
Si se requiere analizar posible presencia de infeccion latente de Psa, las muestras se
tornaran en forma separada de acuerdo al material a analizar (brotes herbaceos, tejido
lefioso a yemas)
En el caso de brotes herbaceos a tejido lefiosc, se tornaran secciones transversales de
aproximadamente 0,5 cm de ancho, siempre y cuando estes tejidos no tengan mas de
1 em de dlarnetro, pudiendo agrupar a no trozos de distintas seeciones de la planta. En
caso de tejido can mas de 1 cm de diametro se tornaran secciones longitudinales de
hasta 1,5 cm de largo, considerando dentro del corte principalmente el tejido
xilernatlco. Finalmente, en el caso de yemas, la cantidad a tamar del brote a tejido
lefioso, debe ser representativa de la muestra.
Los distintos tipos de tejidos se colocan en balsas plastlcas de polietileno transparente,
acordes al tamafio de la muestra, y se identiAcan can el correlativo de ia muestra y el
tipo de tejido tomado.
9.2.3
a)
AisJamiento y peR
Aislamiento
•
Desinfectar en forma superficial los trozos de tejido, en hipoclorito de sodio al 1%
de soluclon eomercial par 1 minuto. No se incluyen en esta etapa las flores, dada la
posibilidad de deqradaclon del tejido.
•
Enjuagar los trozos 2-3 veces en agua destilada esterll.
•
Dilaeerar a machacar las muestras y agregar dos veces el peso de la muestra de
tampon AFT.
•
Mantener en hielo y aqitaclon par 20 a 45 minutos.
•
Las muestras seran sembradas en duplieado en el media de cultivo B de I<ing
mediante diluclon, utilizando para la siembra ias diluciones -1, -2 Y -3. Para ella,
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
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•
•
Codlqo: D-PD-PE-OOS
Versi6n:02
se agrega mediante micropipeta 100 ~I de diluci6n y se dispersa homoqenearnente
dentro de la placa con rastrillo de siembra.
Las placas se identifican e incuban a 25-27°C por 48 a 72 horas.
Revisar los aislamientos y verificar la presencia 0 ausencia de colonias sospechosas
a Psa 0 Pss.
b) Preparaclon de cultivos puros
A partir de las colonias de crecimiento caracterfstlco de Psa 0 Pss, obtenidas en el
punto anterior, se procede a realizar cultivos puros con el fin de multiplicar la bacteria.
Estos cultivos puros se utlllzaran en las pruebas complementarias.
Los pasos a seguir para realizar cultivos puros son:
•
•
•
Seleccionar colonias sospechosas.
Traspasar las colonias sospechosas a medio B de King y CSGA.
Incubar a 28±2°C por 24 horas.
c) Extraccion de ADN a partir de colonias
• Colocar 1 ml de agua destilada en un vial y agregar asadas del cultivo puro en
medio King B.
• Calentar durante 4 minutos a 100°C y colocar inmediatamente en hielo.
• Almacenar a 5±2°C.
d) peR
• La amplificaci6n del ADN se realiza utilizando el par de primers PsaF1 (TIT TGC TIT
GCA CAC CCG ATT TT) Y PsaR2 (CAC GCA CCC TTC AAT CAG GAT G).
• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):
•
Agua Mq
12,7
dNTPs 10mM
0,5
Buffer lax
2,5
MgCI250mM
1,5
Primer PsaF1 10pmol
1,25
Primer PsaR2 10pmol
1,25
Taq platinum
0,3
Muestra
5
La mezcla se prepara considerando el volumen por tuba y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Peqme 26 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control aficial de la plaga en kiwi
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
e)
Codiqo: D-PD-PE-OOS
Versi6n:02
Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de ampliflcacion se debe
incorporar un control negativo blanco (control aqua), un control negativo de Pss y
un control positivo de Psa.
Realizar la arnpllflcacion de acuerdo a los siguientes cicios:
95°C
2 min
95°C
30seg
65°C
30seg
72°C
30seg
noc
5 min
}
30 cicios
Proceder a realizar la electroforesis, con el fin de visualizar si hubo arnpllftcaclon de
muestras y controles.
Preparar el gel de electroforesis disolvlendo, en tampon TAE, agarosa al 2% y
agregando gel red a una concentraclon aproximada de 0,005%.
Tomar 5 a 10 J.l1 de cada tubo ampllficado y mezciar con tampon de carga.
Cargar en cada bolsillo del gelS a 10 J.l1 de la mezcia obtenida en el punto anterior.
Tomar aproximadamente 2 J.l1 de marcador de peso molecular 50 bp Y mezclar con
tampon de carga. Cargar esta mezcla en el gel.
Proceder a correr el gel a 80 0 mas Volts. Observar bajo luz UV la presencia de
bandas luminosas y obtener registro fotogrMico.
5e debe examinar el control negativo, el cual no debera presentar bandas. 5i hay
presencia de bandas de arnpllflcacion se debe repetir el proceso de arnpllftcaclon.
Comparar el marcador molecular con ia posicion de la banda obtenlda por el control
positivo. 51 no hay presencia de banda de arnpllftcacion de 280 bp se debe repetir
el proceso de ampliftcaclon.
Una vez verificados los controles se observa en los carriles de las muestras la
presencia 0 ausencla de bandas de arnpllflcaclon de 280 bp.
La presencia de banda determina el PCR posltivo, sin ser necesariamente la
muestra positiva a Psa.
Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
5e puede utilizar como alternatlva PCR en tiempo real con los mismos partidores.
