Departamento de Fisiología Humana Facultad de Medicina

Departamento de Fisiología Humana
Facultad de Medicina
Universidad Complutense
MADRID
DIFERENCIACION DE LA RETINA DE LOS VERTEBRADOS: CICLO CELULAR,
MORFOGENESIS Y DETERMINACION DEL CONTENIDO EN DNA DE LOS
FOTORRECEPTORES. ESTUDIO EN LA RATA.
Angela Morón Alejandre
Director;
Codirector:
Carmen Erada ~lena
Rosario López López
Departamento de Fisiología
Facultad de Medicina
Universidad Complutense de Madrid
Madrid, Septiembre 1992
Departaifiento de Fisiología Humana
Facultad de Medicina
Universidad Coifiplutense
MADRID
DIFERENCIACION BELA RETINA DE LOS VERTEBRADOS: CICLO CELULAR,
MORFOGENESIS Y DETERI4INACION DEL CONTENIDO EN DNA DE LOS
FOTORRECEPTORES. ESTUDIO EN LA RATA.
Trabajo realizado por Angela Morón Alejandre, en el Departamento
de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad
Complutense de Madrid, bajo la direccion de la Dra. Carmen Prada
E len a.
Edo. Carmen Prada Elena
Profesora Titular de Biotogla
Facultad de Medicina
Edo. Angela Morón Alejandre
Licenciada en Medicna
Madrid, septiembre de 1992
FACULTAD
UNIVERSIDAD
DE
MEDICINA
COMPLUTENSE
CIUDAD UNIVERSITARIA
2S040 MADRID
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
D.
FRANCISCO J. RUBIA VILA, Catedrático de Fisiología y
Director del Departamento de Fisiología de la Facultad de
Medicina de la Universidad Complutense de Madrid
CERTIFICA:
Que el trabajo de Dña. Angela Horón Alejandre, titulado: “Diferenciación de la retina
de los vertebrados: ciclo celular, morfogé—
nesis y determinación del contenido en DNA
de los fotorreceptores. Estudio en la rata”,
ha sido realizado en este Departamento
y
cumple los requisitos necesarios para optar
al grado de Doctor.
Para que conste, y a instancias de la interesada firmo el
presente certificado en Madrid a veintiocho de septiembre
de mil novecientos noventa y dos.
Edo.
F.J.
Rubia Vila
FACULTAD
DE
UNIVERSIDAD
CIUDAD
MEDICINA
cOMPLUTENSE
UNIVERSITARIA
~BO4D
MADRID
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGíA
na.
CARMEN PRADA ELENA, Profesora Titular del Departamento
de Fisiología Humana de la Facultad de Medicina de la
Universidad Complutense de Madrid
CERTIFICA:
Que la Tesis Doctoral titulada: “Diferencia—
ci6n de la retina de los vertebrados: ciclo
celular, morfogénesis
y determinación del
contenido en DNA de los
fotorreceptores.
Estudio en la rata”, que presenta D~ Angela
Morón Alejandre para optar al grado de Doctor ha sido
Madrid,
y dos.
realizada bajo
su direccion.
veintiocho de septiembre de mil novecientos
Fdo.
noventa
Carmen Prada Elena
Esta investigación ha sido financiada a través del
proyecto PS 87—0033 de la Dirección General de Inves—
tiagación Científica y Técnica, y de los proyectos
88/1684 y 89/0063 del Fondo de Investigaciones Sanitarias (Investigador principal: Dha. Carmen Prada Elena)
Quisiera
Carmen
hacer
Prada,
trabajo,
no
constar
mi agradecimiento
sólo por aceptar
sino por su dedicación,
ellos no hubiese
a
mi
de este
lado para
cuando
Vigara,
Juan
por
apoyo y estímulo
darme el
Ignacio
la
por
su
Dr~
de
este
PUES Sin
colaboración
trabajo y porque en
todo
apoyo que todos
empezamos a movernos
A
la dirección
la
sido posible realizarlo.
A la Dr~ Rosario López
dirección
a
en el
Medina,
estimable
en
momento
estuvo
necesitamos
mundo de
la
tanto
la ciencia.
Merit,<ell
López
acogida y ayuda
que
y
me
Rosa
han
bri ndado.
A la
Dr~ AsLínción Colino,
han hecho posible
Finalmente
paciencia
porque sus consejos y ayuda
mi permanencia
quiero agradecer
y comprensión
en
la investigación.
a mi
familia
que me han prestado.
y amigos la
En memoria de mi
sobrino Carlos y mi
amigo
Pepe.
INDICE
1.
INTRODUCCION
1. 1
LA
RETINA
FUNCION
1.2
1.4
III.
VERTEBRADOS:
ESTRUCTURA
Y
2
Segmento
Cilio de
Segmento
Membrana
Soma
Fibra de
Terminal
externo
conexión
interno
limitante
conexión
sináptico
14
17
19
20
25
25
27
27
externa
con
el
terminal
sináptico
FUNCION DEL LOS FOTORRECEPTORES:
FOTOTRANSDUCC ION
DIFERENCIACION
¡.4.1
1.4.2
II.
LOS
ESTRUCTURA DE LOS FOTORRECEPTORES
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6
1.2.7
li3
DE
DE LAS CELULAS
29
FOTORRECEPTORES
Neurogénesis
Morfogénesis
38
40
4E
OBJETIVOS Y DISE~O DE LOS EXPERIMENTOS
MATERIALES
111.1
Y METODOS
e e
MATERIALES
uu
ce
111.1.1 Material
biológico
111.1.2 Productos qLIímicos y enzimas
111.1.3 Instrumentos
111.2
u U
uu
56
57
METODOS
111.2.1
111.2.2
111.2.3
111.2.4
Animales de experimentación
Nuevo método de disociación
Método de Golgi Colonnier
Método de determinación del
de DNA
57
57
60
celular
contení do cel
LIl
ar
61
IV.
RESULTADOS
IV. 1
METODO DE DISGREGACION CELULAR DE LA RETINA
66
IV.2
COMPORTAMIENTO DE LOS NEUROBLASTOS
PRECEPTORES
BO
DE LOS FOTO-
IV.2.1
Estudio del comportamiento de los neuroblas—
de los fotorreceptores
por
disociación ce—
11.11 ar
IV.2.1.1
Clasificación de las formas y
cuantificación de las mismas
IV.2.2 Estudio del comportamiento de los neuroblas—
tos de los fotorreceptores
por el método
de
Gol qi
IV.3
Y.
ESTUDIO DEL CONTENIDO
lORES
81
90
98
EN DNA DE LOS FOTORRECEP—
108
DISCUSION
V.1
V.2
V.3
V.4
Método de disociación celular
Comportamiento de los neuroblastos de
los
fo—
torreceptores
Clasificación de las formas y cuantificación de
de las mismas
Contenido en DNA de los fotorreceptores
115
122
131
134
VI.
CONCLUSIONES
146
VII.
BIBLIOGRAFíA
149
1.
INTRODUCCION
1. 1
LA RETINA DE LOS VERTEBRADOS:
La retina de los vertebrados
tejido nervioso
tuada en el
les
luminosas
ojo.
que
inmediatamente
través del
nervio
óptico.
todas las retinas de
en una
impulsos
cerebro
a
es muy similar
I.1)~
nuclear
ópticas,
Es por lo tanto una estructura
a
otras
externa,
externa
la
2
interna
en capas,
porciones
for-
y plexiforme
más
como modelo experimental
1091 a.
nuclear
Sus prolongaciones
plexiforme
y la capa de fibras
Los somas
en
en
man dos capas plexiformes:
que ofrece ventajas
de
de sus neuronas están dispuestos
ganglionares.
respecto
las sega—
y
interna y de células
mente sencilla
serie
si-
<núcleo
(Fig.
todas.
de
de grosor,
es recibir
Su estructura
tres capas nucleares
interna,
lámina
son enviados al
los vertebrados.
bordeante)
Y FUNCIONO
fina
0,4 mm
SLI función
y transformarlas
nerviosos
citoplasma
es una
de aproximadamente
fondo del
ESTRUCTURA
del
de
relativacerebro
y
en neurobio—
La retina
está
fotorreceptores,
<Fig.
de
<1892),
células
del
clases
de neLironas
bipolares,
amacrinas,
y ganglionares
de
Dogiel)
conocimiento
la retina
y
desplazadas,
células
Cajal
clases
en
de neuronas
de
Múller
prácticamente
cada
veinte
todos
clase
aaos
buen
descubrió
interpíexiformes,
(células
que hoy tenemos
lo debemos
realizados
vertebrados.
de
siete
de gUa
1.2).
estructura
las
ganglionares
llamadas
Gran parte
las
por
horizontales,
interpíexiformes,
también
formada
de
a los
la
de
dos
y
astroglía).
tipos
de neuronas.
tipos
de
se han hecho aportaciones
célude gUa
Además
describió
de células
embargo,
de
todas
las
células
y subtipos
Sin
especies
menos
la
de Cajal
ampliamente
retina,
y
los
trabajos
número
y estudió
sobre
en los
dentro
últimos
importantes,
como
son:
1>
El
descubrimiento
Gallego
1971;
de
las
Dowling
células
y col.
interpíexiformes
1976;
Kolb
y
West
1977).
2)
El
estudio en
amacrinas
mayor
profundidad
desplazadas
< Genis—Gálvez
Hughes y Wieniawa—Narkiewiez
1993)
y de las
(EILInt
y col.
y col.
1989;
células
1974;
1980;
ganglionares
Bunt
Prada y col.
4
de las
y Minckler
1992).
y
células
col.
Balí
1977;
y Dickson
desplazadas
1977;
Prada,
3)
La profundización
en el
sidad
de células
amacrinas
y col.
19B1;
La mayoría
nen dos
nes.
tipos
de
más
células
externa
de estas
desarrollo
y función
(Fig.
te
soma en
al
contactos
los
1.3>.
En
los
de esta
con
las células
tesis
es
dedicamos
a Lina breve
revisión
mismas,
el
el
es-
apar-
de la es—
en diferentes
tienen
especies
su soma formando
(la más externa
Sus dendritas
con
y con
de la
las
las
>
y
prolongaciones
capa plexiforme
primates
hay una única
-J
lateralmen-
de la retina
dendritas
par-
de la capa nuclear
se extienden
plano horizontal
sinápticos
a nivel
las
la rata.
¡.1).
el
con
La
que la porción
células,
horizontales
fotorreceptores
bipolares,
y
de estas
la primera fila
interna
1.1).
interactúa
mientras
objetivos
de las
en
Las células
de
<Fig.
Sus
<Fig.I.3).
introducción
particularmente
te
<Fig.I.2).
establece contactos sinápticos
tado 2 de esta
tructLlra
células
pigmentaria,
basto-
vítreo—pigmentaria,
la capa nuclear
Dado que uno de los
del
en
contie-
conos y
en dirección
y bipolares
< Kolb
vertebrados
retina
externa
horizontales
tudio
de los
la
de la retina
más interna
y ganglionares
fotorreceptores:
en forma radial
de la diver-
19B6).
retinas
alargadas
somas constituyen
porción
las
de células
Son células
dispuestas
Masland
conocimiento
de
hacen
internas
las
externa
clase
y
de
células
<Figs.I.2
de
célula
FIGURA 1.2 Esquema que muestra los tipos de células de la
retina de los vertebrados, observados en preparaciones de
Golgi.
b, bastones;
c, conos; bi, células bipolares;
h,
células horizontales;
a,
células amcrinas;
al,
células
amacrinas invertidas; g, células ganglionares; i,
células
interpíexiformes;
nares desplazadas;
de Dowling
D, células
de Dogiel
M, células
gliales
1970 y modificado>.
ó células
de
Múller.
ganglio<Tomado
horizontal
Gallego
de
la cual
,
1976a,b).
los conos,
posee
axón
Sus dendritas
mientras
su
existe
otra
de
esta
clase
que carece
las células
mediante
1975;
con los pedículos
parece
sinaptar con
horizontal
<Leure—Dupree
horizontales
sinapsis
y Sobrino
las
En el resto de los vertebrados
de célula
de axón
sinaptan
axón
esf érul as de los bastones.
<Gallego
sin
eléctricas
con axón y
1974).
axón se
Las
dendritas
conectan
<gap—junctions),
además
entre
sí
formando
un
plexo por toda la retina.
Las células
clear
interna
que se
(Fi g.
orientan
ción externa
capa
con
los
prolongación
plexiforme
nares
las
1.2
externa,
interna,
permanece
clasificara
bastones.
Las
en la
ret ma.
se ramif ica
y ¡.3
dando dendritas
-fotorreceptores
interna
soma en la capa nu—
que salen dos prolongaciones
verticalmente
se
y
que
células
Su clasificación
invariable
en bipolares
bi polares
desde
para
para
qu e
conos
conos,
externa
exclusivamente
con
pl cxi forme
interna
con ganglionares
y
los
plexi forme
interna.
en
hacen
de
hacen
la capa plexiforme
en distintos
7
la
cone—
Su
capa
ganglio-mono—
< 1892
Cajal
y bipolares
para
conectan
en
la
conos
en
la
y
amacrmnas.
estra tos
de
Las bipolares para bastones
externa
de
la
con criterios
plexiforme
contactos
a nivel
horizontales.
ni vel
rami -fica a
La prolonga—
donde conecta con las células
y amacrinas.
lógicos
tienen su
1.1), del
<Figs.
plexiforme
xiones
bipolares
con bastones
la
Estos
capa
conectan
exclusivamente
OPE
cpI
FIGURA 1.3 Esquema que muestra las conexiones
sinápticas
entre las seis clases de neuronas de la retina de
los
vertebrados. 5, bastones; C, conos; H, células
horizontales; Si, células bipolares; A, células amacrinas; 6, células ganglionares; IP, células
interpíexiformes; p,
células de la pigmentaria; OPE, capa plexiforme externa;
CPI,
capa plexiforme interna. <Tomado de Dowling 1970 y modificado>.
y en la capa plexiforme interna con las
amacrinas del tipo A!!. De
bastones
las
las células ganglionares como lo hacen las bipolares
para
a
través
de
las
bipolares,
en
gan
hasta
membrana
la
longación
tico
de
que
la
sinápticos
bipolares para
con
sino
contactos
que
células
directamente
conos,
no hacen
modo
llamadas
las
amacrinas
vertebrados no
se
capa
desde
plexiforme
Algunas
mamíferos,
limitante
extiende
~II.
externa
el
se
de
prolon-
por una pro—
ramillete dendrí—
externa
a
la
limitante;
esta prolongación se conoce con el nombre de maza
de Lan-
dolt,
el
y su significado funcional se desconoce por
mento.
Con frecuencia se encuentra que la prolongación ex-
terna de estas células se considera dendrita,
la
interna
axónico
es considerada
<característica ultraestructural
Leure— Dupree
dos clases de célLílas bipolares
Tipo II para conos ) en
extensión
del
árbol
mientras que
como axón aunque carece
los axones). En la rata,
ción
mo-
< Tipo 1
función
dendrítico
de
cono
que poseen todos
<1974)
describió
para
bastones y
de la posición del soma,
y longitud
de
la prolonga-
interna.
Las
células
amacrinas
tienen
sus
somas colocados
mayoritariamente en la capa nuclear interna,
se disponen
ocupando
ximadamente <Fig.
las amacrinas
ganglionares
tercio
interno
de esta capa, apro-
¡.1>. Sin embargo una población de célu—
tienen
y
el
Generalmente
sus
somas entre los de las células
se las conoce con el
9
nombre
de
células
amacrinas
desplazadas
O invertidas
<Fig.
1.2).
Las dendri-
tas de las células amacrinas situadas normalmente,
den
sus
dendritas
plexiforme
interna
en los
y hacen
distintos estratos de la capa
contactos
sinápticos
con las células bipolares y contactos
Además algunas
células
recíprocos
sinápticos
cionales con otras células amacrinas y
glionares.
con
amacrinas
para
como hemos indicado
tan entre sí y con las
células
bipolares
mente>
para
bipolares
gan—
especialmente
<amacrinas que conectan con las
anterior
conven—
células
las de tipo AII
bastones,
extien-
diante sinapsis eléctricas <Massey y Redburn
conec—
conos me—
1987;
LeLire—
Dupree 1974>. Las células amacrinas también hacen sinapsis
con las células interpíexiformes
su vez
devuelven
información
<Fig.
1.3),
las cuales
a la capa pl exi forme
a través de contactos sinápticos
a
externa
con las células horizon-
tales y con las bipolares <Dowling 1979).
Cajal
amacrinas
<1892> describió una gran diversidad de células
<hasta
morfológicos
se
pensó
14 tipos
Hasta
finales
que la diversidad
amacrinas
eran
meras
sabemos
descrito
neuropéptido
diversidad
que
por
morfológica
diferente
morfológica
de
de
de
un
criterios
los
a?fos 60
las
células
tipo
celular
Con las técnicas de neuroquimica
prácticamente
Cajal
usando
de la década
variantes
homogéneo funcionalmente.
hoy
diferentes)
utiliza
cada
un
<Masland
de
amacrina
neurotransmisor
1966>.
que describió
10
tipo
Cajal
Es
se ha
más,
o
un
la
ampliado
recientemente;
diferentes
de
basándose
el
Kolb
y col.
células
en el
<1961>
ainacrinas
tamaV<o del
han distinguido
en la retina
campo dendrítico
que terminan sus prolongaciones en la
22 tipos
del
y el
capa
gato,
nivel
en
plexiforme
interna. En la rata Perry y Walker <1960) encontraron nueve tipos de células amacrinas
siete
morfológicamente distintos,
de los cuales corresponden a células amacrinas des-
pl azadas.
Las células interplexiFormes tienen sus somas mezclados con los de las células amacrinas
nombre
se refiere
prolongaciones
la
en
al
hecho
<Figs.
de que estas
convencionales
<Dowling
abundantes
células
las
únicamente
1979).
En
centrífuga
sin
de
las
flujo
plexiforme
han
embargo,
células
1971,
interna
Walker 1960>,
a la
en la
su existencia
y
en
con
las
sinápticos
con
Las
tanto,
células
una
externa.
retina
los
peces
Estas
de
las
vía
desde
céluaves;
teleósteos y
<Dowling 1979), en el gato <Ga-
West 1977),
así como
lo
tienen
de información en la retina,
sido descritas
Kolb
amacrinas
externa
bipolares.
por
En
sinápticos
células
plexiforme
constituyen,
del
extienden
sinápticos (presinápticos>
en el mono del Nuevo Mundo
llego
contactos
las
Su
de la retina.
horizontales y algunos contactos
interpíexiformes
las no
de
la capa
contactos
dendritas
la capa
células
ambas capas plexiformes
capa plexiforme interna reciben
1.2 y 1.3).
y en
la
rata
<Perry
y
su especial sinaptología y su bien
11
conocida
fisiología
obligan a
en el
admitir
que
pez
dorado
<Dowling
se trata de una
19B6>,
nos
clase de células
existente en la retina de los vertebrados, con una función
característica.
Las células ganglionares tienen sus somas formando una
capa
¡.2
en el
y
margen interno
¡.3).
externo
de la retina
Sus prolongaciones
del
soma
<Fig.I.1
dendríticas
y se extienden en la
y
salen
capa
Figs.
del
polo
plexiforme
interna, donde reciben contactos sinápticos de las células
bipolares
para
células
conos y de
células
cerebro
por
medio de
las
en el
en tres
cott
gato
los tipos 1,
a
grandes,
ti enen
las
&
tipos
el
son 1
nancia
los
y
<Perry 1979,
campos
18 tipos
con criterios
O
han
12
tienen
somas
de Kolb
a
y
23
morfológicamente
está
en conso—
ganglionares
electrofisiológicos
Una población de células ganglionares
Las
más
incrementado
morfológica
células
Boycon
1981).
estudios
ganglionares
de
por
dendríticos
las
los
el gato,
di versidad
clasificar—
descritos
as más pequefías y
de
sirviendo
y que se corresponden
r ecientemente,
n Cimero
Esta
distinguen
gato,
somas
tambi én en
diferentes.
con
1 os
Más
<1981>,
en el
para
¡3
y II 1 de la rata
II
intermedios.
col.
<1974)
a,
visual
El tamai=o
variable,
como criterio
t ipos pr incipales:
y Wassle
células
y la rata
axón.
5L1
Las
.
información
de su soma y campo dendrítico es muy
éstos
amacrinas
transportan la
ganglionares
desde la reti na al
las
tiene
< Daw
que
se
1962
).
sus somas
co—
locados
fila
con el
entre los de las células amacrinas que
más interna de la capa nuclear interna.
nombre de células
lulas de Dogiel
critas
Se
conocen
ganglionares desplazadas o
1.2).
Estas células han
sido
morfológicas y
recientemente
des-
y col.
en el
pollo
ultraestructurales encontradas
por
Prada, y
(1992), junto con
los
col.
estudios
tran proyecciones específicas de estas células
de la raíz óptica basal, en
<Karten y col.1977),
el
sistema
hacen pensar
en
un
<1989)
que
al
función es por el
y
muesnúcleo
óptico accesorio
tipo
de células
ganglionares diferente a las normalmente localizadas,
cuya
momento desconocida.
Una parte de los resultados
tesis
cé-
prácticamente en todos los vertebrados. Las carac-
terísticas
Prada,
<Fig.
ocupan la
son contribuciones
a
un
que
mejor
presentamos
conocimiento
estructura de la retina de los mamíferos,
y
abren
en esta
de la
nuevas
perspectivas para el estudio de su estructura y función.
13
1.2
ESTRUCTURA DE LOS FOTORRECEPTORES.
Los
células
fotorreceptores
de la cadena
que forma
es la de transformar
ca.
Son células
de la retina
la energía
alargadas
y polarizadas: por un
la vía visual y su función
luminosa
en dirección
y funcionalmente
están
a lo largo del eje de la célula,
dirección
de
en energía
quími-
vítreo—pigmentaria,
extremo reciben la energía luminosa
y por el otro transmiten la información
estructural
son las primeras
química.
divididas
Además,
en segmentos
el cual es paralelo
los rayos luminosos que
inciden
sobre
a la
la
ret i n a.
Schultze <
primera
nes.
Los
vez,
con criterios
bastones
líndricos y
segmento
1B66 ) clasificó
de
los
morfológicos,
fotorreceptores por
en conos y basto-
tienen segmentos externo e interno ci-
diámetros
externo con
forma
14
similares.
Los conos tienen un
cónica y un segmento interno
cilíndrico
con un diámetro
Posteriormente,
forma
general
esta
por
mayor
segmento externo.
misma clasificación fue utilizada de
Cajal
<1692),
conos de las aves en rectos,
de microscopia
que el
óptica
quien
además clasificó
oblicuos y
posteriores
los
dobles. Trabajos
a los
de Cajal
<Polyak
1957;Duke—Elder
1956>, también coinciden en clasificar los
fotorreceptores
en conos y bastones.
Las
características
ultraestructurales de las dos clases de fotorreceptores se
conocieron
Sjbstrand
más tarde,
<1949,
principalmente por los trabajos de
1953a y 1953b,
1958),
Pedíer
y
Tansley
<1963), Pedíer y Tilly
<1967)
bargo en el pollo los
estudios
Shorey
<1970) muestran tres tipos de conos
<1967) y Morris
simples
en la salamanquesa. Sin
realizados
diferentes estructuralmente.
tes también en pollo
riedad es mucho
<López,
1991>
por
em-
Morris y
Trabajos mas recien-
muestran que esta va-
mayor, distinguiendo
claramente 12 tipos
de conos y uno de bastones.
La
tante
tables
estructura
diferencias
morfológicas
interespecíficas.
como fotorreceptor
descritas
tipo,
fotorreceptores
o
es cons-
aunque existen
< presumiblemente
Clásicamente
uno que incluye
se
todas
no-
también
describe
las estruc-
en los fotorreceptores de las diversas re-
tinas de los vertebrados,
conos
de los
en la mayoría de los vertebrados,
funcionales>
turas
general
bastones.
independientemente de
El fotorreceptor
prototipo
que
sean
<Fig.
