Mecanismos moleculares involucrados en la modulación de la a

Mecanismos moleculares involucrados en la
modulación de la actividad del receptor de
glucocorticoides
Presman, Diego Martín
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
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Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
MECANISMOS MOLECULARES INVOLUCRADOS EN
LA MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR
DE GLUCOCORTICOIDES
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área Ciencias Biológicas
Diego Martín Presman
Director de tesis: Dra. Adali Pecci
Consejero de estudios: Dr. Omar Adrián Coso
Lugar de trabajo: Departamento de Química Biológica, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.
Buenos Aires, 2010
Resumen
MECANISMOS MOLECULARES INVOLUCRADOS EN LA MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR DE GLUCOCORTICOIDES A lo largo de esta tesis se investigaron algunos de los mecanismos moleculares que modulan la actividad del receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción regulado por ligando. En primer lugar, utilizando cuatro esteroides con diferentes actividades se estudió cómo la estructura del ligando afecta la actividad transcripcional del GR. Además, mediante la técnica de Número y Brillo se demostró por primera vez, en forma directa, que el receptor es capaz de homodimerizar in vivo. Los resultados sugieren que este proceso sería independiente de la unión al ADN y a coactivadores como TIF2. En segundo lugar, se investigaron los mecanismos responsables de la inducción dependiente de glucocorticoides del gen pro‐apoptótico Bax, en células derivadas de timoma de ratón S49. Los resultados indican que el aumento transcripcional de bax no es causado por la estabilización de su ARNm, y que las primeras 6.5 kb del promotor del gen no estarían involucradas en el efecto inductor mediado por el GR. A través del uso de un glucocorticoide disociado, sugerimos que el GR induce la expresión de Bax mediante un mecanismo de transactivación. Más aún, no se descarta la posibilidad que el efecto del GR sea indirecto, es decir, induciendo la expresión de otro gen, necesario para aumentar los niveles totales de Bax. Por último, se investigaron los mecanismos involucrados en el efecto antagónico entre la melatonina (MEL) y los glucocorticoides. Nuestros hallazgos muestran que MEL no inhibe al GR en forma generalizada, sino que sólo lo hace en ciertos tipos celulares, y mediante mecanismos diferentes. Mientras que en timocitos de ratón MEL inhibe la disociación del complejo GR‐Hsp90, en células BHK inhibe la interacción del GR con el coactivador TIF2. Finalmente, presentamos evidencias que sugieren que el inhibidor farmacológico de los receptores de melatonina, el Luzindole, sería también un antagonista del receptor de glucocorticoides. Palabras clave: glucocorticoides, receptor de glucocorticoides, análogos rígidos de esteroides, RU486, dimerización, TIF2, apoptosis, bax, melatonina. Abstract
MOLECULAR MECHANISM UNDERLYING GLUCOCORTICOID RECEPTOR’S ACTIVITY MODULATION The glucocorticoid receptor (GR) is a transcription factor that regulates gene expression in a ligand‐dependent fashion. This thesis explores some of the molecular mechanisms involved on GR’s activity modulation. By using four different steroid ligands with distinct glucocorticoid and antiglucocorticoid properties, we analyzed ligand structure effects on GR transcriptional modulation. In this sense, by performing Number and Brightness assays we presented for the first time direct evidence of GR homodimerization process in vivo. Results also show that this event can occur without TIF2 coactivator interaction and most likely in a ligand structure and DNA independent manner. On the other hand, we investigated the mechanisms underlying glucocorticoid‐dependent bax induction in S49 cells. Results show that glucocorticoids do not have any effect on bax mRNA stability, suggesting that GR enhances bax’s transcription rate. Moreover, at least 6.5 kb upstream of bax’s start translation site would not be involved on the glucocorticoid‐dependent induction. Results derived from the use of a selective glucocorticoid suggest that GR induces bax expression through a transactivation mechanism. Moreover, we can’t rule out that GR could regulate bax levels through an indirect mechanism involving the expression of another factor. Finally, we studied the molecular mechanisms underlying melatonin (MEL) modulation on the glucocorticoid pathway. Our results show that MEL is not a generalized‐cell type glucocorticoid antagonist. We found that MEL modulates GR response only in a subset of cells, in a cell‐type specific molecular mode of action. In thymocytes, it inhibits GR action by blocking the dissociation of the 90‐kDa heat shock protein; while in BHK cells MEL reduces GR‐TIF2 interaction. Lastly, we also present evidences suggesting that melatonin receptor inhibitor Luzindole is also an antagonist of the glucocorticoid receptor pathway. Keywords: glucocorticoids, glucocorticoid receptor, steroid rigid analogs, RU486, dimerization, TIF2, apoptosis, bax, melatonin. Agradecimientos
Llegar al final de un recorrido carece de sentido si no se ha podido disfrutar del viaje. Esta tesis, como se de tantas otras, atravesó un largo camino lleno de buenos momentos, frustraciones, amarguras, desazón y alegría. Gracias a todos los que me permitieron no solo llegar a destino, sino haberme hecho disfrutar durante gran parte del camino. A Adali, por todo lo que me enseñó. Por la confianza depositada. Por aguantar mis continuas dudas y mis interminables cuestionamientos a cada experimento que encaramos. Por darme la libertad para elegir el camino a seguir, orientándome, siempre bajo los límites del sentido común y los recursos disponibles. Por hacerse querer tan fácil y naturalmente. Por arreglárselas para conseguir lo que uno necesitaba. Por generar siempre un clima divertido de trabajo, siempre atenta y dispuesta a solucionar los problemas del día a día. Por su honestidad. Gracias por todos estos años compartidos. A mis compañeros del grupo Pecci. A Esteban y a Leo, por la increíble dinámica de trabajo que conseguimos, siempre ayudándonos, compartiendo alegrías y frustraciones. Cuánto que los extrañé en esta última etapa! A Quito, por su honestidad, integridad, rigurosidad científica, sentido de justicia, compañerismo y amistad. Por su inagotable sentido del humor e ironía, por hacer tan divertidos los días en el laboratorio y los viajes a congresos, y porque la sombrilla evidentemente no se cierra. Por compartir sus frustraciones científicas y también de las otras, las importantes. Por las eternas y productivas discusiones científicas, políticas y de la vida. Por interesarse en mis problemas, y por su ayuda para resolverlos. Por demostrar (empíricamente) que es posible caerse y volver a levantarse, con la frente bien en alto. Espero que encuentres tu lugar en el mundo. A Leo, por su compañerismo, humildad y generosidad. Por estar siempre dispuesto a ayudar. Por interesarse en mis problemas y ayudarme a resolverlos. A Lautaro, el integrante satélite del grupo. Por tu envidiable filosofía con la que te tomás el laburo y la vida misma. Por permitirme integrarme y continuar desde otro ángulo tu línea de trabajo, compartiendo experimentos, discusiones y frustraciones. Sin vos el primer capítulo de esta tesis no hubiese sido posible. Gracias por la ayuda con la escritura y realización del manuscrito, siempre aportando y construyendo, con rigurosidad y optimismo. Por los partidos de tenis y por tu gran compañerismo. A Pao, por su obsesión con el orden (que a veces tanto necesita el laboratorio), su peculiar manera de trabajar, su independencia, y su buena onda. A Andrés, por su rápida y amena integración al laboratorio, siempre con ganas de ayudar y participar. Por la instauración y mantenimiento del ministerio más importante del labo: los viernes gordo. A Chocha, por su ayuda con el EMSA y por la buena onda de siempre. A Joel “arcoíris”, por sus locuras y sus brownies. A los más jóvenes y nuevos integrantes del laboratorio: Dieguito, por su gran humor, entusiasmo y rápida integración al laboratorio. A Yanina, Julieta y Martín. A los integrantes del grupo Kordon, con quienes tuve la dicha y fortuna de compartir el laboratorio LEGMA desde el comienzo de mi doctorado. A Ana Q., por sus innumerables aportes al día a día del laboratorio, por su incesante compañerismo, solidaridad y apoyo. Probablemente una de las mejores compañeras de trabajo que uno podría pedir. A la Popi, por sus dos grandes virtudes… su humor y su ironía. Por su vestimenta tan discreta. Por hacer del LEGMA un lugar tan divertido, ruidoso y escandaloso. A pesar del “… ¿no te molesta si subo el volumen un poquito no? ...”. Por sus rayes. Por su valentía para afrontar la vida, por compartir tanto sus problemas como sus alegrías. Y si… Ojalá tengas razón. A la dotora Nati R., por su carisma y personalidad, querible como pocas. Por su sincera sinceridad y compleja simpleza. Por su honestidad y Agradecimientos
coherencia. Por su disposición para siempre ayudar y construir. Por la docencia compartida, de la cual aprendí mucho. A Albana, por su tranquilidad frente a los problemas y su disposición constante a responder cualquier duda. Por su inagotable musicalización de las mañanas, siempre con las mismas canciones. A Vicky S., por su amabilidad y compañerismo. Por las clases de inglés y por compartir frustraciones y alegrías. A Nati F., porque es imposible no quererla, siempre poniendo el hombro y siempre ofreciendo una mano. Por su independencia, y por confiar en el consejo de sus compañeros. Por ayudarme en territorio extranjero, una vez emigrada. Por la docencia y el tiempo en el labo compartido. A Vicky G., por su timidez inicial, y su confianza actual. Por confiar en mi criterio, y siempre estar dispuesta a ayudarme. A Esteban G., por su paciencia, solidaridad y sus inagotables conocimientos de computación, que tanto le sirvieron al laboratorio. A las más jóvenes, que recién comienzan o recién terminan: Sol, Flor y Anitita, por su buena onda. A Carolina Schere, por esas increíbles tortas y brownies que eliminaban cualquier frustración del día. A Edith, porque a pesar de que nuestros caminos científicos prácticamente no se cruzaron, las discusiones y los aportes fueron siempre interesantes y enriquecedores. A todos los integrantes del Laboratorio del Dr. Burton, en especial a Gerardo, por la confianza depositada, a Adriana, por sus aportes a la preparación del manuscrito, y a Virginia, por su predisposición para ayudar siempre. A Silvina, por las simulaciones. Gracias por la base y el hemisuccinato. A Valeria, por la colaboración en los experimentos de N&B. Gracias por enseñarme y compartir la puesta a punto de esta técnica y permitirme realizar los experimentos de distribución intranuclear y translocación. Por tu manera tan rigurosa de encarar un problema y por encontrar siempre una solución. Por la largas jornadas de trabajo. Por engancharte en mis delirios y confiar en mi criterio. A Marcelo, por la ayuda con el microscopio. A Michelle, por su ayuda con el análisis de los datos y la corrección del manuscrito. Al laboratorio de la Dra. Ceballos. A Nora, por enseñarme y permitirme realizar los experimentos de Binding en su laboratorio. Por la discusión siempre enriquecedora de los resultados. Por el préstamo del Luzindole. A Daniela y a Eleonora, por acompañarme y ayudarme con los experimentos. Al Dr. Omar Pignataro, por enseñarme, acompañarme y permitirme realizar los experimentos de RIA en su laboratorio. A los integrantes de su grupo, por la ayuda brindada. A todos los integrantes pasados y presentes del laboratorio del Dr. Coso, en especial a Tamara, Sol y Julián por su ayuda incondicional. Por los seminarios PKC y PKoCo. A Omar, por ser como es. Por permitirme transformarme de alumno en compañero de trabajo. Por obligarme a sonreír más, aunque los experimentos no saliesen. Por haber sido mi consejero de estudios y un modelo de docente. A los integrantes de los laboratorios pertenecientes al CM1. A los miembros del laboratorio de la Dra. Vázquez: Cristian, Paola, Florencia, Javier, Belén, Mercedes, Geraldine, Adriana y Elba. Por ser los vecinos que nos sacaban siempre de cualquier contratiempo, ya sea por reactivos, ayuda, o lo que fuese. Por su solidaridad y buena onda. Al laboratorio Bermúdez‐Correa, por la ayuda de siempre. Gracias Mariana, Susana y Sabri por prestarnos siempre todo lo que nosotros nos olvidábamos de comprar. Por estar ante cualquier dificultad. A los integrantes de los laboratorios Agradecimientos
de los doctores Elizabeth Jares, Lía Pietrasanta y Martín Monte. A Federico, por preocuparse (y ocuparse) de que las cosas siempre funcionen. Al personal no docente del CM1, en especial a Betina. Al laboratorio Galigniana – Piwien‐Pilipuk. A Graciela, por los plásmidos prestados y su disposición para charlar y discutir experimentos. A Mario, por haberme hecho un increíble favor sin siquiera conocerme, y por la ayuda en el diseño de varios experimentos. Por su gran disposición a responder mis preguntas, y a discutir sobre resultados, teorías, hipótesis. A los integrantes del grupo de la Dra. Guberman, en especial a Charly, Noe y Agustina, siempre dispuestos a ayudar. A Ale, por su increíble paciencia y generosidad. Por la docencia compartida. A todos los integrantes del laboratorio del Dr. Cánepa: Eduardo, Floppy, Mariela, Julieta, Pablo S., Abel, Nico P. Por la buena onda, la diversión durante los congresos, y la ayuda con reactivos, cuando más se necesitaban. A los integrantes del LFBM y Neurobiología de la memoria, que de alguna u otra forma siempre me dieron una mano. En especial quiero agradecer a Manuel Muñoz, Manuel de la Mata, Petri, Fede P. y Anabella por su ayuda en el cuarto radiactivo. A Mariano Alló. Gracias a Juan Gerez por las líneas celulares y a Susana Silverstein por su buena predisposición para ayudar. Gracias a laboratorio de Colman‐Lerner (Alejandro, Lucía, Rodrigo y Matías) por su ayuda con el microscopio. A Roberto, por su ayuda con el confocal. A todos los integrantes del Laboratorio de la Dra. Silvia Moreno (Paula Portela, Constanza, Richard, Fiore, Pía, Vane, Jimena, Lucas, Nico, Leticia). A Silvia Rossi, por ayudarme en las primeras pruebas de MALDI. Por elegir justo a esa primer becaria doctoral, y asignarnos juntos en seminarios de biología molecular. A Silvia Moreno, por enseñarme y ayudarme en el análisis de MALDI. A Pía, por realizar el trabajo técnico de análisis de muestras y de espectros, siempre dispuesta a contestar mis dudas. A todos los integrantes, por ayudarme a realizar el gel en su laboratorio y hacerme sentir como si fuera propio. Gracias. A la Dra. Mónica Costas, por los plásmidos otorgados. A Daniela Capiati, por permitirme el acceso y uso al Fosforimager del IByME. A María, por la ayuda con el sacrificio de los animales y la extracción de los timos. A Marcelo Martí, por haberme presentado con Adali varios años atrás; y por la ayuda con la interpretación de los datos de simulación y la escritura del manuscrito. Al Consejo Nacional de investigaciones científicas y Técnicas, por el estipendio concedido que me permitió realizar esta Tesis. A la Universidad de Buenos Aires, en particular a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, por su formación y por ser, pese a todas las adversidades presupuestarias, una Universidad digna, de reconocimiento internacional. A Mariano Saulino, por haber sido mi gran profesor de música, y un ejemplo de vida. A los compañeros que se transformaron en amigos “de la facu”, sin los cuales me habría sido imposible hacer esta carrera: a Pablo; Kia; Ceci Fameli; Ceci Eyssartier, Juli, Nai; Maru; Eli; Gus; Luciano; Ami; Jime; Victoria; Julia; Costi, Ale, Nico, Ceci Calero, Vero, Juan F..Mil gracias por todo. Agradecimientos
A la banda de KM (Eze, Javo, Juancho, y Mari, y Felix), por todo lo vivido, y por haber crecido juntos. A Ine, Flor, Gra, Pau, Joana, Dani, Zequi, Teti, Juli, Bárbara, Nuria, Fla, Sole, Mariela, Móni, Mónica, Mechi, por haber estado, o seguir estando. A Mario y a Betty, por su hospitalidad y cariño, haciéndome sentir siempre parte de la familia. Por esas comidas caseras inolvidables. Por su hija. A mi cuñada, Victoria, por no aceptar devoluciones. A mis padres, por todo. Gracias por la libertad con la que me permitieron desarrollarme. Gracias por el abuso de cariño recibido. Por el techo que me dieron, en su presencia y ahora en su ausencia. Por dejarme ser. Gracias por apoyarme incondicionalmente en todo lo que me propuse. Por darme total libertad, tanto en la música como en la ciencia. Aunque no lo diga muy seguido creo que lo saben: los quiero mucho. A josefina. Por amarme, soportarme, aguantarme. Por estar siempre apoyándome, en especial cuando las cosas no salían. Por no pelearnos nunca. Por respetar mis rayes y mis silencios. Por hacer de mi vida algo que valga la pena. Por ser tan cariñosa. Por hacer tan simple la convivencia, tan natural. Porque no se qué haría sin vos. Por rescatarme. Por todas las cosas que no puedo (ni debo) escribir acá. A Josefina. A mis padres, Hugo y Elsa. “Truth in science can be defined as the working hypothesis best suited to open the way to the next better one”. Konrad Lorenz (1903‐89). Premio Nobel de Medicina, 1973 Índice
ÍNDICE ‐ Publicaciones y financiamiento ‐ Abreviaturas 15 16 INTRODUCCIÓN 1. Glucocorticoides 1.1 Hormonas esteroides 1.2 Glucocorticoides y su regulación 1.3 Efectos fisiológicos 1.4 Farmacología de los glucocorticoides 1.4.1 Glucocorticoides sintéticos 1.4.2 Antiglucocorticoides 1.4.3 Desarrollo de nuevos fármacos: análogos rígidos de esteroides 2. El Receptor de Glucocorticoides 2.1 Receptores nucleares 2.2 Receptores de esteroides 2.3 Estructura del GR 2.3.1 Dominio de activación AF‐1 2.3.2 Dominio de unión al ADN (DBD) 2.3.3 Dominio de unión al ligando (LBD) 2.3.3.1 Bolsillo de unión al ligando (LBP) 2.3.3.2 Región AF‐2 2.3.3.3 Región de dimerización 2.4. Ensamblado del heterocomplejo GR‐Hsp90 2.5 Translocación del GR al núcleo 2.6 Pasaje del GR a través del poro nuclear 2.7 Mecanismo de acción del GR 2.7.1 El GR como factor de transcripción 2.7.2 El GR como modulador de otros factores de transcripción 2.7.3 Efectos no genómicos 2.8 Especificidad de acción 2.8.1 Isoformas del GR 2.8.2 Expresión de cofactores 2.9 El modelo disociado 2.9.1 Transactivación vs. Transrepresión 2.9.1 Moduladores selectivos del GR 2.10 Dimerización y unión al ADN 2.11 El GR dentro del núcleo 2.12 Modificaciones post‐traduccionales 3. Apoptosis y glucocorticoides 3.1 Apoptosis 20 22 23 24 25 26 27 29 30 31 31 32 33 34 34 35 36 39 41 42 43 45 47 49 49 50 51 51 53 54 56 57 59 Índice
3.1.1 Activación del proceso de apoptosis 3.1.2 Iniciación del proceso de apoptosis 3.1.2.1 Vía extrínseca de inducción de apoptosis 3.1.2.2 Vía intrínseca de inducción de apoptosis 3.2 Apoptosis y el sistema inmune 3.2.1 El timo 3.2.2 Relevancia de la apoptosis en el sistema inmune 3.2.3 Efecto de los glucocorticoides en el sistema inmune 3.3 Apoptosis y glucocorticoides 60 61 61 61 62 62 62 63 64 4. Melatonina y glucocorticoides 4.1 Melatonina 4.2 Mecanismos de acción de melatonina 4.2.1 Acción antioxidante 4.2.2 Receptores de membrana 4.2.3 Receptores solubles 4.3 Melatonina y el sistema inmune 4.4 Melatonina y apoptosis 4.5 Antagonismo entre melatonina y glucocorticoides 65 65 66 67 67 68 69 70 ‐ Objetivos Generales 73 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Reactivos utilizados 1.1 Agonistas y antagonistas del GR 1.2 Medios de cultivo celulares 1.3 Preparación de suero delipidado 2. Líneas celulares 3. Tratamientos en las líneas celulares 4. Cultivo primario de timocitos 5. Tratamientos en los cultivos primarios 6. Inmunofluorescencia indirecta 7. Detección de proteínas fluorescentes en células fijadas 8. Plásmidos utilizados 9. Preparación de plásmidos a gran escala 9.1 Preparación de bacterias competentes 9.2 Transformación de bacterias competentes 9.3 Preparación de Plásmidos 10. Transfecciones transitorias 10.1 Transfecciones por Lipofección 10.2 Transfecciones por DEAE‐Dextrano 11. Determinación de la actividad de Luciferasa y de β‐Galactosidasa 12. Distribución intranuclear de GFPGR 12.1 Obtención de las muestras biológicas 12.2 Obtención de las imágenes por microscopía confocal 12.3 Análisis de las imágenes y cálculo del coeficiente de variación (CV) 75 75 75 75 75 76 77 77 77 78 78 79 79 80 80 81 81 83 83 84 84 84 84 Índice
13. Ensayos de retardo en gel (EMSA) 13.1 Extracción de proteínas nucleares 13.2 Preparación de las sondas radioactivas 13.3 Reacción de unión sonda/proteínas nucleares 13.4 Electroforesis, secado del gel y revelado 14. Estudios de Número y Brillo (N&B) 14.1 Obtención de las muestras biológicas 14.2 Obtención de las imágenes por microscopía confocal 14.3 Análisis de las imágenes y cálculo del Brillo 15. Ensayos de coinmunoprecipitación 15.1 Estudios in vivo 15.2 Estudios in vitro 16. Ensayos de Western blot 16.1 Preparación y cuantificación de las muestras 16.2 Electroforesis y transferencia a membrana de PVDF 16.3 Incubación con anticuerpos y revelado 16.4 Anticuerpos primarios utilizados 16.5 Anticuerpos secundarios utilizados 16.6 Soluciones utilizadas 17. Análisis de la fragmentación del ADN 18. Estudios con Actinomicina D y Anisomicina 18.2 Inhibición de la síntesis de ARN 18.2 Inhibición de la síntesis de proteínas 19. Preparación de ARN 20. Retrotranscripción (generación de ADNc) 21. PCR cuantitativa 22. PCR semicuantitativa 23. Ensayos de competencia in vivo 24. Identificación de proteínas por espectrometría de masa MALDI‐TOF 24.1 Principios de la espectrometría de masa MALDI‐TOF aplicada a proteínas 24.2 Obtención de las muestras 24.3 Tinción con azul de Coomasie coloidal G250 24.4 Espectrometría de masa MALDI‐TOF 25. Determinación de AMPc 25.1 Obtención de las muestras 25.2 Radioinmunoensayo (RIA) 26. Análisis in silico 27. Análisis estadístico 86 86 86 87 87 88 88 88 88 89 89 91 92 92 92 92 93 93 94 94 95 95 95 95 96 96 97 98 98 98 100 100 100 101 101 101 101 102 CAPITULO 1 Modulación de la actividad del GR por análogos rígidos de esteroides ANTECEDENTES 1.1 Análogos rígidos de glucocorticoides 1.1.1 21‐hidroxi‐6,19‐epoxiprogesterona (21OH‐6,19OP) 1.1.2 21‐hemisuccinato‐6,19‐epoxiprogesterona (21HS‐6,19OP) 1.2 Mecanismos de acción de 21OH‐6,19OP y 21HS‐6,19OP 104 104 107 107 Índice
1.3 Objetivos particulares RESULTADOS 1.4 Modulación de la translocación nuclear y actividad transcripcional del GR 1.5 Distribución intranuclear del GR 1.6 Actividad monomérica de los complejos ligando‐GR 1.7 Estudios de oligomerización del GR in vivo 1.7.1 Principio de la técnica de Número y Brillo (N&B) 1.7.2 Oligomerización del GR in vivo 1.7.3 Estados de oligomerización de los complejos ligando‐GR 1.8 Dinámica de la interacción entre el GR y el ADN in vitro 1.9 Estudios de actividad e interacción del GR con el coactivador TIF2 109 110 115 117 118 119 121 122 123 127 DISCUSIÓN 1.10 El GR dentro del núcleo 1.11 El GR como factor de transcripción: dimerización, unión al ADN, cofactores 1.12 Actividad monomérica e implicancias farmacológicas 1.13 Mecanismos de acción de 21OH‐6,19OP y RU486 130 131 134 135 CAPITULO 2 Mecanismos involucrados en la inducción del gen bax mediada por glucocorticoides ANTECEDENTES 2.1 Proteínas de la familia de Bcl‐2: Bax y apoptosis 2.2 Apoptosis de timocitos inducida por glucocorticoides: relevancia de Bax 2.3 Objetivos particulares RESULTADOS 2.4 Análisis in silico del promotor de bax 2.5 Análisis in vivo de la actividad del promotor de bax 2.6 Estudios sobre la estabilidad del ARNm de bax 2.7 Análisis in silico de los intrones de bax 2.8 Mecanismo de acción del GR sobre la expresión de bax DISCUSIÓN 2.9 Mecanismos involucrados en la inducción de bax mediada por GR 140 141 143 144 145 149 154 155 158 Índice
CAPITULO 3 Antagonismo entre la melatonina y los glucocorticoides ANTECEDENTES 3.1 Melatonina y glucocorticoides: mecanismos de acción 3.2 Objetivos particulares RESULTADOS 3.3 Modulación de la actividad del GR por melatonina en timocitos de ratón y células de timoma murino S49 3.3.1 Ensayos de competencia in vivo 3.3.2 Estudios de disociación del complejo GR‐Hsp90 3.3.3 La línea celular S49 como modelo de antagonismo entre melatonina y glucocorticoides 3.3.4 Estudios de disociación del heterocomplejo del GR 3.3.5 Identificación de proteínas asociadas al GR mediante espectrometría de masa MALDI‐TOF 3.3.5.1 Diseño experimental 3.3.5.2 Potenciales proteínas interactoras del GR 3.4 Antagonismo entre glucocorticoides y melatonina en otros tipos celulares 3.5 Modulación de la actividad del GR por melatonina en células BHK 3.5.1 Estudios de la translocación 3.5.2 Distribución intranuclear del GR 3.5.3 Oligomerización del GR en presencia de melatonina 3.5.4 Estudios de unión y disociación del GR al ADN in vitro 3.5.5 Estudios de interacción del GR con TIF2 3.6 Estudio de las vías de señalización de melatonina 3.7 Luzindole… ¿un nuevo antagonista del GR? DISCUSIÓN 3.8 Mecanismos involucrados en la modulación del GR por melatonina 3.9 El Luzindole: ¿un nuevo antiglucocorticoide? ‐ Conclusiones finales ‐ Bibliografía 162 163 165 165 166 167 169 170 170 172 177 181 181 182 183 184 186 187 189 193 200 202 207 Publicaciones y Financiamiento
Artículos Publicados • “Melatonin inhibits glucocorticoid receptor nuclear translocation in mouse thymocytes”, Diego M. Presman, Esteban Hoijman, Nora R. Ceballos, Mario D. Galigniana and Adalí Pecci. Endocrinology (2006) 147(11):5452‐9. • “Exploring the Molecular Basis of Action of the Passive Antiglucocorticoid 21‐Hydroxy‐
6,19‐epoxyprogesterone”, Lautaro D. Álvarez, Marcelo A. Martí, Adriana S. Veleiro, Diego M. Presman, Darío A. Estrin, Adalí Pecci, and Gerardo Burton. J Med Chem. (2008) 13;51(5):1352‐60. Manuscritos enviados o en preparación • “Insights on glucocorticoid receptor activity modulation through the binding of rigid steroids” Diego M. Presman, Lautaro D. Álvarez, Valeria Levi, Silvina Eduardo, Michelle A. Digman, Marcelo A. Martí, Adriana S. Veleiro, Gerardo Burton and Adalí Pecci. Enviado para su publicación (Diciembre 2009). • “Cell‐specific molecular mechanisms underlying melatonin and glucocorticoid antagonism”, Diego M. Presman, Valeria Levi and Adali Pecci. En preparación. • “Molecular mechanism underlying glucocorticoid‐dependent Bax induction in S49 cells”, Diego M. Presman and Adali Pecci. En preparación. Financiamiento • Agencia de Promoción Científica y Tecnológica • Conicet • UBA 15
Abreviaturas
ABREVIATURAS 11β‐HSD1 11β‐HSD2 21HS‐6,19OP 21OH‐6,19OP AC ACTH AD ADN Ae AF‐1 AF‐2 AMPc An ANOVA AP‐1 AR ARNm βgal B BHK BrEt BSA CaM CMV Cos‐7 CREB CRH CS‐FCS Cys Da DBD dex DMSO Dpm ε EGFP EMSA 11β‐hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 11β‐hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 21‐hemisuccinoiloxi‐6,19‐epoxiprogesterona 21‐hidroxi‐6,19‐epoxiprogesterona Adenilato Ciclasa adrenocorticotrofina Dominio de activación ácido desoxirribonucleico Actividad específica dominio de función de activación 1 dominio de función de activación 2 Adenosina monofosfato cíclico Anisomicina Análisis de la Varianza proteína activadora 1 receptor de andrógenos Ácido ribonucleico mensajero β‐galactosidasa Brillo aparente Línea celular derivada de riñón de hámster Bromuro de etidio Seroalbúmina bovina Calmodulina Citomegalovirus Línea celular derivada de riñón de mono Proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc hormona liberadora de corticotrofina Suero fetal bovino libre de esteroides cisteína Dalton dominio de unión al ADN dexametasona dimetilsulfóxido desintegraciones por minuto Brillo real Proteína verde fluorescente incrementada Ensayos de retardo en gel 16
Abreviaturas
ER ERK1/2 ES Fas‐L FKBP FT GCs Gi GMPc GR GRdim GRE GRIP‐1 HAT HC11 hGR HPA Hsp IFN‐γ IL IMM Kd L929 LBD LBP LUC LUZ MAPK MALDI MCF‐7 MD Mel MMTV MR MS N&B NCoR NES receptor de estrógenos Quinasa regulada por señales extracelulares error estándar Ligando de Fas Proteína de unión a FK factor de transcripción glucocorticoides Proteína G inhibitoria Guanonina monofosfato cíclico receptor de glucocorticoides mutante A458T del GR elemento de respuesta a glucocorticoides Proteína de interacción del GR 1 histona acetil transferasa Línea celular derivada de glándula mamaria de ratón receptor de glucocorticoides de origen humano eje hipotalámico‐pituitario‐adrenal Proteínas del shock térmico Interferón gamma interleuquina Inmunofilina constante de disociación Línea derivada de fibroblastos de ratón dominio de unión al ligando bolsillo de unión al ligando luciferasa Luzindole proteína quinasa activada por mitógenos Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization línea tumoral humana de glándula mamaria dinámica molecular melatonina promotor del virus de tumor mamario de ratón receptor de mineralocorticoides Espectrometría de masa Número y brillo corepresor nuclear Señal de exportación nuclear 17
Abreviaturas
NFκB NLS NPC NR PCR POMC PPiasa PR RAR RIA RMN ROR Rpm RSV RU486 S49 SDS SDS‐PAGE SFB SGRM SMRT SNuRM SR STAT TAT TBP TIF2 TNF TOF TPR TR factor nuclear kappa‐B Señal de localización nuclear Complejo del poro Nuclear receptores nucleares Reacción en cadena de la polimerasa Proopiomelanocortina Actividad de Peptidilprolil isomerasa receptor de progesterona receptor de ácido retinoico Radioinmunoensayo resonancia magnética nuclear receptor nuclear huérfano relacionado al ácido retinoico Revoluciones por minuto virus del sarcoma de Roux mifepristona línea celular derivada de un linfoma T de ratón Dodecil sulfato de sodio Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS suero fetal bovino modulador selectivo del GR silencing mediator of retinoid and thyroid receptors modulador selectivo de receptores nucleares receptores de esteroides Activadores de la transcripción y transductores de señales tirosina aminotransferasa proteína de unión a Tata factor intermediario de la transcripción 2 factor de necrosis tumoral tiempo de vuelo (time of flight) Repeticiones de tetratricopéptidos receptor de hormona tiroidea 18
INTRODUCCIÓN “…clearly the facts, some of them, that you learn are wrong, so if you take them too seriously you won’t discover the truth. You could say that if you become too imbued in the ideas and talk about them too long, maybe your capacity for ever believing they’re false would be burned out. Probably what you should learn if you are a graduate student is, not large numbers of facts, especially if they are in books, but what the important problems are, and to sense which experiments, work that’s been done, probably aren’t quite right…”. James D. Watson (1928‐ ). Biólogo. Premio Nobel de medicina, 1962. Introducción
1. Glucocorticoides 1.1 Hormonas esteroides El término esteroide comprende a un grupo de pequeños compuestos lipofílicos, derivados de un mismo precursor, el colesterol [1]. En este sentido, los esteroides como grupo no se encuentran asociados a una actividad biológica en particular, sino a una estructura molecular básica bien definida, el ciclopentanoperhidrofenantreno, según se indica en la figura 1. Figura 1. Esqueleto carbonado de los esteroides y su numeración. A partir de este esqueleto, el esteroide puede adquirir diversas conformaciones según el tipo de grupos funcionales adicionales que se incorporen. Las hormonas esteroides actúan como mensajeros químicos regulados por el sistema nervioso central (SNC). Estas pueden clasificarse en cuatro grupos principales: los progestágenos, los estrógenos, los andrógenos y los corticoides. Estos grupos difieren en el número de átomos de carbono que los componen, el estado de oxidación constituido por los distintos grupos funcionales que presentan (figura 2), el tipo de receptores a los que se unen y, en consecuencia, la respuesta biológica que ellos producen [2]. Dentro del grupo de los progestágenos, la progesterona (miembro de mayor relevancia de esa familia), es secretada principalmente por los ovarios e interviene en la regulación del ciclo estral, preparando al endometrio para la implantación del embrión. Además, cumple funciones esenciales en el mantenimiento del embarazo. Por otro lado, el estradiol (el estrógeno natural más activo) es sintetizado a altos niveles en los ovarios de hembras en edad reproductiva durante la primera fase del ciclo estral, promoviendo las características sexuales femeninas y regulando el proceso de maduración del ovocito. En contraste, la testosterona (perteneciente al grupo de los andrógenos), es sintetizada principalmente en los testículos y promueve las características masculinas, manteniendo las glándulas accesorias del sistema reproductor [2]. Finalmente, el grupo de los corticoides, sintetizado por la glándula adrenal, a su vez puede ser subdividido en 20
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dos: los mineralocorticoides, cuya función principal es la de regular el equilibrio hidrosalino; y los glucocorticoides, cuyas múltiples actividades biológicas abarcan desde procesos metabólicos hasta antiinflamatorios e inmunosupresores, o incluso algunos relacionados al comportamiento [1]. Es importante señalar que esta breve descripción funcional de las hormonas esteroides hace referencia sólo a las funciones principales asociadas a cada una de ellas, existiendo muchas otras que no han sido mencionadas. Figura 2. Estructuras de las principales hormonas esteroides. En relación a su modo de acción, se sabe que las hormonas esteroides actúan principalmente a través de su interacción con los denominados receptores de esteroides (SR). Dentro de esta familia, podemos encontrar al receptor de andrógenos (AR), el receptor de estrógenos (ER), el receptor de progestágenos (PR), el receptor de mineralocorticoides (MR) y el receptor de glucocorticoides (GR) [3]. Todos estos receptores son factores de transcripción regulados por ligando, por lo que históricamente los efectos mediados a través de estas proteínas se los denominó globalmente como efectos genómicos [4]. Aunque las hormonas esteroides de una dada familia interactúan principalmente con un sólo tipo de receptor, debido al alto grado de similitud de secuencia existente entre estas proteínas, algunas poseen afinidad por más de uno de ellos, fenómeno conocido como interacción cruzada. Por ejemplo, el cortisol (glucocorticoide mayoritario en mamíferos no roedores) puede interactuar con el GR y con el MR [5]. Por otro lado, la progesterona, además de unirse al PR, presenta también afinidad por el MR [6]. 21
