aumento de la apertura numérica efectiva en microscopía

AUMENTO DE LA APERTURA NUMÉRICA EFECTIVA EN MICROSCOPÍA
CONFOCAL MEDIANTE FILTROS ANULARES DE TRES ZONAS
C. Ibáñez-López 1, M.T. Caballero 2, G. Saavedra 1, L. Muñoz 1 y M. Martínez-Corral 1
1
Departamento de Óptica, Universidad de Valencia, 46100 Burjassot
2
Departamento de Óptica, Universidad de Alicante, 03080 Alicante
1. Introducción.
Los sistemas confocales de barrido se emplean con ventaja en la obtención de imágenes
de especímenes tridimensionales por su elevada capacidad de seccionado óptico. Sin embargo, la resolución de estos sistemas presenta una fuerte anisotropía ya que es netamente
mejor en las direcciones transversales que a lo largo del eje óptico. Para paliar este efecto, se
han propuesto algunas soluciones para estrechar la respuesta impulsional (RI) de estos sistemas en la dirección axial basándose en variantes del esquema confocal clásico [1,2]. En la
misma dirección, se han propuesto también diversas técnicas de apodización mediante el uso
de filtros pupilares en la rama de iluminación del dispositivo, bien puros de amplitud [3], o
bien puros de fase [4,5]. El inconveniente del uso de estos filtros es que se produce un estrechamiento axial del lóbulo central de la RI de iluminación pero a costa de un incremento de la
altura de los lóbulos laterales de la misma. Sin embargo, la característica “confocal” del sistema reduce fuertemente estos lóbulos laterales en la RI final del microscopio. A pesar de
ello, en las técnicas de microscopía confocal por fluorescencia —en particular aquellas que se
basan en procesos a un fotón—, la energía concentrada en los lóbulos laterales de la RI de
iluminación produce un blanqueado de las muestras que puede comprometer la utilidad de los
filtros empleados.
En esta contribución presentamos el diseño de un filtro pupilar binario de amplitud,
compuesto por tres coronas circulares transparentes concéntricas. El empleo de esta máscara
permite estrechar el lóbulo central de la RI del sistema manteniendo bajo control la altura de
sus lóbulos laterales. Por ello, si se emplea en la rama de iluminación de un microscopio confocal, proporciona una mejora sustancial de la capacidad de seccionado óptico minimizando el
deterioro de la muestra por blanqueo. La comparación de las simulaciones realizadas con los
resultados obtenidos sin apodización permite establecer un aumento efectivo de la apertura
numérica del sistema, asociado exclusivamente al empleo de este tipo de filtros.
2. Teoría básica.
Considérese el sistema confocal que se
muestra en la Fig. 1. En dicho sistema la
muestra fluorescente es iluminada por un haz
monocromático, de longitud de onda λ ,
fuertemente focalizado. Dicho haz se supone
linealmente polarizado al salir del emisor (láser), con un ángulo de polarización ϕ . La luz
emitida por fluorescencia a un fotón, completamente despolarizada, es focalizada sobre
Fig. 1. Esquema de un dispositivo confocal convencional.
un detector puntual. La RI del sistema confocal viene dada por
I conf (r , z;ϕ ) = I il (r , z;ϕ ; λ )·I det (r , z;ϕ ; ελ ) = hil (r , z;ϕ ; λ ) · hdet (r , z;ϕ ; ελ )
2
2
.
(1)
En esta ecuación, hil (r , z;ϕ; λ ) representa la RI en amplitud del sistema de iluminación,
mientras que hdet (r , z;ϕ; ελ ) representa la de detección. El parámetro ε = λ / λdet aparece debido a la diferencia entre la longitud de onda de excitación y la de fluorescencia. Estas respuestas pueden obtenerse, a partir del conocimiento de la transmitancia del filtro pupilar, a
través de las fórmulas de Richards y Wolf [6]. En particular, la IR axial del sistema de iluminación viene dada, independientemente del ángulo de polarización ϕ , por
α
cosθ 

hil (r = 0, z;ϕ ; λ ) = ∫ A(θ ) (1 + cosθ ) exp i 2πn
z  sin θ dθ
λ


0
(2)
,
donde A(θ ) representa la función de apodización del filtro pupilar, n es el índice de refracción del medio y α el ángulo de semiapertura del objetivo del microscopio. Realizando la siguiente transformación nolineal
ξ=
cosθ − cosα
− 0'5
1 − cosα
,
Q(ξ ) = (1 + cosθ ) A(θ )
,
(3)
la Ec. (2) puede reescribirse como
+0 '5
 1 + cosα