¡.4>
consta de los siguientes elementos desde la parte más
15
ex—
Discos de membrana
Espacio intradiscal
Membrana plasmática
SEGMENTO EXTERNO
Espacio citoplásmico
Prolongación del segmento
interno (calical processes)
Cilio de conexión
Gota
lipidica
Mitocondria s
SEGMENTO
INTERNO
Aparato de Golqi
Gránulos de glucógeno
eticulo endoplásmico
Nivel de la membrana limitante
externa
Citoesqueleto
SOMA
Ndcleo
PROLONGAC ION INTERNA
TERMINAL
SINAPTICO
U
Ves!culas sinápticas
FIGURA 1.4 Estructura de un fotorreceptor ideal.
Es una
célula muy alargada en la que se distinguen compartimentos
o segmentos que contienen orgánulos diferentes que les
confieren
funciones distintas.
<Tomado de Stryer 1967 y
modificado).
terna a la más interna de la célula:
Segmento externo
Cilio
de conexión
• Segmento interno, el cual
nes del
incluye: Prolongacio-
mismo, Gota lipídica, Elipsoide,
Para-
boloide y Mioide.
Soma
-
Prolongación
Terminal
¡.2.1
El
cl eral
interna
sináptico
Segmento Externa
segmento
externo
se localiza
de la cél ul a y se encuentra
prolongaciones
compuesto
de
las células de
principalmente
cuya bicapa
lipídica
en la parte
rodeado
la
por
más
las
es—
largas
pigmentaria.
por los discos
de
Está
membrana,
se insertan los pigmentos
en
fotosensi-
bles: La rodopsina en los bastones y pigmentos similares a
ésta en los conos.
Los segmentos externos de los bastones son
cos,
de mayor
longitud y grosor
que los
éstos son más cortos y de forma cónica.
cilíndri-
de los conos;
en
En ambos casos los
discos se disponen de forma perpendicular al eje principal
del
fotorreceptor, lo cual permite
capturada
por un disco,
que la luz
sea capturada
por el
que no
siguiente.
flunque existen excepciones en las que los discos se
can
de
forma paralela < Fineran y Nicol
17
1978
es
).
coloEn los
bastones
los discos de membrana están desconectados de la
membrana
plasmática del segmento externo,
excepto en
región más interna donde se -forman continuamente a
de
la membrana basal del
Steingberg y col.1960).
generalmente
en
segmento externo
la
partir
(Nilsson 1964b,
En los conos los discos permanecen
contacto
Morris y Shorey 1967;
con
la
Cohen 1970,
1985,Carter—Dawson y Lavail
membrana
1972;
plasmática
Bailey y Gouras
1979a) por lo que también man-
tienen contacto con el medio extracelular.
Los discos más externos son fagocitados por las células de la
pigmentaria
fagocitosis
se
mecanismo
cada 24 horas.
produce
por
la maT~ana a
desencadenado por la luz.
por la noche y el mecanismo lo
<Young 1967,
En los bastones la
través
En los
de
conos
un
ocurre
desencadena la
obscuridad
1971; Bailey y Gouras 1965;Lavail
1976,1980).
La renovación
de los discos de membrana se produce a par-
tir de la membrana plasmática de la porción basal del segmento externo, a nivel
cidad de
monos,
ratas
y ratones,
El proceso
piensan
brana plasmática
evaginación
los discos
velo-
son completamente
segmento externo cada
brana aún no se
autores
a una
3—4 discos cada hora (Bailey y Gouras 1985).
plazados en el
1976).
del cilio de conexión,
de la formación
conoce
con
que se produce
9 a 13
de nuevos discos
profundidad,
por
días
reem<Lavail
de mem-
mientras
invaginación
En
unos
de la mem-
<Nilsson 1964b>, otros piensan que es por
(Steingber y col.
18
1980; ~nderson
y col.
1978).
En algunas especies, como en la rana <Nilsson 1964b),
monos
(Boewein y col.
ratón
<Carter—Dawson y Lavail
nos de
los
1980>, ovejas
bastones
<Braekevelt 1963a)
1979a),
y
los segmentos exter-
presentan incisuras que dividen los
discos de membrana. A veces son utilizadas como distintivo
ultraestructural, pues los
tran, aunque
también se
Braekevelt
autores
19BZa
piensan
conos
han
en general no las mues-
observado en
algunos casos
Carter— Dawson y Laval! 1979). Algunos
que
estas
incisuras
perímetro de los discos y
por
podrían
tanto de
aumentar
el
la superficie de
membrana.
En algunas
1977),
especi es
adosada al
tura que contiene
cilio.
Esta
de
segmento
se
metabolitos
para
Cilio
externo
se halla
una
formando
une
especie
de
Bu función
se desco—
que podría constituir un canal
< Yacob
no se ha descrito
y col.
esta estructura.
de Conexión.
conecta
Este puente contiene
microtúbulos
estruc-
al segmento externo por
Tanto en conos como en bastones,
citoplásmico
una
el segmento externo
1977>. En otras especies
¡.2.2
Yacob y col.
puente citoplásmico.
ce, aunque se ha propuesto
de
( guppy:
microtúbulos,
estructura
medio de un fino
peces
el
estrecho
puente
con el
interno.
segmento externo
un cilio
modificado con nueve pares de
que han perdido el
co de otros cilios.
un
par central,
característi-
El cuerpo basal de este cilio es
19
uno
de los centriolos de la célula.
lateralizado
externo
y
constituye
<Rodieck
1973;
el
Generalmente se encuentra
eje principal dei
Greiner
y col.
Gouras 1965). El cilio de conexión es
constante
en todos los
Cohen 1972; Rodieck
1.2.3
una
fotorreceptores
1973; Morris
1961;
segmento
Bailey
y
característica
(Sjostrand
1953a;
y Shorey 1967>.
Segmento Interno.
El segmento interno de los fotorreceptores es la re-
gión comprendida entre el estrechamiento citoplásmico
contiene
el
cuerpo
basal del cilio
de
conexión
que
y
la
membrana limitante externa. Contiene la mayor parte de los
orgánulos
retículo
celulares:
mitocondrias,
endoplásmico liso,
aparato
de Golgi
acúmulos de glucógeno,
y
gotas
de lípidos, microtúbulos ,etc. Es una porción de citoplasma
por la que circulan
soma
las mol éculas que viajan
al segmento externo
inverso.
célula
y las que lo hacen
el
sentido
Se tienen evidencias de que es una porción de la
con una gran actividad
Las
en
desde
metabólica.
distintas regiones del
segmento interno
se
des-
criben a continuación de forma ordenada desde la parte más
externa a la más interna,
Pral ongaci ones
El
segmento
interno
de los
fotorreceptores
presenta
prolongaciones citoplásmícas ascendentes que salen a nivel
20
del
cilio de conexión y ascienden abrazando
externo4
Estas
aproximadamente
prolongaciones
calicales
<“calical
es ocasional
el
en su tercio inferior
segmento
<Fig.
también se han denominado
processes’9.
<Galbavy y Olson
En la rata
procesos
presencia
1979).
Ultraestructuralmente están formadas
mentos longitudinales
su
1.4>.
por
microfila—
(Cohen 1963a, Morris y Shorey 1967).
El número de estas prolongaciones citoplásmicas varía
gún la
se-
especie. En el poíío existe una única prolongación
<Morris
la rana
and Shorey 1967),
(Nilsson
pero en otras especies como en
1964a, Eorwein y col.19E0) y
nios <Pérez flrroyo 197B> hay varias.
los
quelo-
Su función es desco-
nocida, pero se ha propuesto que podrían servir de soporte
al
segmento externo
interno
para evitar
<Cohen 1963a).
su giro
También se ha propuesto
de protección del segmento externo
o también que podrían
de la luz que incide
y col.
sobre el
tener
( Reme y
algún efecto
segmento
una función
Young
en la
1977),
refracción
sobre los discos de membrana <Borwein
1980). Estas hipótesis no pasan de ser meras
supo—
sic iones.
En algunas
1966a;
1980
tortugas:
y aves:
prolongaciones
tante
especies
externa
crestas
de
vertebrados
Yamada 1960a;
Cohen 1963a>
citoplásmicas
primates:
a nivel
21
otro tipo
de la membrana
prolongaciones
flunn
Borwein y col.
se han encontrado
que han sido denominadas
laterales.Estas
( reptiles:
aletas,
bordean
de
limi-
aristas
o
la base del
segmento interno aumentando
considerablemente la superfi-
cie de la membrana celular. En cortes transversales, estas
aletas
da’
dan al segmento interno
<Pedíer y Tansley
1963).
una imagen de “rueda denta—
Se presume que su función
té relacionada
con el transporte
<‘<amada 196C’b,
Pedíer y Tansley
rata
no
se
ha
descrito
de
agua
y
metabolitos
1963, Dunn 1966a).
este
tipo
de
es-
En
la
prolongaciones
citoplásmi cas.
Gotas Lipídicas
Los segmentos internos
cies de vertebrados,
lipídicas.
de los conos de algunas
poseen en su parte
Estas se encuentran
cartilaginosos,
monotremas
y
placentarios
dipnoos,
<Rodieck
gotas
reptiles,
pero no existen
1973).
membrana y a su alrededor
más escleral
en retinas de peces óseos,
anfibios,
marsLlpiales,
espe-
Están
se disponen
en
aves,
mamíferos
rodeadas
por
una
las mitocondrias
del
el i psoi de.
En anfibios, reptiles y aves,
las gotas son
colorea-
das y los porcentajes de cada tipo varían según la especie.
El
color de las gotas se
constituyen.
absorción
Cada
debe a los
tipo
de
característico.
carotenoides que las
gotas tiene un
Hasta el
momento,
espectro
no
de
existe
consenso respecto a la función de las gotas lipídicas.
La
idea que parece estar mejor sustentada, con alguna experimentación, es
que
actúan como filtros.
Se ha demostrado
22
,..~n,S.’
1
e
ocflorl
oc~
~
rnmn
pni-rp
1 nS
m~ ~nn~
4n4nrrnrnn—
que las aves poseen fotorreceptores sensibles a la luz ultravioleta
<Graf y Norren 1974;
Goldsmith 1986). Otros au-
tores piensan que pueden estar implicadas en la corrección
de la aberración
(cristalino)
hombre,
cromática
amarillas
reducen
esta
<Bowmaker
1960).
Las lentes
de muchos animales,
aberración
a
incluido
cambio
de
el
perder
sensibilidad a la radiación ultra—violeta.
En
lo que se refiere a su origen,
la proximidad
éstas con las mitocondrias del elipsoide,
que
de
ha dado lugar a
se postule que se forman a partir de las mnitocondrias
<Berger 1965;
Otros
Ishikawa y ‘<amada 1969; Gayoso y col.
opinan
secrección
que
la
gota
aparece
como
<Pedíer y Tansley
mitocondrial
1978).
producto
1963).
de
Ninguna
de las dos propuestas ha sido aclarada experimentalmente.
El i psoi de
Tradicionalmente
de mitocondrias
se llama elipsoide al
situado
en la
porción
gran
más
acúmulo
externa
del
segmento interno.
La estructura
según las especies,
y densidad
así
como entre los mismos
tores de una especie. En los
1980)
son
colocan
ceptor
al argadas y al
de forma paralela
<Nilsson
1964a
).
de las mitocondrias varían
mamíferos ( Elorwein
igual
al
fotorrecep—
que en algunos
eje longitudinal
Pueden estar
y
anfibios
del
23
se
fotorre—
más o menos
tadas en el elipsoide o dispersas por el citoplasma
kevelt 1983a>.
col.
compac—
(Brae—
La función
de las mitocondrias
es de
sobra conocido
que es la de generar la energía que la célula
necesita.Su
especial concentración en el segmento interno, responde al
gran aporte energético que requiere
metabólica
de
esa
la elevada
porción de citoplasma
tráfico de mol éculas hacía el
y
actividad
el
intenso
polo externo de la célula.
Paraboloide
El paraboloide es una estructura granular que aparedel elipsoide.
ce inmediatamente por debajo
microscopia
membranas
gránulos
and
electronica demuestran que está
de
retículo
de glucógeno
Shorey
cisterna
Estudios
1967).
<Dunn 1965,
En reptiles
de glucógeno,
los fotorreceptores.
endoplásmico
liso
1966a y
y curiosamente
1966b;
el
cono
tiene
por
de
Morris
una
no aparece en todos
En el pollo se encuentra
los bastones y conos accesorios.
únicamente
En los anfibios sólo
paraboloide
y
únicamente los bastones <Nilsson 1964a).
se ha descrito
cargadas
también puede formar
en
accesorio
formado
de
en
quelonios
En mamíferos
no
esta estructura.
Mi oi de
Se denomina mioide a la
región más interna
del segmento interno comprendida
soide,
entre la base
<vitreal)
del elip-
<o del paraboloide en aquellos fotorreceptores
lo poseen)
y la membrana limitante externa
24
que
<no rotulado en
la Fig.
¡.4>.
Su nombre se debe a la capacidad
que presenta en respuesta a la ILIZ
zona,
<Young y Droz
En esta
1968),
pues en ella se
encuentran
partículas de ribonucleoproteinas de forma aislada
agrupadas,
fágicas.
vesículas
presumiblemente
o vacuolas
¡.2.4
granulosas
auto—
implicadas en el metabolismo de
célula <Morris and Shorey 1967;
Braekevelt
o
retículo endoplásmico y numerosos microtúbulos.
También se observan
la
<Rodieci< 1973>.
se realiza una gran parte de la actividad metabólica
celular
las
contráctil
Pene and
Knop
1960;
1983a).
Membrana Limitante Externa
Se entiende como membrana limitante externa, la línea
densa
que
se
transversales
uniones,
observa con microscopia óptica
de retina.
de tipo
‘zonula
en
cortes
Realmente está formada por
adherens”
de los
fotorreceptores
a las células de Múller y las mazas de Landolt de las
luías
bipolares
1963a; Morris
en las especies que
y Shorey 1967;
1973; Braekeveit
¡.2.5
El
Dowling
las
las
poseen,
cé-
(Cohen,
1970; Uga y
Smelser
l9BZa y 19B3b).
Soma
soma en los
fotorreceptores
está formado princi-
palmente por el núcleo rodeado de una delgada capa de
toplasma que contiene ribosomas.
microtúbulos
y
ci-
retículo
endopí ásmi co.
25
Dawson y Lavail
1979a; López,
5.
1991>.
En la
porción
de
Generalmente presenta forma oval
encuentra
situado
por
o
debajo de la
redondeada
membrana
y
se
limitante
externa. El conjunto de somas de todos los fotorreceptores,
como ya hemos dicho,
forman la capa nuclear
externa.
La
posición del soma respecto a la membrana limitante externa
varía
según
se
trate
de
conos o
diferentes grupos de vertebrados.
teleósteos,
bastones
anfibios
y
los
externa,
mientras
diurnas,
en el nivel
1967;
que los de los
más interno,
externa
Gallego
Dawson y Lavail
la
conos
mientras
el aparato
diatamente
capa
suelen
que los somas de
1892,
1975 y 1976;
soma
5.
de Golgi.
esta prolongación
En la
aparece
En los
porque el
escleral al
del segmento interno.
26
Morris
y
Carter-
porción
membrana limitante
de
ex-
o escleral
fotorreceptores
soma descansa
por debajo de la membrana limitante
aparato de Golgi
externo
Gayoso 1978;
1991).
con la
1972;
< también llamada prolongación externa
no tienen
los
sin embargo en reptiles y
<Cajal
1979a; López,
citoplasma que une el
se aloja
peces
el soma de
conos se distribuyen en los estratos medio y
Shorey
los
son los bastones los que mantienen el soma
de la capa nuclear
terna
de
Así en mamíferos,
aves nocturnas,
ocupar el estrato más escleral;
siempre
y
se sitúa a distintos niveles dentro de
nuclear
aves
bastones
que
inme-
externa,
el
núcleo, en la base
¡.2.6
Fibra de conexión con el terminal sináptico.
Es la fina
prolongación
de citoplasma que existe en-
tre el soma y el terminal sináptico.También se conoce simplemente
función
como
de la posición
ceptores,
interna.
Su longitud
si
externa,
como ocurre
el caso de los bastones y conos principales
<Morris y Morey 1967; López,
a considerarlo
En
su
microtúbulos
1991>. En los
del
fotorrecep—
hasta una longitud
lo que ha conducido a ciertos
interior
se
y vesículas
Terminal
del
encuentran
sinépticas,
autores
neurofilamentos,
cuerpo sináptico.
sináptico
ternas de los fotorreceptores.
bipolares en la capa plexiforme
terminaciones
Establecen
nápticas con las dendritas de las
in-
conexiones si—
células horizontales
y
externa. Se denomina “es—
férula” al terminal de los bastones y “pedículo”
gulares
de
éstas más abundantes
Los terminales sinápticos son las
conos,
pollo
como axón.
en la proximidad
1.2.7
5.
mamíferos alcanzan
10(1 pm <Cohen 1972).
en
el soma ocupa la posición
dentro de la capa nuclear
tores de algunos
varía
que ocupe el núcleo de los fotorre—
pudiendo no existir
más interna
en
prolongación
al de los
en base a sus formas redondeadas y cónicas o trianrespectivamente.
Los cuerpos sinápticos
alcanzan
distintos niveles en la capa plexiforme externa,
según se
27
trate de conos o bastones. Generalmente las
de los
terminaciones
bastones ocupan el estrato más escleral,
que las de los conos
interno.
En
peces
sinaptan
teleósteos,
en
los
mientras
niveles
medio
en mamíferos y
en
e
aves
nocturnas, sólo existen dos niveles, el más externo al que
llegan
los
bastones y el más interno al que
conos. Sin embargo,
en
aves diurnas los
llegan
los
fotorreceptores
tienen tres niveles de terminación, el más externo formado
por las prolongaciones de los bastones y conos dobles;
nivel
medio
formado por las terminaciones de
los
el
conos
rectos y el nivel interno formado por las terminaciones de
conos oblicuos
<Cajal 1992;
Gallego 1975 ; Gallego y col.
1975a>.
Los pedículos de los conos contienen
culas sinápti cas de 300—600 A de di ámetro,
numerosas vesíuna o
dos lar-
gas mitocondrias y escasas bandas sinápticas. Las
las de los bastones tienen vesículas sinápticas
900 A de diámetro, peque~as
es-férude
mitocondrias y las bandas si—
nápticas que son más numerosas <Leure—Dupree 1974;
y Shorey 1967).
28
400 a
Morris
¡.3
FUNCION DE LOS FOrORRECEPTORES: FOTOTRANSDUCCION.
Los
fotón,
fotorreceptores son capaces
la menor cantidad
reacciones
posibí e. Una
amplifica esta peque~ísima
transformarla
(Stryer
de luz
en
1967).
seF~al
La
útil
captura
segmentos
externos.
La
segmentos
externos
y la
exhiben
funciones
para
de
membrana
absorben
la
eléctrica,
generando
de los discos
de
los
externa
<plasmática)
aunque
íntimamente
la s moléculas
la
impul
so
éstas
ganglionares,
transmi ten
y éstas
la
la
de
la seF=al química
nervioso
información
protei cas
respuesta
transmite como seF~al química a las in terneuronas
tina
nervioso
los
inician
un
hasta
en
excitación. La membrana externa convi erte
en
de
ocurre
distintas,
e
solo
cascada
sistema
luz
membrana
luz
un
información
el
la
relacionadas. Los discos contienen
que
de captar
a
las
que
se
de la re—
células
llevan hasta los centros cerebra—
les de la visión.
En las membranas que
constituyen
29
los discos de
los
bastones
sina,
se encuentra
una mol écul a protei ca llamada rodop—
con una estructura
de la bicapa lipídica
fotón
y genera la
reacciones
disposición
(Fig.I.5
específicas
dentro
La rodopsina absorbe un
).
respuesta
(Rig.I.6).
que son: el
y
inicial
de una
cascada
de
Esta proteína tiene dos componentes
lí—cis retinal, que es una
molécula
orgánica
derivada de la vitamina Ñ, y la opsina, que es una proteína
capaz de desempeaar funciones enzimáticas.
Cuando el
11—cts retinal absorbe un
configuración
11—trans
conformación
en
activada
molécula
la
la
retinal
molécula
de
e
de
fotón, adopta
induce
un
opsina,
rodopsina.
cambio
la
de
quedando
así
Seguidamente,
la
rodopsina activada interactúa con la proteína transducina,
formada
gamma),
por
la
tres subunidades
proteicas
(alfa,
cual constituye un intermedario
beta
y
en
la
clave
cascada excitadora. Esta interacción provoca la conversión
del 51W en GTP,
determina
porción
complejo
en la subunidad alfa de la transducina, y
también
que la subunidad alfa se separe de
enzimática
formada por el
GTP—subunidad alfa
fosfodiesterasa
subunidades:
específica
alfa,
a
cíclico.
Debido
canales
beta—gamma.
de la transducina,
< también
activa
formada
beta y gamma), retirándole
inhibidora gamma.
entonces
complejo
la
por
El
una
tres
la subunidad
La fosfodiesterasa así activada empieza
escindir
a
gran
que
número de
el GMPc
moléculas
mantiene
de sodio de la membrana plasmática
30
de
GMP
abiertos
los
del
segmento
externo
cuando
disminución
cierre
de
de
GMPc
Na+
el
al
el
bastón,
la
<por acción de la luz>
provoca
el
bloquea
la
denominada
una
por lo tanto,
del
bastón
diferencia
hiperpolarización.
pues
sobre
se
interior de la célula. Esto
interior
produciéndose
responde
incide la luz
estos canales;
entrada de
negativo
no
al
descenso de
iones
Na+.
que
de
hace
el
exterior,
potencial
Esta
más
negativa
hiperpolari2ación
la
permeabilidad
de
la
La
hiperpolarización
se
membrana
a
los
transmite
a
lo largo de la membrana
externa,
hasta
el
terminal sináptico en el otro extremo de la célula.
La subunidad
actividad
alfa
alfa de la transducina
ATPasa> hidroliza
se reasocia
con la unidad
la fosfodiesterasa.
rarse
Fig.I.6
la
seF~al
externa,
).
molécula
de
La
la rodopsina,
del
el
bastón
subunidad
reensambla
antes
mediador
hasta
GMP cícli co,
tiene
para recupe—
que presentaba
Por tanto,
desde los discos
es la
GTP en SUP.
cual
beta—gamma y se
Se inactiva
luego la configuración
activación
el
<la
la
que lleva
la
3’,
de
membrana
5’
guanosí n
monof osf ato.
En esta cascada
damentales
de reacciones
que contribuyen
qui ere para que la absorción
ex isten
dos pasos fun—
a la ampli ficación
de un úni co fotón,
que se
genere
re-un
impulso nervioso:
1)
Por parte
de
una
producen centenares
única molécul a de
de complejos
32
rodopsina,
activos
se
alfa—trans—
ducina—GTP,
lo que
constituye
el
primer
paso
de la
amplificación.
2>
Cuando la alfa—transducina—GTP
desencadena la
acti-
vidad de la fosfodiesterasa, no se produce amplifica—
ci ón, pues
tiva
cada unidad alfa—transducina
una sola fosfodiesterasa,
se une y ac-
pero cada molécula
de
fosfodiesterasa activada es capaz de hidrolizar 4.200
moléculas de GMP cíclico por segundo,
lo que
provoca
el cierre de millones de canales de Na+.
Los conos poseen un sistema de transducción parecido
al de los bastones. Se sabe desde hace tiempo que
nos
contienen
rodopsina)
que
tres
pigmentos
visuales <análogos
que responden a la luz
presentan
los coa
la
verde y
azul,
y
fundamental
que
la
roja,
la misma arquitectura
rodopsina.
La transducina,
la
fosfodiesterasa
controlado
por EMP cíclico
en los conos se asemejan a sus
correspondientes
en los bastones,
de
aún no se conoce en detalle.
transducción
pero el
como bastones no generan potenciales
tanto una excepción
en el
y
ciclo
completo
Tanto conos
de acción
modelo general
el canal
.