Pruebas LOPAT
Levana
• Traspasar los cultlvos puros a medio de cultivo 5NA e incubar a 28±2°C por 24
horas.
• Observar crecimiento bacteria no. 5e considera levano positivo cuando el
creclmiento bacteria no es de color blanco perla, brillante, mucoide y abombado.
Oxidasa
• Colocar en un papel flltro unas gotas de reactivo oxldasa (N-N dimetil
parafenilendiamino al 1% en agua destilada, guardada en Frasco opaco a 5°C).
Pagina 27 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
•
C6digo: D-PD-PE-OOS
Version :02
Frotar un asa de platino cargada de cultivo bacteria no.
Reacclon positiva: aparicion de un color purpura en 10 segundos. Si se produce
entre 10 y 30 segundos la reacclon es positiva debil.
Reacclon negativa: color inaiterado despues de 30 segundos.
Pudricion en papa
• Tomar un tuberculo de papa y desinfectar con hipoclorito de sodio al 1%.
• Colocar papel absorbente en una bandeja con tapa y humedecer. Luego colocar en
la bandeja tapas de placas Petri.
• Cortar el tuberculo en los extremos y luego en la mitad.
• Colocar la mitad del tuberculo en la placa Petri y sacar un trozo de tejido mediante
sacabocado y agregar 1ml de suspension bacteriana.
• Cerrar la bandeja y mantener a temperatura ambiente por 24-48 horas.
• Reacclon positiva: se observa pudrlcion blanda alrededor del orificio dejado por el
sacabocados.
Arginina dihidrolasa
• Inocular por picadura a partir de los cultivos puros.
• Agregar aseptlcarnente 2ml de vaselina esterll e incubar a 27°C por 4 dfas.
• Se considera reacclon positiva la alcallnizacion del medio que pasa de un color
rosado a rojo fuerte.
Hipersensibilidad en tabaco
• Preparar una suspension bacteriana concentrada (10 B-109 ufc/rnl).
• Introduclr la suspension, sin burbujas de aire, en una jeringa de 1 mi.
• Inyectar en los espacios intercelulares del enves de las hojas.
• Utilizar de preferencia Nicotiana tabacum L. cv. Samsum.
• AI introduclr el liquido la superficie de la hoja toma un aspecto hurnedo que
persiste durante media a 1 hora.
• Dejar a temperatura ambiente par 48-72 horas.
• Reaccion positiva: la zona infiltrada se seca y aparecen necrosis ligeramente
marrones, que no deben confundirse can ias c1orosis originadas par los saprofitos.
f) Presencia gen constitutivos y efectores
Gen constitutivo cts
•
Realizar la extracclon de ADN de colonias tai cual se indica para PCR.
•
La arnpliflcaclon del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores cts-Fp
(AGT TGA TCA TCG AGG GCG CWG CC) Y cts-Rp (TGA TCG GTT TGA TCT CGC ACG
G).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo ai siguiente esquema (~I):
•
Agua Mq
14,7
dNTPs lOmM
0,5
Pagina 28 de 50
Instructivo Tecnlco para el muestreo y diaqnosttco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de fa plaga en kiwi
•
•
•
•
•
Buffer lOx
2,5
MgCl z 50mM
1,0
Primer cts-Fp 10pmol
2,5
Primer cts-Rp 10pmol
2,5
Taq platinum
0,3
Muestra
1,0
C6digo: D-PD-PE-OOS
Version :02
La mezcla se prepara considerando el volumen por tubo y la cantidad de muestras
y controles a ampliflcar.
Adernas de las muestras a analizar, se debe Incorporar un control negativo blanco
(control agua) y un control positivo de Psa.
Una vez preparado el mix proceder a reallzar la arnpllflcaclon de acuerdo a los
siguientes ciclos:
94°C
3 min
94°C
2 min
56,5°C
1 min
noc
noc
1 min
35 ciclos
5 min
A partir de la ampllflcacion anterior reallzar un nuevo PCR utllizando los partidores
cts-Fs (CCC GTC GAG CTG CCA ATW CTG A ) Y cts-Rs (ATC TCG CAC GGS GTR TTG
AAC ATC).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
Agua Mq
14,7
dNTPs 10mM
0,5
Buffer lOx
2,5
MgCl z 50mM
1,0
Primer cts-Fs 10pmol
2,5
Primer cts-Rs 10pmol
2,5
Taq platinum
0,3
Muestra
1,0
Pagina 29 de 50
Instructivo T,f!cnico para el muestreo y diaqnosttco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
Codlqo: D-PD-PE-OOS
Versi6n:02
La mezcla se prepara considerando el volumen por tuba y la cantidad de muestras
y controies a amplificar.
Adernas de las muestras a analizar, se debe incorporar un control negativo blanco
(control agua).
Realizar la amplificaci6n de acuerdo a los siguientes ciclos:
•
•
•
•
94°C
3 min
94°C
2 min
56,5°C
1 min
noc
noc
1 min
}
35 ciclos
5 min
Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.
Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrilfico.
Gen constitutivo gyrB
•
Realizar la extracci6n de ADN de colonias tal cual se indica para PCR.