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En contraposición a los mencionados efectos genómicos, las hormonas esteroides pueden también actuar a través de mecanismos no genómicos, ya sea interactuando en forma inespecífica con las membranas celulares, mediante la unión a proteínas de membrana, o incluso a través de su receptor, independientemente de la función de éste como factor de transcripción [7‐11]. 1.2 Glucocorticoides y su regulación Los glucocorticoides son sintetizados principalmente en la zona fasciculata de la corteza de la glándula adrenal [2]. Su síntesis y secreción son reguladas a través de la comunicación jerárquica entre distintos órganos endócrinos compuesta por el hipotálamo, la glándula pituitaria y la corteza adrenal, en lo que se denomina el eje Hipotálamo‐hipofisiario‐adrenal (HPA) [12]. En repuesta a diversas señales, el hipotálamo secreta la hormona liberadora de corticotrofina (CRH), la cual a su vez activa la síntesis de POMC (Proopiomelanocortina) y la liberación de la hormona adrenocorticotrofina (ACTH) en los corticotrofos de la glándula pituitaria. Esta hormona actúa sobre la corteza adrenal promoviendo un rápido incremento en la síntesis y secreción de glucocorticoides, mediante la inducción de la expresión de diversas proteínas que participan en la biosíntesis de esteroides [13]. Los niveles circulantes de glucocorticoides son mantenidos, en parte, por la retroalimentación negativa establecida dentro del eje HPA. La alta concentración de cortisol disminuye la secreción de ACTH, disminuyendo entonces la síntesis y secreción de glucocorticoides [14]. Bajo condiciones normales, la secreción de ACTH mantiene un ritmo circadiano, lo que resulta finalmente en un ritmo pulsátil de producción de glucocorticoides endógenos [15]. El mayor estímulo que provoca un aumento de ACTH, y consecuentemente de cortisol es el estrés, ya sea fisiológico, psicológico, o patológico [16‐18]. Luego de su liberación, los glucocorticoides se transportan en forma libre (15% ), o unidos a proteínas plasmáticas, como la globulina fijadora de cortisol (80% ) y la albúmina (5% ) [19]. Es importante destacar que sólo la hormona libre es capaz de ingresar dentro de las células, y por lo tanto ser biológicamente activa. La biodisponibilidad intracelular del cortisol en el citoplasma está controlada por la acción de dos enzimas: la 11β‐hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11β‐HSD2) y la 11β‐hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (11β‐HSD1) [20]. La 11β‐HSD2 cataliza la conversión de cortisol en cortisona, metabolito con muy baja afinidad por el GR, 22
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mientras que, en forma opuesta, la 11β‐HSD1 cataliza la conversión de cortisona en cortisol. Los niveles relativos de expresión de estas enzimas varían según el tipo celular, y como son determinantes de los niveles de cortisol intracelulares, constituyen así un mecanismo adicional en la especificidad de acción de los glucocorticoides. Por ejemplo, dado que el cortisol también posee alta afinidad por el MR, mientras que cortisona no, una alta expresión de 11β‐HSD2 (como sucede en células de riñón y otros tejidos blanco de la acción mineralocorticoide) evita la activación del GR en estos tejidos. En contraste, la alta expresión de 11β‐HSD1 asegura altos niveles de cortisol en tejidos con función metabólica, como el tejido adiposo, el pulmón o el hígado [20]. 1.3 Efectos fisiológicos El receptor de glucocorticoides parece encontrarse en casi todos los tipos celulares, por lo que no es de extrañar que su ligando natural regule una gran diversidad de sistemas fisiológicos. De hecho, los glucocorticoides endógenos poseen funciones indispensables en varios sistemas, como el endocrino, el renal, el inmune y el neuronal; ejerciendo efectos virtualmente en todos los tejidos y órganos del ser humano. Esta hormona ayuda a mantener la homeostasis durante situaciones de estrés como hemorragias, infecciones, desórdenes metabólicos e incluso ansiedad [12]. Acorde a su concentración sistémica, la acción global de los glucocorticoides suele dividirse en dos grandes grupos. A bajas concentraciones, la mayoría de los efectos se ejercen sobre enzimas involucradas en el metabolismo de hidratos de carbono, lípidos y proteínas, mientras que a altas concentraciones ‐como por ejemplo en situaciones de estrés‐ se activa una amplia red de mecanismos antiinflamatorios e inmunosupresores [12]. Dentro de los efectos metabólicos, la principal función de los glucocorticoides, como su nombre lo indica, es la de incrementar los niveles circulantes de glucosa. Para ello, se inducen procesos anabólicos que estimulan la gluconeogénesis en el hígado, a la vez que se activa la acción catabólica en órganos periféricos, dando como resultado la degradación de proteínas y el aumento de la lipólisis [15]. Por otro lado, los efectos antiinflamatorios e inmunosupresores están relacionados, principalmente, a la capacidad de los glucocorticoides de inhibir la síntesis y/o liberación de muchas citoquinas como TNFα, IL‐1, IL‐2, IL‐3, IL‐4, IL‐5, IL‐6, IL‐8, IL‐10, IL‐13, e interferón‐γ en diversos tipos celulares, como células T, macrófagos y neutrófilos [12,21‐26]. Por otro lado, los 23
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glucocorticoides tienen la capacidad de inducir o prevenir la apoptosis, dependiendo del contexto y tipo celular [27]; como veremos en detalle más adelante. Además de los efectos anteriormente mencionados, los glucocorticoides intervienen activamente en el sistema nervioso central (SNC). En el cerebro, no sólo la excitabilidad de las neuronas ante un dado estímulo se encuentra regulada por los glucocorticoides, sino también su morfología y supervivencia. De esta manera, los glucocorticoides poseen claros efectos sobre la memoria y las funciones cognitivas, aunque también afectan otras funciones del SNC, incluyendo la normalización del tono cardiovascular, el estado de alerta y el sueño [22]. Los glucocorticoides también juegan un papel relevante durante el desarrollo embrionario, particularmente en las etapas finales de la maduración pulmonar previas al nacimiento [21]. De hecho, ratones knock out para el GR mueren pocas horas luego del nacimiento debido a problemas respiratorios [28]. 1.4 Farmacología de los glucocorticoides Desde un punto de vista farmacológico, el GR en particular, y los SR en general constituyen uno de los principales blancos moleculares para el desarrollo de fármacos, existiendo para cada uno de estos receptores una gran variedad de ligandos que actualmente se utilizan en el mercado, y que regulan su función. Si bien varias enfermedades son tratadas mediante el uso de estas drogas, ninguna de ellas puede considerarse libre de graves efectos secundarios [29]. Además, dado el alto grado de similitud de secuencia entre los SR, muchas drogas presentan interacciones cruzadas con uno o más receptores, lo cual limita ampliamente su utilidad. Por ejemplo, la mifepristona, un fuerte antiglucocorticoide, es además un antiprogestágeno muy potente [30]. Por lo tanto, es la propia naturaleza de estos receptores lo que condiciona fuertemente el desarrollo de drogas específicas, que actúen a través de un único SR [29]. Además, otro de los grandes inconvenientes en el diseño de este tipo de fármacos reside en que la actividad biológica de un determinado ligando puede depender del tipo celular. De esta manera, ligandos que actúan como agonistas de un SR en ciertos tejidos pueden actuar como antagonistas en otros, como es el caso del tamoxifeno para el ER [31,32]. Así, el descubrimiento de un compuesto con capacidad de unirse a un SR debe acompañarse con un exhaustivo examen de su actividad en diferentes tipos y contextos celulares [29]. 24
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1.4.1 Glucocorticoides sintéticos Los glucocorticoides sintéticos son una de las drogas más prescriptas en el mundo. De hecho, se ha estimado que en el año 2003 más del 0.5 % de la población occidental utilizaba crónicamente algún glucocorticoide [33]. Junto a los receptores de histamina, el GR es el blanco molecular con más drogas aprobadas actualmente en el mercado [34], lo que muestra la importancia farmacológica de este receptor, e ilustra la gran versatilidad que posee para unir diferentes moléculas. Los glucocorticoides son extremadamente efectivos como agentes antiinflamatorios e inmunosupresores, por lo que su uso resulta indispensable en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y desórdenes inflamatorios como la artritis reumatoidea [35], o incluso como inhibidores del rechazo de trasplante de órganos [36]. Además, los GCs son utilizados en terapias combinadas frente a ciertos tipos de cáncer [35]. Entre los glucocorticoides sintéticos más utilizados en la clínica se destacan la dexametasona (dex), prednisolona, triamcinolona, y fluticasona furoato [37,38] (figura 3). Figura 3. Estructura de algunos de los glucocorticoides sintéticos más utilizados en la clínica. Desafortunadamente, los efectos deseados del uso de glucocorticoides siempre están acompañados de graves efectos adversos (figura 4). El uso crónico de GCs sintéticos en dosis farmacológicas provoca efectos similares, o aún más graves, a los causados por el exceso de GCs endógenos. Diabetes, osteoporosis, atrofia de la piel, redistribución de la grasa, glaucoma, hipertensión arterial, psicosis y neurodegeneración, son algunos de los síntomas producidos, según dosis y duración del tratamiento con glucocorticoides [12,15,20]. 25
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Figura 4. Efectos deseados y adversos del uso clínico de glucocorticoides. En este sentido, uno de los objetivos principales de la industria farmacéutica en el campo de los glucocorticoides es encontrar ligandos disociados, capaces de generar la mayoría de los efectos beneficiosos, en detrimento de los perjudiciales. A pesar de los reiterados e intensos esfuerzos realizados durante décadas, a la fecha no existe ningún glucocorticoide que pueda ser usado crónicamente sin presentar severos efectos secundarios [15]. Sin embargo, en los últimos años, el estudio de las bases moleculares de acción del GR se ha incrementado notoriamente, obteniéndose valiosa información que puede ser utilizada para comprender mejor la actividad de los glucocorticoides, y lograr así el diseño racional de moléculas más seguras y con menos efectos adversos [20]. 1.4.2 Antiglucocorticoides Así como los glucocorticoides poseen varias aplicaciones clínicas, los antiglucocorticoides podrían ser utilizados, en principio, para tratar aquellos trastornos en donde se genere un exceso de glucocorticoides endógenos. Un antiglucocorticoide podría entonces ser potencialmente utilizado para tratar la hipercortisolemia asociada al síndrome de Cushing, la hipertensión dependiente de glucocorticoides, la inmunosupresión inducida por glucocorticoides, la diabetes, la depresión y ansiedad, la presión ocular y el glaucoma, entre otros [35,39‐41]. 26
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En la actualidad, los únicos antiglucocorticoides que existen en el mercado son el acetato de ciproterona y la mifepristona (RU486) (figura 5). Sin embargo, ninguno de ello es utilizado como tal, sino por la actividad antagonista que poseen sobre otro tipo de receptor de esteroides (SR). Figura 5. Estructura de acetato de ciproterona y Mifepristona (RU486) El acetato de ciproterona es, además de un antiglucocorticoide débil, un antiandrógeno fuerte utilizado comúnmente en el tratamiento de cáncer de próstata [42]. Por otro lado, RU486 es un antiglucocorticoide fuerte, con alta afinidad por el GR, pero que también posee un fuerte efecto antiprogestágeno, razón por la cual se lo utiliza como abortivo [43]. Aunque cientos de análogos de RU486 se han sintetizado en la búsqueda de separar la actividad antiglucocorticoide de la antiprogestágena, en la mayoría de los casos en que esto se logró, la actividad remanente fue la antiprogestágena [30]. Un ejemplo en donde la actividad principal remanente fue la antiglucocorticoide es el caso de RU43044, pero con un sexto de la actividad respecto de RU486, y sólo activo in vitro ya que es metabolizado rápidamente in vivo [44]. En conclusión, todavía no existe en la clínica un antiglucocorticoide específico, sin efectos cruzados sobre otros receptores de esteroides. 1.4.3 Desarrollo de nuevos fármacos: análogos rígidos de esteroides Como se mencionara recientemente, unos de los problemas principales en el uso clínico de antiglucocorticoides es la acción cruzada del fármaco con otros SR. Los esteroides no son moléculas rígidas. Por el contrario, el esqueleto carbonado de un esteroide es una estructura que posee alta flexibilidad, cuya conformación depende de los grupos funcionales unidos, así como del entorno presente. En particular, desde un punto de vista estructural, los glucocorticoides, mineralocorticoides y progestágenos comparten el esqueleto pregnano de 21 átomos de 27
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carbono. Si bien su conformación es bien definida, dada la flexibilidad intrínseca de la molécula, este esqueleto puede ser deformado como consecuencia de la introducción de puentes o substituyentes. Esto puede resultar en la reorientación de grupos funcionales que pueden favorecer o desfavorecer las interacciones con receptores específicos, dando lugar a cambios significativos en su actividad biológica. A su vez, esta flexibilidad le permite al esqueleto pregnano adaptarse a distintos entornos a la hora de interactuar con un dado receptor, explicando al menos en parte la acción cruzada de una determinada hormona con más de un SR. Por lo tanto, una manera de aumentar la especificidad de un determinado ligando por un único receptor es seleccionando y fijando ciertas conformaciones del esteroide [45]. Una estrategia para fijar la conformación de una molécula y disminuir su flexibilidad es la introducción de puentes intramoleculares. Esta metodología, ampliamente utilizada en química medicinal, puede también observarse en la naturaleza [45]. Por ejemplo, en la aldosterona, la formación de un puente intramolecular entre las posiciones 11 y 18 favorece una conformación globalmente plana, adecuada para la interacción con el MR [46]. Utilizando este concepto, y con el objetivo de aumentar la especificidad de los esteroides por sus receptores, en el grupo de investigación del Dr. Gerardo Burton (Departamento de Química Orgánica/UMYMFOR‐CONICET‐
FCEN‐UBA) se diseñaron y sintetizaron variados compuestos con puentes intramoleculares, análogos rígidos de hormonas esteroides y neuroesteroides. Dependiendo de las posiciones involucradas y de la longitud del puente (tipo y número de átomos) se obtuvieron estructuras con distinto grado de rigidez y deformación [47‐57]. En primer lugar, la introducción de un puente oxígeno entre los carbonos C‐11 y C‐19 en la molécula de progesterona (figura 6A) generó una nueva molécula con estructura rígida y globalmente plana, la cual mostró afinidad por el MR y potentes propiedades sodioretentoras [58]. En contraste, la introducción de un puente epóxido entre C‐6 y C‐19 condujo a una estructura con una curvatura pronunciada entre los anillos A/B (6,19‐epoxiprogesterona) (figura 6B). Si bien este esteroide no presentó actividad glucocorticoide ni mineralocorticoide, la introducción de un hidroxilo en C‐21 condujo a un análogo rígido, 21‐hidroxi‐6,19‐
epoxiprogesterona (21OH‐6,19OP) (figura 6C), con afinidad por el GR. Al evaluarse la actividad glucocorticoide de dicho compuesto en diferentes ensayos, se observó que el mismo se comportaba como un antiglucocorticoide puro [50,59]. Además, 21OH‐6,19OP no presentó afinidad por el PR ni por el MR, lo cual lo hace un potencial antiglucocorticoide específico. Por último, la introducción de un grupo hemisuccinato en C‐21 condujo a un compuesto (21HS‐
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6,19OP) (figura 6D) que mostró notables e interesantes propiedades glucocorticoides [60]. Una parte de este trabajo de tesis consiste en el estudio de las bases moleculares de acción de los análogos rígidos 21OH‐6,19OP y 21HS‐6,19OP. Figura 6. Estructura de algunos análogos rigidos. Ver texto para mas detalles. 2. El Receptor de Glucocorticoides 2.1 Receptores Nucleares Los receptores nucleares (NR) comprenden a una superfamilia de proteínas solubles que actúan como factores de transcripción luego de unirse a ligandos específicos. Esta superfamilia participa y regula funciones esenciales en el organismo, como ser el desarrollo embrionario, la reproducción, la respuesta inmune, el metabolismo y la muerte celular [61‐63]. En términos estructurales, los miembros de esta superfamilia se caracterizan por presentar tres dominios diferentes: un dominio N‐terminal de activación independiente del ligando, un dominio central de unión al ADN y un dominio C‐terminal de unión al ligando [3]. En humanos, la superfamilia de NRs incluye 48 receptores, entre los que se destacan los receptores de esteroides (SR), de vitamina D (VDR), de hormona tiroidea (TR) y de ácido retinoico (RAR) [22]. Además, existen muchos NR a los que todavía no se les conoce ligando, denominados receptores huérfanos [3,61]. 29
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Dado el gran número de procesos fisiológicos en los que esta familia participa, la disfunción en la señalización de los NR produce un gran número de enfermedades, ya sea de orden proliferativo, reproductivo o metabólico, como cáncer, infertilidad, obesidad y diabetes, entre otras [61]. En este sentido, no es de extrañar que las drogas que actúan sobre algún NR se encuentren entre las más comúnmente usadas y según información compilada en 2003, 34 de las 200 drogas más prescriptas en el mundo poseen como blanco molecular algún NR [3]. 2.2 Receptores de esteroides La familia de receptores de esteroides (SR) pertenece a la superfamilia de receptores nucleares. Los vertebrados contienen seis genes evolutivamente relacionados que codifican para los receptores ERα, ERβ, GR, MR, PR y AR. Estos factores de transcripción regulados por ligando median la acción hormonal de diversos procesos fisiológicos como el desarrollo sexual, la reproducción, el comportamiento, la inmunidad y la respuesta al estrés [64]. Ne existen ortólogos de estos genes en insectos como Drosophila melanogaster, nematodos como C. elegans, o incluso urocordados como Ciona intestinalis. El gen más estrechamente relacionado a la familia de NR es el ERR (estrogen‐related receptor), un ortólogo presente en el genoma de la mosca de la fruta [65,66]. Basados en esta distribución génica, se cree que los SR evolucionaron hace unos 500 millones de años atrás dentro del linaje de los cordados, a partir de la duplicación génica de un SR ancestral, similar al ER [67‐69]. Como consecuencia de esa relación evolutiva existe una alta similitud de secuencia entre los distintos dominios de los SR [70], como el dominio de unión a ligando, lo cual provoca interacciones cruzadas entre las distintas hormonas endógenas y los receptores. Por ejemplo, como mencionamos anteriormente, el cortisol también pueden unirse al MR con alta afinidad [5] mientras que la progesterona, ligando natural del PR, también exhibe propiedades antimineralocorticoides [6]. Esta promiscuidad entre hormonas y receptores es un factor determinante para el diseño de fármacos que actúen a través de algún SR. A continuación se realizará una descripción detallada de la estructura, regulación y mecanismo de acción del receptor de glucocorticoides, objeto de estudio central de esta tesis. 30
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2.3 Estructura del GR Como todo miembro de la superfamilia de NR, el GR es una proteína modular organizada en tres dominios estructurales y funcionalmente bien definidos (figura 7): un dominio N‐terminal, que contiene la región de activación (AF‐1) independiente de ligando; un dominio de unión al ADN, que contiene la región responsable de reconocer sitios de unión específicos al ADN además de una región de dimerización del receptor; y la porción C‐terminal, llamada dominio de unión al ligando (LBD) [71]. Este último dominio no sólo contiene la cavidad en donde se une el ligando, sino que también presenta una segunda región de activación (AF‐2), el sitio de unión a chaperonas y otras proteínas [72], y otra región responsable de la dimerización del receptor [73]. Además de estos dominios, el GR presenta dos señales de localización nuclear (NLS) presentes en la región comprendida entre el DBD y el LBD [74]. Figura 7. Estructura modular del GR. Se muestra en forma esquemática los tres dominios del GR, con sus características principales. AF‐1=función de activación‐1; DBD=dominio de unión al ADN; LBD=dominio de unión al ligando; NLS= señal de localización nuclear. Adaptado de Moore y colaboradores [3]. 2.3.1 Dominio de activación AF‐1 En términos de tamaño e identidad de secuencia, el dominio N‐terminal es el más variable en los NR, e incluso entre GRs de diferentes especies [72,75]. Este dominio contiene la región de activación de la transcripción (AF‐1) necesaria para una máxima actividad transcripcional del receptor [76,77]. Esta región actúa en forma independiente del LBD [76], uniendo cofactores indispensables para la actividad transcripcional [78]. En este sentido, se ha descripto la interacción de este dominio con los componentes de la transcripción basal como TFIID y TBP [79‐
81]. Además, esta región posee aminoácidos susceptibles de ser fosforilados, modulando así la actividad transcripcional del receptor [82]. 31
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Hasta la fecha, no se ha podido dilucidar la estructura espacial de la región N‐terminal para ninguno de los NR. El mayor obstáculo reside en la falta de estructura intrínseca que presenta el péptido AF‐1, haciendo virtualmente imposible su cristalización [83,84]. Estudios realizados utilizando un GR recombinante que sólo contiene el dominio AF‐1 y el DBD sugieren que la unión al ADN promueve la formación de estructuras secundarias y terciarias más definidas en la región AF‐1, lo que sugiere que el ADN se comportaría como un modulador alostérico del receptor [85,86]. Más aún, se propone que debido a estas interacciones, la región AF‐1 adquiere la estructura necesaria para que el receptor interactúe con distintos moduladores transcripcionales [71,81]. 2.3.2 Dominio de unión al ADN (DBD) Este dominio, localizado en la parte central del GR, es el más conservado entre los NR y en particular entre los GRs de distintas especies [71]. Dos grupos de cuatro Cys altamente conservadas, cada una coordinando un átomo de Zn, estabilizan una conformación adecuada para la unión a secuencias específicas del ADN, denominada elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE). La secuencia consenso GRE consiste en una secuencia palindrómica conformada por dos regiones de 6 nucleótidos conservados, separados por 3 bases no conservadas: TGTTCTnnnAGAACA. Curiosamente, el GR, PR, MR y AR reconocen la misma secuencia palindrómica de ADN [87]. Figura 8. Dominio de unión al ADN del GR. Se muestra la estructura de rayos X en donde dos moléculas de GR DBD se encuentran unidas a una secuencia GRE. 32
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El GR interacciona con los sitios GRE como homodímero, con un monómero unido a cada una de estas secuencias conservadas. El DBD contiene tres hélices, la primera encaja en el surco mayor del ADN, mientras que la segunda y el loop que la precede crean una interfase de homodimerización. Utilizando rayos X o RMN se han obtenido numerosas estructuras del homodímero GR DBD y de éste unido a un oligonucleótido de secuencia GRE (figura 8) [88‐90]. Estudios mutacionales sugieren que el DBD además participa de la interacción del GR con otros factores de transcripción, como NFκB y AP1 [91,92]. 2.3.3 Dominio de unión al ligando (LBD) Este dominio, como su nombre lo indica, posee una cavidad a la cual se une específicamente el ligando, región denominada bolsillo de unión al ligando (LBP). Además, el GR LBD posee otras dos regiones fundamentales para la actividad del receptor: la región AF‐2 y una segunda interfase de dimerización. El GR LBD, al igual que los LBD de otros NR, está constituido por 9 α‐hélices y 2 hojas beta que se pliegan en una estructura globular, con tres grupos de hélices que forman los lados y la tapa del glóbulo [70], como se esquematiza en la figura 9. Figura 9. Estructura secundaria y cuaternaria del GR LBD. A. El GR LBD humano está formado por 250 residuos, formando 9 α‐hélices y 2 hojas β‐plegadas. B. Se muestra la estructura cristalina del dímero GR LBD (pdb:1m2z), unido a dexametasona. La estructura de α‐hélice violeta corresponde a un péptido perteneciente al coactivador TIF2. 33
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2.3.3.1 Bolsillo de unión al ligando (LBP) El LBP en presencia de dexametasona, acorde a la estructura cristalina pdb:1m2z, comprende una cavidad interna del receptor de 599 Å3 mayormente hidrofóbica, formada por residuos pertenecientes a las hélices H3, H4‐H5, H7, H11, H12 y residuos del loop entre las hélices H11‐H12 (figura 10A). Dentro de la cavidad, se establecen interacciones por puente de hidrógeno entre los grupos polares del ligando y cinco residuos polares del receptor (Asn564, Gln642, Arg611, Thr739 y Gln570). Además, ocurren acercamientos – por efecto hidrofóbico ‐ entre residuos aminoacídicos y el esqueleto carbonado esteroidal (figura 10b) [73]. Así, todos los grupos polares de dex (presentes también en el ligando natural cortisol) interaccionan mediante puentes de hidrógeno con los residuos polares del LBP. 10. Modo de unión de dex al GR. A. Ubicación de dex dentro del bolsillo de unión al ligando Figura (pdb:1m2z). B. La molécula de dex se orienta de manera que el grupo 3‐ceto interacciona con Arg611 y Gln570, el 11β‐OH con Asn564, el 17α‐OH con Gln642, el 21‐OH con Asn564 y el 20‐ceto con Thr739. Es importante destacar que el LBP no es una cavidad rígida, las cadenas laterales de los residuos que lo conforman pueden cambiar la orientación de manera de acomodar grupos voluminosos presentes en el esteroide. Ejemplo de ello son el modo de unión de RU486 [93], del cortivazol [94] y del furoato de fluticasona [95]. En todos estos casos la flexibilidad del receptor permite que ingresen grupos laterales voluminosos. 2.3.3.2 Región AF‐2 La región AF‐2 comprende el hueco hidrofóbico en la superficie del receptor, formado por las hélices H3, H4 y la hélice C‐terminal H12 (figura 11A). En presencia de ligandos agonistas, la 34
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región AF‐2 adopta una conformación capaz de unir coactivadores de la familia p160. Estos coactivadores poseen dos o más motivos LLxxL (L=leucina, x=cualquier aminoácido) en forma de hélice, de manera que las leucinas no polares se orientan hacia un mismo lado, correspondiente al hueco no polar AF‐2. Aparte de esta conformación, hay una interacción electrostática denominada “charge clamp” entre las cadenas laterales de los aminoácidos polares del receptor y el coactivador (figura 11B), interacción que ayuda a mantener estable el contacto coactivador‐
GR LBD [70]. Por otro lado, los corepresores como NCoR contienen tres dominios de interacción caracterizados por la secuencia consenso (I/L)xx(I/V)I (I=isoleucina, V= valina). Estudios mutacionales sugieren que tanto coactivadores como corepresores comparten la zona de unión al GR [96]. De hecho, recientemente se ha cristalizado y caracterizado la estructura del GR LBD unido al antagonista RU486 y el corepresor NCoR [97], mostrando que ambos cofactores (TIF2 y NCoR) se unen efectivamente al mismo sitio del receptor. Figura 11. Región AF‐2 del GR LBD. A. Dentro del LBD se muestra el Dominio AF‐2 (amarillo) y el péptido correspondiente al coactivador TIF2 (violeta). B. Los residuos polares del GR LBD (verde) interaccionan electroestáticamente con el péptido correspondiente al coactivador TIF2 (violeta) formando el charge clamp (pdb:1m2z). 2.3.3.3 Región de dimerización Varios aspectos fundamentales sobre la homodimerización del GR permanecen aún desconocidos, como se discutirá en mayor profundidad más adelante. En lo que se refiere al contacto proteína‐proteína entre monómeros se sabe que, además del domino de unión al ADN, el LBD participa directamente [73]. De acuerdo con la estructura cristalina del dímero de GR LBD‐
dex (pdb:1m2z), el contacto entre monómeros ocurre a través de dos regiones distantes de la proteína (figura 12). Por un lado, dos residuos no polares de un monómero, Pro625 e Ile628, los 35
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cuales forman la lámina β ubicada entre las hélices H6 y H7, contactan con los mismos residuos del otro monómero formando así un núcleo hidrofóbico. Por otro lado, cuatro de los residuos polares del loop H1‐H3 de cada monómero interactúan a través de cuatro puentes de hidrógeno, formando una estructura pseudo anti‐lámina β entre monómeros. Todavía queda por demostrar si estas interacciones observadas representan la interfase de dimerización fisiológica, especialmente en contexto con la región de dimerización del DBD [70]. Sin embargo, la relevancia funcional de este modo de dimerización del GR LBD, el cual difiere respecto del de otros receptores nucleares como ER, RXR o PR, ha sido demostrada por estudios mutacionales [73,98]. Figura 12. Interfase de homodimerización del GR LBD. Residuos de la lámina βA de cada monómero forman un núcleo hidrofóbico mientras que residuos del loop H1‐H3 de cada monómero interaccionan por puentes de hidrógeno (pdb:1m2z). 2.4 Ensamblado del heterocomplejo GR ‐ Hsp90 La Hsp90 es una proteína conservada y esencial en células eucariotas. Si bien es inducida por estrés, es una proteína abundante (1‐2% de las proteínas citosólicas) y realiza numerosas funciones de mantenimiento o housekeeping en células que no se encuentran bajo situación de estrés [99]. Esta chaperona regula el correcto plegado, tráfico, activación transcripcional, reciclado y degradación de varios factores de transcripción, entre ellos, los receptores de esteroides [100]. La unión de la Hsp90 al GR es necesaria para que el mismo sea capaz de unir ligando [101,102]. Dicha unión es el resultado de una acción coordinada de varias proteínas que forman un heterocomplejo con el GR, específicamente con el LBD del receptor. De esta manera, se 36
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induce una conformación en el dominio de unión a ligando tal que éste sea capaz de unir hormona. Una vez que el ligando se une al receptor, el “bolsillo” que une a la hormona se cierra, lo que genera la pérdida de la capacidad del GR de formar complejos persistentes con la Hsp90. El GR unido al ligando se encontraría transformado o activado, siendo así capaz de translocar al núcleo y regular la expresión génica [99]. El ensamblado del heterocomplejo GR – Hsp90 involucra múltiples procesos, que se esquematizan en la figura 13, y se explican a continuación. Figura 13. Modelo de ensamblado del heterocomplejo del GR. Las chaperonas Hsp90/Hsp70 transforman el LBD del GR desde una conformación incapaz de unir hormona (hendidura cerrada) hacia una conformación donde el sitio de unión es accesible para el esteroide (hendidura abierta). Hop se une a Hsp90 y a Hsp70 a través de los dominios TPR para formar el complejo de chaperonas (paso 1). El complejo formado por Hsp90‐Hop‐Hsp70‐
Hsp40 contiene todos los componentes necesarios para abrir la hendidura, proceso que es dependiente de MgATP y K+ (paso 2). Cuando la hendidura se abre, la Hsp90 se encuentra en su estado conformacional dependiente de ATP, el cual es dinámicamente estabilizado por p23. Por otro lado, Hop es liberado de la Hsp90. Por lo tanto, el complejo mostrado al final del paso 2 representa una composición de varios cambios que ocurren en forma dinámica. Posteriormente a la salida de Hop, una inmunofilina (IMM) puede unirse al único sitio aceptor de TPR que existe en el dímero de Hsp90, formando el heterocomplejo final. Los sitios TPR de Hop y de la inmunofilina están indicados en negro. La Hsp70 abandona el complejo intermediario durante el ensamblado, y las líneas punteadas para la Hsp70 ilustra que la misma se encuentra en relación subestequiométrica con respecto al receptor. Adaptado de Pratt y colaboradores [99]. La Hsp90 y la Hsp70 son las proteínas principales en el proceso de formación del heterocomplejo [99]. Ambas son chaperonas que poseen un sitio de unión a nucleótidos. En cada una de ellas, la conformación que adquieren cuando tienen unido ATP provoca una menor 37
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afinidad con péptidos hidrofóbicos. Por el contrario, cuando se hidroliza el ATP por una actividad ATPasa intrínseca de la chaperona, se produce un cambio conformacional que les confiere mayor afinidad por la unión a dichos péptidos, actividad que les permite reconocer proteínas mal plegadas [103,104]. La conformación de la Hsp90 cuando tiene unido ATP es necesaria para la formación del heterocomplejo, ya que el uso del inhibidor específico Geldanamicina, el cual previene que la chaperona adopte dicha conformación, impide la formación de complejos maduros GR‐Hsp90 [105]. Sin embargo, este inhibidor no previene la transformación dependiente de ligando en complejos pre‐formados [106]. La función de ATPasa de ambas chaperonas está regulada por co‐chaperonas, como la Hsp40 [99]. El modelo actual propone que Hsp40 facilita la interacción GR‐Hsp70 [107] y al mismo tiempo acelera la hidrólisis del ATP unido a esta última chaperona. Esto resulta en la unión estrecha entre Hsp70 y el GR [108], facilitando así la unión del siguiente componente del complejo, la proteína Hop (Hsp organising protein) [99]. Esta proteína es considerada como un adaptador que une a los dos componentes principales del complejo: dos moléculas de Hsp90 y una de Hsp70 por molécula de receptor [109] (paso 1 de la figura 13). Hop contiene 2 dominios TPR (tetratricopeptid repeat) que funcionan como sitios de unión a proteínas, mientras que Hsp90 contiene un sitio aceptor de TPR en su región C‐terminal. Como se indica en la figura 13, la unión del complejo Hsp90‐Hop‐Hsp70‐Hsp40 al GR induce un cambio conformacional en el receptor, confiriéndole la capacidad de unir hormona. Este proceso es dependiente de Mg2+ y ATP así como del ión K+ [110,111] (paso 2 de la figura 13). El cambio conformacional producido en la Hsp90 permite que la proteína p23 se una al complejo, estabilizándolo. Posteriormente, Hop y Hsp70 se disocian del complejo, aunque esta última lo hace en forma variable (indicado con las líneas punteadas en la figura 13). El sitio aceptor de TPR en la Hsp90 (que quedó libre luego de la disociación de Hop) es ocupado por alguna inmunofilina, formando el heterocomplejo final [99]. Las inmunofilinas (IMM) son proteínas conservadas que unen drogas inmunosupresoras como FK506, rapamicina, y ciclosporina A. Las IMM tienen actividad de peptidil‐prolil isomerasas (PPIasa), ya que catalizan la isomerización cis‐trans de prolinas, permitiendo así el correcto plegado de muchas proteínas [112]. Se han encontrado varias IMM asociadas al complejo GR – Hsp90, como por ejemplo FKBP52, FKBP51, CyP‐40 y PP5 [113]. La relevancia de las IMM se desarrollará en la próxima sección. 38