Son
por
de la transmisión
sináptica.
Hemos querido
los
hacer este resumen de la fisiología de
fotorreceptores,
aun no entrando
tos en los objetivos de
ción de que si bien
siología de
una
esta tesis,
la fisiología
de és-
para llamar la aten-
se conoce con bastante detalle la fi-
porción
de
34
las
células
bastones,
el
particularida-
segmento externo, muy poco sabemos de las
des funcionales del segmento interno; poco sabemos
fisología
entre
de los conos y de las
las
distintas
funcionalmente
de
clases de ellos;
los patrones
los fotorreceptores
diferencias
significan
de distribución
en algunas especies;
ni
la
funcionales
ni qué
espaciales
de
de
de la función
las gotas lipídicas de los conos en las especies donde
las hay.
El estudio
de la fisiología
res tiene limitaciones técnicas.
nes puras de cada tipo
En este
sentido,
disgregacioón
tipos
de fotorreceptores,
para
lograr
purificar
El conseguir
de fotorreceptor
esta tesis
celular
de los fotorrecepto—
que
aporta
es
un
permite
preparacio-
una de ellas.
método
obtener
nuevo
todos
de
los
y pensamos que supone un avance
poblaciones
su fisiología.
35
de cada tipo
y estudiar
1.4
DIPERENCIACION DE LAS CELULAS FOTORRECEPTORES.
La transformación del
tubo
neural en las
distintas
porciones del sistema nervioso central de los vertebrados,
sigue
una
misma serie de sucesos
en
todas
el las,
que
enumeramos a continuación:
1)
Proliferación de las células neuroepiteliales.
2>
Neurogénesis o salida
3>
Emigración de los neuroblastos hasta que alcanzan sus
posiciones
4)
del ciclo
definitivas.
Formación de las prolongaciones
específicos
celular.
entre
celulares
y contactos
ellas.
5>
Muerte celular.
6)
Síntesis de neurotransmisores y
cas de cada tipo de neurona.
36
moléculas
especifi-
Las células precursoras de cada población de neuronas
primero
proliferan,
después
dejan
el ciclo
entonces neuroblastos) y salvo excepciones,
que emigrar
posición
desde las proximidades
definitiva.
del
(se llaman
después tienen
ventrículo
Los neuroblastos
hasta su
después emiten
las
prolongaciones definitivas y establecen contactos sinápti—
cos
con
sus dianas.
producido
Llegado este
momento,
si
más neuronas de las que las células
se
han
diana pueden
recibir conexiones, mueren aquellas células que no han podido
hacer contactos sinápticos.
neuronas sintetizan el
duladores,
neurona
y demás
precursores
de
<o los) neurotransmisores,
moléculas
<Jacobson
1979).
un
de
población
modo
que
tipo de
celular
La retina,
a lo
dada,
específicas
jóvenes
neuromo—
de cada tipo
de
Sin embargo no todas las células
sucesos a la vez, es decir,
ca,
Finalmente las
neuronas
experimentan
esos
no lo hacen de forma sincrónilargo
del
desarrollo,
esos sucesos
se solapan.
por ser una porción
del
Central, pasa por las etapas <sucesos)
Bistema
en
una
Nervioso
anteriormente refe-
ridas. Para entender cómo se construye la retina durante el
desarrollo,
es pues necesario llegar a conocer en detalle
cada cina de esas etapas.
el
desarrollo
encuentra
ticular
en la
de
de
la
Información bastante amplia sobre
retina
de
revisión de Grún
las
numerosas especies
los
vertebrados,
(1982). En el
células fotorreceptores,
de vertebrados
~37
el
periodo
se
se
caso parconoce
en
de tiempo del
desarrollo durante el
riodo
de
restantes
neurogénesis),
etapas
información
1.4.1
y
pero
poco
se
conoce
desarrollo.
Hemos
al
en
respecto
diferenciación
engloba
cuatro,
del
existente
neurogénesis
parte
cual abandonan el ciclo celular
<pe-
de las
agrupado
dos
morfológica.
la
apartados:
Esta última
información relativa a las etapas
tres
y
enumeradas al comienzo de este apartado.
Neurogénesis.
La neurogénesis de los fotorreceptores ocurre en
ferentes etapas según la especie;
es embrionaria
(Fujita y Horii
1974; Prada y col.
en las aves y
1963;
di-
anfibios
Morris 1973;
Khan,
1991); mientras que en mamíferos es em—
brionara y postnatal
(Denham 1967; Carter—Dawson y
1979b; GrUn 1982; Braekevelt y Hollenberg
Lavail
1970; Kuwabara y
Weidman 1974; Reh 1192).
Numerosos estudios en retinas de
de vertebrados <Sidman 1961;
son 1969; Hollyfield 1969;
Kahn 1973,
1974;
Lavail 1979b
distintas
Fujita y Horii
Fujita y Mishima 1975;
1988)
han revelado
Jacob-1970;
Carter—Dawson
Holt y col.
y
19BB;
que la neurogénesis
cada uno de los tipos de células y por tal
rreceptores.
1963;
Braekevelt y Hollenberg
Branchek 1984; Young 1985;
Zimmerman y col.
especies
de
la de los foto--
comienza en el polo posterior de la retina, y
desde allí se extiende hacia la periferia.
descrito un gradiente de
neurogénesis
38
Por tanto está
centro—periférico.
Holt y colAl9BB)
han observado en la retina de Xenopus un
gradiente decreciente de neurogénesis
cientemente, Prada y col.
retina de pollo,
pos celulares,
la
diente
demostrado que en la
ganglionares desplaza-
1992), sigue tres patrones espaciales de
Uno desde retina
decreciente
dorsal a ventral
Re-
neurogénesis de la mayoría de los ti--
excepto las células
das <Prada y col.
neurogénesis:
<1991) han
dorso—ventral.
central
a periférica
centro--periférico),
otro
<gradiente decreciente
por último desde retina temporal
a nasal
desde
(gra-retina
dorso—ventral,
y
(gradiente decre-
ciente temporo—nasal)
Por otro lado,
la retina
difiere
neurogénesis
col.
la duración de la neurogénesis en toda
de unas especies
ocurre
1988), es
en Xenopus,
en 25 horas aproximadamente
decir, todas las células de la
generan en ese tiempo,
rata y ratón
a otras;
tiene
mientras
una duración
que en
de
(Holt
retina
el
pollo,
varios
días
la
y
se
gato
< Denham
1967; Kahn 1974; Grún 1962;
Wals y col.
Zimmerman
1991; Reh 1992). Consecuente-
1988; Erada y col.
1983; Young 1985;
mente, la duración de la neurogénesis de los fotorrecepto—
res puede durar horas
y gato>,
los
que
Bremiller
La
(Xenopus>,
o toda la vida
ocurre
1984;
días (pollo, rata, ratón
como sucede en algunos
durante toda la etapa adulta
peces,
<Branckek y
Raymond y Rivlin 1987>.
duración de la neurogénesis de cada tipo
de la retina,
en
es bien conocida en retina de pollo
celular
(Erada
y col.
1991),
xenopus <Holt y col.
1961;
Carter-Dawson
y Lavail
1966),
1979b;
ratón
<Sidman
Young 1985) y
rata
<Reh 1992). Estudios autorradiográficos muestran que en la
retina de rata,
EIZ,
la actividad
alcanzando la máxima
mitótica comienza
en el día
producción celular en los días
E20--P1. En el día P2 el ciclo celular tiene
una
duración
de 26 horas y solamente 1/3 de las células del neuroepite—
ho están en prohiferación.
ce
Entre los días P2—P5 el indi-
mitótico disminuye bruscamente,
lo que indica que
la
mayor parte
de las células han abandonado
virtiéndose
en neuroblastos de los distintos tipos celula-
res
de
la retina (Denham 1967).
el ciclo,
En el día P7 ya
observan mitosis en toda la retina <Braekevelt
y
con—
no
se
Hollen—
berg 1970; Kuwabara y Weidman 1974).
¡.4.2.
Morfogénesis.
Son muy pocos los estudios sobre diferenciación
fológica de fotorreceptores,
realizados en
pranos de diferenciación. Cajal
de Golgi,
identificó
ceptores
células
ventricular)
corta4
monopolares
y células
en la retina
con el método de
monopolares
y
< sólo
bipolares
embrionaria
En ratas de un día de vida
•7~O~
1
OLtI~~
~
jóvenes de fotorre—
con
de perro,
Morest
algunos
—
prolongación
—
vítrea
conejo y ratón..
(1970> observó, también
con
40
ruj1tc~
con el método
con prolongación
Golgi, neuroblastos
bipolares,
estadios tem-
<1892,1972),
como neuroblastos
mor-
....
de
fotorreceptores
filopodios
cortos
saliendo
esbozo
alrededor
del
soma,
del segmento interno.
<1979),
en
un
estudio
los cuales
presentan
En el ratón
al
Hinds y
microscopio
neuroblastos
identifica-
bien bipolares,
en
base
En el
pollo
López
bastones dejan el ciclo
mantienen
interno
mientras
y externo.
formas simples,
ya
presentan
longaciones,
forma simple)
<1991) ha
observado
citoplásque
los
en forma simple y prácticamente la
crecen
sucesivamente
Los conos,
en cambio,
los
dejan el
pasan por una fase multipodial,
gota lipídica, después
a continuación
y la prolongación
pedículos
a la
de un esbozo de segmento interno más o menos de-
sarrollado y a la distribución de los orgánulos
micos.
en
jóvenes de fotorreceptores células
simples bien monopolares o
presencia
Hinds
electrónico
retinas de embriones jóvenes <EIS a E17 días>,
ron como
un
interna
crecen
o vítrea
segmentos
ciclo
en la que
polarizan las
el
en
pro-
segmento interno
<adoptando de nuevo una
y finalmente crecen el segmento externo, los
sinápticos
y las prolongaciones
sinápticas.
Sin embargo, hay numerosos estudios realizados con el
microscopio
electrónico,
en
diferentes
especies,
que
tratan del desarrollo de los segmentos externo e interno y
del teminal sináptico
1975; Grtin 1975;
1994;
<peces:
Berger
Wise y Kunz 1977;
1964;
Branchek y
anfibios: Carasso 1958; Nilsson 1964b
1968; Olson 1972,
Fujita 197B
1973; Meller
Rohrscheider
y Tetzlaff
Bremiller
pollo: Meller
1976;
t’lishima y
ratón: De Robertis 1956; Feeney 1973; Carter—
41
Dawson y Lavail
Kuwabara 1968,
Olson 1978;
oveja:
1979a; rata:
1969;
Nir,
Braekevelt
humanos
Estos
De F<obertis 1960;
Weidman y
Kuwabara y Weidman 1974;
Cohen y col.
1983a,b;
1994;
Galbavy
perro:
y
Hebel 1971;
primates: Smelser y col. 1974;
Yamada y ¡shikawa 1965; Hollenberg y Epira 1973>.
estudios
fotorreceptores
todas las
han revelado
en estadios
especies
que los neuroblastos de los
más avanzados,
experimentan
en
la misma secuencia de transformaciones
morfológicas y estructurales.
En una primera fase,
tores
desplazan
poío
más escleral
recto
en las proximidades
los neuroblastos de
los dos centriolos
de la célula,
diplosoma
hacia el
disponiéndolos
en ángulo
de la membrana limitante
En las especies que poseen gota
tesis de los
del
fotorrecep—
externa.
lipídica comienza la sín-
carotenos que las componen, aunque las gotas
aún no son visibles.También
se observan
las primeras
unio-
nes de tipo gap junction con las células vecinas.
En una segunda fase,
brepasa la
con los
la prolongación ventricular so--
membrana limitante
centriolos
rosos microvilli.
en posición
apical
Al mismo tiempo
ponen de forma paralela
al
eje del
mulan en la zona más escleral
polo opuesto
externa
de la
célula
del
las
y crece en longitud
y rodeada
por nume-
mitocondrias
fotorreceptor
segmento
se dis-
y se acu-
interno.
El
se va estrechando y alargando
hacia la futura capa plexiforme externa..
Posteriormente,
el segmento interno se
pone
repleto
42
Después que el segmento interno adquiere una
u~L~r
de
mitocondrias
Golgi.
y vesículas,
procedentes
Las membranas del retículo
del
endoplásmico
aparato
de
son muy nu-
merosas y la mayor parte de los orgánulos celulares
adop-
tan su posición definitiva. Para cuando han ocurrido estos
acontecimientos,
aves
el
las gotas lipídicas
ya se observan claramente
de los conos de
(12 días de incubación
las
en
pollo).
Después que el
da longitud,
comi enza el
Los dos centriolos
interno,
uno
fibrillas
segmento interno
se sitúan
de
de
desarrollo
ellos
anclaje
del
segmento
lateralmente en
<el
que
adquiere una determi—
cuerpo
se
el segmento
basal)
asocian
a
externo.
emite
la
unas
membrana
plasmática produciendo en ella peque~as invaginaciones. Al
mismo
tiempo
pigmentario
el
centriolo
crece
y produce un verdadero
de túbulos centrales
<Greiner
hacia
cilio
el
epitelio
pero sin
y col.1981).
el
Una vez se
formado el cilio de conexión comienza la formación de
par
ha
los
discos de membrana.
Los
primeros estudios de microscopia electrónica so-
bre el desarrollo
1956)
los
fotorreceptores
<De
mostraban que los discos de membrana podían
a partir
lio
de
de túbulos
y vesículas.
Parecían
que crece a partir del segmento
de los discos,
1964,1968),
Mason
y
derivar
interno.
también fue asumido para el
Robertis
for<narse
del ci-
Este origen
pollo
<Ileller
la rata ( Weidman y Kuwabara 1969 ) y la vaca
col.
1973
Pero
).
43
pronto
surgieron
nuevas
investigaciones
que
invaginaciones
basal
del
de
mostraron
que
que
de membrana (Eakin y Westfall
1961;
y ¡shikawa
y
Olney 1968;
y col.
La
1977).
formación
invaginación)
basal
Govardovsky
Vail
y
Hild
Sin embargo,
de
los
pueden explicar
proceso
moléculas
de
sáculos
de membrana
algunos
peces teleósteos,
encontrarse
en la
(Stryer
Ncdar le
<no
por
a nivel del cuerpo
mt erpretaciones
del
específica
de
las
lipídíca
de
los
bicapa
1987). Como dato curioso,
así
como en el hombre,
segmentos extern os accesorios,
es idéntico a los normales,
los discos
flmbas
Vamada
(1980) explica la
evagí nación
la orientación
rodopsina
discos
1965 y 1966;
Sp ir a 1975;
1971;
de conexión •
los
Khar keevi ch
por
porción
Ni 1 sson 196b4;
Stei ngberg
discos
la
origina
de la membrana plasmática
del cilio
sucesivas
las
la membrana plasmática de
segmento externo las
1 965;
son
en
pueden
cuyo desarrollo
excepto en que no desarrollan
de membrana (Young y col.
1977,
f3rún 1982).
~l mismo tiempo que se forman los segmentos externos,
en
el
polo interno
prolongación
terminal
simple
interna
sináptico.
lámina
del
fotorreceptor
que
unirá el
nl principio
va
soma
con
núcleo.
principalmente ribosomas libres o formando
Kuwabara 1969,
1974>
este
gato:
Neller 1964,
Vogel
1976,
proceso está precedido
44
el
monos
2
una
Contienen
polisomas.
rata:
la
futuro
los terminales son
en posición vitreal al
algunas especies <pollo:
creciendo
En
Weidman and
Smelser y col.
por el crecimiento
de
prolongaciones transitorias que salen del
de
la
célula.
El
prolongaciones
plexiforme
aumenta
externa,
contactos
células
terminal
sinápticas
de
célula
formando
1964;
y
.
de
estas
establecen
los
capa
primeros
bi pol ares.
Dos
invagi nan 1 a membrana
horizontales
f or mando
fotorreceptor
las
Después una prolongac ion dendrí ti ca
posi ci ón
central,
la configuración sináptica en “tri adas
<Meller
1974;
Crescitelli
McLaughlin
Witkovsky
Grún
donde
bipolar se coloca
Nilsson y
Smelser
ramificaciones
vitreal
a medida que penetran en la
sináptico del
“diadas”
una
y
con las células horizontales y
dendritas de
del
número
extremo
1978;
1969;
1976;
Linberg
en
yc ol
Blanks
Mc~rdle y c ol •
aparecen
en
Vogel
y Fisher 1978;
los temi nal es sinápticos
lamelas,
cintas
o bandas sinápticas,
Chen
1977
En 1 a mayoría de las especies las
1962).
1974;
-
1976;
vesí cuí as
de
alrededor
las
una vez que éstas se
han diferenciado.
En una fase posterior los segmentos internos muestran
todas
que
sus estructuras
es
el
externos
último
crecen
definitivas,
orgánulo
en
en longitud
salvo el
-formarse.
y aumentan
paraboloide
Los
segmentos
considerablemente
el número de los discos de membrana, en los
que ya pueden
detectarse
opsina
los
presencia
en
interno.
Para
maduras
.
pigmentos
el
visuales.
segmento externo
entonces
las
La
y la diaforasa
primeras
sinapsis
hace
en
parecen
Las vesículas sinápticas adquieren el número
45
el
y
distribución
definitivas.
En las
últimas
fases
del de—
rrollo, el segmento externo continúa creciendo en longitud,
el paraboloide
aparece ya repleto
y los fotorreceptores
de gránulos
establecen
nuevas
de glucógeno
uniones con las
células de MUller.
Resulta llamativa la escasez de trabajos tanto a
vel celular
estudio
res.
como molecular,
de la
dedicados
diferenciación
por el cual
Motivo
en
profundidad
nial
inicial de los fotorrecepto—
nosotros
planteamos
como uno
de
los objetivos de esta tesis, el estudio del comportamiento
<cambios en
la forma
los fotorreceptores
llo.
y posición>
en las etapas
Por otro lado, Cajal
blastos
perro,
<1972)
de fotorreceptores,
células
de
los neuroblastos
iniciales
de su desarro-
interpretó
en la retina
con formas similares
de
como
neuro—
embrionaria
a las de
las
del
células
neuroepiteliales de la retina en fase 62 del ciclo celular,
descubiertas
nos indujo
en el pollo por Prada C. y col.
a plantear
la posibilidad
de que
<1991). Esto
los
fotorre—
ceptores dejasen el ciclo al final de la fase 62 y de que,
por lo tanto, tuviesen un contenido 4C de DNA;
ronas del sistema nervioso central parecen
4C de DNA. damos referencias
otro objetivo
DNA de los
de esta tesis
fotorreceptores.
46
en discusión>.
fue determinar
<otras neu-
tener
también
Por lo tanto,
el contenido
en
II.
OBJETIVOS
EXPERIMENTOS.
y
D¡SE~O
DE
LOS
II.
OBJETIVOS Y DISE~5O DE LOS EXPERIMENTOS.
Los objetivos del presente trabajo de tesis doctoral
han sido tres:
1>
Testar
res podrían
la hipótesis de que algunos
abandonar
el
ciclo
celular
fotorrecepto-al final de la
fase 62.
2>
los
Estudiar
el
comportamiento
fotorreceptores
desde que
hasta que adoptan su forma,
3>
de los
neuroblastos
abandonan el
ciclo
de
celular
tama~o y posi ción definitivas.
Profundizar en el estudio de la estructura de la re--
tina de la rata adulta.
Para conseguir
serie
de experimentos,
estos
objetivos
se
dise~aron
que detallamos a continuación.
48
una
EXPERIMENTOS PARA CONSEGUIR EL OBJETIVO Nfl 1.
El cumplimiento del objetivo
disgregar
poder
nQ 1 suponía
íntegros los fotorreceptores de la
medir
los
al
40
<tetraploide)
final de 62.
por
implica-
mientras que
implicaría el
un
abandono
Para conseguir disgregar
del
íntegros
fotorreceptores de la retina adulta se dise?iaron
serie
de experimentos
de proteasa,
en los que se varió
la temperatura
y el
tiempo
extrajeron
central
de incubación.
las retinas completas,
más periférica,
dieron
sobre
determinación
del
contenido
y
se
utilizado
20
(2,5 pg)
como contenido
col.
1971; Rasch
1991>
.
Aunque se
(6,3 pg
pLteden utilizar
<Rasch
y col.
Thieband,
Tyndal
1971;
Fischberg
1978;
ó
sapo
DNA
de
como
Vindelov
y col
49
es
de
la
pollo,
clásicamente
referencia
y col.
<Rasch y
1983; López,
controles
<5,2 pg DNA).
Xenopus
<Bufo terrestris.
Bachmann 1972;
1977;
exten-
para
eritrocitos
1974 y 19B5; Navarrete
DNA),
se
retina
se
procesaron
de
standard
ferencia eritrocitos de trucha
vis
decir
,
de DNA por célula.
Como controles se utilizaron
porque su contenido
es
días
después se disgregaron,
portaobjetos
urja
la concentración
A una serie de ratas adultas, de más de 21
les
para
DNA
Un contenido 20 <diploide> de DNA
ría el abandono del ciclo celular en 61,
ciclo
rata,
por citofotometría el contenido de
fotorreceptor
contenido
conseguir
Rasch
Coulson y col.
1980; Lee y col.
de relae—
11 pg DNA>
1974,
1985;
1977; Coulson,
1984>;
dado
que en nuestro laboratorio también utilizamos el pollo como material biológico de experimentación,
dad de eritrocitos
eritrocitos
siempre
resultó
de pollo
se extendieron
la
una
disponibili—
comodidad.
sobre
el
mismo
Los
porta
en el que se extendieron las células disgregadas.
Para
1 as
determinaciones
por
citofotometrí a
del
contenido de DNA por fotorreceptor utilizamos el mé todo de
Feulgen. el cual se basa en la
del DNA
a 6000,
hidrólisis
parcial
áci da
con ClH SN a temperatura ambiente, o bien
segu ida de reacción con la
resultado
de la hidrólisis,
tal entre el
base
se deshace el
carbono 0—1’ y C—4> del
la 2—desox irribosa
de
Schi ff.
enlace
anillo
CH
de
IN
Como
hemi ace—
f urano
de
y desp u é £ se rompe el enlace 8—gí i c 051—
dico entre las bases pOn cas y las 2-desoxirribo sas,
fon—
mando un grupo aldehído
del
az O—
(fucsina básica decol orada
con
libre
can. El reactivo de Schiff
anhídrido
libres
cual
sulfuroso>
con
los
grupos
y genera una macromol écul a col oreada
queda
tinción
reacciona
en el carbono 0—1’
unida
se realiza
covalentemente
al
DNA
a las células
mente con DNAsas no se ti½n.
i nso 1 ubí e,
(Fig.
estequiamétricamente,
de DNA, puesto que si
al deh idos
III>
se las
tra ta
mostrado (en una variedad muy amplia de
tipos
que exi ste una correlación
las
entre
La
y es especí fi ca
previa—
Además está ampli amente
directa
la
de—
celulares)
estimaciones
citofotométricas del contenido de DNA y las que
se
obtie-
nen para los mismos tipos de células por métodos bioquími—
50
H
o
Ii
CH,
H
HO—?
ti
cd r
0
Chf~
H
Aso d~
pti,pt, r~
r4 H
o
fj§5.
5VC
A
k4
0
[4
—~.
1
N
H
Ptrn,jdrno
o
1
~
O
E
O
H
NH
p
o
o
501H
R
O
—--O—t
5 OLH
j.£LI CO t0C SW~
E
0
[4
A
H
O
CH
2.
FIGURA
11.1
Química de la reacción que tiene lugar en el
núcleo de la célula al realizar la tinción de Feulgen. La
hidrólisis ácida extrae
las purinas
<en recuadros> y
deja en libertad los grupos aldehídos <en círculos> que
reaccionan con la leucofucsina <reactivo de Schiff>
para
dar el color púrpura. En el esquema, el tamaao de la deso-xipentosa está muy exagerado en
relación con el de la
proteina. (Tomado de De Robertis 1981).
cos directos <Allison y col.