•
La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores gyrBFps (MGG CGG YAA GTT CGA TGA CAA YTC) Y gyrB-Rps (TRA TBK CAG TCA RAC
CTT CRC GSG C).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
•
•
Agua Mq
14,7
dNTPs 10mM
0,5
Buffer lOx
2,5
MgCI250mM
1,0
Primer cts-Fp 10pmol
2,5
Primer cts-Rp 10pmol
2,5
Taq platinum
0,3
Muestra
1,0
La mezcla se prepara considerando el volumen por tuba y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Peoine 30 de 50
Instructivo T'ecrrlco para el muestreo y diagnostico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oflcial de la plaga en kiwi
•
•
C6digo: D-PD-PE-OOS
Version :02
Adernas de las muestras a analizar, se debe incorporar un control negativo blanco
(control agua) y un control positivo de Psa.
Realizar la amplitlcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:
94°C
3 min
94°C
63°C
2 min
1 min
1 min
noc
noc
}
35 ciclos
5 min
•
Reaiizar eiectroforesis y enviar a secuenciar.
•
Ingresar los correiativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
Gen efector hrpKl
•
•
•
Realizar la extraccion de ADN de colonias tal cuai se indica para PCR.
La arnpllftcaclon dei ADN se reaiiza mediante un PCR utilizando los partidores
hrpK1-F (GAC ART GCC GAC AAG GAC K) Y hrpK1-R (ATC KGC GGT TTG CAG AGA
CT).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
Agua Mq
dNTPs 10mM
0,5
Buffer lOx
2,5
MgCI,50mM
1,0
Primer hrpK1-F 10pmol
5,0
Primer hrpK1-R 10pmoi
5,0
Taq platinum
Muestra
•
•
•
10,25
0,25
0,5
La mezcla se prepara considerando ei volumen par tuba y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Adernas de las muestras a analizar, se debe Incorporar un control negativo blanco
(control agua) y un control positivo de Psa.
Realizar la arnpllftcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:
Pagina 31 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
95°e
5 min
95°e
64°e
noe
2 min
30 seg
72°e
5 min
1 min
}
Codlqo: D-PD-PE-OOS
Versi6n:02
35 ciclos
Reallzar electroforesls y enviar a secuenciar.
Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de peR, adjuntando el
registro fotoqrafico.
g) cillculo y Expresi6n de Resultados
•
•
•
•
•
•
•
•
Se conslderara un aislamiento negativo a Pss 0 Psa si no hay desarrollo de
colonias sospechosas en ninguna de las placas de medio de cultivo.
Se conslderara un aislamiento sospechoso a Pss 0 Psa cuando exista desarrollo de
colonias de caracteristicas similares a Pseudomonas syringae.
La fluorescencia puede ser positiva 0 negativa.
Las colonias aisladas edemas de ser Gram negativas y tener forma bacllar, deben
presentar el siguiente perfil LOPAT:
Prueba
Pss
Psa
L
Levano
(+)
(+)
0
Oxldasa
(-)
(-)
P
Pudrici6n Papa
(-)
(-)
A
Arginina Dihidrolasa
(-)
(-)
T
Hlpersensibilldad Tabaco
(+)
(+)
Un resultado positivo al perfil LOPAT indica que la muestra esta posltiva a
Pseudomonas syringae.
Para el caso de aislamientos que presenten colonias con fluorescencia positiva en
medio B de King y resulten ser Gram negativas, oxidasa negativa, de forma bacilar,
pudrlcion en papa positivas, levano negativas e hipersensibilidad en tabaco
positlvas, se deberan enviar cultivos puros al Laboratorlo de Referencia del SAG
para complementar diagn6sticos.
Se considerara un diagn6stico negativo a Psa si no hay presencia de banda de
amplificaci6n de 280 bp para los primers PsaFl/R2.
Se conslderara un diagn6stico probablemente positivo a Psa cuando existe
presencia de banda de amplificaci6n de 280 bp para los primers PsaFl/R2.
Pagina 32 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnosttco de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
g)
C6digo: D-PD-PE-OOS
verstcruuz
Diagnostico Final
•
Se considerare un dlaqnosflco positivo a Pss si hay desarrollo de colonias
sospechosas en las placas de medio de cultivo, hay correspondencia con las
pruebas LOPAT y no hay presencia de banda de arnpliflcaclon de 280 bp para los
primers PsaFl/R2.
•
Se conslderara un dlaqnoatlco positivo a Psa cuando los aislamientos presenten
un perfil LOPAT correspondiente a Psa, existe presencia de banda de arnpliflcacion
de 280 bp para los primers PsaFl/R2 y los resultados de secuenciaclon de genes
constltutivos y efectores se corresponden con un haplotipo de Psa.
9.2.4 PCR directo
a)
Extraccion de ADN a partir de tejido vegetal
Pueden utilizarse diferentes kits comerciales de extraccion de ADN de baeterias que
existen en el mercado, as! como otros procedimientos descritos en la literatura
cientifica, que aseguren una extraccion de calidad y confiable.
No obstante 10 anterior y de acuerdo a los buenos resultados obtenidos, a contlnuaclon
se detalla el procedimiento sugerido, para realizar la extracclon de ADN (protocolo de
extracclon de ADN publicado por L10p et al.,1999)
•
Dilacerar 0 machacar las muestras y agregar dos veces el peso de la muestra en
tampon AFT.
•
•
•
Mantener en hielo y aqitacion por 20 a 45 minutos.
Tomar 1 ml del macerado y centrifugar a 13.000rpm/5min.
Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 ul de tampon de
extracclon de ADN. Agitar mediante vortex y mantener en aqttaclon durante lhra a
temperatura ambiente.
Centrifugar a 5.000rpm/5min. Tomar 450 jJl del sobrenadante y colocar en un
nuevo tubo, Agregar igual volumen de isopropanol. Invertir varias veces y dejar 1
hora a temperatura ambiente.