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2.5 Translocación del GR al núcleo En ausencia de hormona, los SR se mueven constantemente entre el núcleo y el citoplasma, un proceso conocido como shuttling. Dependiendo del tipo de receptor, su localización en el estado de equilibrio puede llegar a ser mayoritariamente citoplasmática o predominantemente nuclear [114]. En general, mientras que en ausencia de ligando el ER [115] y el PR [116] son preponderantemente nucleares, el GR, MR y el AR se localizan mayormente en citoplasma [74,117‐119]. Sin embargo, la localización puede depender a su vez del tipo celular. Por ejemplo, el GR de ratón expresado en células L mantiene una localización predominantemente citoplasmática, mientras que en células de ovario de hámster se encuentra en núcleo, aún en ausencia de ligando [120]. Los mecanismos que controlan la distribución intracelular de los SR en ausencia de ligando aún se desconocen [112]. Luego de la unión al ligando, el receptor de glucocorticoides transloca al núcleo donde actúa como factor de transcripción [121]. Si bien existen decenas de trabajos concernientes al transporte retrógrado del GR, el mecanismo de translocación todavía no se encuentra completamente dilucidado. El modelo clásico establece que la unión de la hormona induce la separación entre el GR y el heterocomplejo de chaperonas, resultando en un cambio conformacional que desenmascara la señal de localización nuclear que ocultaba la unión con la Hsp90, promoviéndose así el movimiento hacia el núcleo [121]. Sin embargo, se ha propuesto otro modelo en donde este proceso también es controlado por el heterocomplejo de chaperonas. De acuerdo a este nuevo modelo, la unión del ligando al receptor desencadena la transformación del GR LBD a un estado en donde la interacción con el heterocomplejo de chaperonas se hace más dinámica, asociándose y disociándose de la Hsp90 y de las inmunofilinas. Estas últimas unirían al complejo del GR con las proteínas motoras responsables del transporte retrógrado [99]. Las inmunofilinas se encuentran unidas por su dominio TPR a la Hsp90 (con estequiometria 1:1), formando un puente entre el complejo del receptor y la dineína, responsable del transporte retrógrado de vesículas y organelas a través de los microtúbulos [122]; permitiendo así el transporte del GR hacia el núcleo [112]. Debido a la naturaleza dinámica de la asociación/disociación del complejo, el GR activado se unirá y liberará de las proteínas motoras, generando un patrón de movimientos discontinuos, como los que se observan en las vesículas que viajan por microtúbulos [99]. En este contexto, el rol de la Hsp90 en el movimiento 39
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del receptor (una vez que éste se une a su ligando) consiste en un incremento de la frecuencia de asociación (vía la inmunofilina) con el sistema de movimiento retrógrado [123]. En ausencia de hormona, el heterocomplejo se encuentra mayormente asociado a la inmunofilina FKBP51, que es incapaz de unir dineína. El primer evento que ocurre luego de la unión del ligando al receptor es el intercambio de FKBP51 por FKBP52 (capaz de unir dineína) en el heterocomplejo. Este cambio es el que permitiría que dicho complejo se una a las proteínas motoras, y viaje a través de los microtúbulos hacia el núcleo [124]. Existen varias evidencias a favor y en contra de estos dos modelos. Por un lado, el bloqueo de FKBP52 mediante anticuerpos intracelulares disminuye la velocidad de translocación del GR [125]. A su vez, FKBP52 coinmunoprecipita con dineína y si bien la mayor parte de esta IMM se encuentra en núcleo, la fracción citoplasmática colocaliza con microtúbulos [126]. Por último, el movimiento entre el citoplasma y el núcleo del GR es bloqueado cuando se expresa dinamitina, proteína que disocia la dineína de sus proteínas cargo [127]. Estos resultados son compatibles con la hipótesis de que el GR se mueve a través del sistema de microtúbulos [128]. Por otro lado, la inhibición de la Hsp90 con geldanamicina, si bien retrasa la translocación del GR, no la detiene por completo [129]. Esto resultados sugieren mecanismos alternativos de transporte a los mediados por el complejo Hsp90‐IMM. Más aún, en ausencia total de la red de microtúbulos, el complejo ligando‐GR es capaz de translocar completamente al núcleo [125], e incluso activar la transcripción de genes [130]. Como veremos en la próxima sección, todavía no es claro si el GR transloca a través del poro nuclear previa o posteriormente a la disociación del complejo con Hsp90. Aunque la Hsp90 fusionada a una señal de localización nuclear (NLS) promueve la acumulación del GR en núcleo en ausencia de hormona [131], se propone que los complejos GR‐Hsp90 son bioquímicamente inestables, es decir, altamente dinámicos. Esto genera la pregunta de cómo inmunofilinas como FKBP52 pueden promover el transporte activo [128]. El ión molibdato, el cual estabiliza el complejo GR‐Hsp90 impide la translocación del receptor, corroborando que es necesaria una relación dinámica entre estas moléculas para que ocurra el transporte retrógrado [112]. Por otro lado, además de la unión a través de la Hsp90, existen evidencias que apoyan la idea de que FKBP52 se une directamente al GR [132], lo cual podría generar otro medio alternativo de transporte. En conclusión, es altamente probable que el GR transloque al núcleo a través de múltiples mecanismos (figura 14), tomando ventaja de la naturaleza dinámica en la interacción con el heterocomplejo de chaperonas. Así, cuando se encuentra fuera del mismo, el GR puede 40
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interactuar con importinas a través de su NLS [133,134], mientras que durante la interacción transitoria con Hsp90, se moviliza a través de la red de microtúbulos [99]. Figura 14. Mecanismos posibles de translocación del GR. En ausencia de ligando el complejo GR‐Hsp90 contiene principalmente la inmunofilina FKBP51. En presencia de hormona, FKBP51 es reemplazada por FKBP52, la cual se asocia con dineína, mediando el transporte activo del complejo a través de la red de microtúbulos (MT). Es posible que el transporte se realice en ausencia de Hsp90, ya sea mediado por microtúbulos vía FKBP52, o bien a través del sistema de importinas. C= citoplasma; N= núcleo. Adaptado de Grad y Picard [128]. 2.6 Pasaje del GR a través del poro nuclear En las células eucariotas, el núcleo está separado del citoplasma por la doble membrana nuclear. El pasaje de macromoléculas, desde o hacia el núcleo, se realiza exclusivamente a través de un complejo multiproteico denominado complejo del poro nuclear (NPC, Nuclear Pore Complex). El transporte a través del poro se realiza gracias a la difusión facilitada mediada por receptores llamados exportinas e importinas [135]. En el caso de proteínas que poseen una señal de localización nuclear (NLS, nuclear localization signal), como por ejemplo los receptores de esteroides, dos importinas están involucradas en la entrada al núcleo. La importina α es el receptor de la NLS, y se une a la importina β, la cual interactúa con las nucleoporinas (integrantes del NPC) para atravesar el poro 41
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[112]. La unidireccionalidad del pasaje involucra la participación de una proteína perteneciente a la familia de las pequeñas proteínas G llamada Ran, la cual une nucleótidos de guanina. Un factor intercambiador de nucleótidos llamado RanGEF se encuentra dentro del núcleo y facilita la unión de Ran a GTP, mientras que en el citoplasma RanGAP (GTPasa activating protein) hidroliza a RanGTP convirtiéndola en Ran‐GDP. De esta manera, se genera un gradiente Ran‐GDP – Ran‐GTP desde el citoplasma al núcleo respectivamente. Como Ran‐GTP pierde afinidad por el cargo de la importina, esto permite la unidireccionalidad del pasaje a través del poro [135]. En el caso de la exportación del receptor desde el núcleo, las exportinas como por ejemplo CRM1 reconocen señales de exportación (NES) y el transporte a través del poro se regula de manera inversa a través de Ran [112]. A diferencia del pasaje de proteínas hacia mitocondria u otras organelas, donde se requiere que las mismas estén desplegadas para pasar; las proteínas que viajan hacia el núcleo pueden hacerlo en un estado plegado, dado que el poro nuclear permite el pasaje de complejos de hasta 3 MDa [136]. Con respecto al GR, como se mencionó previamente, en su estructura se han identificado dos señales de localización nuclear: NLS1, en la región C‐terminal del DBD, reconocida por la importina α; y la NLS2, que comprende una región poco definida dentro del LBD [74]. Actualmente se acepta que la importación nuclear del GR es mediada por la vía clásica que involucra a la importina α [137]. Sin embargo, también se ha postulado la existencia de un mecanismo independiente [138]. Dada la naturaleza dinámica del heterocomplejo GR – Hsp90, es posible que este complejo se disocie antes de pasar por el poro, para luego reasociarse una vez dentro del núcleo. No obstante, existen evidencias experimentales que sugieren que el GR atravesaría el poro nuclear como un heterocomplejo con Hsp90 [131,139]. De hecho, recientemente se ha demostrado que la importina β y la glicoproteína integral del poro nuclear Nup62 interactúan con Hsp90, Hsp70, p23, FKBP52 y PP5 [140]. Más aún, en el mismo trabajo se logró atravesar el heterocomplejo GR‐Hsp90 (unido covalentemente) desde el núcleo al citoplasma. En conjunto, existen evidencias que sugieren la posibilidad de que el GR atraviesa el poro en forma de heterocomplejo [112]. 2.7 Mecanismo de acción del GR El GR regula la expresión de cientos de genes, positiva o negativamente, dependiendo del contexto y del tipo celular. Esta variedad de acciones resulta de un complejo mecanismo de 42
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acción, el cual se encuentra aún lejos de ser completamente dilucidado [141]. En el intento por comprender el accionar de este receptor, es natural el dividir, separar o clasificar sus actividades en diferentes modos y mecanismos de acción, simplificando de esta manera su estudio. Sin embargo, solamente una visión analítica global y holística nos permitirá comprender las bases completas de acción de los glucocorticoides. En las próximas secciones se intentará resumir algunos de los conocimientos adquiridos sobre las bases moleculares de acción del GR. Para ello, dividiremos sus mecanismos de acción en tres modos principales. En primer lugar, sus efectos directos como factor de transcripción, ya sea regulando positiva o negativamente la expresión génica. En segundo lugar, su acción mediada por la interacción directa o indirecta con otras proteínas, en general modulando la actividad de otros factores de transcripción. Por último, se presentarán algunas evidencias con respecto a los llamados efectos no genómicos de los glucocorticoides. 2.7.1 El GR como factor de transcripción Como se mencionó anteriormente, una vez dentro del núcleo el complejo ligando‐GR puede unirse como homodímero a sitios GRE presente en los promotores de sus genes blanco. Si bien algunos genes contienen en sus promotores elementos GRE, suficientes para obtener una respuesta glucocorticoide (figura 15A); en otros, la respuesta no sólo depende de que el GR se una a un determinado GRE, sino que además requiere de la unión adyacente de otros factores de transcripción, lo que se define como una unidad de respuesta a glucocorticoides (GRU) (figura 15B) [142]. Más aún, también se han descripto los llamados sitios 1/2GRE, que consisten justamente en la mitad de la secuencia completa de reconocimiento, en donde el GR se uniría como monómero [143]. A pesar que estos sitios no son suficientes para dar una respuesta, su combinación con factores adicionales, otros GREs, o incluso múltiples 1/2GRE pueden dar lugar a una respuesta glucocorticoide (figura 15c) [142]. Todavía no se comprende en su totalidad como la unión del GR al GRE promueve la transcripción génica [144]. Necesariamente la maquinaria basal de transcripción, entre ellos la ARN polimerasa II y los factores generales de la transcripción, deben ser reclutados al promotor [145]. En este sentido, se ha descripto la interacción entre el dominio AF‐1 del GR y los factores basales TFIID y TBP [79‐81]. Además, la actividad transcripcional del GR depende de coactivadores que remodelan la cromatina [146]. Dentro de los coactivadores esenciales para la 43
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transcripción, CBP y p300 poseen actividad de acetiltransferasas de histonas (HAT), lo cual relaja la cromatina y aumenta la transcripción. Estos coactivadores interactúan en forma directa con el dominio AF‐1 del GR, e indirectamente con el dominio AF‐2, a través del coactivador SRC1/NCoA‐
1, miembro de la familia de coactivadores p160 [144]. Entre los miembros de esta familia también se destacan GRIP1/TIF2/NcoA‐2 y RAC3/NcoA3, que también interactúan con el GR, pero discutiremos su papel en detalle más adelante. Finalmente, el GR también interactúa con BRG‐1, el cual remueve la histona H1 de la cromatina, permitiendo que factores basales como TBP y NF‐1 accedan al ADN [147,148]. Figura 15. El GR como factor de transcripción. En forma directa, el GR puede activar la transcripción de genes uniéndose directamente a sitios GRE, lo cual puede ser suficiente para activar la transcripción (A) o bien puede necesitar de factores de transcripción adicionales, en los llamados unidades de respuesta a glucocorticoides (B). Además, se puede unir como monómero a sitios 1/2GRE (C). Por otro lado, el GR puede inhibir la expresión génica ya sea uniéndose a sitios nGRE (D), o bien compitiendo por la unión al ADN con otros factores de transcripción, necesarios para la actividad transcripcional (E). Adaptado de Schoneveld y colaboradores [142]. Además de aumentar la transcripción génica, el GR como factor de transcripción también es capaz de reprimir genes. Los elementos de respuesta a glucocorticoides que regulan en forma negativa la transcripción se denominan nGRE (negative GRE), aunque su secuencia es demasiado heterogénea como para definir un consenso [144]. En este modo de acción, el GR se une en forma directa al elemento de respuesta, promoviendo la represión génica directamente (figura 15D), o previniendo la unión de otro factor de transcripción necesario para la inducción transcripcional (figura 15E) [142]. A pesar de que la gran mayoría de los estudios sobre los mecanismos de acción del GR como factor de transcripción se han realizado sobre sitios GRE, estudios recientes han mostrado que, sorprendentemente, solo una pequeña proporción de los genes directamente regulados por 44
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glucocorticoides poseen dicho sitios dentro de las 10 kb de su secuencia promotora [149‐151]. Esto sugiere que la gran mayoría de los genes blanco de glucocorticoides responden a otros tipos de mecanismos regulatorios [152]. 2.7.2 El GR como modulador de otros factores de transcripción Además de su acción directa como factor de transcripción, el GR es capaz de interactuar con otras proteínas, modulando su función. Por ejemplo, se ha descripto que el GR regula la actividad de NFκB, AP‐1, PU.1, Smad3,4, T‐bet, Oct 1/2, STAT6, STAT5, IRF3, COUP‐TFII, NGFI‐
B/NuR77, CREB, entre otros [152,153]. Esta modulación puede ser tanto positiva (por ejemplo con STAT5) como negativa (por ejemplo con NFκB), y a su vez puede depender tanto del tipo como del contexto celular [153]. En términos generales, se acepta que el GR interactúa en forma de monómero con las proteínas que modula, sin contacto directo de éste con el ADN (figura 16) [152]. Varios estudios mutacionales indican que la región responsable en la interacción proteína‐proteína es ‐
paradójicamente ‐ el GR DBD, independientemente de su capacidad de unir ADN [153]. Por otro lado, estudios recientes también proponen que el contacto entre el GR y el factor modulado podría ser indirecto, mediado por al menos una tercer proteína. Al menos para el caso de AP‐1 y NFκB, se ha identificado a nTRip6 como componente esencial en el cross‐talk con el GR [154]. Figura 16. El GR como modulador de otros factores de transcripción. El GR puede interactuar con otros factores de transcripción, modulando la actividad de los mismos, ya sea positiva o negativamente. RE del FT = elemento de respuesta del factor de transcripción (modulado por el GR). En los casos en los que el GR promueve un aumento en la actividad transcripcional de un FT, se cree que este lo hace actuando como un coactivador del mismo [153]. En particular, para COUP‐TFII, el GR aumenta su actividad transcripcional en forma dependiente de su dominio de activación AF‐2 [155]. Similarmente, el LBD/AF‐2 también podría ser responsable de la modulación positiva sobre STAT5, al menos cuando el GR se encuentra sobreexpresado [156]. 45
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En los casos en que el GR modula negativamente a otros FTs, los mecanismos parecen ser más variables y complejos. Los primeros estudios proponían el secuestro del FT por el GR, impidiendo así la unión del mismo al ADN. Si bien esta hipótesis presentó evidencias a favor y en contra en modelos experimentales in vitro, posteriormente se descartó esta posibilidad de acuerdo con estudios in vivo, por lo que actualmente se considera que el GR no inhibe la unión al ADN del FT modulado [153]. Otra propuesta fue la inhibición del reclutamiento de coactivadores al FT provocado por el GR. Un ejemplo es el reclutamiento de p65 (componente de NFκB) como coactivador del factor de transcripción IRF3. De esta manera, el GR al secuestrar a p65, reprime la actividad de IRF3 [157]. Por otro lado, existen también evidencias que sugieren que coactivadores del GR podrían estar mediando su modulación negativa. Por ejemplo, la sobreexpresión de GRIP1/TIF2 aumentaría la capacidad del GR de inhibir a AP‐1 y NFκB [158,159]. Además, este cofactor presenta actividad de corepresor cuando es reclutado por el GR al promotor de colagenasa‐3 dependiente de AP‐1 [160]. De hecho, si bien se ha demostrado que GRIP1 es un corepresor del factor MyoD [161], mutaciones en el GR LBD que impiden la interacción del GR con GRIP1 todavía permiten la modulación de AP‐1 y de NFκB [162,163], aunque en rigor no se descarta la posibilidad de que el reclutamiento en el contexto del cross talk ocurra a través de una región alternativa [153]. Algunas evidencias sugieren como parte del mecanismo de represión la participación de factores remodeladores de la cromatina, un ejemplo de ello fue la demostración de la necesidad del complejo SWI/SNF en la acción inhibitoria de GR sobre la actividad transcripcional de NFκB y NGFI‐B/NuR77 [164,165]. Además, también se ha propuesto que corepresores como las HDACs podrían estar involucrados en el mecanismo de acción del GR como moduladores negativos, si bien su grado de participación en ese proceso todavía es motivo de debate [153]. Finalmente, en su conjunto, muchas evidencias apoyan la idea de que el GR reprime la transcripción mediante mecanismos diversos que dependen de la proteína cuya actividad este siendo modulada. En el caso particular de NFκB, se ha demostrado que el GR no inhibe el reclutamiento de la ARN pol II a los promotores blanco de dicho FT, sino que inhibe la fosforilación de la serina 2 de la CTD de la Pol II [166,167], la cual regula la iniciación y elongación de la transcripción [168]. Por otro lado, la inhibición de NGFI‐B/NuR77 por el GR involucraría la disminución del reclutamiento de la ARN pol II al promotor de sus genes blanco [164]. 46
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2.7.3 Efectos no genómicos A los llamados efectos no genómicos se los definió históricamente como aquellos efectos rápidos (segundos‐minutos) que los glucocorticoides ejercen, independientemente de la acción del GR como factor de transcripción [169]. En la actualidad se reconocen al menos tres mecanismos (figura 17). Figura 17. Efectos genómicos y no genómicos de los glucocorticoides. Los efectos genómicos de los glucocorticoides (GC) incluyen todos aquellos en donde el GR actúa como factor de transcripción, ya sea a través de su unión a elementos de respuesta positivos (pGRE), negativos (nGRE) o mediante la modulación de otros factores de transcripción (TF). Se los caracteriza como lentos, debido a que usualmente es necesaria la síntesis de ARNm y proteínas. En contraposición, los efectos no genómicos, rápidos, independientes de la síntesis de proteínas, pueden ocurrir ya sea en ausencia de receptor, o a través de la unión al receptor citoplasmático (cGR) o de membrana (mGR). Adaptado de Löwenberg y colaboradores [170]. Un primer mecanismo involucra la acción directa de altas concentraciones de glucocorticoides, independientemente de la unión a su receptor [171], a través de su interacción con membranas celulares. Ejemplos del mismo son la modulación del transporte de cationes a 47
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través de la membrana plasmática o el incremento en la filtración de protones en la membrana mitocondrial, que lleva a una disminución en la producción de ATP. Estas acciones sobre células del sistema inmune contribuirían a los efectos inmunosupresores y antiinflamatorios de los glucocorticoides [7,172]. Un segundo mecanismo involucra la unión de los glucocorticoides a un receptor específico de membrana (mGR). La existencia de ese receptor se ha demostrado por primera vez en neuronas de anfibios [173], y posteriormente en células de linfoma [174] y mononucleares periféricas humanas [175]. Existen evidencias que apoyan la idea de que este receptor no es simplemente una fracción del GR que se transporta a la superficie celular, sino que es una variante producto de splicing alternativo o uso alternativo de promotores [176]. El origen del mGR aún es desconocido [171], aunque su expresión se la ha asociado a una variante transcripcional del receptor, la cual codificaría tanto para la versión citoplasmática como para la asociada a membrana [177]. Todavía no existe ninguna evidencia de algún camino de señalización específico asociado a este receptor [178]. Por último, se han descripto algunos efectos no genómicos asociados al propio GR. Por ejemplo, se ha documentado una interacción directa entre el GR y JNK, explicando al menos en parte el efecto rápido (no genómico) de los GC sobre este camino de señalización [179]. Por otro lado, como mencionamos anteriormente, frente a la unión del ligando el GR se disocia o al menos intercambia ciertas proteínas del heterocomplejo citoplasmático. En este sentido se ha descripto que la liberación de algunas de estas proteínas es en parte responsable de algunos efectos no genómicos del GR [171]. En particular, se ha encontrado que una fracción del GR (en ausencia de ligando) se encuentra asociado al receptor TCR en células T, lo cual resulta esencial para su correcta señalización. La unión de los glucocorticoides al GR produce la disociación de éste con el TCR, inhibiendo la señalización del mismo [170]. Finalmente, se ha descripto que el receptor, además de migrar al núcleo en presencia de ligando, puede también translocar a la mitocondria [180‐183]. Aparentemente esta translocación podría tener una función relevante en la apoptosis mediada por glucocorticoides [184]. 48
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2.8 Especificidad de acción Además de los mecanismos recientemente descriptos que median la acción del GR, otros dos aspectos fundamentales de este receptor aportan a la especificidad dependiente del tejido blanco de la acción glucocorticoide. Estos son la expresión específica de diferentes isoformas del GR y la presencia de cofactores específicos en cada tipo celular. 2.8.1 Isoformas del GR El GR humano está codificado por el gen NR3C1, localizado en el cromosoma 5q11‐q13. Este gen posee al menos tres promotores alternativos y 9 exones, de los cuales solo el primero no es codificante [185]. Como resultado del splicing alternativo del último exón se generan dos proteínas, el GRα, más abundante y descripto anteriormente, y una variante denominada GRβ. Estas dos isoformas poseen idénticos dominios AF‐1 y DBD, diferenciándose únicamente en el dominio LBD. El GRβ es una proteína más corta que GRα (742 residuos contra 777 residuos), siendo los 15 residuos finales exclusivos para la isoforma β (figura 18A). Inicialmente se había informado que GRβ no unía ligando y que regulaba la expresión génica solamente inhibiendo la acción de GRα, comportándose como un dominante negativo [186,187]. Sin embargo, datos recientes muestran que la sobreexpresión de GRβ, en ausencia de GRα, puede regular la expresión de genes y además es capaz de unir al ligando RU486 [188]. Los niveles relativos de expresión de estas dos isoformas, diferentes en cada tipo celular, constituyen un mecanismo que aporta a la especificidad de respuesta glucocorticoide [189]. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo adicional que genera diversidad al GR: la traducción de su transcripto maduro puede iniciarse en sitios alternativos, codones AUG internos, generándose distintas isoformas de traducción que sólo difieren en la longitud del dominio N‐terminal AF‐1 (figura 18B). Estudios realizados en ratón y rata muestran que el nivel de expresión de estas isoformas depende claramente del tejido analizado, y que cada isoforma regula de manera particular la expresión génica del tejido [189]. 49
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Figura 18. Isoformas del GR. A. El GR humano (hGR) se localiza en el cromosoma 5 y por splicing alternativo del exón 9 presenta dos isoformas: el GRα‐A y el GRβ‐A, las cuales solo difieren en su dominio C‐terminal. B. La iniciación alternativa de la traducción en codones AUG internos produce isoformas que difieren en el N‐terminal, denominadas GRα‐B, GRα‐C1, GRα‐C2, GRα‐C3, GRα‐D1, GRα‐D2 y GRα‐D3, las cuales comienzan en las metioninas 27, 86, 90, 98, 316, 331 y 336, respectivamente. A excepción de las isoformas D, cuya localización es constitutivamente nuclear, todas las demás de localizan en citoplasma en ausencia de ligando. Adaptado de Gross y Cidlowski [189]. 2.8.2 Expresión de cofactores El término de cofactores agrupa a una serie de proteínas que modulan la actividad transcripcional de diferentes factores de transcripción, entre los que se encuentran los NRs. En términos generales, los cofactores son enzimas que median, principalmente a través de la reorganización de la cromatina, la señal entre el receptor unido al ADN y la maquinaria transcripcional. Los cofactores se clasifican como coactivadores o como corepresores, dependiendo de su acción sobre el proceso de transcripción. Los coactivadores son un grupo de proteínas estructural y funcionalmente muy diversas, presentando varias actividades que tienen 50
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un impacto directo sobre la estructura de la cromatina y la accesibilidad de la ARN polimerasa II al ADN, incluyendo actividad acetiltransferasa de histonas, metiltranferasa de histonas o remodelación dependiente de ATP, entre otras. Esto conduce finalmente al remodelamiento de la cromatina y la subsiguiente activación de la transcripción [190,191]. En cambio, los corepresores son proteínas que generalmente poseen actividades opuestas a la de los coactivadores, resultando en una compactación de la cromatina, con la consecuente inhibición de la transcripción [190]. Se han descripto más de cien cofactores distintos para los NRs [22], siendo su expresión dependiente del tipo celular. Además, la mayoría de estos cofactores no son específicos de un dado receptor sino que regulan la actividad de diversos NR y/o de otros factores de transcripción [192], siendo entonces elementos fundamentales de la regulación de la expresión génica. El nivel de expresión y de actividad de un dado cofactor depende del tipo de tejido y del contexto celular [191]. Así, el control espacial y temporal de los niveles de coactivadores activos constituye un mecanismo de la especificidad de respuesta de los NR. Para el GR se conocen varias familias de coactivadores que interaccionan directamente con el receptor. Algunos interaccionan con el dominio AF‐1, como BRG1 (SWI/SNF), o P/CAF (ADA/SAGA), mientras que otros lo hacen con el LBD, como los miembros de la familia p160. Esta familia contiene tres miembros, SRC‐1/NCOA‐1, GRIP1 (TIF2, NCoA‐2) y p/CIP (RAC3, AIB1, ACTR, TRAM1, NCoA‐3) [193,194], que ‐ como se mencionó anteriormente ‐ poseen motivos LxxLL repetidos, adecuados para la unión al dominio AF‐2 del LBD. Dado que todos estos coactivadores, además de unirse al GR, poseen la capacidad de interaccionar entre sí, existe comunicación indirecta entre los dominios AF‐1 y AF‐2 del receptor [190,192]. Por otro lado, dentro de los corepresores del GR, podemos mencionar a NCoR o SMRT, que interactúan directamente con el GR LBD [96]. 2.9 El modelo disociado 2.9.1 Transactivación vs transrepresión A pesar de la compleja red de interacciones que media la acción de los glucocorticoides, en muchos ámbitos todavía se acepta un modelo extremadamente simplificado de cómo el receptor regula la expresión génica. Este modelo, que llamaremos modelo disociado, establece la existencia de dos grandes mecanismos de acción por los cuales el GR actúa: un mecanismo llamado directo y otro, indirecto. El mecanismo directo, denominado históricamente 51
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proceso de transactivación (que en rigor debería llamarse cis‐activación) comprende la inducción de la expresión génica como producto de la unión del homodímero de GR a sitios GRE presentes en los promotores de los genes blanco. Por otro lado, en el modo indirecto, denominado proceso de transrepresión, el complejo ligando‐receptor, como monómero, inhibe la expresión de genes activados por otros factores de transcripción, como NFκB o AP‐1 [141,195,196]. Desde un punto de vista clínico/farmacológico, generalmente se acepta que los genes regulados por el mecanismo de transactivación están asociados a los efectos metabólicos de los glucocorticoides (clínicamente considerados efectos adversos indeseables), mientras que los genes regulados por transrepresión se asocian a efectos antiinflamatorios e inmunosupresores (efectos benéficos) (figura 19A) [141]. Este paradigma se estableció en la comunidad científica principalmente a partir de la caracterización del mutante A458T del hGR, también conocido como GRdim. Este receptor, supuestamente incapaz de homodimerizar1; tiene efecto transrepresor sobre los factores de transcripción AP‐1 y NFκB, pero no transactiva a genes regulados por sitios GRE [197,198]. Estudios realizados sobre un ratón knock‐in para esta mutante revelaron que algunos de los efectos inmunomoduladores de los glucocorticoides se mantienen, mientras que la inducción de ciertos genes involucrados en procesos metabólicos no se producen [198‐200]. De esta manera, se estableció la idea de que, si una mutación puntual es capaz de producir un cambio en la estructura del receptor que lo hace disociar las acciones de transrepresión de las de transactivación, muy probablemente existan ligandos que también puedan lograrlo [141]. Bajo este supuesto, surge entonces el concepto de glucocorticoide disociado: un glucocorticoide capaz de activar la transrepresión pero no la transactivación del GR. Este ligando mantendrían así los efectos antiinflamatorios benéficos pero disminuiría o idealmente eliminaría los efectos adversos, siendo, desde el punto de vista farmacológico, el glucocorticoide ideal [35,201,202]. Si bien es cierto que muchos genes son regulados por alguno de estos dos mecanismos, hay muchos otros cuyo modo de acción no se corresponde con ninguno de ellos. En este sentido, existen numerosas evidencias del por qué el modelo disociado debe ser sustituido por un modelo más general e inclusivo de los diferentes mecanismos de acción de los glucocorticoides [12,141,203]. Además, la asociación de los efectos adversos a la transactivación y de los benéficos a la transrepresión no refleja con exactitud la situación general de la acción del GR, pues, aún si se aceptase que éstos fueran los únicos dos mecanismos de acción, existen tanto 1
La incapacidad de dimerización del GRdim se discutirá en detalle en la sección 2.10. 52
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genes involucrados en respuestas benéficas regulados por transactivación como genes de respuestas adversas por transrepresión [204] (figura19B). Figura 19. ¿El modelo disociado es disociado? Este modelo plantea que los efectos adversos de los glucocorticoides se encuentran asociados a la transactivación, mientras que los efectos benéficos a la transrepresión (A). Sin embargo, muchos genes regulados por transactivación contribuyen a los efectos benéficos y viceversa (B). Adaptado de Clark [141]. 2.9.2 Moduladores selectivos del GR La búsqueda de glucocorticoides disociados sigue siendo un objetivo principal, no sólo de varios grupos de investigación, sino también de la industria farmacéutica [35]. Sin embargo, el diseño de ligandos sintéticos como el RU24858, el ZK216348 y el AL‐438 también aporta evidencias contra el modelo disociado. A pesar de que estos ligandos cumplen los requisitos para ser consideraros como glucocorticoides disociados en ensayos in vitro, los estudios in vivo demostraron que ninguno logra alcanzar completamente la disociación entre efectos deseados y adversos [15]. Es probable que éstos y otros compuestos que originalmente fueron definidos como glucocorticoides disociados sean de hecho ligandos gen‐selectivos [205]. Este nuevo concepto se independiza estrictamente del modelo disociado, refiriéndose justamente a ligandos que activan y reprimen selectivamente un determinado grupo de genes. Dado que, como se mencionó anteriormente, los mecanismos de activación o represión génica mediados por el GR son muy heterogéneos, es lógico pensar que ligandos que promuevan y seleccionen ciertas conformaciones del receptor tiendan a favorecer algunos mecanismos de activación y/o represión génica en detrimento de otros. Algunos autores proponen que un estudio global de expresión génica revelará que muchos de los llamados ligandos disociados regulan diferencialmente a distintos genes, sin responder necesariamente a la dicotomía transactivación/transrepresión [35]. Por lo tanto, el diseño de nuevos ligandos del GR deberá considerar una evaluación detallada de qué tipos de conformaciones del receptor se relacionan con una determinada respuesta transcripcional [203]. 53