1974; Vindelov
y col.
1961; Lee y
col.
1994; Rasch
1963)..
EXPERIMENTOS PARA CONSEGUIR EL OBJETIVO NP 2.
Para
estudiar
los cambios en la forma de los neuro—
blastos de los fotorreceptones hemos utilizado retinas
una
serie
de ratas en edades
comprendidas
entre
de
E18±1
<días embrionarios) y PíO (días postnatales>, a las que se
les hizo tinción de Eolgi. A otra serie de ratas
compren-
didas entre el día PS y 12 meses postnatal se les extrajeron las retinas completas y se
procedimiento
tudiaron
que en los
disgregaron por
experimentos
anteriores.
por ambos métodos las formas diferentes
tan los neuroblastos
de los fotorreceptores
el
mismo
Se
es—
que adop--
durante su di—
ferenriaci ón.
La tinción
de Golgi
se basa en la fijación con solu-
ciones que contienen osmio,
ó bien dicromato potásico, se-
guida de impregnación con una solución de nitrato de plata.
El nitrato
de plata
107. de las células,
penetra
sólo
y las rellene
en
aproximadamente
un
uniéndose a la membrana
plasmática y sistemas de membranas intracitoplásmicas. Así
proporciona una imagen, en negro, de toda la forma celular
sobre fondo amarillo.
Hemos estudiado,
in vivo,
por contraste
células disgregadas de la retine porque:
52
de fase,
las
1’ El procedimiento
tro
de disgregación
laboratorio, extrae
prolongaciones
los
más finas,
utilizado
en
neuroblastos
que a
veces no
nuescon sus
ti?~e
el
Golgi.
2. Se obtienen
mayor cantidad y variedad de neuroblas—
tos para observar.
3. El desarrollo de los segmentos interno y externo
los
fotorreceptores no
método
te
de Golgi
en la
retina
se puede
observar
con
de
el
ya que están incluidos parcialmenpigmentaria, también de color ne--
gro.
EXPERIMENTOS PARA CONSEGUIR EL OBJETIVO
Para estudiar
la rata, se
que
general
de la
ha utilizado el mismo material y
retina
de
metodología
para el objetivo NP 2, debido a que nuestro método de
disgregación
la
la estructura
NP 3.
retina
Además,
también
adulta
extrae
todos los tipos
observados
en los disgregados
que en preparaciones
fiabilidad
al
.3.,
tinción
se puede observar
de células
estudio.
con la
de Golgí,
celulares
de
de
Golgi.
mayor número
lo cual
da mayor
¡¡1.
MATERIALES
Y
METOIJOS.
MATERIALES
111.1
111.1.1
En
Material biológico.
nuestros experimentos hemos utilizado:
1> Ratas albinas de la raza Winstar, de distintas camadas,
procedentes
del animalario del departamento de Fisiología
de la Facultad de Medicina de la
Universidad
de Madrid. La edad de las
varió desde el día E1B±1
ratas
Complutense
hasta varios meses de vida adulta.
2)
Pollos adultos de la
domesticus>,
raza White Leghorn
(Gallus
estirpe Ehaver, procedente del animalario del
Centro de Biología Molecular de Madrid.
111.1.2
Productos químicos y enzimas.
Proteasa
extraída
de
Estreptomices,
facilitada
por
Fermentaciones y Síntesis Espa~ola SA <FYSE).
El
resto
de los
empresas especializadas.
firma
Merck.
reactivos
químicos
se obtuvi eron de
La mayoría de ellos
fueron
de la
Las características relevantes de algunos de
estos productos se describen en las
dientes.
.33
secciones
correspon-
111.1.3
Instrumentos.
Microtomo,
para cortar celoidina, marca “MSE”.
Estereomicroscopio
Fotomicroscopio
‘Zeiss”,
modelo SR.
‘Zeiss”, modelo Universal.
Mi crodensi tómetro
“Vi ckers”,
56
modelo M-85.
III.
2
METODOS.
¡11.2.1 Animales de experimentación.
Las
ratas estuvieron
ubicadas en el
temperatura constante de 18—20 OC,
animalario
a una
con ciclos de 12 horas
de luz y 12 horas de Dscuridad y con acceso libre, en todo
momento, al agua y la comida.
Las ratas
embrionarias
de
E1B±1 días se obtuvieron tras sacrificar a la madre.
111.2.2
Nuevo método de disociación celular.
Para obtener las células de la retina aisladas, hemos
utilizado una proteasa no comercializada,
amablemente
fa--
cilitada por Fermentaciones y Síntesis Espaí{ola SA <FYSE),
de actividad enzimática 24134 uA/mg.
El
procedimiento
disociación
celular
general
seguido
en este método
está indicado en el
57
esquema
de
de
la
figura
se
lilA.
Las retinas
trocearon
sacarosa
finamente
al
el resto
se extrajeron
en
del globo ocular y
200 pl de
una
solución
10,6V. para ratas de 3 a 10 días y al 6%
de las
ratas.
Después se incubaron
en
una
de
para
sol u—
ción stock
(1 mg de proteasa/2,4
preparada
diariamente. La concentración final de proteasa
varié
de
entre
ml de agua milliporizada>
15—20 x 10~ mg/mí, según el día de desarrollo
las ratas cuyas retinas se sometían a digestión.
proceso
mente
se realizó siempre a
cada
10 minutos en un
340
C
y los 60 minutos,
y fue seguido visual--
fotomicroscopio
contraste de fase. La digestión fue
Zeiss
digerir, a~adi endo un volumen de sacarosa
tubo de incubación
temperatura
ambiente.
La suspensión
celular
material
igual
o poniendo
obtenida
con
detenida entre los 45
igualmente dependiendo del
tente en el
Este
la
se utilizó:
al
a
exi s--
solución
a
1) para la
observación y estudio de los neuroblastos y formas adultas
de los fotorreceptores recién extraidos;
2)
para la deter-
minación de cantidades de DNA por fotorreptor; 3)
para es-
tudiar la morfología de los restantes tipos de las células
de la retina
Tanto
adulta.
los neuroblastos
precursores
de -fotorrecptores,
como los distintos tipos de células adultas han sido dibujados a
fueron
40x, utilizando
tomadas
y en contraste
cámara
lúcida. Las
con pel 1 cuí a Kodak Tmax 400
de fase.
58
fotografías
a 25x y
40x
EXTRACCION DE LA RETINA VISUAL
TROCEAMIENTO FINO DE LA RETINA
EN 200 pl DE SACAROSA AL 6-10,26%
INCUBACION EN UNA SOLUCION DE
PROTEASA, EN SACAROSA AL 6-10,26%
Concentración de proteasa:
15—20 x 10
mg/ml
de solución para ratas de
P3 a PS días.
-~
de
20 x
mg/ml
solución para ratas
adultas
1~
SUSPENSION CELULAR
OBSERVACION DE LAS
CELULAS “IN VIVO”
EXTENSTON DE LA SUSPENSTON
EN PORTAOBJETOS
FIJACION:
ir
ETANOL-AC
ACETICO
FIGURA 111.1
Metodología general utilizada en el proceso
de disociación celular.
P, postnatal.
(3:1)
Método de Bolgi Colonnier.
¡¡1.2.3
Los ojos de ratas de E1B±1 días y entre Pl y PíO días,
se
sumergieron en fijador,
extraerles la córnea.
y 10 días,
de
5 minutos
lavados
más
en
hasta
transparente.
durante
3
Tras
la fijación,
en agua corriente,
las
piezas
seguido
solución de nitrato de
de
plata
al
se
varios
0,757.
que la solución de lavado era completamente
A continuación las piezas se dejaron en
volumen de nitrato
días.
tras
El tiempo de fijación varié entre 5
teí{idas.
lavaron
suyo,
<1964),
al objeto de obtener la mayor variedad posible
células
<p/v>,
según Colonnier
de plata
al
0,75%,
75 veces superior
un periodo de tiempo variable,
Tras la impregnación
veces durante
argéntica
10 minutos
dos veces más el proceso
entre
al
7 y 10
las piezas se lavaron
en agua destilada
de fijación
un
y se repitió
y tinción
con nitrato
de plata en las mismas condiciones.
Finalizado todo el proceso de tinción.
deshidrataron
1C>0%>
después
,
(1:1>.
y
crecientes
Los
en una serie creciente de
ojos
pasaron
de nitrocelulosa
se
Los
<50%—
incluyeron
para
a
bloques
40
a
través
de
soluciones
24 horas en cada una de ellas.
en
nitrocelulosa
del
207.,
ser cortados en un piano paralelo
eje rostro caudal del animal.
en cloroformo,
alcoholes
se pusi eron en una mezcí a de alcohol —eter
finalmente
ori entándol os
las piezas se
Los bloques se
al
almacenaron
0, hasta el momento de seccionarlos.
fueron tallados y puestos 1—2 horas
60
en
aceite de cedro antes de ser seccionados.
realizaron
VISE,
se
a 80—100 pm de grosor,
y se recogieron
también
Las secciones se
utilizando un microtomo
en aceite
de cedro,
montaron con resma Dammar siguiendo el
publicado por Prada y López Mascaraque
Las
retinas
fotomicroscopio
bien
Zeiss,
teF~idas
con
(1985).
se
observaron
cámara
lúcida
un
incorporada,
estaban
totalmente
incluidas
dentro
enfocando
los límites
superiores
e inferiores de la misma.
retina
las
en
asegurándonos
cada
que
procedimiento
siempre
De
de
después
observada
lúcida, todas las distintas
se
células
células
de
observadas
la
dibujaron,
sección,
a
cámara
de la retina. Los
di-
bujos fueron realizados a 40x y luz transmitida. Las foto-graf=as fueron tomadas con película
Copex Ahu Pan a 20x y
40x
111.2.4
Método de determinación del contenido celular
de
DNA.
Sobre la mitad de portaobjetos
dieron
las células
procedimiento
se
indicado
extendieron
por
el
disociadas
protocolo
rápidamente
de tinción.
con aire
de
indicado
esta forma ambas poblaciones
mismo
de retina
anteriormente.
eritrocitos
procedimiento
gelatinados,
seco y
61
se exten-
obtenidas por
Sobre la otra
pollo
en el
de células
recién
punto
se
mitad
extraídos
111.2.4.1.
De
sometieron
al
Las extensiones se
continuaron
el
durante
secaron
12
a
16
horas
en
etanol
tiempo
a
temperatura
ambiente.
100%—ácido acético glacial
mínimo de 2 horas.
lavaron
Después
durante
se
fijaron
<3:1),
durante
un
Transcurrido este
tiempo,
se
10 a 15 minutos en agua destilada
y
se
sometieron a hidrólisis ácida, con C1H SN a 19±10C de tem-peratura
durante 45 minutos.
lavados de 15 minutos cada
<40
C>,
A continuación se
Lino,
en
agua
destilada
fría
a temperatura ambiente, e inmediatamente se aplicó
sobre las células el reactivo de Schiff al
según el
hicieron
método de Lillie
1%,
<tomado de Martoja
preparado
1970> durante
2,5 horas en cámara húmeda. Finalmente se hicieron 3 lavados de 2 minutos cada uno en agua sulfurosa
<5 ml CH
IN y
5 ml de metabisulfito sódico 10% en 90 ml de agua destilada),
preparada
en
el momento de su
utilización,
y
un
lavado final en agua destilada durante 5 a 10 minutos. Las
extensiones
se dejaron secar a temperatura ambiente y
se
almacenaron
en
de
oscuridad
<para
evitar
la
tinción de las células) hasta la valoración
do en DNA. En el
las
de
hacer la
de su conteni-
lectura
extensiones se montaron provisionalmente,
agua destilada
selló
momento
pérdida
y colocando
al portaobjeto
un cubreobjetos,
del
DNA
utilizando
el
cual
se
con laca de u?~as.
La lectura de las cantidades de DNA se realizó con un
microdensitómetro
integrador Vickers M—BD.
Se utilizó un
objetivo de lOOx, con máscaras que dejan un campo entre 10
y 30 micras de diámetro, bajo luz de 550 nm de longitud de
62
onda,
con una anchura de banda de 30 nm
y utilizando un ojo lector
<o “spot’)
<de 520 a 560 nm)
de
0,4
micras
de
diámetro.
La selección de los núcleos, para medi r su
en
DNA,
se
cualquier
realizó
núcleo
al
azar;
que nos
la
tomando
encontráramos
contenido
lectura
de
recorriendo
el
porta y aplicando los siguientos criterios:
1>
Identificación inequívoca del tipo de
<cono
fotorreceptor
o bastón) al que pertenecía el núcleo cuya cantidad
de DNA se iba a determinar.
2)
Selección
relación
3)
de la máscara de tamaF~o más conveniente
al tama~o del núcleo.
Ajuste de la transmitancia a 100%,
lector
en
fuera
col ocándo el
del núcleo pero dentro del
ojo
delimi tado
campo
por la máscara.
Cada lectura se obtuvo hallando la media de dos lec—
4)
turas
del mismo núcleo.
Un
fueron
mínimo
de 30 fotorreceptores
medidos por cada portaobjeto
ras integradas que nos proporciona el
expresan
valores
en
en
unidades
absolutos
arbitrarias
de DNA expresados
los resultados,
medio
en DNA en U.A.
tienen
una cantidad
se
y
30
eritrocitos
estudiado.
Las lectu--
microdensitómetro se
de
DNA
(U.A.).
en pg que se muestran
obtienen comparando el
de los eritrocitos
20 de DNA
63
=
Los
2,5 pg
de
contenido
pollo.
que
(Rasch 1965),
con
el contenido
medio en DNA en U.A.
de los
fotorreceptores
de la rata.
Obtención de eritrocitos de pollo.
¡¡1.2.4.1
Los poííos
se sacrificaron
giendo la sangre en
continuación
una
por
decapitación,
un tubo debidamente
gota
de
sangre
se
reco-
heparinizado.
dispuso
en
A
cada
portaobjetos, previamente gelatinado, y se extendió.
1II.2.4..2 Medición del crecimiento de los 4 otorreceptores.
Se
eligieron
al menos
los
20
al azar y se dibujaron a
bastones y todos los conos
disgregados
40
(entre 3 y 24> de
en fresco de retinas completas entre PZ y
12 meses postnatal.
Con un curvímetro se midió la longitud
de cada uno de ellos, desde el pedículo
a la base del ci-
lio de conexión. La media de longitud
en
representó, por separado para conos y
bastones,
al
estadio
aumentos
de desarrollo.
64
centímetros
se
respecto
IV.
RESULTADOS.
IV.1
METODO DE DISI3REBACION CELULAR DE LA RETINA.
Para
en disgregados
realizar
de
desarrollo
retinas
en
de los
fotorreceptores
desarrollo fue
experimentos
numerosos
concentraciones
mayor
el
estudiar
hasta
óptimas de proteasa
necesario
establecer
las
con las que obtener
número de fotorreceptores íntegros.
el
Los resultados
obtenidos se muestran en la tabla IV.1, en la que se deta-lía el número de animales
idóneas
de disgregación
La
células
concentración
precursoras
entre P3 y FC
15-17
<
de PS en adelante
tración
para cada día del
de fotorreceptores
días
hasta el
óptima de proteasa
resultó
de
y PíO necesitamos
de
las
rata
ser
fué de
20 x 10~ mg/ml
adulto,
la
concen(Tabla
en nuestra experimenta-
consistencia de la retina se
extracción
y que en cada
de las células
podrían
que para disociar retinas entre
emplear
de
mientras que para retinas
de
consideramos
variar. Así obtuvimos,
10,26%,
desarrollo.
a medida que avanza el desarrollo,
día las condiciones
condiciones
estadio
ción fue que la estructura y
modifican
las
en retinas
postnatal),
(Tabla lvi),
¡9.1). Un hecho que
y
óptima de proteasa para obtener
(3 y 7
i0~ mg/ml
utilizados
una
solución
mientras que para las retinas
de
de PH
utilizamos una solución al 6% <Tabla ¡Vi).
sacarosa
en
P3
al
adelante
Por otro lado,
el volumen de tejido por volumen total de solución de dis—
66
TABLA ¡VI
Condiciones óptimas para la disociación de la
retina de rata.
EDAD EN D~S
POSTNATALES
NP DE ANIMALES
PROTEASA
mg/ml~10~
SACAROSA
mg/100m1
NP RETINAS POR
DISOCIACION
3
4
15
10,26
2
4
3
15
10,26
2
5
13
15
10,26
6
21
16
10,26
2
7
6
17
10426
2
8
6
20
10,26
2
9
5
20
10.26
2
10
6
20
10,26
2
11
7
20
6
2
12
5
20
6
2
13
5
20
6
2
14
4
20
6
2
15
2
20
6
2
16
2
20
6
1
17
2
20
6
1
18
1
20
6
1
19
2
20
6
1
2
20
6
1
52
20
6
1
Adulto
En todos los casos el volúmen final de disociación fue de 0,4 ml.
Adulto: ratas desde 21 días postnatales hasta 7—8 meses.
gregación
estadios
zar 2
de
el
también resultó
más
jóvenes
retinas por
Pié
una
cada experimento,
única
retina
número de células
requieren
importante.
<entre P3 y PiS>,
del
determindas
gregación
celular
se
elegidos
al
azar.
número de fotorreceptores
íntegros
Consideramos
fotorreceptor
Para obtener
externo.
contamos además
identificados
externo
de
el
sináptico
y
final
de
el
en cada dis—
se
el
total
tipo,
de los
la
El
disociada
promedio
de
óptimas aquellas
no
óptimas
.58
su
prolongación
los segmentos
que ninguna
el
mismos.
que presentaba
soma,
por
2)
número de foto—
interno y
totales
aquel los
íntegros,
poseer
segmentos
otra cél ula de
la
número medio de células
fue siempre
125.
en las que el
aquellas
superior
Consid eramos
fotorreceptores completos superaba
disgregaciones
contaron’
número de fotorreceptores
puesto
contadas por cada retina
disgregaciones
3)
al
forma inequívoca
e interno,
siendo
y
íntegr o aquel
retina posee estas estructuras.
100,
campo
de los fotorreceptores
de
obtener
cualquier
es decir,
el
para
células en 6 campos
En c ada
respecto
terminal
a partir
método,
las
totales
rreceptores
el
que
desarrollo del tejido,
del
contaron
1) el número total de células
interna,
utili-
condici ones de experimentación.
la eficacia
completa;
mientras
grado de
evaluar
estructura
fue necesario
los
Estos resultados demuestran,
Para
ópticos,
Por ello en
fue suficiente
adecuado.
pues que dependiendo
se
ser
en
las
a
como
porcentaje
el
50%,
que
y
el
TABLA IV.2
Evaluación de la eficacia del método de disociación.
A, corresponde a disociaciones consideradas óptimas,
mientras que B corresponde a disociaciones consideradas no óptimas (veáse texto)..
NP
TOTALES
NP DE
ANIMALES
A
B
11
7
NP TOTAL
CELULAS
OBSERVADAS
DE
FOTORRECEPTORES
7. RESPECTO íNTEGROS
7. DE
1 NTEGROS
RESPECTO A
LOS TOTALES
A CELULAS
TOTALES
1380
1191
86,30
818
68,68
982
834
84,92
283
33,93
porcentaje
del
de fotorreceptores
50%.
En
obtenidos
en
postnatal).
la
tabla
íntegros
IV.2
18 retinas
mostramos
se
obtiene,
los
de ratas adultas
Cuando las condiciones
la tabla)
quedaba por debajo
como
resultados
<más de 21
son óptimas
promedio,
que
días
<línea A de
el
86,30% del
número total de células disgregadas son fotorreceptores,
además
que
estudio
el
de
68,687. de ellos
la
disgregaciones
se
viabilidad
óptimas
extraen
de
demostró
íntegros.
LAn
células
en
estas
que
el
y
10C’%
de
los
fotorreceptores íntegros excluyen el trypan blue, es decir
células vivas; además el 98%
son
pletas
también eMcluyó el
<somas sin
de las
colorante.
prolongaciones)
células
no com-
Sólo un 27. de células
incorporó el
colorante,
indi-
cando su inviabilidad.
Como se dijo anteriormente, nuestro estudio está centrado
en el
desarrollo
bargo,
con el
método de disociación
ha
dos
sido
posible
los
mo sont
Fiq.
mayoría
de
hemos utilizado,
fotorreceptores
to-
tipos
celulares
de
co-
ganglionares
en desarrollo
La figura
neuroblastos
em-
además de
distintos tipos de células
¡VZ).
que
Sin
obtener
restantes
horizontales,
retinas
de los fotorreceptores.
y
¡VA
de una retina
como
de
amacrinas,
MUller,
en
tanto
adultas
los distintos
de F12
(12 días postnatal).
formas similares
en
<véase
muestra
ellos ya presentan
70
retina,
bipolares y
células
(Fig.IV.1)
la
tipos de
La
a las adul—
FIGURA IV.1
Dibujos a cámara
lúcida de neuroblastos de
las distintas células obtenidas por disociación celular
de una retina
P12. Las células se flan
dispuesto al azar,
tal y como se observan en un
campo microscópico de
los
disgregados. c, cono; b, bastón; ti, célula horizontal; bi,
célula bipolar; a, célula amacrina; g, célula ganglionar;
M, célula de Múller <glia>. 460 x
tas,
aunque todaví a no han alcanzado
ración
dendrítica
definitivas.
su tama~o y estructu-
En el campo microscópico
mostrado en esta figura
podemos observar células
<bU,
(a>,
células
lulas
amacrinas
horizontales
rreceptores
células
(fi>, células
<conos, c y bastones,
proporción
que el
resto de tipos
más los conos son escasísimos
cordancia
de
con
los estudios
bipolares
ganglionares
(g),
Múller
y
foto—
muchísima
mayor
b)
en
<M),
celulares.
Nótese que ade-
los disgregados,
en
que han
cé-
demostrado
en con-
que
la reti—
na de la rata tiene un pequelio número de estas células.
La
en
identificación de los distintos tipos de
los disgregados
observadas
en preparaciones
por composición
mostramos
de
se hizo por comparación
una retina
PB
te~ida
como
referencia
para el
PB en
adelante.
En
la
figura
disgregadas
podemos
apreciar
capaz
con
de
sus
método
las
se
una
formas
ha
permitido
y
fotorreceptores,
y
de
más
posición
estudiar
del
que explicamos
las restantes
72
disociación
soma
Por
las
clases de
tanto,
diferencias
con detalle
células
las
en
de
es
íntegras,
lo
de
de
En ella
de la retina
finas.
desde
selección
de rata adulta.
método de
neuronas
prolongaciones
nos
¡V.2.1,
de los disgregados
de la retina
las
que utilizamos
estudio
muestra
IV.2
la estructuura
por este método,
cómo nuestro
extraer
las formas
En la figura
mícrofotográfíca
¡V.3
neuronas
de Golgi.
con
células
el
en
células
el
apartado
la retina,
FIGURA XY.2 Composición de una retina de rata
de PB me-diante microfotografías de los diferentes tipos
de células teiidas por el
método de Golgi.
4, fotorreceptores;
bí, célula bipolar; ti, célula horizontal;
a, célula ama-crina;
ai, célula amacrina invertida;
o, célula ganglionar; M, célula de Múller <glia>. N4=tese que las células ya
ocupan su capa definitiva en este estadio. 300 x
1
FIGURA
IV.3
Microfotografías
de los diferentes tipos
celulares de la retina adulta <más de 21 días postnatal).
c, cono; bl—b3, bastones; bil—bi5, bipolares;
al--ab, ama—
crinas; M, célul as de Múller. ~5O x
cuyos hallazgos
más interesantes
Las células bipolares
lógica.
Sus somas
muestran
tienen
otros son
(Fig.
IV.3,
presentan
bit.
bi2,
que termina
que se ext ienden en
bi5>.
carecen
bu,
minal
en
bi3>.
interna más
sinápti co,
el
dos
4 terminales
axónicos
des diferencias
de
tamai<o
de
longitud
otros
(Fig.
dendritas
ser
(Fig.
o piriforme
dendr itico parte
bifurcado
(Fig.
grosor
gruesa
<Fig.