Centrifugar a 13.000rpm/5min. Descartar el sobrenadante y dejar secar a
temperatura ambiente.
Resuspender el pellet en 200 jJl de agua.
•
•
•
b) PCR
•
La arnplificaclon del ADN se realiza utilizando el par de primers PsaFl (TTT TGC TTT
GCA CAC CCG ATT TT) Y PsaR2 (CAC GCA CCC TTC AAT CAG GAT G).
• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
Aaua Ma
7,7
dNTPs 10mM
0,5
Buffer lOx
25
Pagina 33 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
•
MqCl250mM
1,50
Primer PsaF1 10 ornol
125
Primer PsaR2 10 omoi
125
Tao olatinum
030
Muestra
100
La mezcla se prepara considerando el voiumen por tube y la cantidad de muestras
y controles a ampiificar.
Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de arnpllficacion se debe
incorporar un control negativo blanco (control agua), un control negativo de Pss y
un control positivo de Psa.
Realizar la ampliftcaclon de acuerdo a los siguientes cielos:
noc
2 min
30seg
30seg
30seg
72°C
5 min
95°C
95°C
65°C
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Codiqo: D-PD-PE-005
Version:02
}
30 cicios
Proceder a realizar la electroforesis, con el fin de visualizar si hubo arnplificecion de
muestras y controles.
Preparar el gel de electroforesis disolviendo, en tampon TAE, agarosa al 2% y
agregando gel red a una concentraclon aproximada de 0,005%.
Tomar 5 a 10 [11 de cada tube amplificado y mezelar con tampon de carga.
Cargar en cada bolsillo del gelS a 10 [11 de la mezela obtenida en el punta anterior.
Tomar aproximadamente 2 [11 de marcador de peso molecular 50 bp y mezelar con
tampon de carga. Cargar esta mezela en el gel.
Proceder a correr el gel a 80 0 mas Volts. Observar bajo luz UV la presencia de
bandas luminosas y obtener registro fotogrMico.
En primer lugar se debe examinar el control negativo, el cual no debera presentar
bandas. Si hay presencia de bandas de amplificaclon se debe repetir ei proceso de
arnpllflcaclon.
Posteriormente se debe comparar el marcador molecuiar con la posicion de la
banda obtenida por el control positivo. Si no hay presencia de banda de
arnpllficaclon de 280 bp se debe repetir el proceso de arnpliflcaclon.
Una vez veriflcados los controles se observa en los carriles de las muestras la
presencia 0 ausencia de bandas de arnpllflcacion de 280 bp.
La presencia de banda determlna el PCR positive, sin ser necesariamente la
muestra positiva a Psa.
•
Ingresar los correlatlvos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
•
Se puede utllizar como alternativa PCR en tiempo real con los mlsmos partidores.
Peqin« 34 de 50
Instructivo Tlknico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
c)
C6digo: D-PD-PE-005
Version :02
Presencia genes constitutivos y efectores
Gen constitutivo cts
•
•
•
•
•
Realizar la extracci6n de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica para PCR
(9.2.4 a)
La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando ios partidores cts-Fp
(AGT TGA TCA TCG AGG GCG CWG CC) Y cts-Rp (TGA TCG GTI TGA TCT CGC ACG
G).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
Aqua Mq
10 7
dNTPs 10mM
as
Buffer lax
2,5
MoCI,50mM
1,0
Primer cts-Fo 10omoi
25
Primer cts-Ro 10omoi
2,5
Taq olatinum
03
Muestra
5,0
Adernas de las muestras a anallzar, en cada reacci6n de amplificaci6n se debe
incorporar un control negativo blanco (control agua) y un control positive de Psa.
Reaiizar la amplificaci6n de acuerdo a los siguientes ciclos:
94°C
3 min
94°C
56,5°C
2 min
1 min
1 min
noc
noc
•
•
}
35 ciclos
5 min
A partir de los amplificados reaiizar un nuevo PCR can ios partidores cts-Fs (CCC
GTC GAG CTG CCA ATW CTG A) Y cts-Rs (ATC TCG CAC GGS GTR TIG AAC ATC).
Proceder a preparar ei mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
Agua Mq
14,7
dNTPs 10mM
as
Buffer lax
25
MoCi,50mM
10
Primer cts-Fs
25
Primer cts-Rs
2,5
Tao
0,3
Muestra
1,0
Pagina 35 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
•
Versi6n:02
La mezela se prepara considerando el volumen por tubo y la cantldad de muestras
y controles a amplificar.
Adernas de las muestras a anallzar, en cada reacclon de ampllflcaclcn se debe
Incorporar un control negativo blanco (control agua).
Una vez preparado el mix proceder a realizar la arnpllflcacion de acuerdo a los
siguientes cielos:
94°C
94°C
56,5°C
72°C
noc
•
•
C6digo: D-PD-PE-005
3 min
2min
1 min
1 min
5 min
}
35 cielos
Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.
Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
Gen constitutivo gyrb
•
•
•
Realizar la extracclon de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica para PCR
(9.2.4 a).
La arnpllflcacion del ADN se reallza mediante un PCR utilizando los partidores gyrBFps (MGG CGG YAA GTT CGA TGA CAA YTC) Y gyrB-Rps (TRA TBK CAG TCA RAC
CTT CRC GSG C).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):
Aoua Mo
•
•
•
107
dNTPs 10mM
05
Buffer lOx
25
MoC1 250mM
Primer cts-Fo
10
25
Primer Cts-RD
25
Tao
0.3
Muestra
50
La mezela se prepara considerando el volumen por tubo y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de ampliflcacion se debe
incorporar un control negativo blanco (control agua) y un control positive de Psa.