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El concepto de modulador selectivo surgió a partir del descubrimiento de que la actividad antiestrogénica del esteroide sintético, tamoxifeno, es dependiente del tipo de tejido. En epitelio mamario es un potente antiestrogénico [31,32], mientras que en el útero posee efectos estrogénicos. Esta actividad diferencial dependería de los factores reclutados a los distintos promotores blanco de la acción estrogénica en cada tipo celular. De esta manera, se lo ha definido con el término de modulador selectivo del ER (SERM)[61]. Este concepto rápidamente fue trasladado a otros receptores para finalmente ser adoptado para los NR en general (SNuRMs), y para el GR en particular (SGRMs), constituyendo actualmente un concepto fundamental para el diseño de nuevos ligandos esteroides [3]. 2.10 Dimerización y unión al ADN La formación de homodímeros GR‐GR es uno de los eventos clave en el mecanismo de transactivación, o mejor dicho, en el mecanismo de acción del GR como factor de transcripción [121]. Aunque se sabe que la dimerización del receptor está estrechamente relacionada a la etapa de unión del GR al ADN, muchos aspectos moleculares de estos procesos permanecen aún desconocidos. La gran mayoría de los estudios han sido realizados mediante técnicas in vitro, existiendo muy poca información acerca de la dimerización in vivo, la cual a su vez no resulta concluyente. Los primeros estudios sobre la dimerización del GR tuvieron lugar a fines de la década del ‘80 y principios de los ’90. Wrange y colaboradores, a través de estudios bioquímicos utilizando el GR completo, mostraron que el receptor en presencia de ligando existe como homodímero tanto en presencia como en ausencia de ADN [206]. Por otro lado, trabajando solamente con el GR DBD en ensayos de EMSA, Gustaffson y colaboradores propusieron un mecanismo denominado de facilitación, por el cual el receptor se uniría al ADN en primera instancia como monómero. Estos autores encontraron que una mitad del palíndrome imperfecto que compone un GRE no se comporta de la misma forma que la otra, sino que una molécula de GR DBD se une preferentemente a un 1/2GRE, y facilita la unión del otro monómero al ½GRE restante [207]. Este efecto cooperativo dependería del contacto proteína‐proteína de una región cercana a los dedos de Zn del DBD (el loop D), lo que sugiriere que esta región participa en la dimerización del receptor [208]. Contrariamente a este proceso de facilitación, utilizando el receptor entero, Nemer y colaboradores encontraron que la formación de homodímeros es la etapa limitante en 54
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la unión del GR al ADN [209]. Por otra parte, en 1996 se informó que si bien la afinidad de los monómeros por los sitios GRE no se ve afectada en mutantes sin los dominios AF‐1 o LBD, la afinidad de los homodímeros por el GRE aumenta al utilizar el receptor entero, lo cual sugiere que el DBD no es el único dominio que participa en el proceso de dimerización [143]. De hecho, la cristalización del GR LBD en 2002 mostró que este dominio también participa en dicho proceso [73]. Por lo tanto, aún se encuentra en discusión no sólo la identidad de el/los dominio/s del GR involucrado/s en la dimerización, sino también el momento en el cual este proceso ocurre, antes o después de la unión al ADN. En general, ensayos realizados con la proteína completa (siempre hablando de estudios in vitro) apoyan la idea de una dimerización ADN independiente [143,206,209‐211], mientras que estudios que utilizan el GR DBD apoyan la hipótesis de un proceso ADN dependiente [207,208,212]. Si la dimerización es un proceso independiente de la unión al ADN, la localización subcelular de este evento (en el citoplasma o en el núcleo) aún permanece indefinida. Muchos autores esquematizan el proceso de activación del GR con la dimerización ocurriendo dentro del núcleo; mientras que otros consideran que tiene lugar en el citoplasma. En el año 2001, se mostró (en forma indirecta) que la dimerización tendría lugar durante la translocación del GR. La región hinge, localizada entre el DBD y el LBD del receptor, resultaría necesaria y suficiente para dicho proceso [213]. Por otra parte, recientemente Kinjo y colaboradores propusieron un modelo en el cual la dimerización sería el último evento de la transactivación. Es decir, el GR homodimerizaría después de la unión de los cofactores y de la unión al ADN, lo que indicaría que la dimerización no es requerida para la unión al GRE [214,215]. Aunque el proceso de dimerización es una etapa considerada fundamental para la actividad del GR, no existe aún evidencia concluyente respecto del modo en que ocurre. Un caso al menos curioso es el del GRdim. Como mencionamos anteriormente, la mutante GR A458T, según los propios creadores del ratón dim/dim, es incapaz de homodimerizar [198]. Sin embargo, los autores que originalmente describen a la mutante, si bien la caracterizan como un receptor capaz de transreprimir pero no de transactivar, también demuestran que su inhabilidad para transactivar radica curiosamente en la incapacidad de éste de unirse al ADN [197]. Debido a que la manera de demostrar dimerización in vitro fue a través de ensayos de EMSA, nunca se demostró la incapacidad de esta mutante de dimerizar. De hecho, los mismos autores sugieren que la inhabilidad de A458T de dimerizar es causada justamente porque esa mutación se 55
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encuentra en la región D‐loop, descripta previamente relacionada al proceso de dimerización del receptor [208]. Sin embargo, cabe hacer notar que en este último trabajo sólo se demostró (utilizando el GR DBD), que la mutación en el D‐loop inhibe el efecto cooperativo de unión al ADN, pero no anula la capacidad del receptor de unirse como dímero [208]. En conclusión, todavía no ha sido probada la capacidad del GRdim de homodimerizar. Además, algunos trabajos han cuestionado incluso su inhabilidad de unirse al ADN y de transactivar la expresión de genes blanco [216]. 2.11 El GR dentro del núcleo Durante la última década, una serie de experimentos realizados en tiempo real sobre células vivas sugieren que una vez dentro del núcleo el GR puede, en cuestión de segundos, efectuar un barrido de una gran fracción de los posibles elementos de respuesta presentes en el ADN genómico y de sus posibles proteínas interactoras [217]. Estudios de FRAP (fluorescence recovery after photobleeching) mostraron que el GR se asocia y disocia dinámicamente al ADN u otros factores de transcripción [218]. Este rápido proceso es regulado por el GR LBD, aunque la disociación del ADN ocurre independientemente de la liberación del ligando [219]. Este modelo de intercambio dinámico llamado “hit and run” propone que la entrada y salida de moléculas de GR a la cromatina promueve constantemente el reclutamiento de nuevos complejos de iniciación transcripcional [218,220‐222]. De hecho, el ensamblaje/desensamblaje de factores de transcripción y cofactores correlacionan con ciclos de iniciación de la transcripción [217]. Más aún, los experimentos de FRAP indican que la tasa de intercambio de moléculas del coactivador TIF2 y el GR son virtualmente indistinguibles, lo cual confirma que el comportamiento dinámico del receptor sobre un promotor no se encuentra limitado sólo al factor de transcripción, sino que también incluye otras moléculas regulatorias [223]. Se ha propuesto que las chaperonas del heterocomplejo podrían modular estos procesos [128]. Si bien Hsp90 es principalmente citoplasmática, se ha encontrado a esta chaperona colocalizada con moléculas de GR unida a promotores [224,225]. Sin embargo, existen todavía controversias acerca del papel de Hsp90 como modulador del GR dentro del núcleo, ya que algunos estudios siguieren que esta chaperona estabiliza la unión GR‐ADN [224], mientras que otros proponen que aumenta su movilidad nuclear [226]. Por otro lado, también se propuso que p23 modularía la tasa de intercambio del GR, tanto en forma dependiente como independiente 56
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de Hsp90 [128]. Además, se ha vinculado a Hsp90 en el reciclado y retención nuclear del GR. Una vez que el receptor se disocia del ADN y del ligando, este necesita de la chaperona para poder volver a unir hormona y consecuentemente, volver a unirse al ADN [227,228]. En ese sentido, existen evidencias que apoyan la idea de que este proceso ocurre dentro del núcleo [128]. De hecho, estudios recientes utilizando pulsos rápidos de estímulos hormonales, mostraron que la interacción dinámica del GR regulada por chaperonas sería esencial para que la célula responda correctamente a los cambios en las concentraciones de ligando [229]. Los primeros estudios realizados mediante inmunofluorescencia indirecta sobre la localización nuclear del GR luego de la unión al ligando revelaron que esta proteína se encuentra, a excepción de los nucléolos, dispersa a través de todo el núcleo celular. Más aún, se encontró que el GR forma focos discretos compuestos de varias moléculas de receptor, tanto en presencia de agonistas como de antagonistas [230]. Esta localización puntiforme aparenta ser un evento común para los distintos receptores de esteroides y sus proteínas interactoras, lo que sugiere la existencia de los llamados “centros de acumulación”, cuya función aún se desconoce [231]. 2.12 Modificaciones post‐traduccionales Se ha demostrado que las modificaciones post‐traduccionales que puede sufrir el GR constituyen otra manera de regular su localización, actividad transcripcional y vida media [232]. Luego de la disociación del esteroide, una molécula de GR tiene al menos dos destinos posibles: el reciclado o la degradación. En el primero, la molécula se integrará nuevamente al complejo de chaperonas y se esa manera, queda capacitado para volver a unir ligando. En el segundo, la ubiquitinación del receptor (figura 20) “marcará” dicha molécula para su degradación, a través del sistema de proteosoma [233]. La E3 ligasa que ubiquitina al GR se denomina CHIP (carboxyl terminus of Hsp70‐interacting protein). Esta proteína se une a través de su dominio TPR al C‐terminal tanto de la Hsp90 como de la Hsp70 [99], y se ha sugerido que la competencia entre Hop y CHIP modula el equilibrio entre la degradación y el reciclado [234]. Más aún, se ha propuesto que el estado de desnaturalización del GR podría ser determinante en la preferencia de CHIP de unirse a la Hsp70, permitiendo así la ubiquitinación del GR y en consecuencia, su degradación vía proteosoma [99]. Otra modificación a la cual puede ser sometido el GR es la fosforilación de algunos de sus residuos. El GR humano puede ser fosforilado en cinco sitios diferentes, todos en el dominio N‐
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terminal del receptor (figura 20) [235]. Por otro lado, el GR de ratón contiene ocho residuos fosforilables, la mayoría también localizados en el N‐terminal [236]. Las distintas fosforilaciones del GR son producidas por diferentes quinasas como MAPKs, CDKs, GSK‐3 y JNK [232]; y funcionalmente se ha demostrado que dichas modificaciones afectan la localización subcelular del receptor y la capacidad transcripcional del mismo [233]. En particular, recientemente se ha descripto que ciertas fosfo‐isoformas del GR ocupan selectivamente GREs de determinados promotores de genes blanco [237]. Figura 20. Modificaciones post‐traduccionales del GR. El GR humano presente cinco sitios de fosforilación (P) que comprenden las serinas 113, 141, 203 y 226, todas ubicadas dentro del dominio N‐terminal. Además, el GR puede se ubiquitinado (U), y por ende marcado para su degradación. Finalmente, se han encontrado tres sitios de SUMOilación (S) en las lisinas 277, 293 y 703. Adaptada de Zhou y Cidlowski [233]. Por otro lado, estudios utilizando GR con mutaciones en todos los residuos fosforilables mostraron que, respecto a la translocación, la versión mutante se comporta en forma similar al receptor wild type [238,239]. Además se ha sugerido que distintos ligandos, así como el estado del ciclo celular y/o fisiológico modularían el grado de fosforilación del GR de manera dinámica, [233]. Por ejemplo, si bien el GR se encuentra parcialmente fosforilado en ausencia de ligando, sólo en presencia de agonistas su estado de fosforilación se incrementa [240]. Por último, algunos estudios también sugieren que el grado de fosforilación influye sobre la estabilidad de la proteína [239]. La SUMOilación es una modificación post‐transcripcional en donde el grupo SUMO‐1 (un polipéptido de 98 aminoácidos) es adherido covalentemente a los residuos de lisina de las proteínas blanco [241]. Aunque el mecanismo de SUMOilación es similar al proceso de ubiquitinación, sus consecuencias funcionales son muy diferentes [242]. Este proceso ha sido involucrado en la regulación de fenómenos como la estabilidad proteica, la localización y la actividad de reguladores transcripcionales [243]. Se han identificado hasta el momento tres sitios SUMO en el GR, de los cuales dos se encuentran en el dominio N‐terminal y el otro se localiza en 58
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el LBD [232] (figura 20). Aparentemente, el agregado de este grupo funcional modularía la actividad transcripcional del GR en forma promotor‐específica [233]. Dado que la SUMOilación es regulada por factores ambientales como el estrés celular, dicha modificación podría entonces regular la actividad del GR en respuesta a cambios del ambiente, sobre un subconjunto de genes específicos [241]. 3. Apoptosis y glucocorticoides 3.1 Apoptosis La vida requiere de la muerte. Los organismos multicelulares eliminan células dañadas, redundantes, o infectadas por medio de un programa genético de muerte celular denominado apoptosis [244]. Las células apoptóticas presentan una serie de características bioquímico‐
morfológicas comunes, como la reducción en el volumen celular, la compactación de sus organelas, la condensación de la cromatina, la degradación internucleosomal del ADN, el movimiento de fosfatidil serinas desde el lado interno de la membrana al lado externo, y la formación de “cuerpos apoptóticos” que contienen componentes celulares degradados, rodeados por membrana plasmática. Todos estos procesos están regulados genéticamente [245‐
247]. Aunque todas las células parecen susceptibles de morir por apoptosis, las señales que la regulan son específicas de cada tipo celular, y pueden provenir del exterior así como del interior de la célula. La muerte celular puede ser inducida por una gran variedad de estímulos, como por ejemplo el daño al ADN, la falta de factores de crecimiento, las hormonas esteroides como los glucocorticoides, el daño oxidativo, ligandos de receptores de membrana, el estrés celular, la disrupción del ciclo celular, etc. [1,248‐250]. Las células integran la información del conjunto de señales que las alcanzan en un determinado momento y esto podría conducir a la iniciación del programa de muerte. Dicho programa puede iniciarse, al menos, por la activación de dos vías de señalización: la vía mediada por los receptores de muerte y la vía que involucra cambios en el potencial de membrana mitocondrial, controlada por los miembros de la familia de Bcl‐2 (figura 21) [251]. Luego de la iniciación de la señalización del proceso de apoptosis, la mitocondria también integra señales procedentes de las dos vías. De esta manera, distintos estímulos apoptóticos 59
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producen la liberación al citoplasma de proteínas mitocondriales que regulan el proceso de muerte celular. El citocromo C es una de estas proteínas que, una vez en el citoplasma, interactúa con Apaf‐1 para formar el complejo apoptosoma, desencadenando uno de los mecanismos claves que llevan adelante el proceso de apoptosis [252]. Figura 21. Principales vías de la apoptosis. Esquema de algunas de las proteínas involucradas en la vía de los receptores de muerte, la vía de la familia de proteínas de Bcl‐2 y los procesos mitocondriales. Se representa además, la formación del apoptosoma, el cross talk mediado por Bid y algunas caspasas involucradas en las dos vías principales. El daño del ADN y CD95L son mostrados como ejemplos de inductores de apoptosis. Adaptado de Hengartner [251]. 3.1.1 Activación del proceso de apoptosis La activación de las vías iniciadoras desencadena la fase de ejecución de la apoptosis. La mayor parte de los cambios morfológicos que ocurren durante este proceso de muerte son consecuencia de la activación específica de cisteín‐proteasas llamadas Caspasas [253]. Estas proteínas pueden clasificarse en dos grupos: las caspasas iniciadoras, entre las que se encuentran las caspasas ‐2, ‐8, ‐9 y –10; y las efectoras, como las caspasas –3, ‐6 y –7. Estas últimas llevan a 60
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cabo el proceso apoptótico mediante su acción proteolítica sobre distintas proteínas blanco, involucradas en el desarrollo del mismo. Si bien pueden ser activadas por diversos mecanismos, las caspasas iniciadoras, una vez activas, proteolizan a las caspasas efectoras, produciendo su activación [251]. Entre las proteínas activadas por proteólisis se encuentra la proteína CAD, involucrada en la hidrólisis internucleosomal del ADN, y las lamininas nucleares, necesarias para que se produzca la reducción del volumen celular y los cambios en la estructura nuclear [254,255]. 3.1.2 Iniciación del proceso de apoptosis 3.1.2.1 Vía extrínseca de inducción de apoptosis La activación de esta vía involucra a la familia de los llamados receptores de muerte (DR), pertenecientes a la familia de TNFαR1, entre los que se incluyen CD95 (Fas/Apo‐1), CD120a, y los DR 3, 4, 5 y 6. En respuesta a la oligomerización de los receptores mediada por distintos ligandos como TNFα y Fas‐L, se reclutan diferentes proteínas adaptadoras como CRADD, TRADD y FADD, que se unen a los fragmentos citoplasmáticos de los receptores, a través de los dominios de muerte (DD). Estos adaptadores también se unen y activan a las procaspasas ‐8 y ‐2, desencadenando una “cascada de activación”, que lleva a la apoptosis mediada por las caspasas ‐
3, ‐6 y ‐7. De esta manera, esta vía es capaz de activar a las caspasas sin utilizar factores mitocondriales [251,256]. Sin embargo, existe también la posibilidad de que la apoptosis mediada por receptores de muerte involucre la activación de la vía mitocondrial, a través de la activación por proteólisis (mediada por la Caspasa‐8) de la proteína BID, miembro pro‐apoptótico de la familia Bcl‐2. Por lo tanto, se denomina vía extrínseca de Tipo I aquella que involucra la activación de receptores de muerte independientemente de la vía mitocondrial, y vía extrínseca de Tipo II cuando es dependiente de esa vía [257‐259]. 3.1.2.2 Vía intrínseca de inducción de apoptosis La activación de la vía intrínseca requiere un cambio en la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la liberación al citosol de proteínas mitocondriales, principalmente el Citocromo C. Esta proteína, ya en el citoplasma, se une al factor Apaf‐1, donde, además de promover su oligomerización, provoca el reclutamiento de la pro‐caspasa‐9, formando el complejo multiproteico denominado apoptosoma (figura 21). La activación de la caspasa‐9 dentro del 61
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apoptosoma es consecuencia de una proteólisis autocatalítica. Posteriormente, la caspasa‐9 activa, desencadena la activación de caspasas efectoras [260]. Por lo tanto, la permeabilización de la membrana mitocondrial (mediante la formación de poros o canales) es un paso esencial en la inducción de la apoptosis mediada por la vía intrínseca. Esta permeabilización es regulada por las acciones opuestas de distintas proteínas de la familia Bcl‐2. Dentro de esta familia, existen miembros anti‐apoptóticos (como Bcl‐2 y Bcl‐XL) y pro‐
apoptóticos (como Bax y Bad). Los miembros con función anti‐apoptótica se encuentran asociados principalmente a la membrana externa mitocondrial, e inhiben la liberación del Citocromo C al citoplasma. En cambio, los miembros pro‐apoptóticos se localizan principalmente en citoplasma y, ante un estímulo apoptótico, se relocalizan en la membrana externa mitocondrial e inducen la liberación del Citocromo C y en consecuencia la posterior inducción de las caspasas [261]. En el capítulo 2 profundizaremos sobre la estructura y función de los miembros de esta familia. 3.2 Apoptosis y el sistema inmune 3.2.1 El timo El timo es el órgano linfoide primario donde se produce la maduración de los linfocitos T que se generan en la médula ósea. Está compuesto por células T inmaduras, llamadas timocitos, las cuales se localizan dentro de una red de células epiteliales que forman el estroma. Su estructura presenta lóbulos, que poseen una corteza externa, una corteza profunda y una médula. En la corteza externa se ubican las células grandes provenientes de la médula ósea, mientras que en la corteza profunda se ubican timocitos en tránsito hacia la médula y células epiteliales dendríticas. Por último, en la médula se encuentran timocitos y otras células como las epiteliales medulares, dendríticas y macrófagos. Esta distribución de células produce un gradiente de diferenciación desde la corteza hacia la médula [262]. 3.2.2 Relevancia de la apoptosis en el sistema inmune Los linfocitos están sujetos durante todo su ciclo de vida a distintos puntos de control y son susceptibles de entrar en apoptosis. Este proceso asegura un desarrollo apropiado de las funciones inmunes, un mantenimiento de la homeostasis y la tolerancia periférica, además de 62
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colaborar con la generación de células de memoria, y prevenir el desarrollo de enfermedades [263]. Durante el desarrollo de los linfocitos T, cada célula genera un único receptor de antígeno (TCR, T‐cell receptor) y así provee al sistema especificidad antigénica. Este proceso requiere de complejos re‐arreglos cromosómicos donde la mayoría de las células fracasan en generar su receptor T. Estas células no reciben estímulos de supervivencia y en consecuencia mueren por apoptosis [264]. Por otro lado, las células que logran expresar su TCR, deben sufrir una interacción apropiada de su receptor T con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) unidas a antígenos. De esta forma sobrevivirán al proceso de diferenciación en el timo y serán exportadas a los órganos linfoides periféricos. En una primera etapa, ocurre el proceso denominado selección positiva, donde más del 95% de los timocitos que entran en este proceso mueren por apoptosis a través del mecanismo conocido como “muerte por falta de estímulo” (death by neglect), debido a una interacción nula o sub‐umbral del receptor T con antígenos presentados por células epiteliales corticales en el contexto MHC. En una segunda instancia, ocurre la selección negativa, que consiste en la apoptosis que sufren una menor proporción de timocitos, inducida por una interacción de alta avidez del receptor T con el complejo MHC/antígeno, un proceso que elimina las posibles células auto‐reactivas del repertorio T [263,264]. 3.2.3 Efecto de los glucocorticoides en el sistema inmune Como se mencionó anteriormente, los glucocorticoides desempeñan un papel fundamental como neuroinmunomoduladores y se emplean como agentes antiinflamatorios e inmunosupresores debido a su acción inhibitoria sobre el sistema inmune. Son capaces de inducir apoptosis en diferentes tipos celulares de dicho sistema e inhibir la producción de varias citoquinas proinflamatorias [1,12,21‐26]. Estos esteroides participan en la regulación del desarrollo y la selección de timocitos, así como de la involución del timo con la edad. De hecho, la adrenolectomización produce una hipertrofia tímica [1] y la administración in vivo o in vitro de glucocorticoides produce la muerte por apoptosis del 90% de las células del timo entre las 48 y 72 horas post‐tratamiento [246,265]. Además, se ha propuesto que los glucocorticoides participarían en la selección tímica mediante la regulación de la “apoptosis por falta de estímulo” de los timocitos CD4+ CD8+ [1]. Este mecanismo 63
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mediado por GC sería responsable de establecer un umbral para la selección positiva de las células T. Según este modelo, los GC ejercen una presión pro‐apoptótica sobre los timocitos, los cuales sólo sobreviven si reciben señales apropiadas a través del TCR (selección positiva). Estas señales apropiadas son generadas por el TCR con afinidad intermedia por su ligando: no serían excesivamente altas, si no que deberían encontrarse por encima del umbral establecido por los GC a fin de poder rescatar a los timocitos de la apoptosis. En ausencia de esas señales o incluso con señales muy débiles, el timocito no logra sobrevivir [266,267]. 3.3 Apoptosis y glucocorticoides Las hormonas esteroides regulan la apoptosis principalmente sobre órganos y tejidos que dependen de estímulos hormonales como la glándula mamaria, la próstata, y las gónadas [268]. En particular, el efecto de los glucocorticoides sobre la apoptosis es específico del contexto y del tipo celular, induciendo la muerte en algunos casos y previniéndola en otros. Así, como parte de su efecto inmunosupresor, los GC son pro‐apoptóticos en diversos tipos celulares del sistema inmune: timocitos, monocitos, eosinófilos, células T y B. Por el contrario, los glucocorticoides previenen la apoptosis inducida por diversos estímulos (TNF‐α, daño al ADN, deprivación de suero, etc.) en neuronas, osteoblastos, hepatocitos y células epiteliales de glándula mamaria, pulmón y próstata [269,270]. Independientemente de la variedad de mecanismos por los cuales el GR modula la expresión génica, hasta el momento se conocen relativamente pocos genes blanco de la acción glucocorticoide involucrados en la regulación de la apoptosis [271]. En los últimos años, con el uso de microarrays, se identificaron nuevos genes modulados por glucocorticoides. De esa manera se demostró, por ejemplo, que esta hormona aumenta los niveles de expresión de Bim, miembro pro‐apoptótico de la familia bcl‐2, durante la inducción de apoptosis en células linfoides [272]. Por otro lado, también se observó que la inducción por dexametasona de la quinasa SGK‐1 es necesaria para su efecto inhibitorio de la apoptosis producida por quimioterápicos en células tumorales mamarias [273]. Sin embargo, todavía no se realizaron experimentos de genómica funcional en búsqueda de genes que respondan a glucocorticoides y estén involucrados en su acción anti‐apoptótica. Es decir que, salvo pocas excepciones, aún no se identificaron genes que medien su efecto de supervivencia. En este sentido, nuestro grupo identificó al gen p21CIP como candidato a mediar el efecto de sobrevida que los GC ejercen en la glándula mamaria durante la 64
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involución post‐lactancia [274]. Por otro lado, si bien aún se desconoce el mecanismo de control de la apoptosis por glucocorticoides dependiente del tipo celular, nuestro grupo demostró que la regulación diferencial de la expresión del gen Bcl‐X por GC podría mediar la respuesta apoptótica opuesta de células epiteliales mamarias y de células linfoides. La isoforma anti‐apoptótica Bcl‐XL es inducida en la mama mientras que es reprimida en el timo. Esta regulación diferencial depende del posible cross talk entre el GR y el factor de transcripción STAT5B [275]. Los mecanismos involucrados en la apoptosis de timocitos mediada por glucocorticoides se detallarán en el capítulo 2. 4. Melatonina y glucocorticoides 4.1 Melatonina El metoxiindol melatonina (N‐acetil‐5‐metoxitriptamina) es una hormona producida principalmente por la glándula pineal (80% ) [276,277], aunque también se ha demostrado su síntesis en otros órganos como la retina [278], el timo [279], el intestino [280], el ovario [281], el testículo [282], el oído interno [283] y otros tipos celulares como monocitos, linfocitos y células derivadas de la médula ósea [284‐286]. Esta hormona posee una gran versatilidad funcional ya que transmite la información del foto‐período, controla la fisiología reproductiva y es capaz de modular el sistema inmune. Además, posee propiedades antioxidantes al capturar radicales libres [287]. La secreción de melatonina por la glándula pineal sigue un ritmo circadiano. Los niveles máximos en la producción de esta hormona se alcanzan durante la noche, y responde de manera precisa a los cambios de iluminación ambiental [288]. Por ejemplo, la síntesis nocturna de melatonina es interrumpida cuando los animales son expuestos a luz intensa de una determinada longitud de onda durante la noche [276]. Por todo esto se la considera una hormona relevante en la cronobiología. 4.2 Mecanismos de acción de la melatonina La melatonina ejerce sus múltiples acciones por diversos mecanismos. Entre ellos se destacan su efecto antioxidante por acción directa o indirecta, sus acciones a través de 65
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receptores de membrana y nucleares, y la interacción con proteínas citoplasmáticas solubles [288,289]. Dichos mecanismos se esquematizan en la figura 22, y se describen a continuación. Figura 22. Mecanismos de acción de melatonina. En concentraciones del orden µM, la melatonina puede actuar en forma directa como antioxidante al capturar radicales libres, o indirectamente a través de su unión a la quinona reductasa 2 (no mostrado). Por otro lado, en concentraciones del orden de nM, es capaz de activar a los receptores nucleares de la subfamilia RZR/ROR, que regulan la transcripción de genes. También se describieron receptores de membrana para la melatonina, Mel1a y Mel1b, que están acoplados a proteínas G inhibitorias (Gi). Estas últimas inhiben a la adenilato ciclasa (AC), lo que disminuye la producción de AMPc. Por lo tanto, la melatonina puede proteger contra el daño oxidativo, regular la expresión génica y modular la señalización en la que participa el nucleótido cíclico. Además puede interactuar con proteínas solubles como calmodulina, calreticulina (no mostrado) y tubulina (MT, microtúbulos). Adaptado de Carlberg [289]. 4.2.1 Acción antioxidante La melatonina es una molécula altamente lipofílica, lo que le permite atravesar las membranas celulares con gran facilidad y desempeñar funciones no mediadas por receptor. En este contexto, se ha demostrado que la melatonina puede actuar como agente antioxidante, y prevenir contra el daño oxidativo inducido por un gran número de estímulos que provocan la generación de radicales libres [276]. Esta hormona es capaz de proteger del daño oxidativo al ADN nuclear, a los lípidos de membrana, y a proteínas citosólicas. Además, es capaz de reducir la fuga de protones en la cadena de transporte de electrones [290]. Por otro lado, regula la expresión y activación de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa, la glutatión peroxidasa, la glutatión reductasa, la glucosa 6‐fosfato deshidrogenasa, y la óxido nítrico sintetasa [291,292]. Otro mecanismo propuesto involucra a la neutralización directa de radicales 66
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libres, como el radical hidroxilo [276,291], el peróxido de hidrógeno, el ácido hipocloroso, el radical anión superóxido y el óxido nítrico, entre otros [293]. 4.2.2 Receptores de membrana El grupo más estudiado de receptores de melatonina en mamíferos es el que pertenece a la superfamilia de receptores de membrana acoplados a proteínas G. Estos receptores, de 7 pasos de membrana (figura 22) han sido clasificados en dos subtipos en función de su distribución y su constante de disociación (Kd). El receptor Mel1a/MT1 presenta una Kd de 20 ∼ 40 pM, relativamente menor que la del receptor Mel1b/MT2, cuya kd es de 160 pM [294]. Estos receptores comparten un 60% de identidad de secuencia [289]. En cuanto a su distribución, ambos se expresan en varios tejidos, aunque Mel1b es menos ubicuo [288,295]. En el sistema inmune, en particular en linfocitos T, se ha descripto la expresión del ARN mensajero tanto del receptor Mel1a como del receptor Mel1b; mientras que en linfocitos B del bazo sólo se observó expresión del receptor Mel1b [296,297]. Los mecanismos de transducción de señales asociados a estos receptores dependerían del tipo celular [298,299]. No obstante, ambos receptores preferentemente se asocian a proteínas G inhibitorias [300]. Por lo tanto, se ha demostrado que su activación disminuye los niveles de AMPc, lo que provoca un cambio en el estado de fosforilación de factores de transcripción, como por ejemplo CREB [301]. Cuando el receptor Mel1a es sobreexpresado en células Cos, la melatonina estimula la actividad de JNK [302]. Además, la activación de Mel1a también ha sido asociada a un aumento en la fosforilación de ERK1/2 [302,303]. Por otro lado, la activación de estos receptores regula a otros segundos mensajeros: modula los niveles de GMPc [289,304], inhibe la hidrólisis de fosfoinosítidos y modula los niveles intracelulares del ión Ca2+ [294]. 4.2.3 Receptores solubles Además de su interacción con receptores de membrana, la melatonina puede interactuar con varias proteínas en el citoplasma o en el núcleo [288]. Un tercer receptor de melatonina, inicialmente denominado MT3, fue caracterizado como la enzima quinona reductasa 2 [305]. Esta enzima pertenece al grupo de reductasas que participan en la protección del estrés oxidativo, explicando al menos en parte la acción indirecta de la melatonina como antioxidante [306]. Por otro lado, la melatonina interactúa con otras proteínas intracelulares, como la calmodulina, 67