IV.3,
ter—
bu),
bi2,
bi4).
también hemos
gran
con aspecto varicoso
encontrado
Sus somas muestran
Unos
única
que
75
soma con el
IV.3,
se
son
que
—
interna
se ramifi ca en nil—
(Fig.¡V.3,
tamaao
con una
ramifica
<Fig.
gran
redon deados,
prolongación
y varicosas
de
una prolon—
o ramif icado en 3 6
variable,
finas
IV.3,
biS)
amacrinas
una
único
IV.3,
bi3,
morfológica.
redondeados,
interna
externa
Su árbol
longitud
dendríticas
triangular
puede ser
IV.3,
con
dendritas
son
qación
y
soma
en tama~o y forma.
medio
de
las bipolares presentan
(Fig.
una gran diversidad
gruesa,
ramificaciones
externa.
Entre las células
merosas
externa
las
cual
bi4,
soma ovalado
fina 6 axón que une el
bifurcado en
IV.3,
Las que tienen el
soma y suele
Todas
(Fig.
formas;
o piriformes
la capa plexiforme
de prolongación
bi2,
gación
biZ).
y
morf o—
triangulares
Las que tienen el
di rectamen te del
t a ma a os
ovalados
de mayor tamaao,
una prolongación
variable,
bi4,
y
continuación.
gran diversidad
diferentes
mientras un os son pequeaos
biS),
resumimos a
IV.3,
en
a3),
al,
a2),
prol on—
n Limeros a s
y otros
son
redondeados,
de
dendritas,
gruesas
directamente
<Fig.
Las
desde
y
IV.3,
células
toda la retina
y
con
saliendo
varicosas,
(Fig.
IV.3,
M), puesto
a otra.
en posición
del
media.
que
Presentan
se
donde se observan
los “pies
de unión”
esta prolongación
en la retina
también gruesa.
en la limitante
une
vítrea.
también se observan
desde
externa,
citoplásmi—
pigmentaria.
el
soma
con
A lo largo
pequeFias
de
espí cuí as
más de 3—4
pies
Las células ganglionares se caracterizan por un
soma
citoplásmicas.
Estas célul as no presentan
y
gruesa
se extiende
citoplásmicas
las pequeuias prolong aciones
interna,
de
un soma peque~o
Una prolongac ión externa
que se internan
La prolongación
soma
extienden
soma hasta el nivel de la membrana limitante
cas 6 microvilli
pocas
aA—ab).
y con peque~ias espículas
el
tamaaos
de Múller son las de mayor longitud
~tna limitante
ovalado
diferentes
de unión.
grande del
que emerge en su extremo escleral
gran árbol
dendrítico.
<Fig.
IV.
jóvenes
1,
del
diciones
Una
el
axón
han sido extraídas
desarrollo
P12. Sin embargo,
las
disociación
os foto—
adultos
la fíg.
interpretación
hasta
para
no
ganglionares;
glionares
sale
un
g). Estas células
utilizadas
rreceptores
luías
Del extremo interno
ó ext erno,
la
permiten
por
IV.
ésto
4 que
para
Ja
carece
de
de
comentaremos
célu las
más
con,
de cé—
extracción
el hecho de que en
76
en días
gan—
adel ante.
1 as
mismas
condiciones
células
un
de
experimentación
de la retina
determinado
desarrollo
estadio,
complejo
En la figura
retina
de
lúcida,
en el
todos
los
Ál
resulta
imagen
una
dilficilmente
la
por ejemplo
y células
ciarse
de
figs.
Resumiendo:
gación
que
resto
como
de tipos
adulta.
permitido
estructura
también
de
de
sobre la
el
que
Esta interpreta-
dibujos,
células
obtenerse
óptica
a
de la
cámara
obtenidos
por
ó
reti na
las
electrónica.
¡9.2 y 19.5,
que
técnicas
Compárese
y obsérvese
en fotorreceptores
¡9.4 que no pueden eviden—
19.2 y ¡9.5.
a punto un método de disgre—
muy eficaz
celulares
para extraer
Además permite
de la retina
resultados,
hacer un estudio
‘
adulta no sólo de
de las otras
la
mediante
en la fig.
de la retina.
Estos
de
estructurales
Hemos puesto
resulta
fotorreceptores
a base
de la estructura
detalles
Múller
en las
de
apartado correspondiente.
con las figuras
los
a partir
ordenar y orientar las células aisladas,
puede
¡9.4
de molécula
utilizado.
tipos
de microscopia
figura
las
IV. 4 mostramos una reconstrucción
disociación.
clásicas
algún tipo
la rata adulta
de
todas
es que a medidada que avanza
enzimático
ción será discutida
disocien
menos las ganglionares,
desaparece
actúa el
se
clases
rata.
77
como
in vivo”
los
tanto
íntegros
disociar
el
embrionaria
veremos,
nos
del desarrollo
fotorreceptores,
de células
los
de la retina
han
y
la
sino
de la
-
mie
GNE
GPE
CNI
GP’
CG
FIGURA XY.4 Reconstrucción de la retina de la rata adulta
a base de dibujos a cámara lúcida de los
distintos tipos
de neuronas obtenidas por disgregación celular.
m.l.e,
membrana
limitante
externa; CNE, capa nuclear externa;
CPE,
capa plexiforme externa; CNI, capa nuclear interna;
CPI, capa plexiforme interna;
CG, capa
de células gan—
glionares
c,
cono;
b,
bastón;
ti,
célula horizontal;
bi. célula bipolar;
a, célula amacr ma;
ti,
célula de
MUller <glia);
5.i,
segmento interno;
s.e., segmento ex—
terno;
c.c, cilio de conexión.
Las células ganglionares
no han sido incluidas en este esquema por dificultad de su
extracción en retinas adultas. 380 x
CNE
CPE
CM
Gp’
CG
FIGURA IY.5 Microfotografía de retina de rata de PS teF~i—
da por el método de Golgi.
En este día del desarrollo se
identifican claramente todas las capas de la retina debido
a que los distintos tipos de neuronas ocupan su posición
definitiva. ONE, capa nuclear externa; CPE, capa plexifor—
me externa; CNI, capa nuclear interna; CPI, capa plexifor—
me interna; CG, capa ganglionar. 300 x
1W2
COMPORTAMIENTO DE LOS NEUROBLASTOS DE LOS FOTEJRRECEPTURES.
El comportamiento
ceptores
<cambios
estudiado
hasta
en
el
métodos diferentes:
lular
(apartado
de los neuroblastos
la posición
día
1)
P2C’
de los
y la
fotorre—
forma)
<postnatal)
ha
sido
mediante
un nuevo método de disociación
II¡ .2.3.>
•
2) método de Golgi
dos
ce--
<apartado
¡¡1.2.2.)
Comenzamos
de
microscopia
indican
que
comienza
de
es
en el día E18±1,
electrónica
los fotorreceptores
externa
y se extienden
microvilli
células
(Kuwabara
precisamente
a observarse
en
atraviesan
hacia el
pigmentaria.
80
y
este
cómo los cilios
la
previos
Weidman
estadio
1974)
cuando
de los neuroblastos
membrana
limitante
espacio que circunda
<peqLIe~as prolongaciones
de la retina
porque trabajos
citoplásmicas)
los
de las
XV.2.1
Estudio del comportamiento de los neuroblastos de
los fotorreceptores por disociación celular.
Por disgregación celular hemos estudiado el
lía
de los -fotorreceptores desde P3
éste
en
el que las ratas ya se consideran
diferentes
día
hasta
formas de los neuroblastos
desarro-
P20,
estadio
adultas.
obtenidos
se estudiaron en contraste de fase y se
Las
en
cada
dibujaron
a
cámara lúcida.
Los resultados presentados en la figura ¡9.6 muestran
que en el
estadio
ceptores, tanto
como
P3—P4 todos los neurobí astos de fotorre—
en retina central
en periférica
(grupo de la derecha),
bipolares si mil ares a las
lulas
FIGURA
amacrinas
¡V.b
<grupo de la izquierda)
de algunos
ó las formas GA
tienen
neurobí astos
de las
Dibujos a cámara lúcida de
células
formas
de
en
céciclo
neuroblastos
de
fotorrecptores.
obtenidos
por
disociación
celular
de
retinas
comprendidas
entre los días P3 y
P20.
En
cada
estadio
el grupo de
células a la izquierda cDrresponde a
neuroblastos de retina central y el de la derecha a retina
oeriférica.
Para
su
alineación
se
ha
tomado
como
referencia la base del cilio de conexión.
En cada
grupo,
la
primera
célula
de
la
izquierda
representa
a
un
neuroblasto
de cono (c> y las restantes
constituyen
una
muestra
representativa
de los neuroblastos
de
bastones
(ti),
con
los
somas en distintas posiciones en
la
capa
nuclear
externa
< bl—b3
en
PÓ Y.
Flecha,
esbozo
de
segmento interno; s.i, segmento interno; cabeza de flecha,
esbozo de segmento externo; s.e., segmento externo;
c.c.,
cilio de conexión.
Obsérvese que desde las primeras fases
de morfogénesis <P3—P4> los neuroblastos de
res muestran formas si mi lares a las adul tas.
81
fotorrecepto—
3BOx
FIGURA
IV.6
‘CC.
P3—P4
c
b
b
~t
P6
~4t~
b2
b1
PS
b2
se
—
SI
Pb
Se
CC.
P20
—Sl
bi
<Hinds y Hinds
precursores
que~a
19B3,
esceral
futuro cilio
de
de
el
Fig.
esbozo
¡9.7,
distinguen
de
puesto
claramente
una
interno
(Fig.
¡9.6,
sináptica
P3—P4,
diferenciación.
al
formado
b 1)
en
futura
formado
la
capa nuclear
por
los
el
c)
y
ya
y
se
clases
conos,
sináptico
2>
en
forPb
1)
un pedí cu lo
los
bastones,
su
extremo
b).
muestran
externa.
externa
ocupado por
somas
externa
el ni vel
El
nivel
<Fig.
los
sus
somas
fases
como nivel
aquellos
ocupan
83
19.6,
conoci dos~
somas que ocupan el
nivel
se
de las dos
el
Esta
de
estudio,
incipiente
limitante
secci ones,
futura capa nuclear
último,
este
—
el
inter mr
ella
desde las primeras
por
la membrana
de
<Figs.
P3—P4,
Hemos considerado
pr óx irnos a
y que,
En
de bastones
ya
en
incuestionable
externo
19.6,
su
p eabul
interno)
partir
clásicamente
niveles,
escí eral
a
pequeao
en
los
una
P3--P4, c.c).
los neuroblastos
neuroblastos
distintos
que
flecha).
(Fig.
esférula
Los
¡9.6,
los cual es ya muestran
de
bien desarrollado
con
de
fotorreceptores
algunos
(Pig.
embargo,
poseen
emerge de un
segmento
cabeza
mostrados
es un marcador
del
Sin
<futuro segmento
conexión
fotorreceptores,
1983).
la célula e incluye
pequeF(a prolongación
ma
la cual
•
citoplásmico
extremo
col.
de fotorreceptores
prolongación
tamiento
Prada y
de
externo
que
(Fig.
a
su
6 más
estarían
19 6,
más externo
Ph,
de
la
interno o vitreal,
nivel
IV. 6,
somas
más
interno
Pb,
en
b3>.
de
Por
posiciones
A
B
FIGURA IV.7 Microfotografías de algunos neuroblastos de
fotorreceptores disgregados de retinas en distintos estadios del
desarrollo.
Serie A,
neuroblastos de conos.
Serie B,
neuroblastos de bastones. Ambas series
se han
dispuesto en
orden creciente de diferenciación.
flecha,
esbozo del
segmento interno;
s.i,
segmento interno;
cabeza de flecha, esbozo del segmento externo;
s.s, segmento externo; c.c., tillo de conexión. 550x
intermedias
entre los anteriores
(Fig.
19.6,
Pb,
b2).
Obsérvese que los neuroblastos de bastones que tienen
el
soma en posición
sentan una
al
final
ca.
más externa
única prolongación
de
la
Los que
cual
tienen
se
vitreal
observa
el
soma
una única prolongación
extiende
hasta
terminal
en
sináptico
su parte vitreal
soma en posiciones
interna
que
escleral
en
En
tran
y
un
<Eig.
19.6,
medias,
en
<Fig.
son
muy
posición
si mil ares a
en
el pedículo
interno y
prolongación
pedículo.
En
más
o externa
interno;
b3>.
su
Los
soma
una prolongación
sináptica
al
varia dependiendo
el
fina
y
otra
segmento
de la posi-
b2).
que
otra más
de
adultos.
mues-
los bastones
Sus somas,
de
medio y externo de
Los que tienen el soma en
fina,
gruesa
que les une
interna,
que termina
bien diferenciado
soma en
vítrea,
conos
los de
prolongación
85
y
que tienen
los conos
ambos casos
que se
Pb,
externa.
el
interna,
unido al
sólo los niveles
sináptico
Los que tienen
tran sólo
sinápti—
los neuroblastos
media tienen una
segmento
c).
ocupan
capa nuclear
al
esférula
más gruesa que los une
mi smo estadio
pre-
directamente
esférula
¡9.6, Pb,
bí>
muy fina
posición
presentan
la
Pb,
interna
escleral
mayor grado de diferenciación
la futura
un
encuentra
ambas la longitud
forma ovalada,
P4,
se
termina
ción del soma
ó
comienzo del segmento
ligeramente
interno;
¡9.6,
la
en
muestran
el
<Fig.
posición
que termina
<Fig.
¡9.6,
externa
mues-
igualmente
las prolongaciones
son
FC—
en
de ma—
yor grosor que
Desde
observado
las de los bastones.
los
primeros
días
del
dos grupos de neuroblastos
cada estadio.
desarrollo
de fotorreceptores
Uno formado por neuroblastos
de mayor
y grado de diferenciación,
que corresponden
retina central
(Eig.
¡9.6,
grupo de la
los estadios),
y otro
formado por neuroblastos
tama~o y menos
periférica
diferenciados
(Fig.
19.6,
grupo de
ambos grupos nos permite
los fotorreceptores
un
retraso
de
flecha)
los
que
por
afirmar que
ejemplo el
<Fig.
¡9.6,
esbozo del
similar
de P4.
al
y
las
tienen
(Fig.
el
se
forma
inicie su formación
bastones
el
cilio
de retina
de
19.6,
es que el
adulto se encuentra
interno,
P4,
Pb,
segmento
a
a
en
antes
<Fig.
conexión
de
los de
cabeza
de
externo
de
tiene
un
Pb
86
a
va
y periférica
cilio de conexión,
que
¡9.6,
se
con
de
largo
se
man-
P20).
el extremo
periférica
de
diferencias de tamaffo entre
de retina central
Un hecho notable
se produce
de los fotorreceptores
los fotorreceptores
adulto
estudio de
Este retraso se mantiene a lo
de todo el desarrollo
en el
la retina
respecto
de retina periférica
grado de desarrollo
El
la
pequeí=o
la diferenciación
aproximadamente,
Observése
fotorreceptores
retina central
la derecha).
a
a
en todos
de
pertenecen
en
tamaao
sin duda
izquierda
de la retina periférica
dos días.
la retina central.
que
hemos
externo
el
P3—F4,
que en
del
segmento
segmento
interno
neuroblastos
la derecha).
desplazando
de
Por lo tanto
durante
el
desarrollo,
alejándose del
que
el
crece
puede
segmento
explicar
membrana
por
y/o del
tor
a
figura
interno
y
interno.
que el
del
extremo
la
se produce
limitante
(Hg.
bastones
del
mación
¡9.6,
segmentos
hasta
¡V.b y Hg.
alguna
figura
interno
¡9.7),
de las
en el
formas.
¡9.8.
A partir
y
las
y
la
tarnajio defá—
transfor—
produce
duplican
La
tanto en
el ongación
entre
su
<ó
los
longitud
día Pl? hasta el
experimentan
Los conos tienen mayor
87
lo
ex terno,
La
del
a
desarrollo.
sin que ocurr a
que
adelante,
de conos como
que alcanzan el
los bastones
de tamaFTo.
s.e).
semejantes
su
la
dirige hacia
consiste por
máxima de los bastones se
como muest ra la
reducción
formas muy
a
la
éste emerge
de retinas de PS días en
que experimentan
adulto,
y se
flecha,
días muy teffipranos de
periodo
de
del
fotorrecep—
interesantemente
tanto los neuroblastos
días P12 y P17,
estadio
crecimiento
interno ocurre
cabezas de
presentan
de los
ql obal
crecimento
segmento
cilio de conexión
progresiva
(F~ g.
interna al
obser-
de
nitivo
más
Además hemos
los
elongación
en posición
<de
el cilio de conexión.
han revelado que
la formación
de nuevas moléculas
se
en
nos
transformación
desplazamiento
<no indicada
libre del
desde
medida
externa
Las disgregaciones
adultas
a
entre la unión del
segmento externo;
pigmentaria
célula,
Es pues evidente que el
vado que el crecimiento
vez
la
Este
la agregación
la membrana
¡9.6)
de
citoesqueleto)
cilio de conexión.
segmento
soma
una
ligera
longitud que
BASTONES
2—
6~
O
1<
4—
z
O
2—
2
¡
1
3
4
tt
IIII’~••
5
6
7
6
DIAS
6
9
DE
10
11
12
t¡
13
DESARROLLO
i~.
14
15
16
17
1
¡
16
19
1
¡
2’OADULTO
POSTNA¶AL
---~
6-
E-
O
E-
4—
-4
z
O
2
o
——
¡
¡
1
¡
2
3
4
5
IIII¡h
¡
6
7
6
DIAS
9
DE
10
¡
1
1
1.
11
12
~3
14
DESARROLLO
.
1—.-——. -L
1
15
16
17
-1——————
18
1—.
19
Z0AD&JLTO
POSTNATAL
FIGURA IY.S
Curvas de crecimiento de los neuroblastos de
los fotorreceptores: bastones y conos. Cada punto repre-senta la longitud media de 20 6 más fotorreceptores,
elegidos al azar <veáse metodología en el apartado correspondiente).
los
desde PC> a P18,
bastones
indica que
éste es progresivo
Nuestros
resultados
fotorreceptores
adopta
(PZ—P4),
de que
antes
evidencian
presentan
desde
las
formas
limitante
su posición
que
la
externa
soma.
Esto índica que el
tipo
de bastón es
cuales
las
ocurre
Estas formas se
soma.
de fig.
En
a
la
19.6>
soma,
los
membrana
se
elongan
creciendo así
que poseen
de
elongan
cambio,
el
el ongan por ambos
programa
diferente
las
lo
en
Los bastones
se
Esto
igual que
prolongación
intermedias
pronto
soma
interno del
posiciones
¡V.b5
los
al
únicamente por el polo
interna.
de
muy
ocurra.
soma adyacente
<formas bí
soma
unido directamente
polo externo del
el
crecimiento
relativa
fig.
lo tanto,
poseen
de
que el
la morfogénesis
sináptico
Por
únicamente por el
bastones
evidencian
primeros estadios,
adultas.
curva
5L1
<Fig.IV.8).
b3 de
el pedículo
los
formas
y
soma
poí os
crecimiento
la
en
del
de
cada
y que está determinado
desde
muy temprano.
v~ partir de
los días P9—PXO el
significativo
en el
el
progresivo
crecimiento
alcanza el
se>.
Por
tama~o del
desarrollo
del
mo
el
de los fotorreceptores
es
adulto a P20
otro lado los
somas de
los conos van adquiriendo
en
más
segmento externo,
riendo una forma más redondeada
de
cambio morfológico
adulto.
89
(Fig.
¡9.6,
los bastones
y regular,
prolongaciones
hasta
y
van
que
F’10—P20,
adqui-
los pedículos
sinápticas
co—
Resumiendo,
postnatal
desde
tanto
formas simples
las mantienen
los
sinápticos.
P17;
a partir
Su
tantes
capas
de
sustancialmente
da
que
la posición
la morfogénesis
crecimiento
¡‘1.2.1.1
ocurra,
diferentes
distintos de
interna y los
alcanza
el
máximo
ligeramente
Aunquelos
termina-
de
a
tamai~o
de las res-
bastones
no cam-
sus formas durante la morfogénesis,
una aproximación
sus somas adoptan
los segmentos
una reestructuración
la retina.
presentan
prácticamente
paulatinamente
disminuyen
a
desarrollo
bastones
adulto y
crecimiento
de P17
posiblemente
cual
las del
la prolongación
debido
lo
a
mientras crecen
les
días del
conos como los
similares
interno y externo,
bian
los primeros
para
de homogeneidad
relativa
lo cual
entre
definitiva
implica
los segmentos
el los,
antes de
programas de
funcionalmente
la célula.
Clasificación
de las formas y cuantificación
de
las mimas.
Clásicamente
fotorreceptores
embargo,
capa
de
se han descrito
adultas
atendiendo
nuclear externa
estas poblaciones
somas en
en
la rata:
a la posición
bastones
del
de
soma dentro de
y hemos cuantificado
resultados
<Figs.
¡9.9,
muestran
conos son comparativamente
90
células
y conos.
nosotros hemos clasificado
la misma posición
Nuestros
dos clases
cada
Sin
la
una
las células con
¡9.10,
Tabla
que los somas
de mayor tamaio que
¡9.3).
de
los
los de
los
c
P
1
(23
~
—
se
-mie
-CC
W....
b
Cl
FIGURA
IY.9
Dibujos a cámara lúcida de fotorreceptores
adultos,
obtenidos por disociación celular de retinas de
ratas entre P21 a adultas. El grupo de fotorreceptores
de
la izquierda corresponden a retina
central, C, y los del
grupo de la derecha a retina periférica, P m.l.e, nivel
tentativo de la membrana limitante externa; cl—c3,
conos;
b, bastones. fJbsérvese que los bastones presentan el
soma
en posición externa <bí), media <b2> e interna <b3), mientras que los conos sólo en posiciones externa <cl> y media
<c2 y c3>; s.s, segmento externo;
cc, cilio de conexión;
s.i, segmento interno. 350x
bastones,
tienen
forma ovalada
y están distribuidos
mitad externa de la capa nuclear externa
<Hg.
en
19.9).
Cabe
destacar que no fue encontrado cono alguno con el soma
la
mitad
que
interna
tienen
membrana
el
de la capa nuclear
soma en posición
limitante
externa,
prolongación
interna
cónico
finas
con
19.10,
cl).
Los que
ambas
esté
externa,
tienen
terminaciones
sinápticas
tienen
el
soma en
escí eral
con el
19.9
muestran
fotorreceptores
que
¡9.10,
que
de
de
el
también.
larga
si nápti co
<Fig.
¡9.9 y
medias
gruesa y otra vi treal
más
núcleo
de la membrana limitante
c2 y
cuantificación
éstos cosntituyen
la retina.
c3).
Podemos
pues
externa
y conos
de los conos
<Tabla
el
2,69% de todos
Los conos con
el soma
41,02% de todos los conos
soma en posición
Estos resultados
puesto que esperábamos
la
media.
externa son el
tienen
total
y
soma en posición
posición
y
posiciones
conos con el soma en posición
Los resultados
¡9.3)
a
de longitudes variables según que el
<Figs.
distinguir,
Lina única
en
conos
tangente
en un pedículo
situado más o menos alejado
externa
Los
que termina
tienen una prolongación
fina,
externa.
la
medi a son el
llamaron
en
y
los
5S, 97Y.
del
nuestra
mucho menor porcentaje
los
atención,
de conos
en
posición externa y mucho mayor en posición media, dado que
el
espacio
mayor
externa.
que
a
el
ocupar por
que
los conos en posición
tienen para ocupar
Los bastones tienen
92
los
de
media
es
posición
sus somas en cualquiera
de los
A
B
FISURA IV. 10
Microfotografías de fotorreceptores adultos
obtenidas por disociación de retinas de ratas entre P21 y
adultas. Serie A, conos;
Serie 2, bastones; s.e, segmento
externo;
c.c; cilio de conexión;
s.i;
segmento interno;
cabeza de flecha, nivel de la membrana limitante externa.