Una vez preparado el mix proceder a realizar la arnpliflcacion de acuerdo a los
siguientes cielos:
Peqine 36 de 50
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
94°C
3 min
94°C
63°C
2 min
1 min
72°C
noc
1 min
5 min
C6digo: D-PD-PE-OOS
Verstcntuz
}
35 ciclos
•
•
Una vez terminado el programa proceder a colocar los tubas a 5±2 oC.
Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.
•
Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
Gen efector hrpKl
•
•
•
Realizar la extracci6n de ADN tal cual se indica para PCR (9.2.4 a).
La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores
hrpKl-F (GAC ART GCC GAC AAG GAC K) Y hrpKl-R (ATC KGC GGT TTG CAG AGA
CT).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):
Aqua Mq
5,75
dNTPs 10mM
o5
Buffer lOx
2,5
MoC!,50Mm
Primer hroKl-F
10
5,0
Primer hroKl-R
Taq
5,0
025
Muestra
•
•
•
•
50
La mezda se prepara considerando el volumen par tuba y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Adernas de las muestras a analizar, en cada reacci6n de amplificaci6n se debe
incorporar un control negativo blanco (control agua), un control negativo de Pss y
un control positivo de Psa.
Una vez preparado el mix proceder a realizar la amplificaci6n de acuerdo a los
siguientes clclos:
95°C
5 min
95°C
2 min
64°e
noe
noe
30 seg
1 min
}
35 ciclos
5 min
Una vez terminado el programa proceder a colocar los tubas a 5±2 oe.
Pagina 37 de 50
Instructivo Tlf!cnico para el muestreo y dlaqndstico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
C6digo: D-PD-PE-OOS
Version:02
Realizar electroforesis y enviar a secuenciar
Ingresar 105 correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
d) Calculo y Expresion de Resultados
Se conslderara un diagnostico negative a Psa si no hay presencia de banda de
arnpllftcaclon de 280 bp para ios primers PsaFl/R2.
Se conslderara un diaqnosttco probablemente positivo a Psa cuando existe
presencia de banda de arnpllflcaclon de 280 bp para 105 primers PsaFl/R2.
•
•
e)
Diagnostico Final
Se conslderara un diagnostico positivo a Psa cuando exista presencia de banda de
arnpliflcaclon de 280 bp para 105 primers PsaFl/R2 y 105 resultados de secuenclaclon
de genes constitutivos y efectores se corresponden con un haplotipo de Psa.
•
9.2.5 PCR en tiempo real
a) Extraccion de ADN a partir de tejido vegetal
Pueden utilizarse diferentes kits de extracclon de ADN de bacterias 0 procedimientos
descritos en la literatura cientifica, que aseguren una extraccion de calidad y confiable.
A contlnuaclon se indica el procedimiento sugerido, para realizar la extracclon de ADN:
• Agregar a la muestra 5 ml de tampon CTAB y moler mediante homogenizador.
• Dejar decantar unos minutos y tomar 1 ml en un vial libra de DNasas.
•
Proseguir de acuerdo al kits de extracclon InviMag Plant DNA mini Kit.
b)
Ampllflcacion
La arnpllflcacion del ADN se realiza utilizando el par de primers PsaFl (TTT TGC TTT
GCA CAC CCG ATT TT) Y PsaR2 (CAC GCA CCC TTC AAT CAG GAT G) Y 105 controles
internes COX-F (CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA) Y COX-R (CAA CTA CGG ATA TAT
AAG AGC CAA AAC TG).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):
•
•
Aqua Mq
25
EvaGreen Reaction Mix
50
Primer PsaFl 511M
05
Primer PsaR2 511M
05
BSA I Ornq/rnl
05
Muestra
10
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Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
•
•
•
•
•
c)
Version :02
Realizar el mismo mix, pero remplazando los primer PsaF1/R2 por los partidores
internes COX.
Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de arnplificecion se debe
incorporar un control negativo blanco (controi agua), otro negativo de tejido
vegetai, un control negative de Pss y un control positivo de Psa.
Realizar la arnpliflcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:
98°C
98°C
65°C
60°C
83-98°C
•
Ccdlqc: D-PD-PE-005
2 min
5seg }
7 seg
40 clclos
7seg
Incremento 0,5 0C cada 2seg
En primer lugar se debe examinar el control negativo de agua, el cual no debera
amplificar. En caso contra rio se debe repetir el proceso de arnplificaclon.
Luego verificar para el control negativo de planta que la arnpllftcacion sea negativa
para Psa y positiva para los controles internos.
Posteriormente verificar para el control negativo Pss que la ampllflcaclon sea
negativa para Psa y negativa para los controies internos.
Una vez verificados los controles se observa si hubo 0 no arnpllficacion en las
muestras. Para el caso de los controles internes la arnplificaclon siempre debe ser
posltlva, en caso contrario se debe repetir la muestra tanto para Psa con para el
control interno.
La presencia de ampliflcacion determina el PCR positivo, sin ser necesariamente la
muestra positiva a Psa.
Presencia genes constitutivos y efectores
Gen constitutivo cts
•
•
•
Realizar la extracclon de ADN tai cual se indica en punto 9.2.5 a.