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inhibiendo su unión al calcio [307‐309], la calreticulina [310] y la tubulina, aumentando su polimerización [311,312]. Finalmente, los efectos de la melatonina pueden también estar mediados por otro grupo de receptores pertenecientes a la subfamilia RZR/ROR, de la superfamilia de los receptores nucleares. Si bien estos receptores fueron inicialmente considerados como receptores “huérfanos”, luego se demostró que la melatonina se une a varios miembros de esta subfamilia, incluyendo a RZR/RORα, RZRβ y RORγ [313]. Se ha demostrado la presencia de RZR/RORα en la mayoría de los tejidos estudiados, entre ellos el timo [297]. Se han encontrado altos niveles de expresión de RZR/RORα en linfocitos de sangre periférica y en células de la piel. Por el contrario, RZRβ se expresa en la retina, la glándula pineal, la pituitaria, el hipotálamo, el tálamo y la espina dorsal [289], mientras que RORγ lo hace principalmente en el timo y en músculo esquelético [314]. Se han generado ratones knock‐out para cada uno de los tres receptores. Los ratones RORβ‐/‐ muestran alteraciones en la ritmicidad circadiana [289]. Por otro lado, los RZR/RORα‐/‐ presentan alteraciones en el desarrollo del cerebelo y deficiencias en el sistema inmune, incluyendo una reducción en el volumen celular del timo, y un desarrollo deficiente de células B y T [315,316]. El receptor RORγ es esencial para la correcta organogénesis de varios órganos linfoides, y en el desarrollo de los timocitos [314]. Estos receptores han sido propuestos como mediadores de los efectos de la melatonina en varios sistemas: la inducción de apoptosis en células de cáncer de colon [317], la inhibición de la proliferación celular en el ovario [318], y el efecto protector sobre las células neuronales PC12 [319]. También se ha descripto su mediación en el efecto del metoxiindol en el sistema inmune, y en la activación o modulación de la secreción de citoquinas por varios tipos celulares [320,321]. 4.3 Melatonina y el sistema inmune Hace varios años que se ha propuesto que la melatonina podría estar involucrada en las relaciones recíprocas entre el sistema neuroendocrino y el sistema inmune [322]. En este contexto, se ha demostrado que efectivamente funciona como señal inmunomoduladora [323,324]. La exposición de ratones a luz constante produce niveles indetectables de melatonina en suero, lo cual correlaciona con una disminución de la respuesta inmune humoral y celular, mientras que por otro lado, la administración exógena de la hormona puede aumentar la 68
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producción de anticuerpos [325]. También es capaz de modular la producción de citoquinas en linfocitos Th1 [320], Th2 [326], en monocitos [327], y en líneas celulares como las U937 [321]. Se ha demostrado que inhibe la unión del NFκB al ADN en bazo [325], mientras que su síntesis por parte de linfocitos podría llegar a estar involucrada en la regulación fisiológica de IL‐2 y su receptor, a través de un mecanismo dependiente de receptores de membrana y nucleares [328]. Por otro lado, se observó que tiene un efecto antiinflamatorio en varios modelos experimentales [276]. Finalmente, dado que el envejecimiento está asociado a una caída general de la función inmune (inmunosenescencia), sumado al hecho de que los niveles circulantes de melatonina disminuyen con la edad, se ha propuesto el uso terapéutico del metoxiindol como inmunomodulador positivo en individuos de edad avanzada [329]. Estas funciones, junto con la capacidad de regular el proceso apoptótico, son las que permiten proponer que la melatonina podría desempeñar un papel esencial en la regulación del sistema inmune. 4.4 Melatonina y apoptosis El efecto anti‐apoptótico de la melatonina ha sido descripto en numerosos tipos celulares y frente a diversos estímulos apoptóticos. Esta hormona previene la apoptosis de neuronas del hipocampo [330], del estriado [331], de foto‐receptores [332], de células epiteliales de la retina [333], de células del corazón [334], del hígado [335], y de fibroblastos [336]. Además, se ha postulado que la melatonina previene la apoptosis de células neuronales en modelos de Alzheimer [337] y Parkinson [338]. Debido a la capacidad de los radicales libres de inducir la muerte celular, se ha propuesto que el efecto anti‐apoptótico de la melatonina en muchos de los sistemas estudiados estaría relacionado con su efecto antioxidante [335,336,338,339]. Sin embargo, se ha demostrado que en neuronas del cerebelo, el metoxiindol ejercería su efecto anti‐apoptótico a través del receptor Mel1b [340]. Por otro lado, se ha descripto que en modelos neuronales la melatonina inhibe la formación del poro mitocondrial, impidiendo la liberación del citocromo C [341]. En este mismo sentido, pero en células U937, el metoxiindol (a través de ambos receptores de membrana) promueve la relocalización de Bcl‐2 en mitocondria, inhibiendo la oligomerización de Bax, y por ende la vía intrínseca de apoptosis [342]. Por el contrario, también se ha descripto el efecto opuesto en otros tipos celulares, 69
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principalmente en células tumorales. El tratamiento con melatonina reduce la proliferación celular en líneas de cáncer de ovario [318] y de mama [343]. Además, estimula la apoptosis de células de cáncer de colon [317]. Con respecto al sistema inmune, se ha descripto que la melatonina previene la apoptosis de células de la médula ósea inducida por agentes quimioterapéuticos [344]. Más aún, se ha demostrado que tiene un efecto particularmente significativo en el timo, donde previene la apoptosis inducida por radicales hidroxilo [339] y por glucocorticoides [345]. 4.5 Antagonismo entre melatonina y glucocorticoides Numerosas observaciones experimentales permiten postular la existencia de una interacción antagónica entre los glucocorticoides y la melatonina. El metoxiindol previene la desregulación del eje hipotalámico‐pituitario‐adrenal inducida por dexametasona [346] y es capaz de disminuir el peso de la glándula adrenal y los niveles plasmáticos de corticosterona [347]. En estudios realizados sobre la línea celular SL2 de Drosophila o la línea celular MCF‐7 humana, se ha demostrado que la melatonina inhibe la actividad transcripcional del GR, y que este efecto podría estar mediado por el receptor Mel1a [348,349]. Además, se observó que la melatonina inhibe la apoptosis inducida por glucocorticoides en neuronas del cerebelo [350]. Se ha propuesto que uno de los mecanismos modulatorios sobre el sistema inmune por parte de la melatonina podría involucrar, precisamente, la inhibición de la acción de los glucocorticoides [351]. La melatonina impide la atrofia del timo [352] y la apoptosis de timocitos inducidas por dexametasona [345], y a su vez antagoniza los efectos supresores de los glucocorticoides sobre la respuesta inflamatoria [353]. Los mecanismos moleculares que median el antagonismo entre la melatonina y los glucocorticoides todavía no ha sido completamente dilucidados. Se ha sugerido que en timocitos la melatonina inhibe la expresión del GR [354]. Además, nuestro grupo demostró que el metoxiindol inhibe la acción apoptótica de los glucocorticoides en ese modelo, al menos a través de una inhibición en los niveles de expresión de Bax [355]. Por otro lado, también se propone que cambios en la afinidad del receptor, modulados al menos parcialmente por melatonina, podrían explicar el antagonismo tanto en células del timo [356‐358] como en otros modelos celulares relacionados a sistema inmune [359]. Algunas de las proteínas comunes en las vías de señalización de ambas hormonas podrían estar mediando ese antagonismo, aunque su relevancia 70
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funcional todavía no ha sido evaluada. Por ejemplo, la proteína GRIP‐1/TIF2 (que interactúa con el GR) es un posible coactivador del RZR/RORα, receptor de melatonina [360]. Además, la calmodulina, la cual es modulada por melatonina [307,308], interactúa en forma directa con el GR [361,362]. De hecho, mediante su acción sobre esta proteína, el metoxiindol inhibe la actividad transcripcional del receptor de estrógenos en células MCF‐7 [363]. Por su parte, los glucocorticoides disminuyen la producción de melatonina por la glándula pineal y por consiguiente los niveles sanguíneos de melatonina [364‐366]. Este efecto podría ser directo, ya que se ha demostrado la existencia de GR en dicha glándula [365]. Durante el último capítulo de esta tesis intentaremos dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en el efecto antagónico entre los glucocorticoides y la melatonina. 71
OBJETIVOS GENERALES “El motivo no existe siempre para ser alcanzado, sino para servir de punto de mira”. Joseph Joubert (1754 – 1824). Ensayista francés. Objetivos Generales
OBJETIVOS GENERALES En base a los antecedentes mostrados, nos propusimos investigar los mecanismos moleculares involucrados en la modulación de la actividad del receptor de glucocorticoides bajo distintos estímulos y a lo largo de diversos contextos celulares. En el capítulo 1 nos centramos en el estudio de cómo se modula la actividad del receptor en función de las distintas conformaciones que el mismo puede adquirir. Teniendo en cuenta que distintos ligandos pueden generar distintas conformaciones del GR, se evaluó mediante diversas técnicas tanto in vivo como in vitro cómo esos cambios conformacionales afectan la actividad del receptor. En particular, estudiamos los mecanismos moleculares mediante los cuales un determinado ligando actúa como agonista o antagonista del GR. En el capítulo 2 nos abocamos al estudio de cómo el GR participa en la apoptosis inducida por glucocorticoides en timocitos de ratón. En particular, estudiamos los mecanismos a través de los cuales el GR induce la expresión del gen pro‐apoptótico Bax. Por último, a lo largo del capítulo 3 investigamos los mecanismos moleculares que median el antagonismo entre la melatonina y los glucocorticoides. En este sentido, evaluamos cómo el metoxiindol es capaz de antagonizar y modular al GR en distintos contextos celulares. 73
MATERIALES Y MÉTODOS “Si tu experimento necesita estadística, deberías haber hecho uno mejor”. Ernest Rutherford (1871‐1937). Físico Británico. Premio Nobel de Química, 1908 Materiales y Métodos
1. Reactivos Utilizados 1.1 Agonistas y antagonistas del GR La dexametasona, el RU486, y la melatonina fueron adquiridos en Sigma (St Louis, MO, USA). Estas sustancias se disolvieron en etanol absoluto (Merck) y para todos los ensayos se prepararon soluciones 1000X. La melatonina se preparó al momento de cada experimento mientras que las demás fueron conservadas a ‐20°C. Los análogos rígidos de esteroides (21‐
hidroxi‐6,19 epoxiprogesterona y su 21‐hemisuccinato derivado) fueron sintetizados en el laboratorio del Dr. Gerardo Burton [367] y disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) en una concentración de 0.01M y conservado a ‐20°C. El Luzindole fue adquirido en Sigma (St Louis, MO, USA), disuelto en DMSO a una concentración de 0.01 M y conservado a ‐20°C. 1.2 Medios de cultivo celulares El medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI 1640 y la tripsina fueron adquiridos en Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). El suero fetal bovino (SFB) y suero bovino, de la empresa Internegocios S.A. (Mercedes, Argentina). 1.3 Preparación de suero delipidado El SFB libre de esteroides se preparó de acuerdo a lo descripto previamente [368]. Brevemente, 10 ml de una solución 10X Carbón Dextrano (2,5% p/v de carbón activado (Sigma); 0,25% dextrano (Sigma) en 0,01 M Tris‐HCl, pH 7.4) se centrifugaron a 12000 rpm durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y al precipitado se le agregaron 50 ml de suero fetal bovino y luego se incubó a 56 °C durante 30 minutos con agitación. Seguidamente se centrifugó y se repitió este procedimiento con un nuevo precipitado de Carbón‐Dextrano. Finalmente, el suero resultante se filtró primeramente con un filtro de 0,45 μm y luego con un filtro de 0,2 μm. 2. Líneas celulares Se utilizaron las siguientes líneas celulares: ‐ BHK‐21: línea derivada de fibroblastos de riñón de hámster, cultivada en medio DMEM suplementado con 5% SFB y 100 μg/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco). 75
Materiales y Métodos
‐ COS‐7: línea derivada de riñón de mono, cultivada en medio DMEM suplementado con 10% SFB y 100 μg/ml de penicilina/estreptomicina. ‐ HC11: línea derivada de glándula mamaria de ratón, gentilmente cedida por la Dra. Nancy Hynes [369]. Esta línea fue cultivada en medio RPMI 1640 suplementado con 10% SFB, 4 mg/ml de insulina (Novo Nordisk Pharma Argentina S.A.) y 100 μg/ml de penicilina/estreptomicina. ‐ L929: línea derivada de fibroblastos provenientes de tejido conectivo de ratón. Esta línea fue cultivada en medio DMEM suplementado con 10% de SFB y 100 μg/ml de penicilina/estreptomicina. ‐ MCF‐7: línea celular proveniente de adenocarcinoma humano de glándula mamaria, cultivada en medio DMEM suplementado con 10% SFB y 100 μg/ml de penicilina/estreptomicina. ‐ S49: línea derivada de linfoma T de ratón, se crecieron en medio DMEM suplementado con 10 % SFB y 100 μg/ml de penicilina/estreptomicina, manteniéndose su densidad no superior a 2x106 células/ml. Todos los tipos celulares fueron cultivados a 37°C en atmósfera húmeda conteniendo 4.5 % CO2. 3. Tratamientos en las líneas celulares Antes de cada tratamiento, las células se incubaron en medio libre de esteroides (utilizando suero delipidado) por al menos 15 hs. La dexametasona fue utilizada en concentraciones finales de entre 10‐6 M y 10‐8 M según se indica. Los análogos rígidos de esteroides se utilizaron a concentración final de 10‐5 M. El RU486 se utilizó a concentración final de 10‐6 M. La melatonina fue utilizada a concentraciones finales de 10‐7 M o 10‐8 M según se indica. La elección de dichas concentraciones finales surgió a partir de curvas concentración‐
respuesta, previamente realizadas en el laboratorio. El Luzindole se utilizó a una concentración de 20 µM. Los controles se realizaron agregando solo el vehículo (etanol o DMSO según corresponda) al medio de incubación. El tiempo de incubación con las distintas drogas varió dependiendo del ensayo realizado. En todos los casos, los tratamientos fueron asignados al azar a cada placa de células, y cada tratamiento se realizó por duplicado o triplicado (réplicas independientes). 76
Materiales y Métodos
4. Cultivos primarios de timocitos Ratones macho de la cepa CF‐1 fueron mantenidos en condiciones controladas con libre acceso a comida y agua. A los 21 días de edad, fueron sacrificados por dislocación cervical y se les extrajo el timo. Se preparó una suspensión de timocitos disgregando el tejido con tijera (sumergido en medio de cultivo RPMI, con 10% SFB libre de esteroides, y concanavalina A 2 μM) y posterior filtrado en gasa. El número de timos utilizados dependió del tipo de experimento: para los experimentos de interacción ligando‐receptor in vivo (figura 60) se utilizó 1 timo por tratamiento (4 tratamientos por duplicado) mientras que para los experimentos de coinmunoprecipitación (figura 61) se utilizaron aproximadamente 20 timos por experimento. Posteriormente se incubaron en placas de 24 wells a 37°C en un volumen final de 1 ml de medio RPMI 1640, con 10% de suero fetal bovino libre de esteroides y concanavalina A 2 μM. 5. Tratamientos en los cultivos primarios Las distintas drogas fueron agregadas al medio en donde se realizaron los cultivos primarios. Tanto la dexametasona como la melatonina fueron utilizadas en concentraciones finales de 10‐8 M mientras que el RU486 se utilizó a concentración final de 10‐6 M. Los controles se realizaron agregando igual volumen de etanol al medio de incubación. El tiempo de incubación con las distintas drogas varió de acuerdo con el experimento realizado. En todos los casos las drogas fueron agregadas inmediatamente después de haber establecido el cultivo. En todos los experimentos, la asignación de los tratamientos fue realizada al azar. 6. Inmunofluorescencia indirecta Células L929 o HC11 crecidas sobre cubreobjetos circulares (diámetro 10 mm) fueron fijadas con paraformaldehído 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se realizaron 2 lavados de 1 minuto con PBS. Luego las células se permeabilizaron con una solución de SDS 0.1% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se realizó un bloqueo con una solución de sero‐albúmina bovina (BSA) 3% en PBS durante 30 minutos. A partir de aquí se prosiguió protegiendo a las células de la luz. Se incubó el cubreobjetos boca abajo sobre Parafilm con 20 µl de una dilución 1/50 de anticuerpo primario específico anti‐GR (FiGR) preparado en PBS conteniendo 3% de BSA durante 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con PBS‐BSA 3% y se incubó con un anticuerpo anti‐IgG de ratón acoplado al fluoróforo 77
Materiales y Métodos
Alexa flúor 488 (Molecular Probes, cat # A‐11001, máximo de absorbancia = 495 nm y de emisión = 519 nm) (anticuerpo secundario, dilución 1/200) preparado en PBS‐BSA 3% durante 30 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente. Se realizaron 3 lavados de 5 minutos con PBS‐BSA 3% y un lavado de 5 minutos con agua destilada. Por último, se montaron los cubreobjetos sobre un portaobjetos con una solución 1:1 PBS/glicerol. La visualización de la fluorescencia se realizó mediante un microscopio confocal (Modelo Olympus FV300). 7. Detección de proteínas fluorescentes en células fijadas Células L929, BHK, o Cos‐7 previamente transfectadas con plásmidos que codifican para GFPGR o GFP crecidas en cubreobjetos (20 x 20 mm) y tratadas con diferentes drogas fueron fijadas con paraformaldehído 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se realizaron 2 lavados de 1 minuto con PBS. Se montaron los cubreobjetos sobre un portaobjetos con una solución 1:1 PBS/glicerol. La visualización de la fluorescencia se realizó mediante un microscopio confocal (Modelo Olympus FV300 o FV1000). 8. Plásmidos utilizados A lo largo de este trabajo se utilizaron los siguientes plásmidos: •
pRSV‐GR: vector conteniendo la región codificante del GR humano río abajo del promotor del virus de sarcoma de Roux (RSV), gentilmente cedido por el Dr. Keith Yamamoto, •
University of California, USA [76]. pMMTV‐LUC: vector reportero conteniendo el gen de la luciferasa bajo el control del promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) que contiene cinco elementos de •
•
respuesta a glucocorticoides [370]. pCMV‐LacZ: vector conteniendo el gen de la β‐galactosidasa bajo el promotor del citomegalovirus. pEGFP C3: vector conteniendo el gen modificado de la Green Fluorescence protein (EGFP). Este vector de expresión permite el clonado de una proteína quimera en donde la GFP se •
ubica en el extremo N‐terminal de la proteína de interés (Clontech). pEGFPGR: vector de expresión construido a partir del plásmido anterior, en donde el GR de ratón se fusionó hacia el C‐terminal de la EGFP [371]. 78
Materiales y Métodos
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pTIF2: Vector que codifica para el coactivador TIF2/GRIP1, gentilmente cedido por la Dra. Monica Costas [372]. pcJun: Vector que sobreexpresa al factor de transcripción, componente de AP1, cJun. Gentilmente cedido por el Dr. Omar Coso [373]. pRelA: Vector que sobreexpresa RelA, forma activa de NF‐κB [374]. pκB‐LUC: vector reportero conteniendo el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor dependiente del factor NFκB. Gentilmente cedido por la Dra. Mónica Costas •
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[375]. pAP1‐LUC: vector reportero conteniendo el gen de la luciferasa bajo el control de un promotor dependiente del factor AP‐1 [373]. pBAX I –LUC: Vector reportero que contiene el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de Bax (longitud aproximada de 6500 pb, río arriba del primer ATG codificante). •
Gentilmente cedido por el Dr. Möröy [376]. pBAX II – LUC: Vector reportero que contiene el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de Bax (longitud aproximada de 1040 pb, río arriba del primer ATG codificante). •
Gentilmente cedido por el Dr. Möröy [376]. pBAX III – LUC: Vector reportero que contiene el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de Bax (longitud aproximada de 2675 pb, río arriba del primer ATG codificante). Gentilmente cedido por el Dr. Möröy [376]. 9. Preparación de plásmidos a gran escala 9.1 Preparación de bacterias competentes Bacterias de la especie Escherichia coli, cepa DH5α fueron cultivadas en medio LB (10 g/l peptona; 5 g/l Extracto de levadura; 5 g/l NaCl) a 37°C hasta alcanzar una densidad óptica (OD) de 0.3. A 5 ml de ese cultivo se le agregaron 100 ml de LB y se creció hasta una OD de 0.5. Posteriormente se mantuvo el cultivo durante 10 minutos a 0°C y se centrifugó por 10 minutos a 3000g a 4°C. El sobrenadante fue descartado y el pellet se resuspendió en 40 ml de TFBI (30 mM Acetato de potasio; 100 mM KCl; 10 mM CaCl2; 50 mM MnCl2; 15% Glicerol; pH 5.2). Se dejó en hielo por 5 minutos y se centrifugó nuevamente por 10 minutos a 3000g a 4°C. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 4 ml de TFB II (10 mM MOPS; 75 mM CaCl2; 10 mM KCl; 15% Glicerol; pH 6.5). A continuación se dejó reposar las células en hielo durante 15 minutos 79
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para luego guardarlas a ‐70°C en alícuotas de 200 µl. Las bacterias se utilizaron a partir de las 48 horas de haber realizado este procedimiento. 9.2 Transformación de bacterias competentes Con 1 µl de cada plásmido a amplificar, se transformaron bacterias competentes Escherichia coli de la cepa DH5α mediante shock térmico a 42 °C durante 90 segundos. A continuación se incubó en medio LB líquido, sin antibiótico, a 37°C durante 30 minutos en agitación permanente. Las bacterias se plaquearon en placas de Petri, de agar‐LB (LB + 15 g/L de Agar) con ampicilina 100 µg/ml, y se dejaron en estufa a 37°C durante 16 horas. Posteriormente se picaron algunas colonias y se realizaron minicultivos en LB‐Ampicilina a 37°C durante 16 horas, en agitación permanente. 9.3 Preparación de Plásmidos Los minicultivos obtenidos fueron cultivados durante 24 horas en 400 ml de medio TB (1.33% Peptona; 2.675% extracto de lavadura; 0.4% Glicerol; 0.26% KH2PO4; 1.39% K2HPO4) con 100 µg/ml de Ampicilina (Bagó). Se centrifugaron las bacterias 15 minutos a 4000 rpm y se descartó el sobrenadante. Las bacterias fueron resuspendidas en 10 ml de Solución I (25 mM Tris‐
HCl pH 8; 10 mM EDTA pH 8), se agitaron durante 5 minutos y se les agregó 20 ml de Solución II (0.2 M NaOH; 1% SDS). Luego se mezcló por inversión y se dejó a 0°C por 20 minutos. Posteriormente se colocaron 15 ml de Solución III (3 M Acetato de potasio; 11.5% Acético glacial), se mezcló por inversión por 5 minutos a 0°C, y se centrifugó por 30 minutos a 10000 rpm a 4°C. Al sobrenadante se le agregaron 0.6 volúmenes de isopropanol, se mezcló, y dejó 20 min a –20°C. Se centrifugó 1 hora a 5000 rpm a 4°C y se descartó el sobrenadante. El pellet fue resuspendido en 3 ml de TE (10 mM Tris‐HCl pH 8; 1 mM EDTA), se agregó igual volumen de LiCl 5 M (frío), se mezcló y centrifugó a 10000 rpm por 5 minutos en frío. Se colectó el sobrenadante, se le agregó igual volumen de isopropanol, se mezcló y centrifugó 5 min a 10000 rpm a 4°C. El sobrenadante se descartó, el pellet fue resuspendido en 0.5 ml de TE y se agregó 1 µl de ARNsa A 20 mg/ml incubándolo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se agregó igual volumen de 13% polietilenglicol (PEG) en 1.6M NaCl, se mezcló y se centrifugó 5 minutos a 13000 rpm. El pellet obtenido se resuspendió en 400 ml de TE. Se realizaron extracciones con 1 volumen 80
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de fenol saturado en TE (una vez), 1 volumen fenol (saturado en TE):cloroformo (2 veces), y 1 volumen cloroformo (una vez). Se agregó 0.1 volumen de Acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 2.5 volúmenes de ETOH 100 % . Se dejó 20 min a ‐20°C. Por último, se centrifugó 15 minutos a 13000 rpm, se lavó con 70 % ETOH y se resuspendió el pellet en 200‐500 µl de TE. La concentración de ADN obtenida se calculó como (μg de ADN/μl) = OD260 x 50 x Fdil/1000. 10. Transfecciones transitorias 10.1 Transfecciones por Lipofección Las células Cos‐7, L929, MCF7, HC11 y BHK21 fueron transfectadas en forma transitoria mediante el método de Lipofección (lípidos catiónicos). Se utilizó Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, cuando las células alcanzaron el 70 ‐ 90% de confluencia, fueron tripsinizadas con 1 ml de tripsina 0.25% (Hyclone). Luego se contaron en una cámara de Neubauer y se plaquearon según se indica en la tabla 1 el número de células correspondientes a la placa utilizada en el volumen correspondiente de DMEM sin suero ni antibióticos. Cada placa es una réplica independiente. Por otro lado, se preparó la mezcla de Lipofectamina 2000 y del ADN a transfectar de la siguiente manera: en el tubo 1 se colocó DMEM junto con las cantidades de ADN a transfectar señaladas en cada caso (ver tabla 1). En el tubo 2 se agregó el medio de cultivo junto con la Lipofectamina 2000. Luego de 5 minutos se mezclaron en igual proporción los tubos (el tubo 1 en el tubo 2), se esperó 20 minutos, y se agregó gota a gota la mezcla por placa de células a transfectar. Se dejó incubando 6 hs o toda la noche a 37°C en atmósfera húmeda conteniendo 4.5 % CO2. A continuación, se reemplazó el medio por DMEM con 10% de SFB libre de esteroides y antibióticos; y se aplicaron los tratamientos correspondientes. Posteriormente las células fueron fijadas, analizadas in vivo en el microscopio confocal o lisadas para luego determinar la actividad de Luciferasa y β‐galactosidasa como se indica en la próxima sección. 81
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10.2 Transfecciones por DEAE‐Dextrano Las células S49 fueron transfectadas en forma transitoria mediante el uso de DEAE‐
Dextrano [377,378]. El protocolo ha sido modificado de la siguiente manera: se utilizaron 50 µg de ADN por cada 2x107 células a transfectar. En cada tratamiento (réplica) se utilizaron 1x107 células. Brevemente, se colocaron 50 µg de ADN a transfectar en 0.5 ml de STBS (25 mM Tris‐HCl pH 7.4; 137 mN NaCl; 5 mM KCl; 0.6 mM Na2HPO4; 0.7 mM CaCl2; 0.5 mM MgCl2). Se centrifugaron 2x107 de células por 5 minutos a 1500 rpm y luego se las lavó con 5 ml de STBS. Mientras tanto, se agregó 0.5 ml de una solución de DEAE‐dextrano 1 mg/ml a los 0.5 ml de STBS conteniendo el ADN. Posteriormente, las células centrifugadas fueron resuspendidas en esta última solución. Se incubaron por 20 minutos a temperatura ambiente y se agregó (gota a gota) DMSO hasta una concentración final de 1% . Se incubó la solución por 3 minutos y se agregaron 15 ml de STBS. Inmediatamente se centrifugó por 10 minutos a 1000 rpm y se lavaron las células con otros 10 ml de STBS. A continuación se resuspendieron las células en medio DMEM (sin suplemento alguno) y se centrifugación por 5 minutos a 1200 rpm. Por último, se resuspendieron las células en medio completo con suero delipidado a una densidad de 106 células/ml. Luego de 24‐48 hs de comenzada la transfección se lisaron las células para determinar actividad de Luciferasa y β‐galactosidasa como se indica en la próxima sección. 11. Determinación de la actividad de Luciferasa y de β‐Galactosidasa Luego de la aplicación de los tratamientos a las células transfectadas, dichas células fueron lavadas con PBS y se lisaron con 50‐200 µl de Buffer de Lisis (Cell Culture Lysis Reagent E153A, Promega). Las cantidades utilizadas del buffer variaron según el tipo celular y la placa en las que fueron cultivadas. A continuación se trasvasaron los lisados a tubos Eppendorf y se centrifugaron 5 minutos a 13000 rpm. Sobre los sobrenadantes (extractos) se ensayaron las distintas actividades enzimáticas. La determinación de los niveles de actividad de luciferasa se realizó utilizando el kit Luciferase Assay System (Promega, E1501); 10‐50 µl del sobrenadante (dependiendo del experimento) fueron incubados con 20‐50 µl del Buffer de ensayo (Luciferase assay Buffer, Promega) en oscuridad parcial, y se cuantificó la actividad de luciferasa durante 30‐60 segundos, en un luminómetro Hidex (Tipo 425‐014, Finlandia). 83
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La detección de la actividad de la enzima β‐Galactosidasa se realizó mediante un método colorimétrico [379]. A 25 µl de muestra se le agregaron 350 µl de Buffer Z (60 mM Na2HPO4; 40 mM NaH2PO4; 10 mM KCl; 1 mM MgSO4; 0.27% β‐Mercaptoetanol). Luego de 5 minutos a 30°C se le agregaron 75 µl de orto‐nitro‐fenil‐galactopiranósido (4 mg/ml ONPG, Sigma) y se mantuvo a 30‐35°C hasta observar la aparición de color amarillo. La reacción se detuvo (en todas la muestras al mismo tiempo) con 187.5 µl de 1 M Na2CO3 y se determinó la absorbancia a 415 nm con un espectrofotómetro DU serie 500 (Beckman). Cada muestra se determinó por duplicado. Como blanco de reacción se utilizó solución de ensayo. 12. Distribución intranuclear de GFPGR 12.1 Obtención de las muestras biológicas Las células Cos‐7 o BHK fueron cultivadas sobre cubreobjetos circulares (diámetro 24 mm) y se transfectaron con el plásmido pEGFPGR o pEFGP acorde a lo indicado en la sección de transfecciones. Luego de 1‐6 hs de estímulos las células fueron incubadas en solución RAB (10 mM Hepes pH 7.4; 135 mM NaCl; 10 mM KCl; 0.4 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1% Glucosa) junto con el estímulo correspondiente y observadas en el microscopio confocal (Olympus FV1000). 12.2 Obtención de las imágenes por microscopía confocal En todos los casos se utilizó un objetivo UPlanSApo 60X (Olympus) de apertura numérica 1.35. Como fuente de excitación se utilizó un laser de Argón multi‐lineal ajustado a 488 nm (potencia media en la muestra = 700 nW). La fluorescencia se detectó con un fotomultiplicador ajustado al modo pseudo photon‐counting detection. Una vez seleccionada la célula a analizar se tomó una imagen de 512 x 512 pixeles con una velocidad de barrido de 20 µseg/pixel. El tamaño del pixel para las células Cos‐7 fue de 103 nm mientras que para las células BHK fue de 82 nm. Se realizaron al menos 20 determinaciones independientes por tratamiento. 12.3 Análisis de las imágenes y cálculo del coeficiente de variación (CV) Las imágenes obtenidas fueron analizadas con el programa Image J (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA. http://rsb.info.nih.gov/ij/), basados en el trabajo de Schaaf y 84
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colaboradores [380]. Para cada imagen, se trazó una línea recta dentro del núcleo de manera tal de maximizar la cantidad de pixeles analizados, pero evitando atravesar nucléolos (figura 23). Figura 23. Método de obtención del coeficiente de variación (CV) para el análisis de la distribución intranuclear del GFPGR. Se muestra a modo ilustrativo dos células con distribuciones intranucleares opuestas de GFPGR. Para calcular el CV de una dada célula, se traza una línea recta (amarilla en la figura) de manera de no atravesar ningún nucléolo. Mediante el programa Image J se calcula la intensidad de cada pixel a lo largo de la línea trazada, como se muestra en el gráfico. Entonces, para cada línea se obtiene la media de los pixeles que la integran y su desvió estándar. Finalmente se calcula el coeficiente de variación (CV) como el cociente de ambas variables. Una vez obtenida la intensidad en cada pixel abarcado por la línea, se calculó el coeficiente de variación (CV) para cada célula a partir del cociente entre el desvío estándar y la intensidad media de los pixeles atravesados por la línea. A modo ilustrativo, en la figura 23A podemos observar tanto en forma cualitativa (al mirar la célula) así como cuantitativa (histograma de intensidad de fluorescencia) una clara distribución puntiforme del receptor. Por el contrario, en la figura 23B observamos una distribución homogénea: mientras más homogénea sea la distribución del receptor dentro del núcleo, menor será el CV. Este parámetro permite entonces cuantificar el grado de homogeneidad de la distribución del GR dentro del núcleo. 85
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13. Ensayos de retardo en gel (EMSA) 13.1 Extracción de proteínas nucleares Se extrajeron proteínas nucleares según el protocolo de Andrews y Faller [381]. Brevemente, se crecieron células BHK a confluencia en placas de 60 mm y luego de una noche en medio con suero libre de esteroides se trataron durante 30 minutos con las drogas correspondientes. Las células se levantaron mediante rastrillado con 1 ml de PBS frío y se centrifugaron por 5 minutos a 1500 rpm. El pellet obtenido se resuspendió en 400 µl de Buffer A frío (10 mM HEPES‐KOH pH 7.9, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.2 mM PMSF), se mezcló por inversión, se dejó en hielo por 10 minutos y se agitó durante 10 segundos. A continuación se centrifugó el lisado por 30 segundos a 13000 rpm y se descartó el sobrenadante. El pellet obtenido se resuspendió en 50 µl de buffer C (20 mM HEPES‐KOH pH 7.9, 25% glicerol, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT), suplementado con inhibidores de proteasas (Protease inhibitor cocktail set I, Calbiochem, San Diego, CA, USA). Luego de 20 minutos de incubación en hielo, las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 13000 rpm y al sobrenadante se lo guardó en alícuotas de 16 µl a ‐70°C. Para evitar la disociación de los ligandos con el receptor, a los extractos proteicos finales se les agregó igual concentración final del ligando utilizado in vivo. 13.2 Preparación de las sondas radioactivas Los oligonucleótidos utilizados como sonda fueron sintetizados por Invitrogen. Cada oligonucleótido (simple cadena) fue resuspendido a una concentración de 10 µg/µl. Para la reacción de hibridación se tomaron 2.5 µl de cada cadena y se les agregó 95 µl de solución de hibridación (10 mM Tris‐HCl pH 7.5; 1 mM EDTA, 30 mM KCl). La mezcla se incubó por 10 minutos a 90°C y se dejó enfriar lentamente hasta alcanzar temperatura ambiente (aproximadamente 2 horas). Los oligonucleótidos doble cadena se guardaron a ‐20°C. La sonda se marcó radiactivamente en sus extremos 5’ con [32P] ‐ATPγ (Amersham) y la enzima T4 polinucleótido quinasa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, en 25 µl de reacción se agregaron 1 µg de Sonda, 10 U de enzima y 25 µCi de [32P] ‐
ATPγ. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 37°C y la reacción se detuvo mediante el agregado de 5 mM EDTA. 86
