APLICACIÓN DE LA PCR: DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS

Universidad de Granada
Prácticas docentes en la Facultad de Ciencias
COD: 10-71
APLICACIÓN DE LA PCR:
DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS
FUNDAMENTO TEÓRICO
La PCR es una técnica que permite llevar a cabo la síntesis in vitro de fragmentos de
ADN. Está basada en una reacción enzimática catalizada por una ADN polimerasa, que produce
múltiples copias (amplificación) de un mismo fragmento de ADN. Para la reacción se requiere:
 El ADN que va a copiarse, que servirá como molde a la ADN polimerasa para hacer
las copias.
 Polimerasa termoestable, habitualmente se utiliza la polimerasa de la bacteria
Thermus aquaticus conocida como Taq polimerasa.
 Cebadores o primers específicos, que se unirán a los extremos del fragmento de
ADN que quiere amplificarse. En este caso, se unirán a un fragmento de ADN del
genoma del parásito. Se utiliza la especificidad de los cebadores para amplificar una
región del genoma del parásito cuando se encuentra presente en una muestra.
 Desoxirribonucleótidos trifosfato, o dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,dGTP), que son
los sustratos para la síntesis de ADN,
 y un medio de reacción adecuado, que contenga iones magnesio y otras sales
necesarias para que se produzca la reacción enzimática, y que se consigue utilizando
un tampón de reacción apropiado para la enzima
Una PCR típica incluye tres pasos:
 Etapa de desnaturalización. Se calientan las muestras a una temperatura por
encima de 90ºC durante un periodo de 30s-1 minuto. Las moléculas de ADN están
compuestas por dos cadenas de nucleótidos (son bicatenarias). Al incubar las
reacciones a esta temperatura elevada se rompen los puentes de hidrógeno que unen
las dos cadenas de nucleótidos (la molécula de ADN se desnaturaliza), de modo que
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cada una de las dos cadenas sirve como molde para la copia de un nuevo fragmento
de ADN.
 Etapa de cebado o annealing. las reacciones se enfrían con rapidez a una
temperatura que puede variar entre 50-65 ºC y se incuban a esta temperatura durante
un periodo de entre 30s a 1 minuto para que los cebadores se unan a las secuencias
complementarias en las cadenas molde. Los cebadores son fragmentos cortos de
ADN, entre 15 y 35 nucleótidos, de secuencia inversa y complementaria a los
extremos de la región de ADN que va a copiarse. Son además específicos, de modo
que se unen exclusivamente a los extremos del fragmento de ADN a amplificar, y
no se unen a ninguna otra secuencia de ADN cercana.
 Etapa de polimerización. Las reacciones se incuban durante un periodo de entre
30s a 1 minuto a 72ºC, temperatura óptima de actuación de la ADN polimerasa, que
añadirá los desoxirribonucleótidos trifosfato al extremo de los cebadores e irá
sintetizando las cadenas de ADN copia. Al final de esta etapa, se obtienen dos
moléculas de ADN por cada molécula de ADN original de la muestra
Estas tres etapas forman un ciclo que se repite unas 30 veces. En cada nuevo ciclo, tanto
las cadenas de ADN original como las cadenas copiadas sirven como molde para la síntesis de
nuevas copias, de modo que el número de moléculas de ADN se duplica en cada ciclo
(aumentando la cantidad de moléculas de ADN de forma geométrica).
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El resultado final es un gran
número
de
fragmentos
de
ADN
flanqueados por los cebadores, que se
obtienen en apenas unas horas (después
de 30 ciclos, cada molécula de ADN
molde inicial se habrá copiado más de
1000 millones de veces).
Como los cebadores que se utilizarán n la reacción son específicos para secuencias de
ADN presentes en el genoma de un parásito (cebadores específicos de especie), la PCR puede
utilizarse para detectar la presencia de ADN del parásito en cuestión en una muestra que
contenga también ADN que no sea del propio parásito (ADN del hospedador).
Los resultados de la PCR se analizan habitualmente mediante
la técnica de electroforesis en gel de agarosa. En esta técnica, la
aplicación de un campo eléctrico permite la separación a través
de un soporte sólido (gel de agarosa) de moléculas cargadas en
función de su tamaño. Las moléculas más pequeñas avanzarán más
en el gel y las moléculas más grandes avanzarán menos. El ADN
tiene carga negativa y migrará desde el polo negativo hacia el polo
positivo. La separación simultánea, en diferentes pocillos del gel,
de los productos de PCR y de un marcador de peso molecular con
fragmentos de ADN de tamaño conocido, permite determinar el
tamaño de los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR.
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
Se utilizará la técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa, o PCR, para diagnosticar
la presencia del protozoo parásito Perkinsus olseni en muestras procedentes de dos de sus
hospedadores habituales, la almeja fina (Tapes decussatus) y la almeja japonesa (Tapes
philippinarum).
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MATERIALES NECESARIOS
 Agua ultrapura estéril.
 ADN de almejas (4 muestras), extraído individualmente de dos individuos sanos y
dos individuos afectados por el parásito.
 Controles de la técnica, control positivo (ADN de un animal fuertemente infectado
por el parásito), y control negativo (agua estéril).
 Tampón de PCR, 10x.
 Mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs), 10 mM cada uno.
 Cebadores PK1 y PK2, 200 micromolar cada uno, específicos para amplificar un
fragmento del espaciador IGS de los genes ribosómicos del genoma de Perkinsus
olseni.
 Enzima Taq polimerasa, 10U/µL.
 Microtubos estériles, 0,2 mL.
 Gradilla para microtubos.
 Micropipetas automáticas, p2 (0,2-2 µL), p10 (1-10 µL), y p20 (2-20 µL).
 Puntas de pipeta estériles.
 Termociclador.
 Agarosa.
 Tampón de electroforesis TAE, 1x.
 Colorante SYBR-Safe®, 10.000x.
 Tampón para cargar muestras en gel de agarosa.
 Marcador de peso molecular.
 Matraz Erlenmeyer, 250 mL.
 Balanza.
 Microondas.
 Cubeta de electroforesis.
 Fuente de alimentación.
 Transiluminador.
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METODOLOGÍA
1.
Preparar las reacciones de PCR, una reacción para cada una de las muestras a
amplificar: 4 muestras de almejas, 1 control positivo y 1 control negativo.
2.
Colocar los tubos en un termociclador, e incubar las reacciones de PCR utilizando un
programa adecuado para los cebadores empleados:
3.
Mientras se lleva a cabo la reacción de PCR, preparar el gel de agarosa.
4.
Una vez finalizada la reacción de PCR y polimerizado el gel, se lleva a cabo la
electroforesis de las muestras amplificadas mediante PCR.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
1. En un microtubo de 0,2 ml se añaden los siguientes reactivos en el orden indicado para
cada muestra (muestras de 4 almejas, control positivo y control negativo), y un volumen
final de 25 µl:
Agua ultrapura estéril 16
Tampón de PCR (10x) 2,5
dNTPs (10 mM)
1
Cebador PK1 (200 µM) 2
Cebador PK2 (200 µM) 2
ADN
1
Taq polimerasa (10U/µl)0,5
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
2. Colocar los tubos en un termociclador, e incubar las reacciones según el siguiente
programa:
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
94ºC
Cebado
58ºC
Polimerización
72ºC
Polimerización final 72ºC
94ºC 5 minutos
30 seg.
30 seg.
x 30 veces
30 seg.
10 minutos
3. Mientras se lleva a cabo la reacción de PCR, se prepara el gel de agarosa:
a.
En un matraz de 250 ml añadir 40 ml de tampón TAE 1x y 0,4 g de agarosa, para
preparar un gel de agarosa al 1%.
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Calentar utilizando un microondas hasta que se funda la agarosa y dejar enfriar la
disolución.
c.
Mientras se deja enfriar la agarosa, preparar el molde en el que se dejará
polimerizar el gel, sellando los extremos y colocando un peine que labrará los
pocillos en los que se cargarán las muestras.
d.
Cuando la temperatura de la disolución de agarosa sea inferior a 60ºC, añadir 4 µl
del colorante para ADN SYBR® Safe (10.000x) y verter en el molde. El gel estará
preparado cuando adquiera una apariencia translúcida.
e.
Retirar el peine y dejar libres los extremos del gel. Colocarlo en la cubeta de
electroforesis y cubrirlo con tampón TAE 1x para llevar a cabo una electroforesis
en gel horizontal sumergida.
4. Una vez finalizada la reacción de PCR y polimerizado el gel, se lleva a cabo la
electroforesis:
a. Añadir 5 µl de tampón de carga a cada reacción de PCR, mezclar con ayuda de
la micropipeta y cargar cada muestra en un pocillo del gel. Cargar en otro
pocillo 4 µl de un marcador de peso molecular.
b. Conectar la cubeta de electroforesis a la fuente de alimentación.
5. El resultado de la electroforesis se observa en un transiluminador. El tamaño
esperado del fragmento de ADN del parásito amplificado mediante PCR es de
unos 500 pb.
CUESTIONARIO PARA LOS ALUMNOS
1. ¿Qué criterios deben seguirse a la hora de diseñar cebadores para el diagnóstico de una
enfermedad parasitaria a partir de ADN extraído de los hospedadores?
2. Se han utilizado los cebadores PK1 y PK2 para diagnosticar la presencia del parásito
Perkinsus olseni en tejidos procedentes de 29 almejas muestreadas en una zona de
cultivo de Huelva. Se muestra la fotografía de la electroforesis en gel de agarosa (C+=
control positivo y C-= control negativo).
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Marcador
peso
molecular Muestras:
1
2
3
4
5 6
7
8 9 10 11 12 13 14 15
500 pb
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 C+ C-
Describir los resultados obtenidos.
3. Al analizar los resultados de una PCR en gel de agarosa se observa un fragmento
de ADN del tamaño esperado en todas las muestras ensayadas, incluido el
control negativo de la técnica, tal y como puede verse en la fotografía. ¿Qué
indicaría este resultado?
Marcador
peso
molecular
Muestras:
C-
C+ 1
2
3
800 pb
500 pb
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4. ¿Sería posible diagnosticar la presencia de dos parásitos distintos en muestras de
un animal mediante una única PCR? En caso afirmativo, describe brevemente
cómo podría hacerse.
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