La arnpllflcaclon del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores cts-Fp
(AGT TGA TCA TCG AGG GCG CWG CC) Y cts-Rp (TGA TCG GTT TGA TCT CGC ACG
G).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):
Aqua Mq
107
dNTPs lOmM
05
Buffer lOx
25
MqCI,50mM
10
Primer CtS-FD 10Dmol
25
Primer CtS-RD J.Dnrnol
2,5
Taq platinum
0,3
Muestra
5,0
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
94°C
3 min
94°C
56,5°C
2 min
1 min
1 min
•
35 cielos
5 min
A partir de los amplificados realizar un nuevo PCR con los partidores cts-Fs (CCC
GTC GAG CTG CCA ATW CTG A ) Y cts-Rs (ATC TCG CAC GGS GTR TTG AAC ATC).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (IJI):
147
dNTPs 10mM
as
Buffer lax
MqCI250mM
25
Primer cts-Fs
Primer cts-Rs
Tao olatinum
Muestra
2,5
25
03
1,0
10
La mezcla se prepara considerando el volumen por tube y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Una vez preparado el mix proceder a realizar la amplificaci6n de acuerdo a los
siguientes cielos:
94°C
94°C
56,5°C
noc
noc
•
•
Versi6n:02
}
Aoua Mo
•
O-PO-PE-OOS
Realizar la amplificaci6n de acuerdo a los siguientes cielos:
noc
zz-c
•
c6digo:
3 min
2min
1 min
1 min
5 min
}
35 cielos
Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.
lngresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando ei
registro fotografico.
Gen constitutivo gyrb
•
•
•
Realizar la extracci6n de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica en el punta
9.2.5 a.
La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores gyrBFps (MGG CGG YAA GTT CGA TGA CAA YTC) Y gyrB-Rps (TRA TBK CAG TCA RAC
CTT CRC GSG C).
Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (IJI):
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
Aqua Mn
•
•
•
•
•
Codlqo: D-PD-PE-OOS
Version :02
107
dNTPs 10mM
05
Buffer lOx
25
MoC!,50mM
10
Primer cts-Fo
Primer cts-Ro
Tao olatinum
Muestra
25
25
o3
50
Adernas de las muestras a analtzar, en cada reacclon de arnplificaclon se debe
incorporar un contral negativo blanco (controi agua) y un control positivo de Psa.
Una vez preparado el mix praceder a realizar la arnpliflcaclon de acuerdo a los
siguientes ciclos:
94°C
94°C
3 min
63°C
1 min
noc
noc
1 min
2 min
}
35 ciclos
5 min
Una vez terminado ei programa proceder a colocar los tubos a 5±2 oC.
Realizar electraforesis y enviar a secuenciar.
Ingresar los correlativos de las muestras en el registra de PCR, adjuntando el
registro fotogrMico.
Gen efector hrpKl
•
•
•
Realizar ia extraccion de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica en el punto
9.2.5 a.
La arnpllflcaclon del ADN se realiza mediante un PCR utllizando los partldores
hrpK1-F (GAC ART GCC GAC AAG GAC K) Y hrpK1-R (ATC KGC GGT TTG CAG AGA
CT).
Praceder a preparar el mix PCR de acuerdo ai siguiente esquema (~I):
Aqua Mn
575
dNTPs 10mM
0,5
Buffer lOx
2 5
MoCI,50Mm
1 0
Primer hmK1-F
5,0
Primer hrnK1-R
5.0
Tao olatinum
Muestra
0,25
5.0
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
•
•
•
•
•
•
Codlqo: D-PD-PE-OOS
Version :02
La mezcla se prepara considerando el volumen por tuba y la cantidad de muestras
y controles a amplificar.
Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de arnpliflcacion se debe
Incorporar un control negativo blanco (control agua) y un control positivo de Psa.
Una vez preparado el mix proceder a realizar ia arnpliflcaclon de acuerdo a los
siguientes clelos:
95°C
95°C
64°C
5 min
2 min
30seg
noc
noc
1 min
5 min
}
35 cielos
Una vez terminado el programa proceder a colocar los tubos a 5±2 0 C.
Realizar electroforesis y enviar a secuenciar
Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el
registro fotograFico.
d) catculo y Expresion de Resultados
5e conslderara un dlaqnosfico negative a Psa si no hay arnpllflcaclon con los
primers PsaF1/R2 y hay arnpllficacion con los partidores internes COX.
5e conslderara un dlaqncstlco probablemente positive a Psa cuando hay
ampllflcaclon con los primers PsaF1/R2 y hay arnptiflcacion con los partidores
internos COX.
d) Diagnostico Final
• 5e conslderara un diagnostico positive a Psa cuando exista ampllflcaclcn con los
primers PsaF1/R2 y arnpllflcacion con los partidores internes COX, y los resultados
de secuenclaclon de genes constitutivos y efectores se correspondan con un
haplotipo de Psa.
9.2.6 PCR en tiempo real alternativos
EI metoda de tiempo real alternativo verificado hasta la ernision de este instructivo es
dnature, el cual corresponde a un kit comercial para Psa-V, sin embargo, de ser
necesario, pueden verificarse mas metod os alternativos.
a)
Extraccion de ADN a partir de tejido vegetal
A coritlnuaclon se indica el procedimiento sugerido, para realizar la extracclon de ADN:
•
Tomar la muestra y moler, de preferencia con nltroqeno Iiquido.
•
Transferir 50-100 mg a un vial y agregar 400 ul, de Buffer GPX1 y 4 ul, de 5MB y
homogenizar.