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Para separar la sonda marcada del ATP radiactivo se llevó la mezcla de reacción a 50 µl con agua miliQ, y se pasó por columna S‐200 (GE healthcare) según instrucciones del fabricante. Brevemente, se rompe la punta de la base de la columna y se centrifuga sobre eppendorf sin tapa 1 minuto a 3000 rpm. Se descarta el eluído y se pasa la mezcla conteniendo la sonda sobre la columna. Se centrifuga por 2 minutos a 3000 rpm en eppendorf sin tapa y se guarda el eluído (la columna retiene el [32P] ‐ATPγ). 13.3 Reacción de unión sonda/proteínas nucleares Para el ensayo de unión entre la sonda y el extracto proteico se agregaron (por reacción) 12.5 µl de solución de unión 2X (10 mM Tris‐HCl pH 8; 1 mM β‐MSH; 10% Glicerol; 1 mM EDTA), 1µg PolidIdC, 90 ng de ADN de timo bovino, 60 µg de BSA, 3 µg de extracto proteico, y 1µg de sonda específica no radiactiva o 20 ng de pBluescript según corresponda. Esta mezcla se incubó por 15 minutos a temperatura ambiente y luego se agregó 10 ng de sonda radiactiva. Se incubó por otros 20 minutos a temperatura ambiente y se sembró en el gel, como se indica en la próxima sección. En el caso de los experimentos de disociación, por cada tratamiento se agregaron 60 µl de solución de unión2X, 1µg PolidIdC, 90 ng ADN de Calfthymus, 60 µg de BSA, 18 µg de extracto proteico, y 50 ng de sonda radiactiva. Esta mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se agregó 10 µg (200x) de sonda radioinerte. A partir de ese momento, y a los 1; 2.5; 5; 10 y 20 minutos se extrajeron alícuotas que se sembraron inmediatamente en el gel, mientras se encontraba corriendo a 200V. 13.4 Electroforesis, secado del gel y revelado Las muestras se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida (29:1 acrilamida: bisacrilamida) 6% en TGE 1X (40 mM Tris, 0.27M Glicina, 2 mM EDTA). Se realizó una pre‐corrida del gel por 30 minutos a 200 V y luego las muestras se sembraron y corrieron durante aproximadamente 2 horas a igual voltaje. Posteriormente, el gel se secó durante 2 horas a 80 ºC en vacío, se reveló por autorradiografía, o mediante STORM® PhosphorImager. Las bandas presentes en las imágenes fueron cuantificadas utilizando el programa Image J 1.34s (Wayne Rasband, National Institute of Health). 87
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14. Estudios de Número y Brillo (N&B) 14.1 Obtención de las muestras biológicas Las células L929, Cos‐7 y BHK fueron cultivadas sobre cubreobjetos circulares (diámetro 25 mm) y se transfectaron con el plásmido pEGFPGR acorde a lo indicado en la sección de transfecciones. Luego de 1‐6 hs de estímulos las células fueron incubadas en solución RAB (10 mM Hepes pH 7.4; 135 mM NaCl; 10 mM KCl; 0.4 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1% Glucosa) junto con el estímulo correspondiente y observadas en el microscopio confocal (Olympus FV1000). 14.2 Obtención de las imágenes por microscopía confocal En todos los casos se utilizó un objetivo UPlanSApo 60X (Olympus) de apertura numérica 1.35. Como fuente de excitación se utilizó un laser de Argón multi‐lineal ajustado a 488 nm (potencia media en la muestra = 700 nW). La fluorescencia se detectó con un fotomultiplicador ajustado al modo pseudo photon‐counting detection. Una vez seleccionada la célula a analizar se tomaron 200 imágenes (tamaño 256 x 256 pixeles) secuenciales con una velocidad de barrido de 10 µseg/pixel, con un tamaño de pixel de 82 nm. El tiempo aproximado de toma de imágenes para cada célula es de 3 minutos. Durante una sesión de trabajo (aproximadamente 8 horas) se pudieron medir hasta 3 tratamientos. 14.3 Análisis de las imágenes y cálculo del Brillo Las imágenes fueron analizadas usando el algoritmo N&B del programa "GLOBALS for Images" desarrollado en el laboratorio de Fluorescence Dynamics (UCI, Irvine, CA) [382,383]. Con este programa se determina la intensidad media (⟨k⟩) y la varianza (σ2) de cada pixel a partir de los valores de intensidad obtenidos en cada una de las 200 imágenes secuenciales de cada célula. El brillo aparente (B) se calcula como el cociente entre σ2 y ⟨k⟩ para cada pixel de la imagen mientras que el número aparente de partículas en movimiento corresponde al cociente entre ⟨k⟩ y B. La salida de datos del programa es un histograma (de los 65536 (256 x 256) pixeles de la imagen) para B, es decir, el número de pixeles que presentan un determinado brillo aparente. Seleccionando el cluster de pixeles que uno desea analizar (por ejemplo conjunto de pixeles que se encuentran en citoplasma o en núcleo) y mediante la obtención del histograma para ese cluster, uno puede calcular el brillo aparente medio para ese conjunto de pixeles (i.e. región de la 88
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célula) (ver figura 24). Esto se logra a través de una aproximación de estos datos a una distribución normal de Gauss. Este cálculo fue realizado con el programa Excel® 2000, a través de su función Solver. En un trabajo anterior, Digman y colaboradores han demostrado que B = 1 + ε, donde ε representa el brillo real [382]. Por lo tanto, se puede obtener fácilmente el valor de ε a partir de los valores de B. Más aún, este tipo de análisis provee información concerniente a las moléculas fluorescentes que se encuentren en movimiento dado que moléculas estáticas darán valores de B = 1 (para mayor detalles consultar Digman y colaboradores [382]). Figura 24. Medición del Brillo de moléculas de GFPGR. A. Foto representativa de una célula tratada con 21OH‐
6,19OP. B. La figura muestra valores del histograma de B para dos regiones de la célula mostrada en A. El histograma de la izquierda (azul) corresponde a la región citoplasmática de la célula (puntos rojos en cuadro izquierdo). Por el contrario, el histograma de la derecha (negro) corresponde a la región nuclear de la célula (puntos rojos en cuadro derecho). Como puede observarse, los valores nucleares de B son –en promedio – mayores a los valores citoplasmáticos. Esto indica un mayor grado de oligomerización en el núcleo con respecto al citoplasma. Cada histograma se aproxima a una distribución de Gauss para obtener su valor medio. Finalmente, el brillo real (ε) es B‐1. En resumen, el brillo real (ε) se define como ε = B ‐1, donde B es el brillo aparente [382]. De esta manera, se calculó el brillo real medio para cada región (citoplasma vs núcleo) de cada célula. Se analizaron el menos 15 células por tratamiento. 15. Ensayos de coinmunoprecipitación 15.1 Estudios In vivo Una vez que las células fueron tratadas con los estímulos correspondientes se procedió a la lisis de las mismas: 89
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En el caso de las células crecidas en suspensión (cultivo primario de timocitos o células S49) se centrifugaron por 10 minutos a 1000 rpm, se las lavó 1 vez con PBS frío y se lisaron agregando 200‐400 µl de solución HEM (10 mM Hepes pH 7.5; 1 mM EDTA; 20 mM Molibdato de sodio; 0.1% NP‐40, Cocktail de inhibidores de proteasas (Protease inhibitor cocktail set I, Calbiochem, San Diego, CA, USA)). Las muestras se homogeneizaron en microhomogeneizador vidrio‐teflón, se centrifugaron por 10 minutos a 13000 rpm a 4°C y se colectó el sobrenadante. ̇
En el caso de las células crecidas en placa (BHK), las células fueron colectadas mediante rastrillado en presencia de PBS frío y luego centrifugadas por 5 minutos a 1500 rpm. Se retiró el sobrenadante y se lisaron las células con 200 µl de CytoBufer® (Novagen, cat. No. 71009) [384]; suplementado con inhibidores de proteasas (Protease inhibitor cocktail set I, Calbiochem, San Diego, CA, USA). Luego de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente las muestras fueron centrifugadas por 5 minutos a 13000 rpm a 4°C y se colectó el sobrenadante. A partir de este paso, el protocolo es idéntico para todas las líneas celulares o el cultivo primario. Se tomó 1 mg de proteínas por tratamiento (a excepción del experimento para la identificación por MALDI‐TOF donde su usaron 8 mg) y se las llevó a un volumen de 200 µl con la solución correspondiente. En un primer paso, se realizó un pre‐clareado de la muestra con el agregado de 15 µl de una solución de Proteína A/G plus agarosa (Santa Cruz, cat # sc‐2003) en solución HEM (relación 2:1 respectivamente) y se mezcló por rotación durante 1 hora a 4°C. Posteriormente, se centrifugó por 3 minutos a 13000 RPM y se colectó el sobrenadante. A continuación, se realizó la inmunoprecipitación con 30 µl de la solución de Proteína A/G plus agarosa en solución HEM y el anticuerpo correspondiente (Ver tabla 2). Al sobrenadante se le agregó solución de siembra para ser sometido a un ensayo de Western Blot. Por otro lado, el inmunoprecipitado (IP) fue lavado con TEGM (10 mM HEPES pH 7.5; 1 mM EDTA; 20 mM Molibdato de sodio; 5% Glicerol; 50 mM NaCl), agitado y centrifugado por 3 minutos a 13000 RPM. Este procedimiento se repitió 3 veces. Por último, el IP fue resuspendido en solución de siembra y sometido a ensayo de Western blot como se indica en la próxima sección. 90
Materiales y Métodos
Tipo celular BHK Timocitos Número de células por tratamiento ≈ 6.000.000 (placa p100 confluente) ≈ 30.000.000 (4 timos) Solución de extracción Masa de proteínas (mg) Anticuerpo para inmunoprecipitar (µl) CytoBuffer 1 4 µl anti‐TIF2 HEM 1 S49 30.000.000 HEM 0.1% NP40 1 S49 (MALDI) 80.000.000 HEM 0.1% NP40 8 2 µl anti‐GR (FiGR) 3 µl anti‐GR (FiGR) 5 µl anti‐GR (FiGR) Tabla 2. Coinmunoprecipitación in vivo. Se muestra ‐ para cada tipo celular ‐ el número aproximado de células utilizadas por tratamiento, el buffer de extracción utilizado, la masa de proteínas que se usó para inmunoprecipitar y la cantidad de anticuerpo con el cual se realizó la inmunoprecipitación en cada caso. 15.2 Estudios In vitro El extracto proteico utilizado para los experimentos de coinmunoprecipitación in vitro fue obtenido a partir de un homogenato de timo de ratón. Para ello, ratones macho de la cepa CF‐1 fueron mantenidos en condiciones controladas con libre acceso a comida y agua. A los 21 días de edad, fueron sacrificados por dislocación cervical y se les extrajo el timo. Para cada experimento, 3 timos se homogeneizaron en Solución de unión (10 mM Hepes, 5 mM EDTA, 20 mM Molibdato de Sodio, 10 % Glicerol, 0.1 mM PMSF) en microhomogeneizador vidrio‐teflón. Posteriormente, se centrifugaron por 10 minutos a 13000 rpm a 4°C y se colectó el sobrenadante. Se separaron alícuotas conteniendo 1 mg de proteínas (en un volumen de 200 µl) y se incubaron en presencia o ausencia de 5 µM dexametasona por 2 horas en hielo, en presencia o ausencia de 20 mM Molibdato de sodio. La mitad de las muestras se incubaron a 25°C por 1 hora mientras que el resto permaneció en hielo. Luego, se detuvo la reacción por el agregado de 1 mM de Molibdato de sodio y posterior enfriamiento en hielo por 30 minutos. La reacción de inmunoprecipitación se llevó a cabo agregando 30 µl de Proteína A/G plus agarosa (Santa Cruz, cat # sc‐2003) en Solución de unión (relación 2:1 respectivamente), 2 µl del anticuerpo anti‐GR (FiGR) y se mezcló por rotación durante 2 horas a 4°C. Posteriormente, se centrifugó por 3 minutos a 13000 RPM. El IP fue lavado con TEGM (10 mM HEPES pH 7.5; 1 mM EDTA; 20 mM Molibdato de sodio; 5% Glicerol; 50 mM NaCl), agitado y centrifugado por 3 minutos a 13000 RPM. Este procedimiento se repitió 3 veces. Por último, el IP fue resuspendido en solución de siembra y sometido a ensayo de Western blot como se indica en la próxima sección. 91
Materiales y Métodos
16. Ensayos de Western blot 16.1 Preparación y cuantificación de las muestras Extractos de proteínas totales fueron obtenidos de células S49, utilizando solución de extracción de proteínas RIPA (20 mM Tris HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 10% glicerol, 0,1% SDS, 0,5% deoxicolato de sodio y 1 % tritón X100) suplementado con inhibidores de proteasas (Protease inhibitor cocktail set I, Calbiochem, San Diego, CA, USA). Las muestras se incubaron 10 minutos en hielo y luego se centrifugaron 5 minutos a 4°C a 13000 rpm. Las proteínas presentes en el sobrenadante se cuantificaron por el método de Bradford [385], usando una curva de calibración hecha con concentraciones de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma) que comprenden el rango 0.5‐3.5 µg/µl. El reactivo de Bradford está compuesto por 4 % p/v Coomasie blue G‐250; 5% Etanol Y 8,5% ácido fosfórico. A 30‐60 μg de proteínas totales o a las muestras inmunoprecipitadas se les agregó solución de siembra y se las calentó 5‐10 minutos a 100 °C para completar el proceso de desnaturalización. 16.2 Electroforesis y transferencia a membrana de PVDF Las proteínas se separaron por SDS‐PAGE en un gel de 7, 8, 9, 12 o 15% según corresponde durante 1.5 a 3 horas a 80‐100 Volts y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (Bio‐Rad, Hercules, CA, USA) durante 1.5 horas a 300mA o durante 3 horas a 100 Volts. Se realizó una tinción de proteínas durante 5 minutos con rojo Ponceau‐S al 0,1% en ácido acético 5% para verificar la eficiencia de la transferencia y facilitar el corte de las membranas para someterlas al revelado con diversos anticuerpos. 16.3 Incubación con anticuerpos y revelado Luego de la transferencia, se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS 0,1% Tween 20 (TPBS) conteniendo 5% de leche descremada (Molico o Purísima). Se incubó durante toda la noche a 4°C con los anticuerpos primarios específicos, preparados en TPBS conteniendo 3% de leche descremada. Posteriormente, se realizaron un lavado de 20 minutos y dos lavados de 5 minutos en TPBS para luego incubar la membrana con el anticuerpo secundario, preparado en TPBS conteniendo 3% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se realizaron nuevamente un lavado de 20 minutos y 2 lavados de 5 92
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minutos con TPBS. Finalmente, se reveló por quimioluminiscencia utilizando el reactivo ECL+Plus System (GE Health Care, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) en el detector FujiFilm ImageReader LAS‐1000. La intensidad de las bandas presentes en las imágenes fueron cuantificadas por densitometría utilizando el programa Image J 1.34s software (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA). 16.4 Anticuerpos primarios utilizados • Anti‐GR: monoclonal de ratón FiGR, provisto por el Dr. Jack Bodwell (Darthmouth Medical School); policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology) sc‐1002 (dilución 1/1000); sc‐1003 (dilución 1/1000); sc‐1004 (dilución 1/500). • Anti‐GRIP1/TIF2: policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology) sc‐8996, dilución 1/1000. • Anti‐Bax: policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology) sc‐493, dilución 1/1000. • Anti‐Actina: policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology) sc‐1616‐R, dilución 1/5000). • Anti‐Hsp90: monoclonal de ratón (StressGen, cat # SPA‐830), dilución 1/1000; policlonal de conejo [386], gentilmente cedido por la Dra. Mónica Costas, dilución 1/5000. • Anti‐Hsp70: policlonal de conejo (StressGen, 820/822), dilución 1/2000. • Anti‐FKBP51: policlonal de conejo (Affinity BioReagents, PA1‐020), dilución 1/2000. • Anti‐FKBP52: policlonal de conejo, UP30, provisto por el Dr. K. Leach (Pharmacia and Upjohn, Inc., Kalamazoo, MI); dilución 1/2000. • Anti‐PP5: policlonal de conejo, provisto por el Dr. M. Chinkers (University of Alabama, Mobile, AL); dilución 1/2000. 16.5 Anticuerpos secundarios utilizados Anti‐ratón acoplado a peroxidasa (SIGMA, cat # A‐4416, dilución 1/3000); anti‐conejo acoplado a peroxidasa (Bio‐rad, dilución 1/5000); anti‐conejo‐IgG de Santa Cruz Biotechnology (sc‐2004, dilución 1/5000). Anticuerpo anti‐IgG de ratón acoplado al fluoróforo Alexa flúor 488 (Molecular Probes, cat # A‐11001). 93
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16.6 Soluciones utilizadas • Solución de siembra: 40 mM Tris‐HCl pH 6.8; 6% glicerol; 0.006% azul de bromofenol; 1% SDS; 1% β‐Mercaptoetanol. • Solución de Corrida: 25 mM Tris‐HCl pH 8.3; 192 mM glicina; 0.1% SDS. • Solución de Transferencia: 25 mM Tris‐HCl pH 8.3; 192 mM glicina; 0.1% SDS; 20% Metanol. • Gel de poliacrilamida (gel de resolución): 7, 8, 9, 12 o 15% Acrilamida‐bisacrilamida 29:1 (BioRad catálogo # 161‐0156); 375 mM Tris‐HCl pH 8.8; 0.2% SDS; 0.2% persulfato de amonio; 0.075% TEMED. • Gel de poliacrilamida concentrador: 3.9% Acrilamida‐bisacrilamida (proporción 29:1); 0,25 M Tris‐HCl pH 6.8; 0.1% SDS; 0.2% persulfato de amonio; 0.075% TEMED. 17. Análisis de la fragmentación del ADN Se aisló ADN de células S49 previamente tratadas con dexametasona y/o melatonina siguiendo el protocolo descripto por Herrmann y colaboradores [387]. Brevemente, se crecieron células (106 por tratamiento) y luego de 24 hs de estímulo fueron centrifugadas por 5 minutos a 2000 rpm. El pellet fue resuspendido suavemente durante 1 minuto en 50 µl de buffer de lisis (5 mM Tris‐HCl pH 7,5; 20 mM EDTA; 1% Nonidet P‐40). Se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante (que contiene el ADN fragmentado) se recolectó en otro tubo. El pellet (ADN nuclear) fue nuevamente resuspendido en 50 µl de solución de lisis y se repitió el procedimiento, resuspendiendo el pellet esta vez en 100 µl. Ambas fracciones fueron incubadas durante 2 horas a 56°C con el agregado de 5 μg/μl de ribonucleasa A y 1% final de SDS. Luego de este tratamiento se agregó a cada muestra 5 μg/μl de proteinasa K y se incubó durante toda la noche a 37°C. El ADN fue precipitado mediante el agregado de 75 μl de 10 M acetato de amonio y 450 μl de etanol. Luego de centrifugar por 15 minutos a 13000 rpm y descartar el sobrenadante, se lavó el pellet con etanol 70% y el ADN fue resuspendido finalmente en 20 μl de agua destilada. Posteriormente fue corrido por electroforesis en gel de agarosa 1,8% durante 2 horas a 80 V y visualizado en un transiluminador UV (DyNA light, Labnet). Las fotografías se tomaron con cámara digital (Kodak DC290). 94
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18. Estudios con Actinomicina D y Anisomicina 18.1 Inhibición de la síntesis de ARN Se crecieron 5x106 células S49 en medio libre de esteroides a una densidad de 106 células/ml. Se pre‐trataron las células con dexametasona 10‐7 M o vehículo durante 4 horas. Posteriormente se agregó 5 µg/ml del inhibidor de la transcripción Actinomicina D y a las 0, 4, 8, 20, y 30 horas se tomaron alícuotas de 5 ml del cultivo (5 x106 células). A cada alícuota se le extrajo el ARN para posterior análisis. 18.2 Inhibición de la síntesis de proteínas Se crecieron 15x106 células S49 por tratamiento en medio libre de esteroides durante toda la noche a una densidad de 106 células/ml. Se realizó una pre‐incubación con 10‐6 M de Anisomicina por 30 minutos y luego se trataron las células con dexametasona 10‐7 M o vehículo. Luego de 4 hs de tratamiento se extrajo el ARN para posterior análisis. 19. Preparación de ARN Para preparar ARN total a partir de células adherentes (HC11 y L929), se partió de células crecidas hasta confluencia en placas p60. Cuando la extracción fue a partir de S49 o cultivos primarios de timocitos se utilizaron aproximadamente 5 x106 de células por tratamiento. La extracción del ARN se llevó a cabo utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Brevemente, las células fueron colectadas en Trizol (600 µl para las células en suspensión y 500 µl para las adherentes) y luego de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se agregó 0.2 ml de cloroformo por ml de trizol utilizado, mezclando vigorosamente por 15 segundos. Posteriormente se incubó a temperatura ambiente por 2‐3 minutos y se centrifugó durante 15 minutos a 12000 g a 4°C. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo para luego precipitar el ARN. Esto se logró agregando 0.5 ml de isopropanol por ml de trizol y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente. El pellet resultante fue lavado con 1 ml de EtOH 75 % y centrifugado por 5 minutos a 7500 g a 4°C. El ARN se resuspendió en 50 µl de agua libre de ARNsas. La concentración de ARN obtenido se calculó como [(µg de ARN/µl de 95
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solución) = OD260 x 40 x Fdil/1000]. Se verificó también que la relación OD260/OD280 comprendiese el rango 1,7 – 2, lo que indica una buena pureza del ARN total obtenido. 20. Retrotranscripción (generación de ADNc) Para realizar la retrotranscripción se utilizaron 4 μg de ARN total, 25 ng/ml de oligonucleótidos al azar (Random primers) (Invitrogen), 1mM de dNTPs (Invitrogen), 200 U de la enzima transcriptasa reversa MMLV (Promega), y se siguió el protocolo indicado por el fabricante. Brevemente, se llevó la muestra de ARN a 10 μl final con agua destilada libre de ARNasas y se desnaturalizó por calentamiento a 70°C durante 5 minutos en termocicladora. Luego, para evitar la renaturalización, la muestra se colocó inmediatamente en hielo. Finalmente se agregaron 10 μl de la mezcla conteniendo el resto de los reactivos mencionados anteriormente y se llevó a cabo la reacción utilizando el siguiente programa en termocicladora: 60 minutos a 37°C para que ocurra la retrotranscripción y 5 minutos a 95°C con el fin de inactivar la enzima. 21. PCR cuantitativa Todas las reacciones de PCR en tiempo real de este trabajo se realizaron en 25 μl de volumen final con 4 mM de MgCl2 (Invitrogen), 0,25 mM de dNTPs, 1,25 U de la enzima Taq polimerasa (Invitrogen) y 1 μM de cada oligonucleótido específico para la secuencia a amplificar. El seguimiento de la reacción se llevó a cabo mediante el agregado de Sybr Green (Roche) 1:30000 a la mezcla de reacción. La PCR se realizó en el ciclador ADN Engine Opticon (MJ Research). Como ADN molde para la reacción se utilizaron 2 μl de una dilución 1/10 de cada ADNc obtenido. Cada muestra a analizar fue determinada por triplicado. Los oligonucleótidos utilizados se encuentran en la tabla 3. El programa que se utilizó en todos los casos fue el siguiente: 4 minutos a 94°C, 40 ciclos de 40 segundos a 94°C, 40 segundos a 65°C y 40 segundos a 72°C, efectuándose una lectura de la fluorescencia producida al finalizar cada paso a 72°C. Para cada uno de los ADNs analizados, se realizaron curvas de temperatura de hibridación y de concentraciones de magnesio para seleccionar las condiciones óptimas de reacción. Se determinó que exista un sólo producto de amplificación mediante la observación de la curva de melting y de geles de agarosa teñidos con 96
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bromuro de etidio, y la amplificación producida por cada par de oligonucleótidos debió cumplir el requisito de tener una eficiencia cercana a 2. Para calcular la eficiencia promedio de la reacción y poder estimar la masa de molde inicial relativa en cada muestra se realizó en cada reacción una curva de calibración con diluciones al medio seriadas partiendo de una mezcla de los ADNc en estudio. Una vez calculada la masa inicial relativa en cada réplica, se promediaron las 3 réplicas y se normalizaron a los valores obtenidos para el ADNc de GAPDH, o ARN ribosomal en el caso de los experimentos con Actinomicina D. Finalmente, los valores obtenidos fueron relativizados al tratamiento control. Gen Primer directo (5'‐3') Primer reveso (5'‐3') Actina GAPDH Bax ROR Mel1a TTP HuR CCACACCCGCCACCAGTTC AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC GTTGCCCTCTTCTACTTTGC GCTGACGGAACTGCATGA CCGCAACAAGAAGCTCAGGAACTC CGGAACTCTGCCACAAG TGGGCTACGGTTTTGTG GACCCATTCCCACCATCACACC CGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG CCTCAGCCCATCTTCTTCC TGGATATGTTCTGGGCAAGGT TCG TACTTGAGGCTGTGGCAAATG GGCGAAAAGGAACAAGA GGACCCTGGAGTTGATGATT Temperatura de hibridación (°C) 65 65 65 57 60 52,5 52,5 Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para PCR. Se muestra el par de oligonucleótidoss utilizados para cada gen blanco a amplificar, junto con la temperatura de hibridación utilizada. 22. PCR semicuantitativa Todas las PCRs de este trabajo se realizaron en 25 μl de volumen final con 4 mM de MgCl2, 0,25 mM de dNTPs, 1,25 U de Taq polimerasa y 1 μM de cada oligonucleótido específico para la secuencia a amplificar. •
Para amplificar el ADNc proveniente del ARNm de TTP y HuR se utilizó el siguiente programa de PCR: 2 minutos a 94°C, 25 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 52.5°C y 1 minuto a 72°C; y una elongación final de 5 minutos a 72°C. •
Para amplificar el ADNc proveniente del ARNm de RORα se utilizó el siguiente programa de PCR: 3 minutos a 96°C, 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 57°C y 1 minuto a 72°C; y una elongación final de 5 minutos a 72°C. 97
Materiales y Métodos
•
Para amplificar el ADNc proveniente del ARNm de Mel1a se utilizó el siguiente programa de PCR: 3 minutos a 96°C, 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C y 1 minuto a 72°C; y una elongación final de 5 minutos a 72°C. •
Para amplificar el ADNc proveniente del ARNm de Actina se utilizó el siguiente programa de PCR: 3 minutos a 96°C, 30 ciclos de 40 segundos a 94°C, 30 segundos a 65°C y 40 segundos a 72°C; y una elongación final de 5 minutos a 72°C. Todos los productos (entre 200‐300 pb) se detectaron mediante la separación por electroforesis en gel de agarosa 1,5% teñido con BrEt, en TBE 1X (0,089 M de Tris‐Borato; 0,002 M de EDTA pH 8) y visualizado con luz ultravioleta. 23. Ensayos de competencia in vivo Se realizaron cultivos primarios de timocitos según lo indicado anteriormente. El volumen de incubación fue de 1.5 ml de medio (por tratamiento) sobre placa p6. Se agregaron a todos los tratamientos 5 nM de dexametasona tritiada ([3H]‐Dex, Ae = 26.5 Ci/mmol) y 2.5 µM de dexametasona radioinerte, 500 nM de RU486, o 500 nM de melatonina según corresponda. Luego de 1 hora de incubación a 37°C, se centrifugaron en frío por 5 minutos a 1500 rpm y se las lavó 2 veces con PBS frío. Posteriormente, las células se lisaron con 2 ml de líquido de centelleo Hisafe‐3 (Wallac) y se cuantificó la radioactividad en un contador (Wallac, modelo 1409DSA). 24. Identificación de proteínas por espectrometría de masa MALDI‐TOF 24.1 Principios de la espectrometría de masa MALDI‐TOF aplicada a proteínas Las partículas cargadas, cuando se someten a un campo electromagnético en el vacío presentan un comportamiento muy bien definido. La espectrometría de masa (MS) explota este principio, separando iones de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) [388]. En particular, para el caso de proteínas, éstas son previamente digeridas con una proteasa, generando péptidos más pequeños. Esta técnica se basa entonces en la ionización de esos péptidos, y en la capacidad del espectrómetro de determinar su relación m/z en tiempo real [389]. Para la ionización de los péptidos, las dos técnicas más utilizadas son la ESI (Electrospray ionization) y la MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization). En la técnica ESI, los péptidos, que deberán estar disueltos 98
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en fase líquida, pasan por una fina aguja que es sometida a un alto potencial eléctrico y de esta forma se vaporizan en finas gotas [390]. En la técnica MALDI, utilizada en este trabajo, la muestra se co‐cristaliza con una matriz sobre una placa, y se utiliza un Laser que, al excitar la matriz, ésta transmite energía a la muestra, produciendo su ionización [391]. Este último método genera partículas monocargadas mientras que el primero genera partículas multicargadas. En ambos tipos de espectrómetros, los péptidos ionizados son enfocados y se evalúa su relación m/z de acuerdo al tiempo de vuelo (TOF, time of flight) dentro del espectrómetro [389]. Esto permite generar los llamados espectros de MS, donde la combinación de m/z de varios péptidos generara una huella peptídica, que por comparación con bases de datos en las que se digieren las proteínas in silico, se genera una la lista de m/z teórica de los péptidos resultantes de la digestión, permitiendo así la identificación de una proteína (figura 25). Prot e ín a s
Pé pt idos
D ige st ión
En zim á t ica
List a de picos
e x pe rim e nt ales
Espe ct ro M S
840.695086
1676.96063
1498.8283
1045.564
2171.967066
861.107346
842.51458
1456.727405
863.268365
Com pa ra ción Est a díst ica
…MAI I LAGGHSVRFGPKAF
AEVNGETFYSRVI TLESTNM
FNEI I I STNAQLATQFKYPN
VVI DDENHNDKGPLAGI YTI
MKQHPEEELFFVVSVDTPMI
TGKAVSTLYQFLV …
Se cu e n cias e n la s
ba se s de da t os
D ige st ión
in silico
- MAIILAGGHSVR
- FGPK
- AFAEVNGETFYSR
- VITLESTNMFNEIIIS TNAQLA TQFK
- YPNVVIDDENHNDK
…
D ige st íon t e órica de
los pé pt idos
861.107346
838.695086
1676.96063
1498.8283
1045.564
2171.967066
842.51458
1457.827405
863.268453
List a de picos
t e óricos
Figura 25. Identificación de proteínas mediante espectrometría de masa (MS). Las proteínas a ser identificadas son digeridas enzimáticamente. Los péptidos resultantes se ionizan y se analizan dando lugar a un espectro MS, el cual es comparado con el espectro teórico de todas las proteínas que se encuentran en las bases de datos. Además, existe un análisis complementario que se realiza con equipos que permiten la espectrometría de masa en tándem (MS/MS). En estos casos, los péptidos ionizados con mayor señal en el MS son seleccionados para ser fragmentados a través de la colisión con partículas gaseosas que generan la ruptura de las uniones peptídicas. La masa de estos fragmentos será determinada, generando de esta manera un espectro de MS/MS, el cual puede compararse in silico contra otros espectros generados a partir de fragmentaciones teóricas en las bases de datos [389]. 99
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24.2 Obtención de las muestras Se trataron aproximadamente 8 x 107 células S49 con 10‐8 M dexametasona en presencia o ausencia de 10‐7 M melatonina por 45 minutos. Las células se lisaron y el extracto proteico se inmunoprecipitó contra el receptor de glucocorticoides acorde a lo mencionado en la sección correspondiente. Al inmunoprecipitado se lo sometío a una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: el 50% del inmunoprecipitado se lo separó en un gel de acrilamida al 15% , mientras que la otra mitad de la muestra se la separó en un gel al 7% . De esta manera, se resolvieron por un lado proteínas de bajo peso molecular (<50 kDa) y por otro lado, proteínas de alto peso molecular (>50 kDa), respectivamente. 24.3 Tinción con azul de Coomasie coloidal G250 Luego de realizar el PAGE‐SDS, se procedió a la tinción del gel con azul de Coomasie coloidal. En primer lugar, se realizaron tres incubaciones de 30 minutos con Solución I (30% Etanol, 2% ácido fosfórico) en agitación moderada. Posteriormente, se llevaron a cabo 3 lavados de 20 minutos con Solución II (2% ácido fosfórico), y luego se incubó por 30 minutos en Solución III (18% Etanol, 2% ácido fosfórico, 15 % Sulfato de amonio). Finalmente, se agregaron a 25 ml de la solución III, 1 ml de 2% Coomasie G250 y se dejó por 24 hs en agitación moderada. Por último, se realizaron una serie de lavados con agua miliQ, con el objeto de eliminar el background de colorante en el gel. 24.4 Espectrometría de masa MALDI‐TOF Luego de la tinción, se procedió al aislamiento de las bandas para su posterior identificación. Se decidió realizar cortes paralelos a lo largo de todos los geles. De cada fila aislada, se separaron en forma perpendicular los fragmentos correspondientes a cada tratamiento. Se realizaron un total de 21 cortes, obteniéndose 84 fragmentos (21 x 4 tratamientos) para ser identificados por espectrometría de masa. La misma se realizó en el Centro de Estudios Químicos y Biológicos por Espectrometría de Masa MALDI‐TOF (CEQUIBIEM), FCEN‐UBA. 100
Materiales y Métodos
25. Determinación de AMPc 25.1 Obtención de las muestras Se incubaron células BHK en placas p6 a 70‐90% confluencia en el medio descripto anteriormente, conteniendo 0.5 mM isobutil‐metilxantina (IBMX) y los distintos tratamientos, a 37°C durante 30 minutos. Se colectaron las células mediante rastrillado en 100 µl de H2O destilada y se llevó a 500 µl de volumen final con el mismo solvente. Posteriormente, las muestras se hirvieron durante 1 minuto y se sonicaron por 40 segundos. Una alícuota de 10 μl se utilizó para determinar la concentración de proteínas en cada tubo. 25.2 Radioinmunoensayo (RIA) Los niveles de AMPc se cuantificaron por radioinmunoensayo (RIA) de acuerdo al método establecido por Steiner y colaboradores [392]; y modificado por Mondillo y colaboradores [393]. La curva de calibración se realizó por duplicado con cantidades variables de AMPc (0; 12.5; 25; 50; 100; 175; 250; 500; 1000; 2500; 5000 fmoles) en una solución de acetato de sodio 50 mM (volumen final = 300 µl). Se tomaron 100 µl de cada muestra y se agregaron 20 µl de 250 mM acetato de sodio. Con el objeto de aumentar la afinidad del AMPc por el anticuerpo, se acetilaron con 10 µl de anhídrido acético/trietilamina (2:1). Luego, se mezclaron con 125I‐ScAMP‐TME (30000 cpm) y 100 µl de anticuerpo anti‐AMPc (Chemicon International Inc., dilución 1:200). Cada muestra (Volumen final = 300 µl) se incubó durante toda la noche a 4°C, y el complejo antígeno‐anticuerpo se precipitó con 2 ml de etanol a 4°C usando 2% albúmina sérica bovina. Luego de 10 minutos se centrifugaron las muestras a 3000 rpm por 12 minutos y el pellet se separó del sobrenadante por aspiración. La radioactividad se determinó en un contador gamma (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL). La cantidad de AMPc se expresó como fmoles/μg de proteína. Este ensayo se realizó en el IByME‐CONICET, bajo la supervisión del Dr. Omar P. Pignataro. 26. Análisis in silico La búsqueda de potenciales sitos GRE para el promotor y regiones intrónicas del gen Bax se llevó a cabo con el programa MatInspector [394]. 101
Materiales y Métodos
27. Análisis estadístico Los resultados fueron expresados como media ± error estándar (ES) o media ± desviación estándar según se indica en cada caso en la leyenda de cada figura. Todos los análisis estadísticos se hicieron con el software STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc.) y consistieron en estudios de ANOVA de uno o dos factores seguidas de pruebas post hoc de Tukey‐kramer para diseños balanceados o no balanceados según corresponda. Las únicas excepciones fueron para el caso de la figura 32A, en donde se realizó un test t‐student debido a que el supuesto de homocedacia no se cumplía para todos los tratamientos. Dado que sólo se realizó una única comparación (Dex vs. Dex + 21OH‐6,19OP) la tasa de error de tipo I global es igual a la del ANOVA. Por otro lado, en el caso de la figura 39, el grupo completo de datos no cumple con el supuesto de homocedacia para ninguna transformación de los datos posible. Sin embargo, al eliminar el grupo de datos pertenecientes al tratamiento con RU486 es posible realizar el análisis. Por lo tanto, se realizó un ANOVA de 2 vías para ese subconjunto de datos, y un test t‐student para el subconjunto de datos de RU486. Finalmente, en el caso del experimento de la figura 63, el diseño experimental es un diseño en bloques al azar, pero como no se cumple el supuesto de aditividad no es posible analizar los datos mediante este modelo estadístico. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas si se cumplía que p<0,05. Antes de realizar el análisis estadístico se corroboró que los datos cumplieran con los supuestos de normalidad y homocedacia usando las pruebas de Lilliefors y Bartlett respectivamente. En algunos casos se utilizaron los datos transformados con la función logaritmo o raíz cuadrada de manera tal de que los supuestos se cumplan. En todos los casos, los tratamientos con letras distintas (a,b,c…) son significativamente distintos entre sí. Si al menos una letra es compartida entonces no se encontraron evidencias para decir que existen diferencias significativas entre ellos.