3, pedículos y esférulas. Obsérvese la variación en la posición del soma de los bastones. 550x
TABLA IV. 3
CLASE DE
Clasificación y cuantificación de
rreceptores.
los
foto—
POS¡C¡ON DEL
NR
FOTORRECEPTOR
A
8
SOMA
Externa
lb
41,02
Conos
2,69
Medi a
23
SE,??
Externa
237
16,80
Med i a
994
70,49
Interna
179
12,29
Bastones
97,31
J
Número total
de fotorreceptores:
1449
NR : Número de fotorreceptores
de cada tipo.
A : Porcentaje
de cada tipo de fotorreceptor respecto al
total de cada clase de fotorreceptor.
B : Porcentaje de cada clase de fotorreceptor respecto al
total
de fotorreceptores.
tres
niveles
son células
Los
la
de
muy alargadas
bastones con el
membrana
sináptica
cualquier
en el
escleral
y
1=2). ~ diferencia
externa
y el
interna
única y
peque~a
medio,
otra
vitreal
del
soma (Fig.
soma
en cualquier
interno.
tienen
a
fina
esférula
Los que tienen
nivel
y
¡9.10).
<tangente
el
soma
tienen
una
de
longitudes
19.9 y IV. 10,
los conos que ocupan el
tienen el
externo
posición
con
¡9.9 y
tienen una
IV.9 y ¡9.10, bí).
según la posición
los bastones
<Fig.
posición
posición
prolongación
nivel
soma en
considerados,
vitrea que termina en una
(Figs.
variables
externa
y delgadas
limitante externa),
prolongación
en
la capa nuclear
nivel
posición
Los bastones con
una única prolongación
el
medio,
entre el
soma
en
escleral
y
su esférula sináptica sale directamente del soma.
No
hemos
“calicial
encontrado prolongaciones citoplásmicas
processes”
fotorreceptores
en
de la retina
La cuantificación
indica
que
éstos
fotorreceptores.
na
son el
soma en
el
del
segmento
interno
número de bastones
constituyen
el
97,31%
16,5% de todos los bastones;
<Tabla 19.3>
de
todos
son el
eran
puesto
que el espacio a ocupar
ocupan
el
medi a son el 70,49% y los que ti enen el
interna
en
los
exter—
los que tienen
soma en posición
esperados
los
de la rata.
Los bastones con somas en posición
posición
bastones
de
o
posición
los que tienen
media
12q29%.
Estos
Es mucho mayor
sus somas en posición
95
resultados
que
por
los
el
que
externa e in—
terna.
fldemás,
puesto que los bastones en estas
posiciones
ocupan espacios
similares,
indicando una distribución homogénea.
En la tabla
similares,
los porcentajes
IV.4 mostramos la distribución
los fotorreceptores
de
de los cuales
1,10V. son conos y 16,367. bastones.
1,76?. son conos y el 68,6% bastones.
interna
sólo
todos
de fotorrecep—
posición media están el 70,18% de fotorrecptores,
cuales
son
en los tres niveles de la capa nuclear
externa. En posición externa hay un 17,46%
tores,
últimas
hay
bastones
y
son
el
de
En
En
los
posición
12,35%
de
los
fotorreceptores.
En
resumen,
permitido
base
a
clasificar
la
resultados
rata
posición
obtenidos
predominan
llegan
nuestro método de disgregación
a ser el
nos
ha
las formas de los fotorreceptores
en
del
indican
tienen
nivel
en
cuantificarías.
1)
en la retina
puesto que los
3% de fotorrecptores,
puesto
de la capa nuclear
posición
y
que
los bastones,
los conos es restrictiva,
externa
soma
sino
la capa nuclear externa.
96
de
la
conos
no
la posición
de
que ocupan Sólo la mitad
externa,
restrictiva
2)
Los
y 3)
que
los bastones no
ocupan
cualquier
TABLA IV. 4
Distribución de los somas de los fotorrecep—
tores en la capa nuclear externa de la retina.
NjNPJ
DEL SUMA
POSICIO
Externa
253
1,10
c
16,3
b
17,46
Fotorreceptores
1,76 c
Media
1017
70,18
68,5
Interna
Número total
179
de fotorreceptores:
12,35
b
12,35 b
1449
NQ
número de somas encontrados en cada nivel <externo.
medio e interno) de la capa nuclear externa.
Y.
porcentaje de somas respecto al total de fotorrecep—
tores. La columna última a la
derecha muestra
los
porcentajes de conos
<c) y bastones
<b> en cada
nivel.
IV.2..2
Estudio del
comportamiento
los fotorreceptores
Este
gestación
Se
estudio
en
fotorreceptores
aunque
(RIO)
segmentos
en
Para
el
escleral
del
dn.
se
formas
de
de
es
bien
canon
de
retine central
en
realizado
un
cren er
98
postnatal
la
del
<Prada y
puede
no
estudi cd os
Tabla
o
1 y. 5.
de
todas
los
las
super-f icie
desarrollo.
centra 1
de
no
tirbci ón,
en la
ventrículo
de
éstos entre
cámara lúni da
desarrollo
<ver
sus
gradiente
que la periférica.
adul tas,
crecimiento
animale s
cada día
a periférica
largo del
10
mor-fogénes is
en retina
do gLie hay
los
que
negro por
la
de
significativo
pues al
di bujaron a
la retine,
lo
es e 1
día
cuyo seguimiento
coner tadas al
ha sido
más avanzada
inés
El número de
seguimiento
que a
a partir del
de color
día
tama~o de-fmi tivo
desarrol lo se presenta
CStLtdi o
forma
a las
método de tolgi.
fotorrecept ores,
di sti ntas
formas similares
y externo,
su observad
cada di a
este
su
día
(Pl—RIO)
que en
morfológico
retine pigmentaria
permite
debido a
Además,
interno
1B±l
10 días postnatales
los 1 otorreceptores
hacerse con el
la
RiO,
cambi o
experi ment en
a
de
el método de Golgí.
en ratas de
no han alcanzado
IV.2. 1).
el
1
muestran
todavía
apartado
se realizó
(E1G±1) y de
interrumpió
por
de los neuroblastos
debido a
El
que
di -f erenci a ci ón
col.
1991),
de
la retine
central
va
TABLA IV.5
Número de retinas satisfactoriamente
te~Ti—
das por el método de Golgí. E, embrionario;
Y’, postnatal.
OlAS DE DESARROLLO
NS
DE
RETINAS
EIS±1
e
Pl
4
P2
4
P4
2
P5
2
Pb
2
p7
4
PS
e
Pb
2
En E1S±1 (Fig.
el
IV.11),
tercio interno de
células
capa
retina central
Hinds
1979),
conectadas
da);
neuroblastos
amacrinas
en
al
proceso
<Fig.
célLilas ganglionares
(Fig.
también
limitante ventricular
11,
das
más
celular
células
que
IV.
IV.1l,
longitud
1992),
recién
que
comenzado
frente
y están
células
a emigrar,
al
han
col.
células
na,
conectados
células
nr),
(Fig.
las céluilas
y conectadas
horizontales
abandonado
de
a
y
y
el
una
bastones
al
nM).
ident ji 1 caen
del
ciclo
pequeal sima
las
o hay
amacrinas
y
su
a 1 gunas
ventricul
ciclo
la
ql lo—
IV.1 1,
tienen
<Reh,
no
han
propor-
que han abandonado
ciclo en este estadio.
1 00
ng)
Aunque a E18±1 entre
constituyen
número
abandonado el
y
de
las fases 61 y 62
a fotorreceptores.
de
base a
inonopolares o bipolares,
a células en
de peque?<a
los
i zqui er—
IV.11,
de células de MÉ.iller
la figura
precursores
ción
(Fig.
formas simples,
parecidas
en
serie
y
como neLtroblastos de fotorreceptores,
mayoría
En
<en dcl o celu—
IV.1l,
neur-oblastos de -fotorrecptores,
Como muestra
qL
identificar4
neuroepiteliales
de emigración
blastos precursores
IV.11,
en
<1967 y en retina de ratón d e Hinds
ventrículo
de
(Fig.
Lina
tanto
en retina de pollo de Erada
células
lar),
y por
interna observable
hemos podido
(1981) y Prada y ccl.
y
la capa de
diferenciadas
como en periférica
previos
trabajos
claramente
plex iforme
dos tercios restantes
los
que apro>~ i madamente
la retina está formado por
ganglionares
incipiente
se observa
Esto
índica,
cPI
FISURA
IV.1l
Dibujos a cámara lúcida de diferentes tipos
de células observadas en preparaciones de Golgi, en la re—
tina de rata de E1B±1. La línea inferior horizontal r epr e—
senta la membrana 1 imitante interna. La línea superior re—
presenta la superfí cie escleral de la retina o nivel de la
membrana limitante externa; M, 61, 5, 62, células ventrí—
cular-es en las dist intas fases del ciclo celular; g, célu—
la ganglionar;
gM,
neuroblasto de célula de Múller;
na,
neuroblastos de cél ulas amacrinas; ng, neuroblastos de cé—
luías ganglionares;
nr, neuroblastos de
fotorreceptores;
CPI, prospectiva capa plexiforme interna. 237x
por
ra
lo tanto,
IV.11
que
la mayoría
son neuroblastos
En ratas de
capas
en
ocupa
menos
células
del
En
y MUller
EIE±1,
células
esta
muestran
todavía
además
células nr>,
formas
que
primeros
con
distinguen
claramente
las
observables)
abandonan
células
que
en Pl
el
dos
en
que
la
la
capa
capa
de
tercios
más
amacrinas
Como
en
ciclo conectadas
al
de
de
precursores
las
por
de
los
ciclo
de
células
y
de
en EIB±1 describimos
los
de
(Fig.
a
Los precursores
que
y
ganglionares,
precursores
asemejan
mezclados
renci ación
retina,
los
neuroblastos
las obtenidas
Los precursores
ganglionares
de diferenciación.
IV.12,
de
los
Pl)
celular
están
y
entre
ellos
de conos
<c)
muy
conos,
mayor
grado
bastones,
celular
102
antes
los
fotorreceptores
(b),
los
en
P3—P4
los de bastones
muestran
presentan
IV.6,
en ciclo
neuroblastos
ya
<Fig.
fotorreceptores,
<véase Figs.
los
como
fotorreceptores
disociación
días de vida postnatal
IV.7).
mente
células
de células
IV.11,
a
de la
ocupa
grado
de
neuroblastos
idénticas
células
tres
y horizontales.
La población
se
las
numerosas
bipolares
posibles
día
de la figu-
se diferencian
incipiente,
que
mayor
aparecen
ventrículo,
y
la capa de
neuroblásticas
externos.
<PI)
tercio interno
interna
nr
de bastones.
1 día postnatal
la retina,
plexiforme
de las células
debi do
que
sin
se
<rara-
numerosos.
de
duda
aquellos.
dife—
a
que
Además
c
Pi’
P4
=1
mie
10 ¡a
P6
PS
no
FIGURA
!V.12
Dibujos a cámara lúcida de fotorreceptores
Pl y PíO tegidas por
de retina central de ratas entre
el método de Golgi. Para su
alineación se ha tomado
como refer encia la membrana limitante externa <m.1.e.). En
Cc), re—
cada grupo las primeras células de la izquierda,
presentan a los neuroblastos de los conos y las de la de—
recha, <b)
los neuroblastos
de los bastones. Obsérvese
que desde las primeras fases
del
desarrollo, los neuro—
blastos de fotorreceptores muestran formas similares a las
adultas, y ocasionalmente
formas multipodiales,
Cm). 38C>x
hemos
corroborado
Lituados
en los
pa nuclear
que
los
niveles
externa,
núcleos
medio
como ya
de los
y externo
visto
de la
por
nuestros
(Fig.
IV.12, Pí—FbO, c
IV.13, A1,2>. Su pedículo sináptico incipiente,
de forma irregular.
marcada con ni
Rara vez
observamos
en la figura
IV.12,
<López
1991)
formas
Pl,
recido a los numerosos neuroblastos
trados por
ca-
posición relativa la man-
tendrán durante todo el desarrollo
y Fig.
ya aparecen
respecto
habíamos
resultados en disgregados. Esta
conos
como
es
la
y que por su pa-
multipodiales
encon-
en retinas de pollo son con toda
probabilidad neuroblastos de conos.
Los neuroblastos
sus
somas
riormente
dispuestos
en
<externo,
medio
externa
(Fig.
tan
esférLtla
una
terno
precursores
de la
Entre
IV.12,
los
Pi.
de bastones
tres
niveles
e interno)
b).
sináptica
Los
en
incipiente
sin
la
capa
los
días
cambio
P4 y Pío,
llamativo
pedículos
sinápticos
bastones,
adoptan
el
P4—PXO y
que
nuclear
ya presen-
en el
polo
los
fotorreceptores
más
alguno
de los
en
las
y posición
conos
progresivamente
Fig.
de
y
sus
sus
se
in-
formas.
Los
ya se
somas
definitivos
las
y los
esférulas
formas
elon—
prolongacio-
de los
maduras
<Fi g.
IV.13, A>.
Queremos llamar la atención de que desde PZ,
en
ante-
célula.
adquieren su forma, tamaF~o
iV.12,
muestran
descritos
más avanzados
gan progresivamente por crecimiento
nes,
ya
distingue
104
la
capa
plexiforme
estadio
externa,
A
e
r
~1
—mie
h
1
eU
2
—GPE
B
1
-j
/
JI
ji
¿
1
—m le
—GPE
4
.9
FIGURA
IV.13 Microfotografías de células te~’idas por el
método de Golgi.
Al
fotorreceptores de retinas de 5 a 10
días postnatal; l—2~ conos a diferentes aumentos; 3—5 bastones con los somas en distintas posiciones. L células en
‘botella’, posibles neuroblastos de bastones 6 células 62
(cabeza
de flecha)
de retinas P8
m.l.e., membrana limitante externa; OPE, capa plexiforme externa.
Al, BI—B2
bOOx, 42—AS, B3 30C>x.
hasta
PB,
se
denominamos
en
encuentran
única
observa
a distintos
Estas
nes
los
de
niveles
por
células
células
que
redondeados
se
de la retina y poseen
una
(Fig.
tanto
que
de
somas
IV.13,
E.
cabezas
de prolongación
son muy similares
bastones
más interna
cuyos
ventricular
careciendo
vítrea.
peque~=o número
“botella”,
prolongación
flecha>,
un
presentan
a las
el
interna
formas
núcleo
de
en
o
jóve-
posi ci ón
(Fig.
IV.13, AS),
e idénticas a las formas 62
del ciclo celular
<véase Fig.
IV.11). Sin embargo, descar-
tamos que sean
nuestros
precursores
experimentos
en
los
de
fotorreceptores.
que
hemos
des de DNA evidencian que se
trata
62 del ciclo celular. Se trata
timos ciclos de división que
medido
dado
las
que
cantida-
de células en la fase
pues de células en los úlocurren
en la retina <véase
discusión).
Por
conocer
último,
cuándo
el
método
aparecen
claramente
capas de la retina
<dibujos
pleMiforme
está
células
das.
interna
amcrinas
En
PS
incipiente,
de Golgi
no
nos
visibles
mostrados).
formada
y ganglionares,
por
las
algunas
ha
permitido
las
En
diferentes
Pl,
dendritas
bién
la
capa
de
las
diferencia-
aparece la capa plexiforme externa de
en retina central,
y las células horizontales
comienzan a visualizar-se en su capa definitiva.
A
de
sus
P4,
la
retina
ya está
estructurada
que aumentan, paulatinamente,
za el
-op
desarrollo.
106
forma
en
todas
partir
capas
su grosor a medida que avan-
Resumiendo~
presentan
desde
precursores
formas simples,
se localizan,
relativa
definitiva.
longitud.
Por
fotorreceptores
muy similares
a
elongando
tiempo
desde muy pronto,
Después
las
comienzan
prolongaciones
adultas,
las
lado,
permitido
observar
botellas)
formas
del
adoptadas
similares,
y col.
ciclo
las
por
posición
a incrementar
externa
celular
por
sinápticas
preparaciones
primera
las
si no idénticas,
en
vez
la
a las
de
formas
rata,
células
(1981) en retina de poíio.
1CVY
sus
su
e interna,
(en
el
<en el caso de los conos),
desarrollan las terminaciones
otro
en la
y
que el soma adopta su forma redondeada
caso de los bastones) u ovalada
y
de
los primeros días del desarrollo postnatal,
núcleos
al
Los
definitivas.
Golgi
62
nos
han
(células
en
y muestran
en
ciclo
encontradas
que las
son
por
muy
Prada
IV.3
ESTUDIO DEL CaNTENIDa EN DNA DE LOS FOTORRECEPTORES
Hemos determinado
de
las
la
rata,
células
porción
ello
del
primera
fotorrecptoras
utilizando
Para
por
el
el
de
de la
de
pollo
y en la otra se
una
son
tiempo
de
que
el
IV.1).
El
hidrólisis fué de 45 minutos a temperatura
de
fotorreceptores
19±1 20, determinado
López
(1991)
para
de
pollo,
y el
tiempo
de 2,5
Al
iniciar
hicimos
distinción
contenido
igual
teniendo
conos
nuestro
laboratorio
y células
incubación
mediciones
entre
fuera
en
en
eritrocitos
de
apartado
de
en el
reactivo
conos
diferente.
lecturas
ambos,
del
y bastones,
Sin
lo
que
sobre
el
total
108
en
esperando
embargo,
comprobamos
por
contenido
que
después
el
decidimos
además en cuenta el pequeF(o porcentaje
representan
la retina
de
horas.
las
numerosas
(véase
previamente
por
era
de
e>~tendió
86,30%
realizar
retina
una
de células disgregadas de la retina en la
su
DNA
en
mezcla
SchifF fué
en
Feulgen.
eritrocitos
portaobjetos
contenido
disgregadas
método
extendimos
vez
de fotorrecptores.
DNA
q tie
de
conteni
do
agruparí
os
que
los
Los
resultados
fotorreceptores
y
de medir el
células
contenido
control
se
presentan
figura IV.14 y ejemplos de fotorreceptores
que
medimos
figura
su
IV.15.
contenido
Analizando
en
DNA
de DNA en
se
aislados
muestran
los histogramas
se
en
a
en
observa
los
la
los
la
q ite
OTORRECEPTORES
DE RATA
50’’
n: 45
~: 17,04
£ SM: 0, 42
40
311
ERITROCITOS
DE POLIJO
a-
50—
o
~j:
40~
.5
40
x: 10,20
£5,8.: 0,1
:1
11.1
~1
12
14
16
18
20
22
24
26
UNIDADES ARBITRARÍAS DE DNA
FIGURA IV.14 Contenido de DNA por núcleo de fotorreceptor
y de eritrocitos
de pollo
<control).
Los histograinas
corresponden
a sólo una de las preparaciones
utilizadas,
y
son representativos
de los resultados
obtenidos.
n, número
de células leídas;
x, media del contenido de DNA/célula en
Linidades arbitrarias;
E.S.M. error standard de la media.
109
los fotorreceptores
de
los eritrocitos
de
los
frente a
las
un
de pollo.
fotorreceptores
17,04,
entre
tienen
La media del
en unidades
10,20 eritrocitos.
es decir
casi
Dado que
res
son
DNA de
los eritrocitos
de rata
la relación
que
tienen
de
4,26
con
de
de unidades
en
la tabla
(pg)
medias
de
DNA son similares
<1968)
(también por el
contenido
celular
20
DNA y que,
por
durante 61.
111
40
contenido
no
de
en
indica
DNA.
La
absolu-
contenido
Esta cantidad
de
contrasta
indica
para
los
nuestras lecturas
Feulgen)
secciones
en
por
Lapham
hepatocitos
de hígado,
los fotorreceptores
lo tanto,
de
fotorreceptores
las obtenidas
método de
nos permi te pensar que
fotorrecepto—
fotorreceptores
a
<20)
contenido
en base al
Sin embargo,
de
estas especies,
Los
(1972)
es
relación
en unidades
de poíío.
B pg de DNA que Bachman
rata de tamaWo pequeRo
tengan
iV.6.
obtenida para
20 de la rata.
en
de DNA
se obtiene
arbitrarias
de DNA,
hepatocitos
cual
la
al
eritrocitos.
que el
arbitrarias
los eritrocitos
picogramos
los
conocido
entre unidades
4,26 picogramos
2,5 pg
de los
son de pollo y los
los fotorreceptores
la presentamos
el
20 es muy diferente
obtenida
transformación
tas
arbitrarias
Hallando
que
y que es bien
las célulass
“per se”
contenido
dos veces mayor el
DNA de los fotorreceptores
de
DNA superior
lecturas medias de ambas poblaciones
que es 1,7:1,
de
contenido en
abandonan
ti enen
lo
un
el ciclo
TABLA IV.6
de DNA de
Contenido
rata.
los
fotorreceptores
NP DE NUCLEOS
LEíDOS
de la
TIPO DE
CELULAS
CONTENIDO DE
DNA EN U.A.
X±
E.S.M.
CONTENIDO
DE DNA EN
U. ABSOLUTAS
Fotorrecep—
tores (rata)
17,04
0,42
45
4,26
Eritrocitos
<pollo)
10,20
0,16
40
2,5
unidades arbitrarias; X, medí a del contenido de DNA;
E.S.M., error standard de la media; las unidades absolutas
U.fl.,
de
la media están
El
permite
método
conos
de
visualizar
completos,
figura
así
son
picogramos.
Feulgen
la
como la
IV~15
esféricos.
A
El
y E se puede ver
de
cromatina
al
mientras
citífotometría,
en concordancia
de
es
simi 1 ar
no mostrados)
fotorreceptores
forma de las
núcleos
los
En
los núcleos
los
<datos
los
bastones
conos
y
de
la
son
es ligera—
la distribución
obtenidos
por
Es tas observaciones
están
La
estructura
sino también
y la
núcleos
la cromatina.
IV.
figura
real
posición de
112
la forma
15,
E da
de la capa
puesto que en ella se observa
células
completos
de
aisladas
hecho de que ambos tipos de células
de la
precisa
células
los
b ast ones
tienen los mismos valores de DNA.
una idea muy
cómo
los de
núcleo de
los
muy
con el
a
tama~o
forma y
tama?i’o del
superior
ap Ii cada
distribu cié n de
ovalados
mente
la
en
no sólo
de
la
y tama~o de sus
los somas.
En resumen~
hemos medido por primera
vez el
contenido
de DNA de los fotorreceptores aislados, utilizando células
de
a
referencia y condiciones de experimentación
las
utilizadas
por
otros
autores
para
similares
determinar
cantidades de DNA en células del Sistema Nercvioso Central
de otros tejidos. Nuestros resultados muestran un contenido de DNA
por
eritrocito.
contenido
El
fotorreceptor
valor
superior al
medio en Unidades
de DNA obtenido
en
contenido
Arbitrarias
fotorreceptores
aislados,
similar al
encontrado por otros autores en hepatocitos
de
rata,
en secciones;
del
asumido
por
E<achman
del
de
es
2C
aunque el valor absoluto difiere
(1972)
113
para los hepatocitos
2C.
y.
DISCUS
taN.
V.1
METUDO DE DISUCIACIUN CELULAR
Son
varios los métodos de aislamiento de células del
sistema
muy
nervioso central descritos;
complejos,
laboriosos
ñlthaus y Newhoff,
revisión).
obtenido
de
Sin
1962,
y no del
en
mejores resultados
células
nerviosas
manteniendo
todo
y Sachaffer
embargo,
técnicas mecánicas
la mayoría
los
y Schnaar
libres
relativamente
de
intacta
aF~os
han
combi nado
envuel tas
su
para
se
habi endose
sus
<ver
1963,
el empleo
y enzimáticas,
ellos
efíca ces
¡U timos
mediante
de
aislado
gí iales,
morfol ogz~a y propie—
dades electrofisiológicas.
el
En
ciertos
el
caso de la retina,
tipos de células en
caso
de
la retina de
de Múller
chenbak
del
conejo
conejo
y Reichelt
no extraen
y col.
de
1988),
(Reichenbach
conjuntamente
Los
la
especies
retina
las células
(Dana Giulian
1986).
conseguido
determinadas
los fotorreceptores
<Townwes—Anderson
de
se ha
1980)
y
de
las
conejo
células
1984,
procedimientos
tipos
como es
ganglionares
y Birkenmeyer
los diferentes
aislar
Rei—
utilizados
de
células
115
células
disociadas
son
fotorreceptores
y
de
éstos
el
de
la
retina,
peque~a.