•
5eguir el procedimiento de acuerdo a 10 especificado en el Kit (adjunto).
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Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
C6digo: D-PD-PE-OOS
verston.oz
b)
Amplificacion
• La ampliflcaclon del ADN se realiza utilizando ei kit dnature, de acuerdo ai siguiente
esquema (J-lI):
Aqua Mq
PsaV orimer mix 20X
qPCR master 2X
Muestra
•
•
Adernas de las muestras a analizar, se debe incorporar un control negativo blanco
(control agua), otro negativo de tejido vegetal, un control negativo de Pss y un
control positivo de Psa.
Realizar la arnpllftcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:
95°C
95°C
60°C
•
•
•
•
•
c)
•
•
d)
•
7,0
10
10,0
2,0
3 min
15 seg
30 seg
}
43 clclos
En primer lugar se debe examinar el control negativo de agua, el cual no debera
amplificar. En caso contra rio se debe repetir el proceso de arnpllflcaclon.
Luego verificar para el control negativo de planta que la arnpllflcacion sea negativa
para Psa y positiva para los controles internos.
Posteriormente verificar para el control negativo Pss que la arnpliflcacion sea
negativa para Psa y negativa para los controles internos.
Una vez verificados los controles se observa si hubo 0 no arnplificaclon en las
muestras. Para el caso de los controles internos la arnpllflcacion siempre debe ser
positiva, en caso contra rio se debe repetir la muestra tanto para Psa con para el
control interno.
La presencia de arnplificacton determina el PCR positive, sin ser necesariamente la
muestra positiva a Psa.
Calculo y sxpresten de Resultados
Se conslderara un diaqnosttco negativo a Psa si no hay arnpliflcacion con los
primers PsaV y hay ampllflcaclon con los partidores internos COX.
Se conslderara un diagnostico probablemente positivo a Psa cuando hay
arnpllflcacion con los primers PsaV y hay arnpltflcaclon con los partidores internos.
Diagnostico Final
Se conslderara un dlaqnosflco positivo a Psa cuando exista arnpllflcacion positiva
con los primers PsaV y arnpliflcacion positiva con los partidores internos del kit, y
adernas, se obtengan resultados de secuenclaclon de genes constitutivos y efectores
que se correspondan con un haplotlpo de Psa, para las 5 primeras muestras
positivas.
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
•
Codiqc: D-PD-PE-OOS
Version:02
Se entendera que despues de las primeras 5 muestras positivas el metoda estara
completamente estandarizadD por el laboratorio autorizado.
Para la secuenclaclon de genes constitutivos y efectores remitirse ai punto 9.2.5 c
de este instructivo.
9.2.7 Porrnulaclon medios de cultivo y tampones
a)
Medios de Cultivo
King B (ajustar a pH 7.2)
•
K2 HP0 4
• MgS0 4*7H 20
• Glicerol
• Proteosa peptona N°3
• Agar
• Agua
SNA (ajustar a pH 7.0 -7,2)
• Extracto levadura
• Bacto peptona
• NaCI
• Sacarosa
• Agar
• Agua
CSGA (ajustar a pH 7.0)
• Casarnlnoacldo
• K2 HP0 4
• MgS0 4*7H 20
• Sacarosa
• Geiatina
• Agar
1,5 9
1,5 9
10 mL
20 9
20 9
1 Lt
2g
59
59
50 9
20 9
1 Lt
10 9
19
19
10 9
30 9
20 9
Levano
Medio SNA conteniendo 5% de sacarosa
Arginina dihidrolasa
•
•
•
•
Peptona
Extracto de ca rne
Fosfato de piridoxal
Purpura de bromocresol
5g
5 9
0,005 9
5 mi (sol. acuosa a 1 por 500)
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Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
•
Rojo de cresol
2,5 ml (sol. acuosa a 1 por 500)
•
•
•
Glucosa
Agua destilada
Disolver y ajustar el pH a 6.0
0,5 9
1 Lt
•
•
Afiadir L( +) arglnina HCI
10 9
Distribuir de 6ml por tuba y autoclavar.
b)
Ccidigo: D-PD-PE-OOS
TAMPONES
AFT
•
NaCI
• NaH2P04*2 H2 0
•
Na2HP04* 12H 20
• Agua
8 9
0,4 9
2,7 9
1Lt
Tampon extraccion de ADN PCR Convencional
• Tris HCL, pH 7,5
24,2g
• NaCI
14,6 9
• EDTA
9,3 9
• 5DS
59
•
Polyvinil pyrrolidone PVP-10
20 9
• Agua destilada ajustar volumen a 1 Lt.
Tampon CTAB
• CTAS 2,5% (w/v)
• Tris-HCI 100mM
•
EDTA 50mM
• NaCI 1,4M
• PVP-40 1% (w/v)
25 9
100 ml de Tris-HCL 1M, pH 8,0
100 ml de EDTA 0,5M, pH 8,0
82 9
10 9
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verston.oz
Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico de
Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
9.3
Codigo: D-PD-PE-OOS
Version:02
FORMULARIOS
9.3.1 Formulario de ldentlflcaclon de personal que conforma equipos de
muestreo y de analista(s) del laboratorio vinculado(s) al diagnostico
Personal oara las labores de rnuestreo:
Nombre completo
NO de cedula de
Cargo (Jefe
identidad
eguipo/apoyol
Firma
Identificaci6n del analista(s):
Nombre completo
N° de cedula de identidad
Firma del postulante
Fecha recepci6n SAG:
0
Firma
su representante legal
"
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
C6digo: D-PD-PE-OOS
Version:02
9.3.2 Declaraci6n jurada para la designaci6n del laboratorio autorizado que
prestara servicios al vivero de kiwis
Por el presente instrumento, yo
................................................ Cedula de identidad N°
de
nacionalldad
,
con
.