102
CAPÍTULO 1 Modulación de la actividad del GR por análogos rígidos de esteroides. “The aim of science is to seek the simplest explanation of complex facts. We are apt to fall into the error of thinking that the facts are simple because simplicity is the goal of our quest”. Alfred North Whitehead (1861‐1947) Matemático y filósofo inglés. Capitulo 1: Antecedentes
Modulación de la actividad del GR por análogos rígidos de esteroides ANTECEDENTES 1.1 Análogos rígidos de glucocorticoides Los análogos rígidos 21OH‐6,19OP y 21HS‐6,19OP (figura 26) fueron originalmente sintetizados en el laboratorio del Dr. Burton [395]. Ensayos biológicos realizados en el laboratorio del Dr. Lantos mostraron que dichos esteroides presentaron propiedades glucocorticoides. Figura 26. Estructura de los análogos rígidos de esteroides utilizados. 21‐hidroxi‐6,19 epoxiprogesterona (21OH‐6,19OP); y su derivado 21‐hemisuccinato (21HS‐6,19OP). Al evaluar la actividad de 21OH‐6,19OP sobre los receptores GR, MR y PR se encontró que este esteroide es un antagonista del GR, sin afinidad por el MR ni el PR [48,50]. Este comportamiento hace de 21OH‐6,19OP un compuesto sumamente atractivo desde el punto de vista farmacológico, ya que como vimos anteriormente aún no existe en el mercado una droga antiglucocorticoide específica. Por otro lado, la introducción de un grupo hemisuccinato en la posición C21 de 21OH‐6,19OP conduce a un nuevo derivado, 21HS‐6,19OP, también específico para el GR pero con propiedades glucocorticoides diferentes a la de su precursor [60]. 1.1.1 21‐hidroxi‐6,19‐epoxiprogesterona (21OH‐6,19OP) La determinación inicial del efecto de 21OH‐6,19OP como ligando esteroide reveló que si bien posee la capacidad de desplazar la [3H]corticosterona unida al GR de extractos de timo de rata, es incapaz de desplazar a [3H]aldosterona del MR de células de riñón o a [3H]progesterona del PR de células de útero [50]. Cuando se evaluó la capacidad de producir in vivo un aumento en la cantidad de glucógeno acumulado en hígado de rata (efecto característico de un agonista 104
Capitulo 1: Antecedentes
glucocorticoide), se encontró que 21OH‐6,19OP per se no posee actividad alguna [50]. Sin embargo, su efecto antagonista se evidenció al estudiar la actividad de la enzima tirosina aminotransferasa (TAT) dependiente de glucocorticoides, en hepatocitos de rata. La administración de 21OH‐6,19OP per se no produjo aumento en la expresión de TAT, pero cuando el mismo fue administrado junto a dex, inhibió en un 80% la actividad de la enzima inducida por el esteroide comercial [50]. Del mismo modo, tanto en células Cos‐1 como en fibroblastos L929, 21OH‐6,19OP se comportó como un antiglucocorticoide puro, es decir que inhibió la capacidad de dex de transactivar al vector reportero MMTV‐LUC (gen reportero Luciferasa río abajo del promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), que contiene cinco elementos de respuesta a glucocorticoides [370]); y no mostró actividad per se sobre la expresión de dicho gen [396]. La actividad antagonista de 21OH‐6,19OP también fue demostrada in vivo, evaluando su capacidad de inhibir la acción apoptótica de dex en timocitos de ratón [397]. Por último, su falta de actividad progestágena/antiprogestágena se confirmó en ensayos de expresión de MMTV‐LUC en células Cos‐1 que sobreexpresan el hPRα [397]. En ese sentido, dadas sus propiedades antiglucocorticoides selectivas, 21OH‐6,19OP también fue utilizado por el grupo de Funder para estudiar el mecanismo del antagonismo cortisol/progesterona en la regulación de la actividad de 15‐hidroxiprostaglandina deshidrogenasa [398]; y más recientemente, por el grupo de Lubo para investigar el efecto del PR y del GR en la contracción de arterias uterinas [399]. Figura 27. Estructura del cortisol, dexametasona (dex), mifepristona (RU486) y 21‐hidroxi‐
6,19epoxiprogesterona (21OH‐6,19OP). Se resalta el grupo voluminoso de RU486. Desde un punto de vista estructural, 21OH‐6,19OP comparte similitudes y diferencias con otros ligandos del GR. Al igual que la dexametasona o el cortisol, 21OH‐6,19OP posee el sistema Δ4‐3‐ceto, esencial para la actividad glucocorticoidea [400]. Además, presenta la misma cadena 105
Capitulo 1: Antecedentes
lateral en posición 17β (figura 27), pero a diferencia de estos ligandos agonistas, en el análogo rígido no existen los hidroxilos en posiciones 11β y 17α. Como se mencionó anteriormente, RU486 (figura 27) es una droga que posee fuerte actividad antiglucocorticoide y antiprogestágena [43], y al comparar su estructura con la del 21OH‐6,19OP se observan similitudes sustanciales. Por ejemplo, la superposición de la estructura cristalina que adopta RU486 dentro del GR LBD [93] con la estructura de mínima energía de 21OH‐6,19OP, muestra que las conformaciones de estas dos moléculas resultan notablemente similares (figura 28A). En contraposición, la conformación de 21OH‐6,19OP es muy diferente de la conformación global del agonista dex dentro del GR LBD (figura 28B). No obstante, existen ciertas diferencias estructurales fundamentales entre ambos antiglucocorticoides. Por ejemplo, RU486 posee un grupo voluminoso en posición 11β ausente en la estructura del 21OH‐6,19OP (figura 27), que es directamente responsable del efecto antagonista sobre el GR. Es por ello que RU486 es considerado un antiglucocorticoide activo mientras que al ligando rígido se lo considera como un antagonista pasivo. Por otro lado, RU486 es una molécula muy flexible, cuya conformación global es altamente dependiente del entorno. Esto se evidencia en el hecho de que mientras que RU486 adquiere una conformación torsionada dentro del GR LBD, su conformación en el PR LBD es globalmente plana (figura 28C). Figura 28. Estructura tridimensional del RU486, dexametasona, y 21OH‐6,19OP. A. Superposición de la estructura de 21OH‐6,19O optimizada HF/6‐31G** (violeta) con la estructura de RU486 en el GR LBD (verde). B. Superposición de la estructura de 21OH‐6,19OP optimizada HF/6‐31G** (violeta) con la estructura de dex en el GR LBD (rojo). C. Superposición de la estructura de RU486 en el GR LBD (verde) con su estructura en el PR LBD (amarillo). RU486 en el GR LBD obtenida de pdb:1nhz, dex en el GR LBD obtenida de pdb:1m2z y RU486 en el PR LBD obtenida de pdb:2w8y. Por lo tanto, la alta flexibilidad del esqueleto esteroidal estaría vinculada con la capacidad de RU486 de unirse a más de un receptor de esteroides. En contraste, 21OH‐6,19OP al ser una 106
Capitulo 1: Antecedentes
molécula rígida, reduce su capacidad de adaptación a distintos entornos. Debido a la presencia del puente 6,19 epóxido, este análogo rígido no puede adoptar una conformación plana como la de RU486 en el PR LBD sino que adopta una conformación torsionada, como la observada para RU486 en el GR LBD. Esto podría explicar, al menos en parte, la especificidad de acción de 21OH‐
6,19OP por el GR [396]. 1.1.2 21‐hemisuccinato‐6,19‐epoxiprogesterona (21HS‐6,19OP) 21HS‐6,19OP es el derivado C21‐hemisuccinato de 21OH‐6,19OP. Este compuesto fue diseñado originalmente con el fin de aumentar la solubilidad de su precursor, de manera de generar un nuevo análogo con mejor biodisponibilidad in vivo. Sin embargo, cuando este esteroide fue analizado en el ensayo de inducción del gen reportero MMTV‐LUC en células Cos‐1 se observó, sorpresivamente, que poseía actividad agonista. Al igual que para 21OH‐6,19OP, se evaluó también su efecto apoptótico en timocitos de ratón, encontrándose que la actividad de 21HS‐6,19OP es característica de un agonista parcial. Al administrarse solo, actúa como un glucocorticoide moderado, sin embargo cuando se administra conjuntamente con dex, inhibe la acción de ese potente agonista comercial [60]. Por último, 21HS‐6,19OP no posee efecto progestágeno o antiprogestágeno, de acuerdo con ensayos de inducción de MMTV‐LUC realizados en células Cos‐1 que sobreexpresan el hPRA, lo cual indica que este derivado retiene la especificidad por el GR característica de 21OH‐6,19OP [396]. 1.2 Mecanismos de acción de 21OH‐6,19OP y 21HS‐6,19OP Con el objeto de comprender las bases moleculares de acción de los análogos rígidos, el Dr. Lautaro Álvarez durante su tesis doctoral utilizó la técnica computacional, denominada simulación por dinámica molecular (MD), que permite estudiar tanto el modo en que estos ligandos se unen al receptor, así como los cambios conformacionales que esta unión provoca en la proteína. De esta manera, se evaluaron las características estructurales del LBD del GR unido a los distintos ligandos [45,60,396]. Como se mencionó en la introducción, de acuerdo a la estructura cristalina del dímero de GR LBD‐dex (pdb:1m2z), uno de los contactos entre monómeros ocurre a través de sendos loop H1‐H3 (residuos 547 a 551) a través de cuatro puentes de hidrógeno, formando así una estructura pseudo anti‐lámina β entre ambos monómeros (figura 12) [73]. Los resultados de la 107
Capitulo 1: Antecedentes
simulación por dinámica molecular muestran que la conformación promedio de la región N‐
terminal del loop H1‐H3 depende fuertemente del estado del LBP. Como se observa en la figura 29A, en el estado libre (en ausencia de ligando), este loop adquiere una posición intermedia entre los estados con ligando. Esta posición resulta desplazada hacia una más cercana a la proteína cuando están unidos los agonistas dex y 21HS‐6,19OP; y más lejana cuando el ligando presente es 21OH‐6,19OP (figura 29B). Figura 29. Estudios de simulación por dinámica molecular del GR LBD. A. Superposición de las estructuras promedio (últimos 4 ns) de la interfase de dimerización de los complejos GR LBD‐dex (rojo), GR LBD‐21OH‐
6,19OP (azul) y GR LBD libre (amarillo). B. Superposición de las estructuras promedio (últimos 4 ns) de la interfase de dimerización de los complejos GR LBD‐dex (rojo), GR LBD‐21OH‐6,19OP (azul) y GR LBD‐21HS‐
6,19OP (verde). Gentileza del Dr. Lautaro Álvarez [396]. En conclusión, cuando el antagonista pasivo está unido al GR LBD, la conformación de una de las zonas que participa en la homodimerización resulta notablemente modificada respecto al caso de los ligandos agonistas. Dado que el complejo GR‐21OH‐6,19OP resulta incapaz de transactivar, y que una etapa imprescindible de este mecanismo de acción consiste en la homodimerización del GR, surge la hipótesis de que el antagonismo de 21OH‐6,19OP se basa, al menos en parte, en la incapacidad de este ligando de generar una conformación del GR tal que pueda homodimerizar, o al menos, de formar dímeros funcionales [45]. Uno de los objetivos de esta tesis es evaluar experimentalmente esta hipótesis. Por otro lado, cuando se evaluó la región AF‐2 (responsable de la interacción con coactivadores) en presencia de cualquiera de los análogos rígidos, la hélice H12 se extiende cinco residuos hacia el lado N‐terminal con respecto al sistema dex (figura 30). Además, respecto a la 108
Capitulo 1: Antecedentes
posición observada en el complejo GR LBD‐dex, la H12 del complejo GR LBD‐21HS‐6,19OP sufre un desplazamiento considerable (figura 30A), posiblemente provocado por la presencia del grupo hemisuccinato voluminoso. Por su parte, la dimensión del dominio AF‐2 es distinta cuando 21OH‐
6,19OP está unido (datos no mostrados). Conjuntamente, estos resultados sugieren que la capacidad de los complejos GR‐21OH‐6,19OP y GR‐21HS‐6,19OP de interactuar con los coactivadores podría llegar a estar comprometida [45]. Nuevamente, uno de los objetivos de este trabajo es evaluar esta hipótesis empíricamente. Figura 30. Estudios de simulación por dinámica molecular del GR LBD. Análisis de la conformación de la H12 (interacción con coactivadores). A. Estructura promedio (últimos 4 ns de simulación) de GR LBD‐dex (rojo) y GR‐
LBD/21HS‐6,19OP (verde). B. Estructura promedio (últimos 4 ns de simulación) de GR‐LBD/21HS‐6,19OP (verde) y GR‐LBD/21OH‐6,19OP (azul). Gentileza del Dr. Lautaro Álvarez [396]. 1.3 Objetivos particulares En base a los antecedentes mostrados, los objetivos particulares de este capítulo son: • Estudiar y caracterizar cómo las distintas conformaciones del GR inducidas por la unión de diversos ligandos modulan su actividad. • Poner a prueba la hipótesis de que la actividad antagonista del ligando 21OH‐6,19OP reside al menos en parte en su incapacidad de promover la homodimerización del GR. • Poner a prueba la hipótesis de que los complejos GR‐21OH‐6,19OP y GR‐21HS‐6,19OP tienen comprometida su capacidad de interactuar con el coactivador TIF2. • Dilucidar los mecanismos moleculares de acción de los antagonistas RU486 y 21OH‐
6,19OP. • Evaluar el potencial uso farmacológico de los análogos rígidos de esteroides 109
Capitulo 1: Resultados
RESULTADOS 1.4 Modulación de la translocación nuclear y actividad transcripcional del GR El GR es un factor de transcripción regulado por ligando. En ausencia del mismo, se encuentra inactivo, localizado principalmente en el citoplasma de la célula. Una vez que el ligando se une al receptor, el GR transloca al núcleo en donde regula la expresión de genes blanco de la acción glucocorticoidea [121]. Uno de los objetivos de este capítulo es comprobar empíricamente el mecanismo de acción del análogo rígido 21OH‐6,19OP propuesto en los estudios de dinámica molecular realizados por el Dr. Álvarez (figuras 29‐30). Sin embargo, antes de poder considerar dichos mecanismos, fue necesario analizar si la unión de ese ligando al GR afecta algún paso anterior, dentro del proceso de activación del receptor, a los puntos evaluados durante las simulaciones. Por lo tanto, primeramente se analizó si 21OH‐6,19OP es capaz de inducir la translocación del GR a núcleo, o por el contrario, de inhibirla. Figura 31. Localización subcelular del GR endógeno. Inmunofluorescencia indirecta para el receptor de glucocorticoides. Se incubaron células L929 en presencia y/o ausencia de dex 10 nM o 10 µM 21OH‐6,19OP durante 30 minutos. Se utilizó un anticuerpo primario anti‐GR y un anticuerpo secundario acoplado al fluoróforo Alexa flúor 488 (fluorescencia verde). Las imágenes fueron obtenidas por microscopía confocal. Barra de escala = 50 µm. 110
Capitulo 1: Resultados
En este sentido, se realizaron estudios de localización subcelular del GR por medio de inmunofluorescencia indirecta en células L929 tratadas con dexametasona o 21OH‐6,19OP. Los resultados de la figura 31 muestran que en ausencia de estímulos, el GR se encuentra localizado tanto en el citoplasma como en el núcleo celular. Sin embargo, frente a cualquier combinación de ligandos, el receptor presenta una localización mayoritariamente nuclear. Como se verá más adelante, a lo largo de este trabajo se estudió al GR mediante diversas técnicas de microscopía de fluorescencia. Para poder llevar a cabo dichas técnicas, se recurrió al uso de la proteína fluorescente GFP fusionada al extremo N‐terminal del receptor, de aquí en más llamada GFPGR. Si bien esta proteína parece responder de manera similar al receptor wild type [371], se consideró necesario verificar que los análogos rígidos modulen la actividad de esta proteína quimera de la misma manera que la del GR endógeno. Por este motivo, determinamos la actividad transcripcional de la proteína GFPGR sobreexpresada en células BHK, utilizando el vector reportero pMMTV‐LUC (figura 32). Figura 32. Actividad transcripcional de GR sobreexpresando GFPGR. Ensayos de transactivación de GFPGR. A‐B. Se co‐transfectaron células BHK con el vector pEGFPGR y el vector reportero pMMTV‐LUC. Se pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron por 18 hs con vehículo (Control), 10 nM utilizó dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP, 1 µM RU486 o la combinación de ellas según se indica. Se realizaron 3 experimentos independientes, cada uno con 3 réplicas independientes entre sí. Se muestra las veces de inducción respecto del control ± Error estándar (ES) de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Como se observa en la figura 32B, 21HS‐6,19OP presenta actividad agonista en este sistema. En cambio, 21OH‐6,19OP actúa como un antiglucocorticoide, dado que es capaz de revertir en forma parcial la acción de dexametasona (figura 32A) e inhibir completamente la 111
Capitulo 1: Resultados
actividad glucocorticoide de 21HS‐6,19OP (figura 32B). Por otro lado, RU486 no presenta actividad agonista per se, pero es capaz de antagonizar a la dexametasona (figura 32A). Estos resultados son muy similares a los observados previamente con estos análogos rígidos sobre el GR endógeno [396]. Teniendo en cuenta que las células BHK expresan endógenamente GR, si el GFPGR sobreexpresado no se comportara en forma similar, se esperaría observar un efecto dominante negativo por parte de la proteína quimera. Dado que eso no fue observado, los resultados sugieren que, al menos para la transactivación, los análogos rígidos interactúan en forma similar con cualquiera de las moléculas de receptor. En segunda instancia, continuando con la evaluación de GFPGR, se decidió analizar si los diferentes ligandos son capaces de promover la translocación al núcleo de la proteína quimera. Para ello, se transfectaron células BHK, L929 y Cos‐7 con el vector que codifica para GFPGR, o que solamente codifique para GFP. Las imágenes tomadas por microscopía confocal (figura 33) muestran que en ausencia de ligando (control), la mayoría de la señal fluorescente se visualiza en el citoplasma de las células. Por el contrario, frente a cualquiera de los estímulos utilizados la proteína se acumula en el núcleo celular. Es interesante destacar que, si bien el tratamiento con 21OH‐6,19OP induce la translocación de GFPGR, ésta no parece ser total, observándose también fluorescencia en el citoplasma. Por otro lado, en el caso de las células L929, se evaluó también la localización de GFP y los resultados muestran que, aún en presencia de dexametasona, GFP se encuentra distribuido homogéneamente en toda la célula, indicando que el movimiento de GFPGR es dependiente de la presencia del receptor de glucocorticoides y no de la proteína fluorescente. 112
Capitulo 1: Resultados
Figura 33. Localización subcelular de GFPGR. Análisis por microscopía confocal. Se transfectaron células BHK, L929 y Cos‐7 con el vector pEGFPGR. Se incubaron las células con vehículo (Control), 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 21HS‐6,19OP o 1 µM RU486 por al menos 40 minutos. Se tomaron imágenes por microscopía confocal. 10 µM Barra de escala = 20 µm. La figura muestra células representativas para cada tratamiento (n=20). En el extremo superior izquierdo de las células L929 tratadas con dex se muestra la localización de GFP en presencia de dex. A continuación se realizó un análisis cualitativo del proceso mismo de translocación, registrándose a distintos tiempos ‐ a partir del agregado del ligando ‐ la fluorescencia acumulada dentro de la célula. Los resultados (figura 34 y videos suplementarios) muestran que al añadir 113
Capitulo 1: Resultados
tanto dex como 21HS‐6,19OP o RU486, la translocación del GR es similar, observándose que la máxima fluorescencia nuclear se alcanza aproximadamente a partir de los 15 minutos de agregado el estímulo. Con respecto a 21OH‐6,19OP, la translocación no se produce en forma completa, observándose abundante fluorescencia remanente en citoplasma, aún luego de 18 minutos de agregado el esteroide. Figura 34. Translocación de GFPGR. Análisis por microscopía confocal secuencial. Se transfectaron células BHK con el vector pEGFPGR. Se seleccionó en el microscopio una célula al azar y en ambiente controlado de temperatura (37°C) se agregó 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP o 1 µM RU486, según se indica. Se tomaron imágenes secuenciales de 1024x1024 pixeles a intervalos regulares de 22 segundos (el tiempo que tarda el microscopio en barrer cada imagen). La figura muestra algunas imágenes tomadas en los tiempos indicados. El video completo se encuentra disponible en material suplementario. Durante este ensayo también se observó que la distribución intranuclear del receptor aparenta ser diferente y dependiente del ligando utilizado: mientras que los dos análogos rígidos promueven una distribución más homogénea del GR, dex y RU486 inducen distribuciones menos uniformes (figura 34, paneles de 18 minutos). Este fenómeno se analiza en la siguiente sección. 114
Capitulo 1: Resultados
1.5 Distribución intranuclear del GR Los resultados anteriores sugieren que los distintos complejos ligando‐receptor se distribuyen diferencialmente dentro del núcleo. De hecho, varios trabajos han sugerido que la estructura del ligando influye en la distribución intranuclear del GR. Los primeros estudios describieron que luego de su activación y posterior translocación, el GR forma “dominios focales”, que consisten en la concentración localizada de varias moléculas de receptor [230,401]. Posteriormente, se demostró que tanto la distribución del GR así como su movilidad dependen de la estructura del ligando al cual se encuentre unido [380]. Sorprendentemente, no existe correlación entre la actividad agonista o antagonista de los ligandos con el tipo de distribución observada, sino que es la afinidad del mismo por el receptor la que aparenta modular su distribución: mientras mayor es la afinidad, mayor la formación de estos dominios intranucleares [380]. En este contexto, nos propusimos evaluar el efecto de distintos ligandos sobre la distribución intranuclear del GR. Para ello, se transfectaron células Cos‐7 con el plásmido que codifica para GFPGR, se trataron con los ligandos sintéticos y se analizó su distribución mediante microscopía confocal. Como se observa en los paneles de la figura 35, en presencia del agonista dexametasona o del antagonista RU486, el receptor se distribuye en varios dominios focales, dando una apariencia de distribución puntiforme. Sin embargo, en presencia de 21OH‐6,19OP el GR parece distribuirse homogéneamente. Finalmente, 21HS‐6,19OP promueve una distribución intermedia: si bien no se observan dominios focales, su distribución aparenta ser menos aleatoria que la inducida por 21OH‐6,19OP. Estas observaciones cualitativas se confirmaron en forma cuantitativa. Para ello, se calculó el coeficiente de variación (CV) de la intensidad de fluorescencia dentro del núcleo (ver Materiales y Métodos2). Así, se pudo determinar cuan homogénea es la distribución del receptor: mientras menos homogénea sea su distribución, mayor resulta el CV [402]. La dexametasona (0.201±0.009) y el RU486 (0.208±0.009) presentan un CV significativamente mayor que el de 21OH‐6,19OP (0.172±0.005). Por el contrario, el CV obtenido del tratamiento con 21HS‐6,19OP (0.181±0.008) se encuentra en un valor intermedio entre los otros dos grupos, no pudiendo asignarlo significativamente a ninguno de ellos (figura 35). 2
Sección 12.3 115
Capitulo 1: Resultados
Figura 35. Distribución intranuclear del GR inducida por los distintos ligandos. Se transfectaron células Cos‐7 con el vector pEGFPGR. Se incubaron las células con 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP o con 1 µM RU486 por al menos 40 minutos y se tomaron imágenes por microscopía confocal (n=21 por tratamiento). La figura muestra células representativas para cada tratamiento y el coeficiente de variación (CV) medio ± ES, calculado como se describe en Materiales y Métodos. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). En conclusión, nuestros resultados apoyan la idea de que el tipo de distribución intranuclear de los distintos complejos ligando‐receptor no mantiene relación con sus actividades transcripcionales, dado que ligandos con actividades opuestas presentan similar distribución intranuclear. 116
Capitulo 1: Resultados
1.6 Actividad monomérica de los complejos ligando‐GR Como vimos en la introducción, el modelo clásico de acción del GR o modelo disociado establece que existen dos grandes modos de acción por los cuales el GR actúa: un modo directo y otro indirecto. En el modo directo, denominado transactivación, el receptor luego de ser activado por la unión del ligando se une como homodímero a sitios GRE presentes en los promotores de los genes blanco, lo cual conduce a la transcripción de dichos genes. En cambio, en el modo indirecto, denominado transrepresión, el complejo ligando‐receptor, como monómero, inhibe la expresión de genes activados por otros factores de transcripción, como NFκB o AP‐1 [141,195,196,403]. Con el objeto de estudiar como los distintos ligandos modulan la actividad monomérica del GR, se realizaron ensayos en donde se determinó la capacidad del receptor de transreprimir tanto a NFκB como a AP‐1. Para ello, se co‐transfectaron células BHK con genes reporteros que responden a la acción de dichos factores de transcripción junto con vectores de expresión para la subunidad p65, componente de NFκB o el factor cJun, componente de AP‐1. Como se observa en la figura 36, al establecer la actividad del control (células no tratadas) como el 100% , puede observarse que la dexametasona reprime significativamente la actividad transcripcional de NFκB y de AP‐1. Asimismo, tanto RU486 como ambos análogos rígidos se comportan como agonistas del GR, inhibiendo la acción de ambos factores de transcripción. Por lo tanto, a pesar de que los complejos GR‐21OH‐6,19OP y GR‐RU486 no son capaces de generar una respuesta glucocorticoide directa (figura 32A), si poseen la habilidad de actuar como monómeros modulando la actividad de otros factores de transcripción (figura 36). Por otro lado, el GR unido a dex o a 21HS‐6,19OP es activo tanto como homodímero (figura 32) y como monómero (figura 36). Los resultados indican entonces que, dentro de los alcances de estos ensayos, 21OH‐6,19OP se comporta como un glucocorticoide disociado mientras que 21HS‐
6,19OP actúa como un glucocorticoide puro. En su conjunto, estos resultados sugieren que la acción directa del GR como homodímero (transactivación) dependería en mayor medida del estado conformacional del complejo ligando‐receptor que su acción como monómero (transrepresión). 117
Capitulo 1: Resultados
Figura 36. Actividad monomérica de los complejos ligando‐GR. Ensayos de transrepresión. Se co‐transfectaron células BHK con el vector reportero pκB‐LUC y el vector pRelA (Actividad transcripcional NFκB), o el vector reportero pAP1‐LUC y el vector pcJun (Actividad transcripcional AP‐1). Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se incubaron las células durante 18 hs con vehículo (Control), 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP o 1 µM RU486. Se determinó actividad de luciferasa y de β‐galactosidasa. Se muestra la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal) expresada como % de inducción respecto al control. Se muestra la media ± ES de 3 experimentos independientes, cada uno con 3 réplicas independientes entre sí. Las barras con diferentes letras (a o b o c) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Dentro de la teoría del modelo disociado, los llamados efectos farmacológicos benéficos de los glucocorticoides han sido asociados a los mecanismos de transrepresión, mientras que los efectos perjudiciales o secundarios se han asociado a la transactivación [35,202]. En este sentido, 21OH‐6,19OP surge como un potencial glucocorticoide selectivo, con potenciales aplicaciones farmacológicas. 1.7 Estudios de oligomerización del GR in vivo A pesar de que el proceso de dimerización del GR es considerado un paso esencial en el camino de activación del receptor, todavía existen controversias sobre la región proteica involucrada en ese proceso, así como también el mecanismo molecular por el cual este ocurre. Esto se debe principalmente a que la mayoría de las evidencias que existen del mismo provienen de estudios in vitro, ya sea utilizando el GR completo [143,206,209‐211] o solo el DBD [207,208,212]. De hecho, aunque se demostró que una mutante en el DBD del GR (A458T) genera un variante supuestamente incapaz de homodimerizar in vitro [197,404], varias evidencias siguieren que tanto los dominios LBD como AF‐1 también participan en la dimerización del GR 118
Capitulo 1: Resultados
[73,143]. En este sentido, cambios conformacionales inducidos por la unión de un ligando podrían afectar la habilidad del receptor de formar homodímeros funcionales, y consecuentemente de modular su actividad transcripcional. De hecho, los resultados de los estudios de simulación por dinámica molecular realizados por el Dr. Álvarez [396] sobre el mecanismo de acción de 21OH‐6,19OP (figura 29) predicen que su antagonismo se basa, al menos en parte, en la incapacidad de este ligando de dar una conformación al GR tal que pueda generar homodímeros funcionales. Con el objeto de evaluar estas hipótesis, nos propusimos estudiar la dimerización del GR in vivo. Para ello, utilizamos una técnica recientemente desarrollada denominada Number and Brightness (N&B), cuyos principios básicos se describen a continuación. 1.7.1 Principio de la técnica de Número y Brillo (N&B) Esta nueva técnica, basada en análisis de momento, como su nombre lo indica nos permite calcular el número promedio de moléculas fluorescentes en movimiento, así como su brillo en cada pixel de una imagen. En su caso más sencillo, el brillo de oligómeros formados por n monómeros es n veces el brillo de cada monómero. Por lo tanto, la técnica de N&B puede utilizarse para obtener el estado de oligomerización de proteínas en células vivas con alta resolución espacial [382,405]. El brillo molecular, o brillo real (ε) se define como el número de fotones emitidos por molécula por unidad de tiempo. Supongamos una proteína que contiene un solo fluoróforo, como es el caso de GFPGR. Entonces, ésta sola molécula emitirá n fotones por unidad de tiempo. Si ahora esa misma proteína se encuentra como dímero, se considera que esta nueva entidad contiene dos fluoróforos (uno por cada monómero). Por lo tanto, esta nueva molécula emitirá 2n fotones por unidad de tiempo, es decir, su brillo se duplicó. Si ahora tenemos por ejemplo un tetrámero, esta nueva molécula emitirá 4n fotones por unidad de tiempo, teniendo como resultado un brillo 4 veces superior al monómero. Por otro lado, la intensidad de fluorescencia que se detecta con un microscopio es proporcional al número de fluoróforos presentes en la célula. Sin embargo, un determinado valor de intensidad de fluorescencia puede estar dado por varias moléculas individuales (i.e monómeros) o por pocas moléculas oligomerizadas. Esta técnica entonces nos permite distinguir 119
Capitulo 1: Resultados
entre estas dos posibilidades y por lo tanto, calcular el estado de oligomerización de proteínas fluorescentes en una dada región celular. El principio por el cual se puede distinguir entre estas dos posibilidades se ilustra en la figura 37. Figura 37. Principio de la técnica de N&B. En los pixeles k (A) y j (B) la intensidad de fluorescencia media es igual para ambos, pero la desviación estándar es mayor en el primer pixel (C) que en el segundo (D). Esto se debe a que pocas partículas brillantes fluctúan en el pixel k mientras que muchas partículas con menor brillo fluctúan en el pixel j. Ver texto para más detalles. Adaptado de Digman y colaboradores [382]. Supongamos que analizáramos dos pixeles (k y j) de una imagen. Para ello se toman imágenes consecutivas en períodos cortos de tiempo, y se registra los valores de intensidad para cada uno de los pixeles de la imagen, a lo largo del tiempo. Supongamos también que las partículas fluorescentes se encuentran en movimiento, y que en promedio, el número de fluoróforos que pasan por el pixel k es igual a los que pasan por el pixel j. Entonces, la intensidad promedio registrada en ambos lugares será la misma, como ilustra la figura. Ahora bien, en el pixel k se registran fluctuaciones en intensidad a lo largo del tiempo, con mucha mayor amplitud que las registradas en el pixel j (paneles A y B en figura 37). Esto puede explicarse a que en el primer caso lo que ocurre es que pocas proteínas oligomerizadas se encuentran entrando y saliendo de ese pixel, registrando mayores “saltos” en los registros de intensidad. Por el contrario, en el pixel k, la amplitud de los cambios es mucho menor, consistente con que en ese espacio están entrando y saliendo moléculas con un solo fluoróforo (monómeros). Estas diferencias de comportamiento se evidencian entonces calculando la varianza en los valores de 120
Capitulo 1: Resultados
intensidad (paneles C y D en figura 37). En el pixel en donde son oligómeros los que fluctúan, la varianza registrada será mayor que en el pixel poblado de monómeros. Por lo tanto, el brillo aparente (B) en un dado pixel puede calcularse como el cociente entre la varianza y la intensidad promedio. Luego, se demuestra que el brillo real (ε) es igual a B‐1 [382]. Finalmente, registrando la intensidad de todos los pixeles de una imagen a lo largo del tiempo, uno puede calcular el brillo de una determinada región de la célula. Para mayor detalle sobre la técnica, consultar la sección de Materiales y Métodos3. 1.7.2 Oligomerización del GR in vivo Con el objeto de evaluar si la técnica de N&B permite detectar la formación de oligómeros del GR in vivo, se trataron con dex distintos tipos celulares transfectados con el vector de expresión que codifica para la proteína GFPGR o GFP. Posteriormente se determinó el brillo real (ε) tanto en el citoplasma como en el núcleo de la células analizadas. Figura 38. Análisis de oligomerización in vivo de moléculas de GFPGR. Análisis de N&B. Se transfectaron células Cos‐7, BHK y L929 con el vector pGFPGR o pEGFP; y se incubaron en presencia de vehículo (control) o 10 nM dex. L929 (GFP) corresponde a las células que sólo expresan GFP. Las imágenes se tomaron entre 40 min y 6 hs luego del agregado de los estímulos. Para cada célula (15≤n≤30 por tratamiento) se calculó el brillo aparente como se describe en Materiales y Métodos. La figura muestra las veces de aumento del brillo real (ε) relativo al citoplasma por cada tipo celular. Las barras de error indican el ES. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). La figura 38 muestra las veces de aumento del brillo ε (i.e: medida de la oligomerización del fluoróforo) correspondiente a las moléculas de GFPGR expresadas en diferentes tipos 3
Sección 14.3 121
Capitulo 1: Resultados
celulares. En ausencia de ligando, los valores de ε son similares entre el citoplasma y el núcleo; indicando el mismo estado de oligomerización del GR en ambos compartimentos celulares. Sin embargo, en presencia de dex, los valores de ε aumentan significativamente (aproximadamente 2 veces) en el núcleo con respecto al citoplasma. Estos resultados son consistentes con la transformación y dimerización del GR que se producen luego del tratamiento hormonal. Por el contrario, células L929 transfectadas con GFP no muestran incrementos significativos en ε, aún en presencia de dex. Estos resultados demuestran que es el GR, y no la GFP, el responsable del aumento en el brillo en respuesta a la hormona. La presencia de moléculas de GR endógenas en las líneas celulares L929 y BHK no parecen interferir con el análisis, dado que los valores de ε obtenidos no difieren significativamente a los valores obtenidos en Cos‐7, que carecen de GR endógeno. Por lo tanto, asumiendo que el heterocomplejo citoplasmático del GR contiene solamente una molécula de receptor, y que la homodimerización es el máximo estado posible de oligomerización para el GR, entonces – teóricamente– los valores de ε deberían duplicarse si todas las moléculas de GFPGR dimerizaran. En este sentido, dado que en presencia de dex el brillo es de aproximadamente el doble en el núcleo respecto al citoplasma, los resultados sugieren que la mayoría de las moléculas de GR dimerizan luego de la unión al ligando. Esta sería la primera evidencia directa de dimerización del GR in vivo registrada hasta el momento. 1.7.3 Estados de oligomerización de los complejos ligando‐GR Si bien la región proteica responsable de la dimerización del GR es todavía motivo de debate, se ha descripto que el LBD participa activamente en la homodimerización del receptor [73]. Por lo tanto, los cambios conformacionales provocados por la unión del ligando podrían afectar la habilidad del receptor de formar homodímeros; y consecuentemente, de inducir la transcripción mediada por la unión directa del GR al ADN. Una vez comprobada la capacidad de la técnica de N&B para distinguir entre los estados monoméricos y diméricos del GR, evaluamos cómo distintos ligandos modulan la capacidad del GR de homodimerizar. La figura 39 muestra un incremento similar en los valores de brillo entre el núcleo y el citoplasma de células L929 cuando las células son tratadas con cualquiera de los análogos rígidos. Sin embargo, aunque el tratamiento con RU486 también induce en forma significativa la oligomerización del GR, éste parece provocar una menor formación de dímeros. 122
Capitulo 1: Resultados
Figura 39. Análisis de oligomerización in vivo de los complejos ligando‐GR. Análisis de N&B. Se transfectaron células L929 con el vector pGFPGR y se incubaron en presencia de vehículo (control), 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP o 1 µM RU486. Las imágenes se tomaron entre 40 min y 6 hs luego del agregado de los estímulos. Para cada célula (15≤n≤30 por tratamiento) se calculó el brillo aparente como se describe en Materiales y Métodos. La figura muestra la veces de aumento del brillo real (ε) relativo al citoplasma de cada tratamiento. Las barras de error indican el ES. Las barras con diferentes letras (a o b o c) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). En su conjunto, los resultados indican que el GR activado es capaz de formar oligómeros, independientemente del tipo de ligando al cual se encuentre unido. Como se mencionó anteriormente, los resultados de las simulaciones por dinámica molecular muestran que la conformación del loop H1‐H3 (involucrado en la homodimerización) resulta notablemente modificada en presencia de 21OH‐6,19OP respecto al caso de los ligandos agonistas (figura 29). Sin embargo, los resultados experimentales indican que el GR es capaz de oligomerizar en presencia de este análogo rígido. En este sentido, es probable que, aunque el cambio conformacional inducido efectivamente ocurra, este no inhiba la dimerización pero resulte en la formación de un homodímero no funcional. 1.8 Dinámica de la interacción entre el GR y el ADN in vitro Como todo factor de transcripción, el GR se une al ADN y de esta manera regula la expresión génica. En particular, el GR puede unirse a regiones del ADN llamadas elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE), localizadas en las regiones promotoras de ciertos genes blanco [142]. Para investigar si los cambios conformacionales inducidos por la unión del ligando afectan la habilidad del GR de interactuar con GREs específicos, se realizaron ensayos de retardo 123
Capitulo 1: Resultados
en gel (EMSA) a partir de extractos nucleares obtenidos de células BHK previamente tratadas con diferentes ligandos. Estos extractos se incubaron con una sonda radioactiva, que contiene uno de los elementos GRE correspondientes al promotor del MMTV [209]. Figura 40. Efecto del ligando sobre la unión del GR al ADN in vitro. Ensayo de retardo en gel (EMSA). Se realizó un EMSA con extractos nucleares de células BHK tratadas con vehículo (control), 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP o 1 µM RU486 por 30 minutos. Calle 1: sin extracto proteico. 32
P] Calles 2, 5, 8, 11 y 14: extractos proteicos incubados con una sonda marcada radiactivamente con [
conteniendo el sitio consenso GRE. Calles 3, 6, 9, 12 y 15: competencia con 200x de sonda radioinerte no específica. Calles 4, 7, 10, 13 y 16: competencia con 200x de sonda radioinerte específica. Las flechas indican la sonda de ADN libre y los complejos GR‐ADN. Los extractos celulares preparados en ausencia de ligando generaron una doble‐banda retardada que desaparece con un exceso (200x) de la misma sonda radioinerte (figura 40, calles 2 y 4, respectivamente). Esta independencia hallada entre la capacidad del GR de unir ADN in vitro y la presencia de ligando es aún motivo de controversia en la bibliografía. Varios grupos de investigación sugieren que el ligando no es requerido para una asociación estable, in vitro, entre el GR y el ADN [406‐411]. Sin embargo, existen algunos estudios que muestran una clara dependencia entre la presencia del ligando y la unión al ADN [197]. Al menos en las condiciones experimentales realizadas en este trabajo, nuestros resultados avalan el consenso de los primeros. Más aún, cuando se realiza el ensayo con extractos nucleares de células tratadas con distintos ligandos, los resultados muestran que el GR se une a la sonda con similar afinidad, independientemente del complejo ligando‐receptor formado (figura 40, calles 5; 8; 11 y 14). 124
Capitulo 1: Resultados
Esta habilidad del GR para unir ADN in vitro sin necesidad de ser previamente activado por ligandos podría ser un producto artefactual del diseño experimental utilizado. Uno de los primeros eventos descriptos que produce la unión del ligando al GR in vivo es su disociación del complejo de chaperonas, ya sea antes [121], durante [99], o luego [112] de la translocación al núcleo. Por lo tanto, decidimos evaluar si este proceso también puede ser inducido in vitro en ausencia de ligando. La figura 41 muestra como con solo aumentar la temperatura a un extracto proteico conteniendo el heterocomplejo GR‐Hsp90, se observa disociación entre las dos proteínas. Estos resultados explicarían la independencia de ligando observada en los ensayos de EMSA. Figura 41. Disociación in vitro entre GR y Hsp90. Ensayo de coinmunoprecipitación in vitro. Se tomaron alícuotas de extractos citosólicos de timocitos y se preincubaron durante 1 h en presencia o ausencia de 20 mM Molibdato de sodio (MO). A cada alícuota se la incubó en presencia o ausencia de 5 µM dex por 2 horas en hielo. Mientras que la mitad de las alícuotas se dejaron en hielo, la otra mitad fue calentada a 25 °C por 1 hora. Finalmente, se detuvo la reacción por el agregado de 1 mM MO y re‐enfriamiento en hielo por 30 minutos. Las muestras se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti‐
GR como se detalla en Materiales y Métodos. Se muestra un gel representativo (A) y la media ± ES para los niveles de Hsp90/GR (% respecto a 0°C) de dos experimentos independientes (B). Dado que no se observó efecto de los distintos ligandos sobre la capacidad del GR de unirse a sitios GRE, se decidió evaluar in vitro la dinámica de la interacción entre el GR y el ADN. Inspirados en el trabajo de Pandit y colaboradores [410], realizamos un estudio de la cinética de disociación entre el receptor y el ADN. Para ello, se incubó la sonda radioactiva con extractos nucleares conteniendo los diferentes complejos ligando‐GR durante 20 minutos. A continuación, se agregó 200x de exceso de un competidor específico radioinerte y luego diferentes alícuotas fueron tomadas a diferentes tiempos y sembradas en un gel de poliacrilamida corriendo a voltaje constante (ver esquema experimental, figura 42). 125
Capitulo 1: Resultados
Figura 42. Diseño experimental de los ensayos de disociación. Se incubaron los extractos proteicos provenientes de células tratadas con los distintos ligandos junto con una sonda radiactiva conteniendo el sitio consenso GRE. Luego de 20 minutos, se agregó un exceso de sonda no radiactiva específica y alícuotas tomadas en los tiempos indicados se sembraron en un gel corriendo a 200 V.