h'il (r = 0, z N ;ϕ ; λ ) = (1 − cosα ) exp i π
z N  ∫ Q(ξ ) exp(i 2πξ z N ) d ξ
 1 − cosα
 −0'5
,
(4)
donde se ha expresado la posición axial en el volumen focal en términos de la variable adimensional normalizada z N = n(1 − cosα ) z / λ . La Ec. (4) indica que la RI axial de iluminación está gobernada por la transformada de Fourier unidimensional de la versión modificada
de la transmitancia en amplitud del filtro pupilar, Q(ξ ) . Así pues, el procedimiento que seguiremos en el diseño de este filtro para controlar la respuesta axial del microscopio confocal
se apoyará exclusivamente en las propiedades de esta transformación de Fourier.
3. Diseño óptimo de filtros anulares de tres zonas.
La familia de filtros que estudiaremos corresponde a funciones transformadas Q(ξ ) como la representada en la Fig. 2.
Estos filtros estarán constituidos por una abertura central circular
rodeada por dos regiones anulares transparentes concéntricas. Cada elemento de la familia vendrá caracterizado por dos parámetros, a saber, la transmisión conjunta del disco interior y del
anillo exterior, µ , y la correspondiente al anillo intermedio, b .
Fig. 2. Función Q(ξ ) de la familia
de filtros considerada.
Para la selección óptima del filtro de la familia anterior para
su uso en microscopía confocal por fluorescencia a un fotón nos fijaremos en dos magnitudes.
Por un lado, consideraremos la ganancia axial, G A , definida como el cociente entre las anchuras a media altura de las respuestas axiales de iluminación con y sin el filtro pupilar. Por otro
lado, tendremos en cuenta el cociente γ entre la máxima altura de los lóbulos laterales y la
del lóbulo central de la RI axial de iluminación con apodización. Como función de mérito
emplearemos el cociente G A / γ cuyo valor máximo en términos de los parámetros de diseño
µ y b determinará el filtro óptimo. El resultado de esta maximización conduce a unos valores µ = 0'55 y b = 0'15 . Este filtro proporciona unos valores G A = 1'14 y γ = 0'18 .
4. Aplicación en microscopía confocal por fluorescencia a un fotón.
Para analizar las mejoras que introduce el filtro diseñado simulamos numéricamente su comportamiento en un
microscopio confocal por fluorescencia a un fotón con parámetros de funcionamiento λ = 350 nm, ε = 0'8 y una
apertura numérica n sin α = 1'40 . La Fig. 3 muestra los resultados calculados de la IR 3D del sistema, suponiendo que
en detección no se emplea ningún filtro pupilar mientras que
se usa nuestro filtro óptimo en iluminación. El resultado obtenido sin el empleo de dicho filtro se muestra también en
esta figura, observándose la clara reducción del ancho de la
IR conjunta del sistema en la dirección axial. Por último, en
la Fig. 4 se ha representado la intensidad integrada proporcionada por nuestro filtro y por dos sistemas no apodizados.
Ya que esta función caracteriza la verdadera capacidad de
seccionado óptico de un microscopio, en dicha figura se observa claramente que nuestra propuesta proporciona la misma
resolución axial que un sistema no apodizado de una apertura
numérica sensiblemente mayor de la empleada realmente en
el sistema apodizado.
Fig. 3 Valor calculado de la IR 3D confocal obtenida usando nuestro filtro (a)
y sin apodización (b).
Agradecimientos
Los autores agradecen la ayuda financiera proporcionada por el Plan Nacional I+D+I del Ministerio de Ciencia y
Tecnología (Proyecto DPI 2000-0774). C. Ibáñez-López disfruta de una beca FPI financiada por la misma institución.
Referencias
[1] E. H. K. Stelzer y S. Lindek, Opt. Commun. 111 (1994)
536.
Fig. 4 Intensidad integrada calculada para el
filtro propuesto y para dos sistemas sin apodizar, en función de la coordenada axial
[2] S. Hell y E. H. K. Stelzer, J. Opt. Soc. Am. A 9 (1992) 2159.
[3] M. Martínez-Corral, P. Andrés, C. J. Zapata-Rodríguez y M. Kowalczyk, Opt. Commun.
165 (1999) 267.
[4] M. A. Neil, R. Juskaitis, T. Wilson, Z. J. Laczik y V. Sarafis, Opt. Lett. 25 (2000) 245.
[5] C. J. R Sheppard, Opt. Lett. 24 (1999) 505.
[6] B. Richards y E. Wolf, Proc. Royal Soc. (Londres) A 253 (1959) 358.