,
domicllio
en
,
, personal encargado del vlvero de plantas de kiwis
, declare bajo juramento:
................... ,
comuna de
de la empresa
1Que todas las muestras vegetales obtenidas de las plantas mad res de kiwis
inscrltas por el vivero antes indicado para la certificaci6n fitosanitaria libre de Psa, que
estan ubicadas en la comuna de
deberan ser enviadas al
siguiente laboratorio autorizado para que realice el diagn6stico de la bacteria Psa
Nombre
0
Raz6n social:
..
Nurnero y afio de su resoluclon de autorizaci6n vigente:
Direcci6n:
.
Correo electr6nico:
Telefonc:
.
.
.
2Que ante una modificaci6n en la designaci6n del laboratorio autorizado,
lnforrnare al SAG en un plazo no superior a 48 horas, el nombre del nuevo laboratorio
acreditado al cual el Servicio debera enviar las muestras.
Nombre
Personal encargado Vivero
0
representante legal
Laboratorio autorizado
Fecha recepcion SAG:
.
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
C6digo: D-PD-PE-OOS
Version:02
9.3.3 Formulario modelo de Declaraclcn de plantas mad res
usa EXCLUSIVO
SAG
FOUOU'
DECLARACION DE MUESTREO ANUAL DE PLANTAS MADRES
PARA DIAGNOSTICO DE PSA (HOJA 1)
TEMPORADA:
I OfICI!tA, I
IREGIOU
,
EI
AIl1<cc<lomO$ <1<1
t""'\""'"~
'''"'"'~''''''''
"""po"""" ~~(l
~'",
..
II'
WI'", Sit
R",:n
.....
1!WOUllUO' OO'I!I<! ~'I""!.:I. P a"l"~"'"
""' ,""
tj,mc~.". P"'''''t""n''J"/ .~rc
rl:m"H ·:on\-J;J.M I,;ai,a
M.
Fn.
jj:rr.:J'~
·~n
:.s~n::~U"lC
E.'.'"
~rn'O~(I<erur
C"""lotu:b:t
un.' IC,llm, we",f.;,
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~¢lli:"W;xlor",e~"
1l,",,,,~T.!to'"
tl,'Tl~"
"-e,,,,,,'o.>!"" H",~""
SOLO Sf D!'1!EU OEClARAR l-/IS PWITAS
~lADRES QUE:
• tlO Sf EI/(UErrTilEUUBICAOAS Ell HUERTas POSITIVOS
• Sf EU:UWTRfll flTOS""IITARlAMElI1E SMIAS 15\11 SlllfOMAS DEBACTERIOSIS>
[C'''-;I:'O<;C",,,,,,,
f""""fo,
ESTADECLAAACI'JII, SOLOSfRA \lALIDAOA SI es ACOMPAIJAOA POR:
.:.'.rr(:'<.::~::Ct, DE r,'C,J::",R::O 1',,0'" ET~HIO "'"-::D'O
C;:i("':"IJI~ :;."..1.
;.:CEDEfl;. !-1JERE, O,,':VIV,C<) y OI"~::J~ICC'1 O'::;:ACII.L CE (:.I.QI. L'/;:' na(.,I.e' P~t.T"':lII,CWID~ Ell LA D::C'~;'F""CIC:II
oe can, un:, C'E~~~Pl..AljTA!:; r.~OF£o; DECl.M'....r>;.!:;:AM DiAG'jO~T,:ODEPSA
C;;QCIJI~ ~,,~:. DI~p::s;:rJII O'~:,:':I:'L
lIi)rM:;Rf.PR()PlrrARJOI~'
VIVERO
fiRMA PROPIETARIOlSIVIVERO
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Instructivo Tecrrico para el muestreo y diagn6stico de
Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
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Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco
del control oficial de la plaga en kiwi
C6digo: D-PD-PE-005
version-Oz
9.3.4 Formulario modele de Programa de toma muestras para dlaqnosttco de Psa
Lo"O ·T~Tcero Al;fWibdu To",,,,
de MU<O:itnt Pdf.:! Mu=trt:o y
dllH.ln(l~tlctl
PROGRAI-1A TOr·1A DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DE
cl ... 1"=0;'"
PSEUDOMONAS S\'RINGAE PV, ACTINIDIAE CPS-A)
Fecha:
ANTECEDENTES TERCERO AUTOR.J.ZAOO
(E.mi~or)
Nornbr .. ·Terceru Aulorl;".du
Ncmbn: R=pon""'ble Tecnko
Din:ct:i6n Dntin e ! Com un..
F. .
Tdefono
(~)
(fijol rna ...ll)
Numbre del Hu=-trelOdor {JerI:: eQuipo)
r."lconc (::.) mvvil dt: corrt.s ct.c
IOENTIF1CAClON Of. PRf.DIOS A HU.E.STREAR
FECHA Of;
HUESTRf.O
COMUNA
NOMDRf. DEL PR£DIO
NOMBRE DEL
PRODUCTOR
SU:P£RFlCl£
VARll'OAO
{His}
YlPO
MUESTR£O
(HUUtTO/
PLANTAS
HAORES)
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ESTIMACION
PLANTAS