En
sino
un
cambio
solo tipo
y
en
resultados
nuestros
cantidad
muestran
muy
que
el
método de disgregación celular que hemos utilizado
extrae
íntegras y en cantidad las distintas células de la
retina
de
la rata tanto en embriones como en
Además es
posible
celulares
de
purificar
la
rada
de las
variando
las
que
retina
puesto
la
capas y los fotorreceptores
en
una
cualquiera
retina
experimentación. Así,
animales
adultos.
poblaciones
condiciones
está
están
de
estructu-
constituyendo
capa externa y son células de morfología sencilla sin
intrincadas
conexiones
minutos)
de
entre
incubación
ellos,
con
una
el
contrario
las células de 3’lúller,
una
limitante
a otra de la retina,
sí
y
células vecinas
prolongaciones
celulares,
se
pura de
a
se extraen
proporciona
Por
que se extienden
de
que están unidas entre
con
a tiempos
(20
corto
fotorreceptores.
ambos
entremezclan
tiempo
proteasa
practicamente
con la
suspensión
la
un
de
niveles,
los
y
cuyas
restantes
tipos
incubación
largos
<más
de 45 minutos).
En
método
los experimentos
(Tabla
la proteasa
suspensión
las
clases
células
que
que valoramos
utilizamos
entre 20 y
Lina
muestran
IV.2)
en
tiempos
45 minutos.
celular compuesta
de
células
en
de
la
disociaciones
disociadas
son
de incubación
ron objeto de
por
retina.
óptimas
Los
de
con
todas
resultados
el B6.¿~0X
y
del
obtener
una mezcla de
fotorreceptores
116
la eficacia
de
éstos
las
el
97¿31% son bastones
real izados
indicando
los fotorreceptores
en
resultados
2,69% conos
ratón
similares
que
esta
del
está
mismo
al obtenido
en plano,
el
método,
sabemos,
ciación
que
semejante
La
y
La
en las figuras
eficacia.
El
que
IV.2 tambi én
disociados
IV.’?,
extraen
demás
los
no pueden
células
indica que el
están completos,
IV.10
y
IV.15.Hasta
de un método de diso—
de
la rata
ser
con el
intactas.
con
col.
del
adultos,
comparados.
que nos
encontramos
ganglionares
en las mismas condiciones en
se disgregan
y
la eficacia
fotorrecptores
partir de P12 las células
íntegras,
ser
retinas
trabajo de Townes—Ñnderson
resultado sorprendente
Lt n a
disgregó
los mi snos en
los fotorreceptores
que los resultados
a
con
de cada tipo resultó
empleado para extraer
es
que
favor
pues
método
Un
En
con la misma eficacia,
en retina de conejo no cuantifica
lo
ambos
poíío
(1988)
por
1979),
extrae
(1991)
López
no tenemos constancia
extraiga
indican
Vai 1,
de
otro
de la retina de
tabla
los fotorreceptores
como se muestra
donde
próx i ma)
hecho
por contaje de
in vivo
de
68, 68%
Aunque
los trabajos
con la misma eficací a.
porcent aje de fo torreceptores
idéntico
,
nuestro método de disociación
<bastones y 9 tipos de conos)
el
muy
los t ipos de fotorreceptores
todos
IV.3).
la rata
(Carter—Dawson
afirmación
modificación
de
(especie
tipos de f otorreceptores
de
<Tabla
alguno que haya cuanti ficado por algún
no hay estudio
procedi mi en to
y el
Esto mismo
no
que
se
las
ocurre
117
Perry
<1979.
1981)
y Perry y Walker
<1980).
En
nuestros
cuando
disociamos
las
publicados);
demás
cuyo
retina de poíío
células
célul as en
los
ganglionares
disgregados
a este hecho es
digeridas
p or
que 1 a
(ó
las)
moelécula
a
de
ganglionares.
posibilidades
demostrar
daF~adas,
nes,
y
o bien
que son
con lo cual
no pueden
incuestionable
(Johnson
1986).
disgregados,
será
ser
utilizado
pocos
la
que
Cajal
<1892)
estudió
en el
ratón como especie
-fotorrec eptoras
Golqi
no estLldió
microscopio
observar
amacrinas
1981)
sus
para
que
han
y Perry
Thy—1
en
los
utilizado
aunque
más próxima.
por
y las
y
las
y Walker
la
sí
método
la
sido
estu—
alguno
que
sin embargo
con el
células
las
método
de
ganglionares,
interpíexiformes
(1980).
en
Las células
MUí ler no han
estudiadas
invertidas
uso de un
la única especie
la retina,
de
<1974),
El
otras posibilidades.
óptico
han sido
sino
prolongacio-
buscarlas
su forma completa,
por Leure Depree
<1979,
otras
ganglionares,
Quizás sea
las células
bipolares
amacri nas.
Perry
y
sin
un
capa
tendremos
los trabajos que
adulta de la rata.
c él u 1 a s
de la
objetivo
de células
retina
permi ti ese
de
existen
identificadas.
antes de considerar
muy
al
que son
embargo,
di sgregadas
marcador
di adas
las
lo que sucede es que no son disgregadas,
si
Son
primer
como
(s)
partir
estadio en la matriz extracelular
Sin
a
Una explicación
determi nado
células
no
hasta E18±1, a partir de
disminuyan,
la proteasa
todavía
acompa~Tan
no se observan.
estadio estas células
fácil
(resultados
En
por
nuestros
118
.n~.y
~TSLctC
~trdy~¡Iuu
¿os otros
tipos ue cejuias
oe
ja
disgregados
hemos observado
células bipolares
las mostradas
por Leeure Depree
idénticas
las
<1960>.
por
a
de
las preparaciones
Comparando nuestros
esos
autores,
se
digregación
utilizado
muy
extrayendo
eficaz
retina que no son
posibilidades
(1974)
y células
amacrinas
de Golgi
de
resultados
evidencia
en nuestros
idénticas a
con
que
los
el
Perry
obtenidos
método
experimentos
es también
los otros tipos de células
fotorreceptores,
para el estudio
abriendose
“in vivo”
de
de
de
así
la
nuevas
estas
células
disgregadas.
Teniendo
en
los
en cuenta que
paises industrializados
pérdida
de
y Sarks
1989),
no
la principal
causa
está relacionada
y que la destrucción
necesariamente
al
a la
pérdida del
conexión
actualmente
se trabaja sobre la posibilidad
cierto grado de visión
cerebro
en
reemplazados
y
se
En base a
versos trabajos
consistentes
en
la
1992),
conseguir
indican
transplante
119
retina
se han realizado di-
externa
<1988)
ventajas
la
de
fotorre—
<Del Cerro y col.
Los resultados de los trabajos
una serie de
de
el transplante
1992>.
tiene
de
<Silverman y col.
lo anterior
la capa nuclear
que el
<Sarks
resto
reestructurase
bién de forma aislada
fragmentos de
la
el caso de que los fotorrecepto—
apropiadamente.
en
con
de los fotorreceptores
retina o su
ceptores.
ceguera
las células -fotorreceptores de la retina
conduce
res fuesen
de
sobre
de
<Silverman
de Del
o
y col.
Cerro y
células
los
1983)
col.
disociadas
transplantes
de
fragmentos sólidos de tejido de la retina.
Algunas
ventajas
mejor
ción
2)
de
la
son:
1)
el contacto más
las células
posibilidad
transplantadas,
supervivencia
y
solución
El
podría
ser
que
la
el poder
que su
una de las
parte,
causas,
de
demuestran
éxito
res
a partir de
que
los
diferenciación
sino
de
huésped,
las células
sólo un
y
marcandolas
los mismos
de transplante
de
“intento’
de
Del
células
de
precursores
Adíer y
col.
(1986,
1987)
tantes de la disgregación
prolongaciones
de
de
fueron
los
evttrae
la
Por
fotorrecepto—
embrionarios,
e
indican
genético
alterable
la cual
En base
íntegros
a
el
resul-
rompe
que
no
por
de
usados por
células redondas,
tripsina,
las
se puede conseguir
de los fotorreceptores
120
por
grupo de Adíer
tienen un programa
las células.
disgregación
cual
no concluye con
en pollo del
que “in vitro”
con
lo
principal,
que resulta dificilmente
Los
col.
la capa fotorreceptores.
los precursores
medio.
Cerro y
íntegros,
la
la diferenciación
fotorreceptores
de
tejido
la distribución
usado por
Estas
los eMperimentos
1987)
con relativo
método
constituye
extrae los fotorreceptores
reinserción
(1986.
procedimiento
disgregación
perfecta reestructuración
otra
determinar
integra-
problema.
método de
no
contaje
aislados
del
<1968)
de realizar
el
el
A pesar de estas ventajas,
reconocen
fotorreceptores
en
las células transplantadas
por fluorescencia,
autores
transplantadas
3)
de
íntimo y
de las
las
nuestro
sólo
los
fotorreceptores
sólo
de
los de la
poíío
ye en
tivos
el
1991),
sino también
pensamos
que
de
para
intentar
la retina.
Además,
los neuroblastos
nuestra
mejorar
opinión un
la
los
mecanismo
resultados
abren
de
de los fotorreceptores
paso previo para mejorar
de diferenciación
121
celLilar.
nuevas
transplantes
posibilidad
de estas células y realizar nuevos
y no
los de retina
los
en este trabajo de tesis doctoral
perspectivas
íntegros
sino tambien los embrionarios
retina de rata,
<López
obtenidos
células
adultos
de
extraer
constitulos cul-
estudios
sobre
V 2
DE
COMPORTAMIENTO
LOS
NEUROBLASTOS
DE
LOS
FOTORRECEPTORES.
Uno
cómo se
de
comportan
rata
adultas.
forman
las
de los objetivos de nuestro
era estudiar
las células fotorreceptoras
de la retina
desde que dejar
Es decir,
el
ciclo celular hasta
nos propusimos
las células postmitóticas
células en
redondeadas
mitosis e
y
monopolares
Hinds.
trabajo
las
1974;
Erada
en
y col.
observar
transformación
fotorreceptores.
dejasen
el
tendrí amos
En
ciclo al
el
fotorreceptores.
el
Prada y
Gí
de
dc 82
122
puesto
los
(la
1981,
que
sucesivamente
1971;
Hinds
tendriamos
formas
estas
1983,
y
los
que
en
f otorreceptores
otra
la transformación
col.
trans-
pen samos que sí
ciclo en
son
post mitóticas son
son
caso de que
final
que observar
61
1961),
dejasen
cómo se
adultas.
<Hinds y Ruffet,
fotorrecptores
la
en
inmediatamente
células
y bipolares
estudiar
que
de
posibilidad>
formas 62
en
descubrieron
en
retina
de pollo en
(2q~Bq5)
con
una
los primeros
células
monopolares
única prol ongación
cualquier
posición
en
llamaron
células
“en
las
forma s
fase 92.
en
los e stadios
del
electrónica,
de
grosor de la
los trabajos
retina
a
dedujeron
ciclo
las
en
en
que
que
son
durante
la
realizados
retina
o de la corteza cerebral
con
1971),
microscopia
cLient a de estas cél ulas,
rata,
soma
dif erenciación de la
1 974)’
buscarlas
de
y el
anteriormente
(Hinds y Puf f e t
die ron
propusimos
y
ventrículo,
retina,
las célu las en
<Hinds y Hinds,
al
<la ventricular)
inicial es de
mismo animal
nos
de
de diferenciación
conectadas
botella”
que adoptan
Ninguno
de ratón
el
estadios
preparaci enes
como paso
previo
al
por
lo que
de
Golgi
estudio
del
comportami ento de los neurob lastos de los fotorreceptores.
La
retina
método de
según
ser
Golgi —Stensaas
protocolo
modificado
preparaciones
botella
la
embri onari a no -fué posibí e teFilrla por
con
retina
original
<véase
de
la
c é 1 u las pigmentar i as.
de
el
Golgí—Colonnier
tampoco
material
Golgi
los somas
desde
y
de
resultó
y
cél Lilas
botella
vítrea
se
ganglionares.
con
el
No
en
de
hasta
la
capa
de
1 V. 11,
92)
ninguna
soma metido entre las células
123
los som as
más pr óx imos a
por en cima dc
se observó
en
grosor
zona ventricular
encuentran
c él ul as
el
1 as formas en hotel la que observamos
1 ~mi tan te
hubo de
Nu e st ras
métodos).
a distintos niveles
En E1B±1 (Fig.
realizado
útil;
EIS a PR muestran
el
1 a
la
cpa
de
célula
en
ganglionares,
ni
contact ando
si mil ares
en
a los obtenidos
retinas
también
la
la limitante
vitrea.
en
Estos resultados
pollo por Prada
de 6 a 8 días de incubación,
la capa de células ganglionares
zona
matriz
plexiforme
<o mesetelio)
interna.
Las
por
y col.
en
células
consonancia
con
por Denham
<1967).
timidina
una
duración
a
P2
es
capa
observadas
desde
externa
celular.
un a de
a
la
somas
introdujo
3 y 4
ventri cular
por
60 horas,
de la
capa
está
en
obtenidos
un pulso de
Además
de
determinar
ciclo,
por
una
<donde realizan
62
limi tante vítrea a medida
la
encontró
banda
interna,
P3 y P4.
DNA cada vez
las células
y
para determinar
externa durante
lo que
la
días postnatales,
incipiente capa nuclear
la n ucí ear
la razón
de
lo cual
las fases del
las céluls sintetizan
la limitante
los
2,
E>,
zona S queda delimitada
se acerca a
ésta
r atas de
ciclo
cada
la
lo tanto,
a
del
de
marcaje,
cual
en
de
incipiente
de ciclo celular
Este investig ador
cada 2 hora s hasta 1 as
la duración
que
IV. 13,
los resultados
tritiada
sacrificó
(Fig.
cuales
está separada
formas en botella
ganglionares
<1991>
las
PO a PB tienen sus somas más al ejados todavía
de
son
de
la
Por
más próximas
la mitosis>
van
y
alejando
que avanza
el
desarrol lo.
Los resultados
el
G2
ciclo celular
1,5
ciclo
dura en
y S12,Sh.
dura
de Denham
menos
(1967>
la retina
indican
2Bh.
M
O,Bh,
En estadio prenatales
se
y
en
01
y S
1 24
también,
que en
P2—PS
G1
13’
piensa que el
base
a
los
resultados
embargo,
de
la
Fujita
<1962>
larga duración
del
sus fases,esp ec ial mente en 81
el
la probabilidad
método de Golgi.
elvado
observarse
formas
del
en
la fig.
resultados
que adoptan
ciclo,
y
la
determinada
por
celular
la
muestra
en
tante
Nuestras
así
que
Sin
los primeros
dias
como las
las
pensamos
la explicación
en
que ha
£4.
13
en
y
células
Ten i endo en
cLient a
q ue muest ran las
una
de
la
la
fi gui r a
tienen
formas
y .1
Este
en
es-féri cas
y una prol on—
próM i ma
más jóvenes.
las
esféric as.
va desplazando
la que progresivamente
“en
fases,
ciclo
pasan de formas
formas monopolares
fases
el
divi den
cono de cr ecimiento
los estadios
las
esquemat izamos
si tuada
para el
pueden
cada una de
de cada
por
que
las cé lujas se
ventrículo
a
Durante
botella”,
el
la limi—
8
las
que man—
82.
preparaciones
disgregaciones
los conos tienen
Esto está en
lo cual
como ejemplo,
,
de rata en
la zona de síntesis,
tienen durante
8,
(1967),
formando un
ad op tan
y
las células
retina
del
vi trea en
células
pollo.
sobre ciclo cel ul ar,
Denham
gación vítrea por
62
duración
la fase 81,
a bipolares,
núcleo a
de
de ti nción de estas formas
IV.
que en la fase M,
proMimidades
Durante
ciclo en
Esta podría ser
número de células
nuestros
retina
i mplica que 1 as cél ulas pasan mayor tiempo
postnatales
aumentado
en
de
Golgi,
de estos
de retinas
estadios,
formas más maduras
concordancia
con
125
PO—P4,
muestran
que los bastones.
los resultados
de
autorra—
-r
6~
VENTRI CULO
VITREO
FIGURA
Y.1
Ciclo celular en
dio
P2.
Obsérvense
las disti
formas que las células adoptan
mitosis; 61, fase Gí;
5, fase
7. tiempo total del ciclo celul
la retina de
rata en esta—
las
nt as fases del ciclo y
en
cada
fase.
M, fase de
de
síntesis;
62
fase 62.
ar.
diografia
de Reh
<1992)
en rata,
los
cuajes
neurogénesis de los conos es prenatal
de
días de
vida,
siendo su peri odo de neurogénesis
PB,
Los
result ados obteni dos sobre
de
los
neurogénesis
3%)
y
bastones
debido
inicial
a
n LIestr as
no
conos
proceso
de
de
las
que
cuales abandonan
una
fase
prol ongac ion es
el
que los del
ciclo celular
multipodial
citoplásmicas
posteri ormente
prolongación
su
mr mas multipodiales
Figs.
11,
formas nr
dibujo
de 1 a retina
trabajo
de
la
pollo
al
en
Sin
mismo
<López
1991),
de
emiten
61,
varias
del
soma,
la
la deecha y
un neuroblasto
neuroblastos
EXB y Pl,
IV.
<véase
12
PUm>.
que
127
en
(lámina VII
que no hace comentario
a
la
hemos enc ontrado
los días E18 y Pl
de ratón
de
el
comienzo
que
Nosotros
embrionaria
de
que estos
a
postmitóticas.
una única célula multipodia 1
que podría corresponder
observado
secuencia
cortas alrededor
última a
tambi én muestra
cuenta
en
interna definitiva.
1972),
material
van perdiendo a medida que emi ten
algunas
IV
formas
la
de
la rata podrían seguir
de transformación
adoptan
preparaciones
pocas
sid o posibí e obtener
ha
embargo,
los
peque~o número
ElÓ a
las
inicial
en
de
aquel a tinción de Gol gi sólo tii=e un 107. de
transformación
Ca jal
los primeros
del
en
a su
en
mientras
la morfogénes is
son muy p obre s porque,
es prenatal,
embrionario
que
generan
la
<menos
células,
los
se
<E1O—E18),
que la mayoría
conos
los
indican que
multipodiales
la neurogénesis
de
del
al guno.
de cono.
su
y
Teniendo
los
hemos
los
conos
concluye
la
a EIB
reti na
cual
<Reh
1992)
peque~o
formas
multipodiales
formas
también
1983
y
son
durante
las formas
la
son
células
amacrinas
posición
definitivas,
que
en
corresponden
precursores
1983)
1 as
este
muy parecidas,
61
y
del
preparaciones
el
éstas
en
que hemos observado
en
Sin
las
embargo,
con
formas
<Fig.
Sin embargo,
su prol ongación
a
Pl
las
las formas y
se puede
multipodiales
de
y
hemos visto
en
llevan
<1979)
IV.12)
un
cilio
en
de
en
ori entado hacia
Estas
por Morest
Gol gi de ratas de Pl y
que
las formas
los di sgregados
como tales.
a 1 as observadas
Hinds
de
¡VAl,
ventricular
que los diferencia
parecidas
Hinds
Hinds
que
formas de fotorreceptores
preparaciones
por
células
argumentarse
de bastones,
celular
de Golgi •
extremo de
muy
Estas
CHinds y
a veces indistinguibles,
ciclo
la pigmentaria
son
que 1 as
conos.
lo tanto dificilmente
estadio
lo
a estas c é 1 u 1 a s.
son
P3—P4
3%),
pensamos
de
hemos observado
y por
del
de emigración
amacrinas.
de ellos en
determinadas
y podrí a
Las formas más jóvenes
(32
por
multipodiales
células
pensar
son
el proceso
realidad
<menos
número observado,
adoptadas
Prada y col.
rata
la proporción
de la rata es muy pequeF~a
explica el
amacrinas
y que
formas
(1970>
a las
en
obtenidas
reconstruyendo
secci ones
ultrafinas
de retinas de ratón
entre £15 y E17.
De estos
resultados
se
al
de
-fotorreceptores
evidencia
dejan
el
que
menos
ciclo celular
128
parte
durante
01
los
puesto
que
hay formas
único
que
de neuroblastos
las diferencia
de 61
las
formas de neuroblastos
(32,
podrían
por
abandonar
consi derado
Sí
de
DNA
indicar que tienen
el
contenido
es
212
y
(32.
Pensamos
de
dejar
y
de la prolongación
en
adultos.
a
postnatales,
nos
fotorreceptores
bastones
nuestras
por
el
desde
la
sido
<1892>
Caja 1
rat ón
del
como
conteni do
que
ciclo
en
su
01,
adoptar
que
inmediatamente
ci cío
estas
formas
por
de estas formas con
hasta
pensar
los
que 1 os
formas 62 son
soma en
externa
estadios
pri meros
los
posición
neurobí astos
única
de crecimiento
que
en
de los
más interna
<b3 en
están
limitante ventricular.
129
apoyada
diferenciados
a base de
poseen,
este
de
precursores
Esta hipótesis estarría
PO y hasta P17 están elongandose
la
ha
La cohexistencia
hace
con
el
hecho de que estos bastones
núcleo a
precisamente
indican
el
a
hasta convert i rse
ilustraciones>.
capacidad
similares
interna
formas 61
que tienen el
prolongación
unica
bastones
lo
embargo,
los neuroblast os de fot orreceptores
mitosis
las similares
del
lo tanto dejan
crecimiento
bastones
retina
Las determinaciones
(32 podrían
la
alguno,
que
1 a otra posibil idad.
q LI e
formas
Sin
Aunque esto no
autor
1 a
en
por
cilio.
Estas formas
hemos real izad o en
quedando excí uida
después
62
de bast ones.
que
tienen
ciclo en
formas
percursores
es el
de fotorreceptores
anteri ormente por
seWaló
de fotorreceptores
elongar
indicando
segmento
su
que une el
Esta capacidad
podría
ser
adquirida
inmediatamente
distintas
por
el
hecho
después de mitosis,
formas
de
de
abandonar
ciclo celular
<Prada y col.
células
amacrinas
1983).
130
en
abandonar
de manera
emigración
neuroblastos
el
de
que
por
distintos
el
ciclo
análoga a
las
adoptan
los
el
hecho
momentos
de
de
61
VI.3
CLASIFICACION DE LAS FORMAS Y CUANTIFICACION DE LAS
MISMAS.
Los trabajos prévios
ceptores
en
la retina de rata
con microscopia
dijimos
en
electrónica
apartados
para
obtener una
idea exacta
reconstruyan
el
caso
de
secciones
las
adulta han
los
capas celulares
se obtengan
para
las células,
tanto,
nuestro
morfología
completa
131
fotorre—
realizados
de
como ya
ultra-finas
no permiten
las células,
seriadamente
pero tampoco se
secci cines.
la
de
a
la
pueden
rata.
se
no
y con ellas
sido realizado
inmunohistoquimica
de
mostrar
microscopio
esto no ha
formas completas
Por
al
fotorreceptores
utilizadas
sido
Las secciones
de la forma
las mismas;
los
inmunohistoquimica,
la observación
las secciones
se
e
estudiado
anteriores.
utilizadas
ser que
que han
En
en
las
distinguen
observar
sino los perfiles
las
de sus
estudi o es el pr i mero
en
de conos y
en
bastones,
preparaciones
de
(3olgi
nuestros
resultados
la
tienen
rata
<Cohen A.
1965,
se deduce que
Hogan
el
la mitad
y col.
externa
y que el
sin sobrepasar
nuclear
externa.
muestran
En cambio
son
muy parecidos
tener
LaVail
una distribución
los peces
y
LaVail
<Pérez
Arroyo
monos
(Rorwerin
tambien
mientras
la
similar
t ienen
en el
de
restringidos
a
de la capa
Estos resultados
.
ratón por
ratón
1964a),
<Braekevelt
puesto que
posición
pollo es diferente-
que presentan
gran
mientras que
132
limitante
están distribuidos
y porcentaje
la posición
que
intermedias,
interna,
en
el
sus
Carter—
que
podrían
son
(Carter—Dawson
las
tortugas
1983a)
y
los
en sus retinas
los somas a distintos niveles,
tienen en
los somas,
hombre
externa,
posiciones
(Nilsson
1980),
-
el
y
de los fotorreceptores
1987).
distribución
los
conos
posición
y col
ratón
la membrana
la capa
las ovejas
los conos los
fotorrecptor
los
1978>,
los bastones
embargo,
a
Otros ver tebrados
la rana
1979),
capa nuclear
la mitad
er,
(Raymond y R ivlon
del
que los conos tienen
a los encontrados
<1979).
los
1979),
los bastones
6 menos homogéneamente
y
de
ocupan
caso
más
Dawson
la
(59%)
en ningún
los fotorreceptores
y LaVail
están tangentes
resto
De
a
en
1971>.
externa de
42,02% de ellos
fresco.
muy similar
Carter—Dawson
Nuestros resultados
somas en
en disgregados
un aspecto
1972,
<Missoten
y
En
más ex t er n a
de
cada
—
tipo
Sin
de
esta esp ecie son
variabilidad
los bastones
más interna unicamente
en
la
están
<Cajal
1892,
Mor-ns y Shorey 1967,
1976b,
López
1991>.
El
Gallego
y col.
1975a,
signi ficado biológico de
4 eren ci as ent re especi es no se conoce por el
En
los
últimos
evidencias
aros
se
experimentales
han
moleculares
entre los bastones,
en
dominantes
(Ecunt y Klock
Falt
col.
1982 y
Ishikawa
1984,
y
en
la
las
estaría
en
celulares
futuro de
formas
trabajo
en
de
el
1990).
diferencias
diversidad
diferencias
1 981,
Szel
lad o,
y
la
funcional
y col.
ya
que
ha
diversidad
la
diversidad
entre
a
con
conocimiento
de
otras
las
El
moleculares
los fotorreceptores
sin
enorme
la
ya mencionadas.
las diferencias
supondrá,
demostrado.
la que
con
la
Esta
bastones,
diversidad
poblaciones
conocimiento
en
entre cada una de
desc ritos
en
nuestro
avance consi derabí e
duda al guna,
un
la fisiología
de la
133
los
que
ellos,
superior
ent re
funcional
presentan
la retina,
se
ha si—
con
punto de vista éste muy coherente
que
19B5,
fotorrecptores,
muy
y
diversidad
amacrinas
t anto,
los
bastón—
Hollyfield
estruct urales
consonancia
de
Por
numerosas
especies
ganglionares
núcleo de
diversidad
mofofuncicianí
las
col.
molecular
hipotética
las
forma incuestionable
del
conocemos,
diversidad
el
y
posición
podría entraWar
hoy
de
momento.
las
1964,
Por otro
de las células
<Daw
determina
y col.
1989).
do correlacionada
funcional
Araki
col.
morfológica
1960,
estas di—
obteni do
sobre
Gallego
visión.
v.4
CaNTENIDO EN DNA DE LOS FOTORRECEPTORES
El método de Feulgen
en
una gran variedad
con ten i do
central
de
de
los
secci cines han
<1959)
DNA de
del
corte>:
a
también
parecen
412.
col.
Las
primeros
cerebral
células
1970).
son
<1974),
hiperploides
en
En
sit uación
para
cerebelo.
respecto
encontrado
que son todas diploides
1973;
Fujita y
134
Algunos
col.
ciertas
cont eni do
del
de
a
y Fuj ita
y una mezcla
1974;
y
1968>.
célul as
investig adores
(Morselt
1968,
la m é d LI la
y Lap ham
las
DNA
Vii poc ampo
<1 970)
<1981),
para Herman
del
y col.
que
Lapham
<Herman y Lapham
Béhm y col.
se da
nervioso
Her man y
piramidales
del
obteni dos en
encontrar
poseen un
Purki nje
Cohen
estudio
cambio las células de
tetraploides
similar
utilizado
En el sistema
diploides para Nováková y col.
dipí oides y
Una
el
los resultados
ser tetraploides
espinal
de
para
las células.
vertebrados,
los
pró>~ i mo
Mciv á k 0v ti y
de organismos
sido a veces controvertidos.
f ueron
neuronas
ampliamente
ha sido
col.
Mann y col.
de
han
1972;
1978;
Kaplan
1961;
Mares y col.
porcentajes
una
variables
población
1981;
1982)
Bdhm y
mientras
,
un
1981;
1968,
col.
1970.
Kuenzle
y col.
Esta
controversia
en
especial
la
de
mayor
y por
1 964).
de
o
debajo
1979).
a
la
menor
del
mediciones
contenido
cuestionados
los demás investigadores,
secciones
células
de
cantidad
y además
contenido
Sin
que
que han
unidades
arbitrarias,
ni
135
obtenido
los valores
absolutas)
Tampoco
fotorreceptores.
de
de DNA
obtenidos
demuestra
los
el haber
las condiciones
ni muestra
a
la
de la misma manera
temperatura,
aislados correspondan
de
sus
ni
ai sí ados.
de DNA
embargo,
ni
en
de
Feulgen
núcleos
porque no indica
de referencia,
DNA
núcleo.
del
2C.
men—
discusión
de la rata por el método de
un
ser
La
los valores
de 2 y y en preparacion es de
secci cines y en núcleos
núcleos
y col.
variación
(1967> realizó
resultados en
en
Hobi
una
por encima
resul tados pueden
<ni
y col.
y
trabajos
indicando
hidrólisis,
Bregnard
Nováková
los
secciones
utilizado
1969,
de
consecuencia
de
todas ellas son
los resultados parece deber-se
de los fotorreceptores
los
1978,
Scherini
(ver las discusiones
centra en
retina,
y Lapham
1981;
de los núcleos
mayor
en
Lentz
Scherini
DNA
en
Denham
Bhatnagar
y
de
de
cionados,
citoplasma
y
dentro
de medir el contenido
en secciones
como
encontrado
<Bernocchi
tercer grupo afirma que
(Lapham
se
diploide
Swartz
tetraploides
dificultad
otros han
de células hiperploides
básicamente
col.
1985),
que
en
los
Nuestro trabajo
contenido
tenido como objetivo
de DNA de los fotorreceptores
te un procedimiento
método de Feulgen
do
ha
original,
a células
en
citofotometría
aplicación
pensamos
la valoración
en
el
de la rata median-
que la
disgregadas
los problemas que presenta
de DNA por
el
determinar
secciones,
del
ha obvia-
del
contenido
como veremos
más
adelante.
El
método de Feulgen exige gran
realización
(Decosse y Aiel lo,
fluijin 1973;
Rasch
1985)
material,
que
Kjel 1 strand
pues son
fi jaci ón,
pueden
numerosos
Navarrete y c ol.
de
que
la
<ambiental)
de
realiza
tiempo
1980;
1983;
Rasch
a
se
a
elevada
de
del
lectura de DNA.
alta temperatura
óptimo
resulta
en el
variaciones
en
der
muy
136
del
parte,
1980;
la conveniencia
CLH
temperatura
<SN),
de
ya que
óptimo
como
de
para
que
hidrólisis
la
DNA.
no
hidrólisis
corto,
tiempo de hidrólisis
la lectura
del
Ploeg
y baja concentración
ser
1983;
1969;
de tiempo
Cuando
y
Fox
baja
amplio
tiempo
otra
1966;
indican
realice
Duijndam
y col.
Por
Aiello
1985)
su
temperatLlra,Etc)
Mares y Van
sufic ientemente
la
modificaciones
des
y
en
(preparación
resultados.
CDecosse y
var i aciones
modifiquen
Navarrete
se consx que una meseta
o
1969;
los factores
y concentración
hidrólisis,
peque~as
los
hidrólisis
este modo
Fox
tiempo de hidrólisis,
tr abajos
1977
1977;
varios
alterar
Kjel lstrand
198(3;
meticulosidad
se
de CIH,
y
el
peque~as
i ntroducen gran—
Además
a
alta
temperatura
importante
Por
se
de DNA
hidrólisis
<Kjellstrand
tratarse nuestro
cantidades
óptimas
de
las
nuestro
produce
DNA
en células
laboratorio,
45 minutos
de
hidrólisis
con
pérdi da
de la determinación
de
retina,
establecidas
por López
y
1980).
estudio
condiciones
rápida
<1991>
tomamos
de
como
previamente
en
para retina de pollo
CHI SN,
a
19±10 12
y
2,5
horas de reactivo de Schiff>. Estas condiciones resultaron
muy
similares
estudios
a
las
realizados
tejidos
utilizadas
en
diferentes
secciones
a la retina
Lapham 1969;
Mayalí
Ploeg
Navarrete y col.
1980;
factores
1969;
anteriormente
controlaron
en
la
ó
mayoría
células
(Lapham
198Z;
en
los
otros
Lentz
y
Mares y Van der
en t re
consi derados como
cuidadosamente
de
1968;
l3achman 1972;
de
otros)
—
importantes
Los
se
cada uno de nuestros experi—
men tos.
La
rehidratación
lavados
con
clorhídrica
de
forma
para
el
sólo
agua
destilada
reactivo
entre otros>.
lavado
citrato
pues
mantenimiento
estequicimétricamente
el
a
de
la fijación,
después
de
final
son
Schuff
que
quede en el núcleo
Ciertos
137
i mport antes
une
por
y para
que
al
or~n
(Navarr ete y coil
autores recomiendan
con agua destilada
pH 5,6 antes de
hidrólisis
celular
se
como los
se realizaron
extremadamente
de la morfología
de
así
la
y los lavados en agua sulfurosa,
rigurosa,
el
1983,
después
tampón
la deshidratación
y
sustituir
fosfato—
montaj e,
pues
y
así
se
conseguirían
mayor estabi lidad de
valores más altos de absorbancia
los preparados
Mares y Van der Ploeg
1973;
preparaciones
no
en
inclusión
fueron
1980).
perfiles
c el ul ares se perdí an.
de
1 avad as
ser
destilada,
hasta la
oscuridad
sido
Navarrete
En
de
el
la
la
alterar
resultados
en
control
(recién
troc i tos
rosa
nuestro
portaobjetos
mi smc’
proteasa
a
a
la
del
DNA,
autores
di storsiona
de tal
obtenidos
en
laboratorio
forma
y
en
ha
<véase
a
alguna
q ue
podría
descartada
de incubación-
138
a 540
concentración
en
para
de
todas
En
un
pollo
alguno),
C
en
saca—
incubados
30
isotónica
más
extraer
las
se realizó
El
previo
<1991).
y eritrocitos
experimento
de DNA son similares
trabaj ci
tratamiento
utilizada
proteasa
de
eritrocitos
30 minutos
isotónica,
Este
un
por López
sin
durante
concentración
para 45 y 60 minutos
una
Esta posi bi 1 idad queda
C en sacarosa
cél tilas nerviosas.
val ores
después
sulfurosa
utilizamos
se extendieron
incubados
340
agua
otros
que
extraidos,
a concentración
minutos
muestras
los
Este procedimiento
por
podría pensar
1 ea lecturas.
los
que
1983>.
estructura
real izado
en
se
con
e
seco y se almacenaron
pr oce so de disociación
qu e
manera
por
y col.
utilizado
nuestras
comprobarse
lectura de DNA.
amp í i amen te
Duijin
deshidratación
Nuestras
secaron con aire
se
a
al
consecutivamente
y
Sin embargo,
sometidas
medio de montaje,
<Duijndam
resultado
igualmente
es que
las condiciones
el
<fi—
gura V.2>
y
ninguna de
control
la forma
las
condiciones,
ciertos
determinación
Mares y Van
factores
CLentz
der Ploeg
la dispersión
que
1980;
de la luz
Kaplan
fragmentos
de células por encima
fotómetro
2>
el grosor
utilizado
utilizado
en
medición.
células
de citoplasma
máximo alrededor
debajo que pueda alterar
máscara
absorbanci a
porta.
siempre
sobre
de
del
óptica
superior
y
las 1 ec t ura s.
niveles
de
y
En nuestro trabajo
aisladas,
área del
soma,
Se utilizó
un
lecturas
y el
la
una parte
dentro
de
bac k gro LI n d
Vickers
lo que es
por
siempre
lectura,
M85.
la
y
Este
densi dad
campo con densidad
con
la
por su
por encima y
celular
por
absorción
139
con
del
no quedando
hi cieron
Se
integra
núcleo
tipo de cito—
que no se modificaba
a ~ína selecci onada,
diferentes
citoplásmicos
al rededor
núcleo,
el mi smc’ aparato,
por otra el
y
las que se puede ceair
el citoplasma
modelo de c i tofotómetro
difracción
el
citoplasma
lectura.
comprobando
se utilizó
en
1970;
Entre ellos está
completamente
esf érica prácticamente
misma
y
la
de DNA por
y por debajo del
la
identificables,
del
de los
Goldstein
1981>.
tejido
perfectamente
al
1969;
del
cantidad
máscara
contenido
sobre orgánulos
despreciable
la
en
cuestionarían
por la reflexi ón,
al
considerado,
incidir
del
y Lapham
refracción
forma
altera
siendo indistinguibles
por citofotometría
célula en secciones
hemos
tampoco
-
Ex i sten
1)
de los eritrocitos
ópti ca
posible
medir
de
misma
una
~0.
0~
02
03
e42
;—972
E.S.M—OA
40
n—30
C.SMA.0l5
30
20
jo
L4
o
——
u
50
z
40
a,
30
20
lo.
r
u
A
A
o
o.
A
40
#—l0.0
L5M..OtO
7
a
•
‘o II
12
UOOCt *RUT2AI~AS OC DftA
13
m
7
7
U
—
•~ 20
1—9.79
CSMA.0.l2
a. 20
•..9S4
LtM0~S
9
¡0
tI 12
—T~UDC DM
II
7
5
9
¡0
It 12
wao>MS S1-AS DC DM
13
FIGURA V.2. Contenido de DNA por núcleo de eritrocito. Hi2,5
horas en el
drólisis durante 30 minutos a
23±1 0C y
reactivo de Schiff. Los histogramas de
cada
columna
corresponden al mismo
porta. A, eritrocitos
control;
91,
eritrocitos incubados 30 minutos
en
solución de sacarosa
19,6%;
CI, eritrocitos incubados 30 minutos en una
solu—
ción de sacarosa
19,6% más
proteasa
<0,136 mg/mí);
B2,
eritrocitos incubados 45 minutos
en
solución de sacarosa
19,6%; C2, eritrocitos incubados 45 minutos en solución de
sacarosa 19,8% más proteasa;
93, eritrocitos incubados 60
minutos
en solución de sacarosa
19,8%;
C3,
eritrocitos
incubados 60 minutos en solución
de
sacarosa
19,6%;
¡1,
número de células leídas; ~,
media del contenido de DNA de
cada población ;
E.S.M.,
error
standard
de
la
media.
(Tomado de López 1991).
célula,
correspondientes
de
condensación
del
método
a áreas
la cromatina.
pone en
seleccionar
Drosophila
medir
cuanti -Fi car
el
<véase Rasch,
El
obtenido
valor
en
y
dias en
por Lapham
por
<1969)
y
control,
causa
inducir
a
nsamos que
los
212
celular
en 61
y Lap ham
en
por
DNA y
como
interpretación
e
la
est os
por
que por
es
diferente
hepatocitos
nuestras
lecturas me—
a las obtenidas
(1969)
en
hepatocitos
la
que
rata
abandonan el
indicó.
Por
resultados
los cuáles ti enen cantidades
es necesaria
la
en este trabajo
realizada
(1991)
experi mentación
141
pen-
ciclo
otra parte,
es
ceptores
López
pudiese
tienen can—
obtenidos
Sin embargo,
de
células
resultados,
con los resultados
de pollo,
grano
como
empleada
1 o tanto
pci r
a
Puesto que no encontramos
de
de nuestros
incluso
para
nuestros
(1967
de
fotorreceptor
autores
metodologí a
hacia
sido
cromatina
cesto y células
212 de DNA.
Denham
preci si ón
1983)
son similares
-fotorreceptores
de
de
(1972)
células
la
DNA,
Bachmann
desconfianza
tidades
esta
en
DNA
Sin embar go.
consideradas
alguna
de
<4426 pg)
Lentz
es decir con
de
y
de
de los cromosomas
trabajo
arbitrarias
de tamaí=o peque?~o,
cerebelo,
cantidad
de rata.
unidades
las bandas
contenido
grado
hecho de que ha
de condensaci ón
el presente
(20)
fiabilidad
Navarrete y col.,
de
los 8 pq asumidos
diploides
su
grado
1971
La
evidencia por el
utilizado para
y
con distinto
coherente
en
fotorre—
2C de
DNA.
complementaria
de tesis doctoral
a
para resol—
ver la discrepancia
anteriormente
mencionada.
ción
de rata
células
de hepatocitos
control
como
será imprescindible
en
nuestra
La util i za—
212 de rata como
próxima
experí men—
taci ón.
La
observación
ciones obtenidas
nos
ha
hemos
y
su posición
tienen
restrictiva,es
la
capa
capa.
conoce
está
1983).
La
cuando
una
ocupan
cambio,
y
evidencia
cél ul a
muere
celular>,
de
la
su
tienen forma
que
tiene
su
(sus
genes
dejan
el
núcleo
célula.
POcir
5
en
la posición
no son una población
c orno
que
los
posición
es
de
esférica
Aunque
que la
en
lo
la posición
del
142
es
del
diferencias
mismo,
y
de células,
col.
es que
posición
cont rolar
tanto,
se
en tre
y
en
se col oca en
menos si gni fi can
homogénea
de
la
posición del
<Alberts
núcleo
de
y se
no
más simple de que esto es así
al
de
que
sólo por parte
genéticamente
que las diferencia
control
forma de los
la mitad externa
sí es bien conocido
conos y bastones
el
la
A y E>,
biológico de esta diferencia
controlada
excéntrica
pensar
vez
a todos los ni vel es de la capa.
núcleo
geométrico
ovalados
externa;
conos y bastones,
actividad
PÁg. 15,
Hemos encontrado
decir están distribuidos
significado
prepara—
dentro de unas células
simétricas.
Los bastones en
el
por primera
núcleos
nuclear
distribuyen
de fase de las
método de Feulgen
estudiar
visto no son
conos
contraste
por el
permitido
núcleos,
por
el
la
centro
razonable
núcleo
de
genéticas
que los bastones
dada
la
varía—
ción en
la posición
Hay
del
otros
visto
miento
en
el
y disponen
este modo,
ya
en
los núcleos
externa,
externa
de el
del
determinación
después
(E1B—P4)
(PÁgs.
de
Los
posiciones
medias,
y
dependiendo
interna,
<Fig.
la
diferencian
el
de la posición
que
del
crecen y diferencian
IV.6,
Ph,
bZ),
del
núcleo
en
des-
interna,
en
posición
núcleo
interna
como vimos
fijan el núcleo
una
de
núcleo son
posiciones
longitudes
sólo
mitad
genéticamente
más
en
en
prolongación
varaiables
Los -fotorreceptores
en
posición
la prolongación
carecen de prolongación
143
la
Esto indica que
posición
núcleo.
fijan el
en
nuclear
Las consecuencias
que
De
se observan
la capa
A).
soma
de
ciclo
diferenciación
observan
crecen y diferencian
interna,
el
una prolongación
fotorreceptores
otra
bastones)
de
en
IV.7,
y carecen de prolongación
resultados.
<sólo
se
que fijan el
más larga que los que tienen
externa
posición
estas
definitiva.
los bastones
,
Como
comporta-
abandonar
la diferenciación.
que los fotorreceptores
internas,
de
IV.6 y
temprana
núcleo.
los fotorreceptores,
que los conos
crecen y
del
resultados,
núcleo está determinada
comienzo de
más externa
de
en cualquier
la capa
la posición
de
los primeros estadios
mientras
de
la posición
interpretación
el núcleo en posición
los fotorreceptores
con
de
apartado
inmediatamente
se alargan
la
funcional
de los neuroblastos
células
de
hechos que apoyan nuestra
significado
hemos
núcleo.
de su
más
externa
interna y
las
es-férulas sinápticas
salen directamente
resultados,
evidencian
posición
pues,
del
núcleo a su vez
estructurales
entre
Finalmente,
genética
de
determinan
hecho a favor
posición
-fotorreceptores
de
tienen posicones
opuestas
la rata y otras
del
de
los
determinadas
especies
Además
pollo
a
las de
En el
los
y por
eatán
1970;
porcentajes
en
diferencias
1991>
también
camente.
144
es
que
como el
los
pollo,
los fotorreceptores
mientras
a
ocupando
que
de
todos
y rata,
de
la
los núcleos
los
niveles.
de conos y bastones
son característicos
lo tanto podrían
determinación
restrictiva,
distribuidos
López,
de la
pollo los bastones son los
comparando los porcentajes
<Morris,
las
especies
interna de la capa;
conos
Nuestros
diferencias
núcleo,
que tienen el núcleo en posición
posición más
las
soma.
los fotorreceptores.
otro
la
que
del
en
se evidencia que
distintas especies
estar determinados
genéti-
VI.
CONCLUSIONES.
VI. CONCLUSIONES.
Primera..
—
El
punto
para aislar
es el
y
método de disgregación
más eficaz
excepción
de
los fotorrecptcires
de los que se han
podría utilizarse
sino cualquier
celular
íntegros
de la
utilizado hasta
para purificar
otra clase de células
de las células
que hemos puesto
a
rata
ahora,
no sólo estas células
de
ganglionares
la retina,
con la
de retinas
mayores
12 dias postnatales.
Segunda.
—
El
indica
estudio
des-arrollo de
que la posición
después
que
del
del
de que las células
además
determinan
células,
las
las
van
soma
los
se determina
abandonan
aci cines
variaciones
fotorrecpetores.
en
el
pronto
ciclo celular,
la posición
estructurales
debido a que desarrollan
muy
del
entre
programas
de
y
soma
estas
crecimiento
diferentes.
Tercera.
—
Los bastones
de
la rata,
desde que abandonan
celular
tienen formas simples muy similares
a d u 1 t a 5,
por
miento
ó
lo que
su morfogénesis
elongación
el cingaci ón
que dupí ican
de
se
máxima cicLirre desde F12 a
su longitud.
146
a las
reduce
la célula desde
P17,
el ciclo
r~o
formas
al
a
creci~
P17.
periodo
en
La
el
Cuarta.
—
El
estudio del
contenido
res indica que tienen
células
abandonan
final
de
62
considerado
en DNA de
un contenido
el
212.
ciclo celular
posibilidad
los fotorrecepto—
Por
lo
tanto,
durante Si
ésta
última
en base a las formas más
y
que
estas
no
al
habfamos
jóvenes adoptadas
por
los neuroblastos.
Quinta.
—
Nuestro trabajo
con
de
la
el
método de Golgi
la rata
adulta,
posición
diferencias
Sexta.
del
primero
que estudi a
las formas de los
y pone en
soma de
estructurales
evidencia
los
“in
vivo”
y
fotorreceptores
la variabilidad
bastones,
entre ellos y con
así
como
en
las
los conos.
-
Nuestro
rreceptores
mentación
de
es el
trabajo
íntegros,
al
podría dar
que trata de conseguir,
fotorrecptores
-fotorreceptores,
únicamente
relativo
aislados,
en
retinas
esta capa.
147
aislamiento
un
impulso
mediante
la regeneración
en
las
que ha
de
los foto--
a
la
experi—
el
transplante
de la
capa de
sido
daF~ada
VII.
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