Figura 43. Efecto del ligando sobre la disociación entre el GR y el ADN in vitro. Ensayo de retardo en gel (EMSA). Se realizó un EMSA con extractos nucleares de células BHK tratadas con 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐
6,19OP o 1 µM RU486 por 30 minutos. Los extractos incubados se sometieron al diseño experimental de la figura 42. Se muestran geles representativos para los distintos tratamientos (A). Las curvas de disociación (media ± ES) de tres experimentos independientes muestran la fracción unida (relativa al tiempo cero) expresadas como el cociente entre el complejo GR‐ADN y la sonda libre (B). Las flechas indican la sonda de ADN libre y los complejos GR‐ADN. 126
Capitulo 1: Resultados
Dado que todos los extractos mostraron una unión similar al ADN al tiempo inicial de agregado del exceso de sonda radioinerte, se concluye que la tasa de disociación es independiente de la fracción de ADN unido [410]. Como se observa en la figura 43A, dex y RU486 tienen efectos opuestos sobre la cinética de disociación del complejo GR‐ADN. La figura 43B muestra que el complejo dex‐GR/ADN posee la mayor velocidad de disociación (t1/2= 0.56±0.05 min) mientras que el complejo RU486‐GR/ADN tiene la menor (t1/2= 2.33±0.56 min). Estos resultados concuerdan con los previamente hallados [410] y con la idea de que la dinámica de disociación estaría relacionada con la capacidad de activar la transcripción de genes. Sin embargo, los complejos 21OH‐6,19OP‐GR/ADN y 21HS‐6,19OP‐GR/ADN poseen velocidades de disociación intermedias (t1/2= 0.96±0.08 y 1.02±0.13 min., respectivamente). Entonces, las diferencias que poseen los análogos rígidos en su capacidad de inducir la transactivación del GR no estarían asociadas a la dinámica de interacción de estos complejos con el ADN. En su conjunto, estos resultados también sugieren que la estructura del ligando modula la dinámica de la interacción GR‐ADN más que la capacidad del receptor de unirse a los sitios GRE. 1.9 Estudios de actividad e interacción del GR con el coactivador TIF2 Los coactivadores son proteínas que aumentan la actividad transcripcional de los receptores nucleares. En particular, los coactivadores pertenecientes a la familia p160 (SRC‐1, TIF2 y p/CIP) juegan un papel especialmente relevante como mediadores de la acción de glucocorticoides ya que estas proteínas interactúan en forma directa con el GR LBD [70,193,194]. En estudios de sobreexpresión, el efecto de los miembros de esta familia sobre la actividad transcripcional del GR varía desde un incremento de la transcripción hasta la inactividad; dependiendo de la concentración relativa de GR/p160, del tipo celular y del promotor estudiado [192,412]. Como se mencionó anteriormente, las simulaciones por dinámica molecular de los complejos 21OH‐6,19OP‐GR y 21HS‐6,19OP‐GR predicen que la interacción del dominio AF‐2 del GR con el coactivador TIF2 podría estar comprometida en presencia de estos ligandos (figura 30). Por lo tanto, realizamos una serie de ensayos con el propósito de poner a prueba estas hipótesis. En primera instancia, se evaluó la capacidad de los diferentes complejos ligando‐receptor de interactuar funcionalmente con el coactivador TIF2. Para ello, se co‐transfectaron células BHK con el gen reportero pMMTV‐LUC en presencia o ausencia el vector pTIF2. De esta manera, 127
Capitulo 1: Resultados
analizamos el efecto de la sobreexpresión de este cofactor sobre la actividad transcripcional del GR (figura 44). Figura 44. Efecto de la sobreexpresión de TIF2 sobre la actividad transcripcional del GR. Ensayos de transactivación. Se co‐transfectaron células BHK con el vector reportero pMMTV‐LUC y el vector pCMV‐LacZ (control de eficiencia de transfección) en presencia (+TIF2) o ausencia (‐TIF2) del vector de expresión pTIF2. Se trataron a las células durante 18 horas con vehículo (Control), 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐
6,19OP y 1 µM RU486. Se muestra las veces de inducción de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal) respecto del control ± ES. Las barras con diferentes letras (a o b o c o d) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Los resultados muestran que TIF2 potencia la actividad transcripcional de los dos ligandos agonistas. De hecho, en presencia de dex, la expresión del gen reportero sufre un incremento de 1.6 veces cuando se sobreexpresa TIF2 mientras que en el caso de 21HS‐6,19OP, el incremento es de 2.85 veces. Por otro lado, la sobreexpresión de TIF2 no es capaz de generar respuestas agonistas por parte de RU486 o de 21OH‐6,19OP. Estos resultados indican que, o bien no existe interacción entre RU486‐GR o 21OH‐6,19OP‐GR con el coactivador, o que en caso de existir, esta resulta en un complejo no funcional. En segunda instancia, y con el propósito de discriminar entre estas dos posibilidades, se realizaron ensayos de coinmunoprecipitación entre TIF2 y los distintos complejos ligando‐GR. Debido a que los niveles endógenos de los coactivadores son muy bajos, y como además no contamos con anticuerpos que reconozcan al GR de células BHK (hámster), se transfectaron dichas células con los vectores de expresión phGR y pTIF2, para luego ser incubadas con los 128
Capitulo 1: Resultados
diferentes ligandos. Finalizada la incubación, se extrajeron proteínas y los extractos se sometieron a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti‐TIF2. Figura 45. Interacción entre TIF2 y los complejos ligando‐GR. Ensayos de coinmunoprecipitación in vivo. Se co‐
transfectaron células BHK con los vectores de expresión para hGR y TIF2. Se trataron a las células con vehículo (Control), 10 nM dex, 10 µM 21OH‐6,19OP, 10 µM 21HS‐6,19OP y 1 µM RU486 por 90 minutos. Luego, se inmunoprecipitaron extractos proteicos con un anticuerpo anti‐TIF2 (αTIF2) como se describe en Materiales y Métodos. El input corresponde al 10% de la muestra previa al protocolo de inmunoprecipitación. Se muestra un gel representativo revelado contra hGR (A). El gráfico muestra la cuantificación (media ± ES) de tres experimentos independientes, como niveles de GR respecto al tratamiento con dex (B). Las flechas en el gel “input” indican las tres isoformas del αGR (GRA; GRB; GRC) descriptas anteriormente [384,413]. La figura 45 muestra el ensayo de western blot contra el GR humano. Los resultados indican que, mientras que los complejos dex‐GR, 21HS‐6,19OP‐GR e incluso RU486‐GR son capaces de interactuar con TIF2 (figura 45, calles 3, 5 y 6, respectivamente), el complejo 21OH‐6,19OP‐GR resulta incapaz de asociarse al coactivador (figura 45, calle 4). Por lo tanto, estos resultados demuestran que mientras 21OH‐6,19OP afecta la capacidad del GR de interactuar físicamente con TIF2, RU486‐GR si bien une TIF2, generaría un complejo no funcional. 129
Capítulo 1: Discusión
DISCUSIÓN A lo largo de este capítulo intentamos profundizar los conocimientos acerca de los mecanismos involucrados en la modulación de la actividad del GR. Utilizando cuatro ligandos con diferentes actividades glucocorticoides, analizamos los efectos de su estructura sobre la actividad transcripcional del GR y consecuentemente, sobre la respuesta glucocorticoidea. De hecho, creemos que una caracterización precisa de los determinantes moleculares involucrados en los cambios conformacionales específicos del GR contribuirá al entendimiento de los diferentes mecanismos de acción del receptor, lo cual podría mejorar sustancialmente el diseño racional de fármacos selectivos. Un resumen de los resultados obtenidos se muestra en la tabla 4. Experimento/ligando Dexametasona 21OH‐6,19OP
Transactivación agonista antagonista Transrepresión agonista agonista Translocación al núcleo si si (parcial) Distribución intranuclear no homogenea homogenea Dimerización completa completa Disociación del ADN in vitro rápida rápida Respuesta funcional a TIF2 si no Interacción con TIF2 si no 21HS‐6,19OP RU486 agonista antagonista agonista agonista si si intermedia no homogenea
completa parcial rápida lenta si no si si Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos. Se muestran los efectos, sobre el GR, de cada uno de los ligandos utilizados a lo largo de este capítulo. 1.10 El GR dentro del núcleo Al comparar el comportamiento de los diferentes complejos ligando‐receptor, observamos que éstos se distribuyen dentro del núcleo en forma diferencial. En este sentido, ya se ha descripto previamente que el GR forma dominios focales nucleares, con alta concentración de moléculas de receptor [230,401]. Sin embargo, el significado biológico de este fenómeno así como los mecanismos que gobiernan este proceso permanecen aún desconocidos. Dada la dependencia del ligando en el tipo de distribución observada, y que la deleción del LBD promueve una distribución homogénea del receptor [414], se ha propuesto que los cambios conformacionales sobre este dominio, inducidos por la unión al ligando, son los mayores determinantes en la distribución intranuclear del GR. De hecho, la distribución observada dependería de la afinidad del ligando más que de su capacidad de activar o inhibir al receptor 130
Capítulo 1: Discusión
[380]. En este trabajo, confirmamos que ligandos de alta afinidad [415], con actividades opuestas sobre el GR como dex y RU486 promueven una distribución puntuada del receptor. Además, observamos que ambos análogos rígidos inducen una distribución más homogénea, aunque el derivado hemisuccinato indujo una distribución ligeramente menos aleatoria. Si bien la afinidad de estos ligandos por el GR todavía no ha sido determinada, resultados previos de transactivación sugieren que 21OH‐6,19OP es un ligando de baja afinidad, dado que sólo altas concentraciones ([10 µM) son capaces de bloquear la actividad inducida por la dexametasona ([10 nM]) [60]. Esto apoyaría también las evidencias a favor de la correlación existente entre la afinidad del ligando y el tipo de distribución observada [380]. En el caso de 21HS‐6,19OP, no es posible hacer una comparación directa ya que la actividad transcripcional de un ligando agonista no depende solamente de su afinidad por el GR, sino también de su concentración, la del propio receptor, de la capacidad de unir cofactores, etc. Sin embargo, su valor de CV más alto respecto a 21OH‐
6,19OP podría residir en un aumento de la afinidad, dada justamente por la presencia del grupo hemisuccinato. Con respecto al significado biológico de estas distribuciones puntiformes, se ha demostrado que la mayoría de estos clusters no son sitios transcripcionalmente activos [230,416]. Aunque todavía en discusión, se ha sugerido que estos dominios puntuales serían “sitios de almacenamiento”, parte de un mecanismo de control que regula la cantidad de receptores libres de difundir dentro del núcleo [417,418]. 1.11 El GR como factor de transcripción: dimerización, unión al ADN, cofactores La determinación del estado de oligomerización de moléculas en un contexto celular es materia de gran interés biológico. De hecho, numerosos procesos dependen de la oligomerización de proteínas. Por ejemplo, en respuesta a estímulos externos muchos receptores de membrana inician eventos de señalización a través de la dimerización de sus receptores [419,420]. Sin embargo, a pesar de la relevancia funcional y la ubiquidad de este concepto, para muchos de ellos aún no existen demostraciones directas de estos eventos, e incluso se ha presentado evidencia contradictoria para otros [421‐423]. Es más, el grado de oligomerización en la mayoría de los casos no ha sido cuantificado [383]. En particular, la capacidad del GR de homodimerizar luego de la unión al ligando fue propuesta originalmente a partir de estudios in vitro [143,206‐212]. Hasta nuestro conocimiento, es en este trabajo donde se demuestra por primera vez, en forma directa, que el receptor es capaz de oligomerizar in vivo. Esto se realizó 131
Capítulo 1: Discusión
mediante la técnica de N&B, la cual permite obtener mediciones dentro de la célula viva y por lo tanto, estudiar interacciones proteína‐proteína en presencia de todos los demás componentes celulares, evaluando así la función biológica en un ambiente natural. Asimismo, la formación de dímeros de otro miembro de la superfamilia de NR, el RXR, también ha sido demostrada mediante espectroscopía de fluctuación de fluorescencia utilizando sólo el RXR LBD [424], obteniéndose resultados similares a los presentados en esta Tesis. Los resultados obtenidos en este capítulo sugieren que la formación de homodímeros de GR no parece depender de la estructura del ligando, dado que todos los esteroides utilizados aquí fueron capaces de inducir la dimerización del receptor. Más aún, el proceso de oligomerización sería a su vez independiente de la distribución intranuclear del GR, debido a que ligandos que promueven distribuciones opuestas del receptor poseen estados de oligomerización similares. Como se mencionó en la introducción, todavía es motivo de debate si la formación de dímeros de GR ocurre antes o después de la unión al ADN. Por un lado, los estudios de EMSA que utilizan sólo el DBD del receptor sugieren que la formación de dímeros ocurre luego de la unión al ADN, como resultado de la unión cooperativa de monómeros [207,208,212]. Por otro lado, aquellos estudios en donde se utiliza al receptor completo, mediante el análisis in vitro por gradiente de glicerol, sugieren que el proceso de dimerización puede ocurrir de manera ADN‐
independiente [143,206,209‐211,425]. El único estudio in vivo, indirecto, fue realizado por Savory y colaboradores [213], en donde utilizaron una versión mutante del GR deficiente en la señal de localización nuclear NL1 (GRNL1‐), la cual no es capaz de translocar al núcleo aún en presencia de ligando. Sin embargo, la co‐transfección de esta mutante junto a la versión wild type del receptor (GRwt) promueve la importación al núcleo de GRNL1‐, por lo que los autores concluyen que se forman heterodímeros GRNL1‐:GRwt durante, o incluso antes del proceso de translocación. Estos resultados favorecen entonces la teoría de la dimerización ADN‐independiente. De todas maneras, esta dimerización “pre‐translocacional” plantea algunos inconvenientes con respecto a los mecanismos conocidos que median la translocación del receptor. En los ensayos de N&B realizados en este trabajo tenemos una gran cantidad de moléculas de GFPGR debido a la sobreexpresión causada por la transfección transitoria de las células. En estas condiciones, es muy poco probable que haya, en un determinado momento, suficientes sitios GRE accesibles en el genoma disponibles para unir a todas las moléculas de GFPGR presentes en núcleo. Por lo tanto, dado que los estudios de N&B indican que la mayoría 132
Capítulo 1: Discusión
de las moléculas de GR se encuentran oligomerizadas, esto sugiere que la homodimerización del GR debería ocurrir antes de la interacción GR‐ADN, o al menos en forma ADN‐independiente. Las proteínas son sistemas inherentemente flexibles. Esta movilidad, esencial para su función biológica, comprende un amplio rango de escalas, tanto temporales como espaciales [426,427]. Si bien la determinación de la estructura espacial de una proteína con resolución atómica se obtiene mediante la técnica de difracción de rayos X, la obtención de las estructuras cristalinas requiere la utilización de condiciones que no representan necesariamente el medio biológico. De hecho, en solución, a temperatura fisiológica, las proteínas existen como una población dinámica de conformaciones energéticamente posibles, de manera que la estructura tridimensional de una proteína se encontrará mejor descripta mientras más estados conformacionales se encuentren representados. Desafortunadamente, el uso estándar de la cristalografía da como resultado una estructura estática, promediada en tiempo y espacio que no representa eficientemente el total de las conformaciones posibles. En este contexto, la simulación por dinámica molecular es, al presente, la mejor manera de obtener un conjunto más completo de los distintos confórmeros. Sin embargo, los tiempos de simulación limitados, junto a la posible presencia de altas barreras energéticas sólo permiten obtener un pequeño conjunto de todas las conformaciones posibles [426,428]. Partiendo de la estructura cristalina del complejo dex‐GR LBD (pdb:1m2z) el Dr. Álvarez realizó simulaciones por MD de los distintos complejos ligando‐receptor. De acuerdo a esos resultados, se propuso que el complejo 21OH‐6,19OP‐GR podría tener afectada su capacidad de homodimerizar [396]. Sin embargo, los estudios empíricos realizados en este trabajo indican que 21OH‐6,19OP‐GR es capaz de formar oligómeros. Teniendo en cuenta los ensayos funcionales que demuestran que 21OH‐6,19OP no induce la transactivación del GR, pero si promueve su actividad transrepresora, no podemos descartar la posibilidad de que los dímeros formados adquieran una conformación incapaz de activar al receptor. De acuerdo a los resultados de EMSA, esta conformación no afectaría la capacidad del GR de unirse a ADN desnudo, dado que todos los complejos ligando‐receptor son capaces de unirse a un sitio GRE in vitro. Más aún, la dinámica de la interacción GR‐ADN es similar entre los complejos con dex (dímeros funcionales) y 21OH‐6,19OP (dímeros no funcionales). Dado que antagonistas como RU486 o 21OH‐6,19OP promueven la oligomerización del receptor, se concluye que la formación de homodímeros es posible, incluso frente a complejos ligando‐GR sin capacidad de transactivar. Por lo tanto, nuestros resultados apoyan la idea de que 133
Capítulo 1: Discusión
el paso de dimerización no es suficiente como para definir al GR como un factor de transcripción activo. El hecho de que el complejo 21OH‐6,19OP‐GR no sea capaz de interactuar con TIF2 en conjunto con los resultados de N&B siguieren que la formación de dímeros sería independiente tanto de la unión a sitios GRE como de la asociación a cofactores. Actualmente se acepta la teoría que establece que la capacidad de diferentes ligandos de regular la expresión génica depende de la identidad y expresión relativa de coactivadores y corepresores presentes en un determinado contexto celular [190]. Más aún, la unión del ligando al receptor no provocaría el pasaje de un estado inactivo a otro activo, sino que seleccionaría un determinado subconjunto de las conformaciones posibles que puede adoptar la proteína. En este sentido, la acción glucocorticoidea podría entonces clasificarse en término de los coreguladores que interactúan con el receptor, más que en actividades de transactivación (homodímero) o transrepresión (monómero). Por lo tanto, el estudio de las bases moleculares que determinan que un dado ligando promueva el reclutamiento de un subconjunto de cofactores echará luz al diseño de una nueva generación de drogas con actividades glucocorticoide‐selectivas. 1.12 Actividad monomérica e implicancias farmacológicas Como se mencionó en la introducción, los únicos antiglucocorticoides utilizados en la clínica son el acetato de ciproterona y el RU486. Pese a ello, ninguno es utilizado como tal, sino por la actividad antagonista que poseen sobre otro tipo de receptor de esteroides. Por lo tanto, un antiglucocorticoide específico, apto para uso clínico y sin efectos cruzados sobre otros receptores de esteroides es todavía una asignatura pendiente. En este sentido, 21OH‐6,19OP, al no presentar afinidad ni capacidad de transactivar al PR y al MR [50], lo hace un potencial antiglucocorticoide específico. Como hemos visto anteriormente, el GR puede modular a otros factores de transcripción como NFκB y AP‐1. En células BHK observamos que ambos análogos rígidos inhiben la actividad de estos factores de transcripción. Si bien se han descripto varios mecanismos a través de los cuales el GR puede modular la actividad de esas proteínas, al sobreexpresarse la subunidad p65 o el factor cJun, principalmente se está determinando la capacidad de los distintos complejos del GR de interaccionar físicamente con NFκB y AP‐1, respectivamente. En esta interacción, el GR participaría como monómero, por lo tanto, el hecho de que 21OH‐6,19OP se comporte como un agonista indica que el complejo GR‐21OH‐6,19OP posee la capacidad de actuar como monómero. 134
Capítulo 1: Discusión
Al menos para el caso de este ligando, nuestros resultados de coinmunoprecipitación sugieren que este proceso sería independiente del reclutamiento de TIF2, pese a que algunos autores sugieren un rol activo de este coactivador en la transrepresión [158,159]. Si adoptásemos el modelo disociado, podríamos decir que 21OH‐6,19OP adquiere especial interés farmacológico, dado que al actuar como un antagonista de la transactivación (efectos adversos) y como agonista de la transrepresión (efectos deseados) se comporta como un glucocorticoide disociado ideal. Sin embargo, dada las limitaciones descriptas anteriormente de este modelo, es preferible decir que 21OH‐6,19OP es un glucocorticoide que, si bien no puede inducir la transcripción de genes regulados por sitios GRE, puede actuar como monómero reprimiendo a factores como NFκB y AP‐1. La capacidad de este ligando de modular los efectos farmacológicos deseados en detrimento de los perjudiciales debe ser evaluada exhaustivamente en modelos in vivo. En cuanto a RU486, se han informado distintos resultados respecto a su capacidad de inhibir a NFκB. Por un lado, en células Cos‐1 que sobreexpresan la subunidad p65 de NFκB y el hGR, se observó que RU486 efectivamente inhibe la acción de NFκB [429]. Un resultado similar se obtuvo en células HeLa al sobreexpresar p65, mediante un ensayo de doble híbrido [430]. Por el contrario, en estas últimas células, al inducir la acción de NFκB con TNFα, RU486 no se comporta como agonista, al no afectar la acción de la citoquina [431]. En conjunto, estos resultados sugieren que la actividad inhibitoria de RU486 sobre NFκB depende del modo en que este factor de transcripción es activado. Dado que en nuestro ensayo se ha sobreexpresado p65, la actividad agonista de RU486 observada resulta consistente con los resultados anteriores. Por su parte, 21HS‐6,19OP también posee la capacidad de inhibir la acción de NFκB y de AP‐1, resultado consistente con su actividad agonista en la inducción del MMTV‐LUC. El complejo 21HS‐6,19OP‐GR se comporta, al menos en parte, de forma similar al complejo dex‐GR. Por ejemplo, ambos interactúan físicamente con TIF2, y ambos aumentan su actividad transcripcional cuando se sobreexpresa este coactivador. 1.13 Mecanismos de acción de 21OH‐6,19OP y RU486 Los ensayos de transactivación realizados previamente por el Dr. Álvarez [60,396], así como los plasmados a lo largo de este capítulo muestran que la introducción de un grupo hemisuccinato en la posición 21 del antagonista 21OH‐6,19OP produce un nuevo análogo rígido 135
Capítulo 1: Discusión
con actividad agonista. Este resultado ilustra como la simple adición de un grupo lateral voluminoso (en la posición C‐21) produce un cambio de antagonismo a agonismo sobre el GR. Por lo tanto, este grupo hemisuccinato podría estar involucrado en la interacción proteína‐ligando, estabilizando el complejo 21HS‐6,19OP‐GR en una conformación adecuada para inducir la transcripción. Esto implica que la unión de 21HS‐6,19OP al receptor produce un complejo capaz de llevar a cabo todos los eventos necesarios para la transcripción de un gen regulado por sitios GRE. Los resultados indican que ambos análogos rígidos son capaces de promover la translocación del receptor y su homodimerización. Sin embargo, pese a que ninguno inhibe la unión del GR al ADN in vitro ni modifican la cinética de disociación GR‐ADN, los análogos rígidos no se comportan de la misma manera respecto al reclutamiento de coactivadores. Curiosamente, la capacidad de reclutar coactivadores no ha sido evaluada en la gran mayoría de los ligandos del GR [153]. Figura 46. Modelo propuesto del mecanismo de acción de los antagonistas 21OH‐6,19OP y RU486. Tanto en presencia de 21OH‐6,19OP (21‐OH) como de RU486 el GR es capaz de translocar al núcleo celular y dimerizar, si bien en presencia de éste último posiblemente no se promueva la dimerización completa de todas las moléculas de GR. El mecanismo por el cual 21‐OH actúa como antagonista sería explicado, al menos en parte, por la incapacidad de promover el reclutamiento de coactivadores como TIF2 (A). Por otro lado, RU486, si bien promueve el reclutamiento de TIF2, la menor tasa de intercambio dinámico del GR con el ADN evitaría la formación de nuevos complejos de iniciación (B). En el caso de 21OH‐6,19OP, de acuerdo a los experimentos de coinmunoprecipitación, el complejo que forma con el GR es incapaz de interactuar con TIF2, explicando al menos en parte el mecanismo de acción de este antagonista. Por lo tanto, en presencia de 21OH‐6,19OP, es 136
Capítulo 1: Discusión
posible que el dominio AF‐2 del GR adopte una conformación incapaz de unir TIF2 o que el homodímero GR‐21OH‐6,19OP se encuentre bloqueado, quizás por la unión de otras proteínas que impiden el reclutamiento del coactivador (figura 46A). En este mismo sentido, los resultados de simulaciones por MD realizadas en el grupo del Dr. Gerardo Burton (Lic. Silvina Eduardo, comunicación personal), si bien analizan los mecanismos de disociación más que los de asociación, muestran que en presencia de 21OH‐6,19OP no se forman algunos puentes de hidrógeno entre la H12 del GR y TIF2, aumentando la fluctuación del péptido en comparación a otros complejos ligando‐GR. De cualquier manera, la presencia del grupo hemisuccinato genera un complejo ligando‐GR capaz de reclutar TIF2 e inducir la transcripción de un gen regulado por sitios GRE. A pesar de que el dominio AF‐2 del GR, involucrado en la unión a cofactores, está formado por residuos pertenecientes a las hélices H3, H4 y H12, su conformación depende principalmente de la posición de la H12. Así, la unión de un agonista como dexametasona induce un cambio conformacional en donde la H12 se posiciona de manera tal de permitir la interacción con coactivadores como TIF2 [73,432]. En cambio, cuando RU486 se une al GR, la H12 adopta una posición que, si bien previene la interacción con los coactivadores [432], permite el reclutamiento de corepresores [433]. En este sentido, nosotros observamos que GR y TIF2 coinmunoprecipitan in vivo frente a la unión de dexametasona o 21HS‐6,19OP y que además, ambos complejos agonistas aumentan su actividad transcripcional al sobreexpresarse el coactivador. Sin embargo, sorprendentemente, encontramos que en presencia de RU486 el GR es capaz de interactuar con TIF2, diferenciándose claramente en el mecanismo de acción de 21OH‐
6,19OP. De todas maneras, esta interacción no es funcional respecto a la capacidad del receptor de transactivar genes. Acorde con nuestros resultados, algunos grupos han descripto la interacción de TIF2 con el complejo RU486‐GR [384,434]. Además, también se ha demostrado que al menos para el PR, el RU486 también puede inducir una conformación agonista de la H12 [435]. Por lo tanto, cabe preguntarse por qué el RU486 es un antagonista del GR, siendo capaz de unirse al receptor, promover su translocación, su dimerización (al menos parcialmente) e incluso el reclutamiento de TIF2. Como se mencionó en la introducción, los mecanismos por los cuales el GR promueve la transcripción génica no han sido hasta el momento completamente dilucidados. El modelo de intercambio dinámico (“hit and run”) propone que la entrada y salida de moléculas de GR a la cromatina promueve constantemente el reclutamiento de nuevos complejos de iniciación 137
Capítulo 1: Discusión
transcripcional [218,220‐222]. En este sentido, el experimento de EMSA realizado en primer lugar por Pandit y colaboradores [410]; y reproducido satisfactoriamente en este trabajo podría llegar a explicar, al menos parcialmente, el por qué RU486 es un antagonista para la transactivación (figura 46B). De acuerdo a los resultados de disociación in vitro, dex promueve una rápida disociación entre el GR y el ADN. Por el contrario, en presencia de RU486 la tasa de disociación disminuye abruptamente. El efecto del agonista es consistente con el modelo de hit and run, ya que la alta tasa de intercambio entre el receptor y el ADN permitiría el constante reclutamiento de nuevos complejos de iniciación. Bajo este modelo, el retardo observado en la disociación, producido por RU486, podría explicar por qué este antagonista inhibe el GR, ya que no permitiría la formación de nuevos complejos de iniciación. Igualmente, es necesario aclarar que estas conclusiones son altamente especulativas, dada la artificialidad del experimento del cual se extraen: realizado completamente in vitro, con un extracto proteico y con ADN no cromatinizado. De todas formas, queda pendiente elucidar cuál es la causa de la diferencia en la tasa de disociación observada entre los distintos complejos ligando‐receptor. Por último, los resultados de N&B sugieren que RU486 promovería la dimerización de una menor cantidad de moléculas de GR respecto a los otros ligandos, lo cual podría aportar, al menos parcialmente, al efecto antagónico de este antiglucocorticoide (figura 46B). 138
CAPÍTULO 2 Mecanismos involucrados en la inducción del gen bax mediada por glucocorticoides. “Nature's laws govern which things can be done, and which can't. The trouble is, when we set out to do something, we don't always know which of these categories it's in”. Donald Simanek. Físico y escritor. Capítulo 2: Antecedentes
Mecanismos involucrados en la inducción del gen bax mediada por glucocorticoides ANTECEDENTES 2.1 Proteínas de la familia de Bcl‐2: Bax y apoptosis La familia de proteínas de Bcl‐2, de la cual se han identificado 24 miembros en mamífero hasta el momento, participa en el control de la apoptosis inducida por estímulos muy diversos, entre los que se incluyen la radiación ultravioleta, los glucocorticoides y la falta de estímulos de supervivencia [271,436,437]. Las proteínas de esta familia tienen la capacidad de promover así como de prevenir la apoptosis, y estructuralmente se caracterizan por la presencia de hasta cuatro dominios de tipo α‐hélice conservados, conocidos como dominios de homología con Bcl‐2 (dominios BH1, BH2, BH3 y BH4). Los miembros de esta familia se dividen en dos grupos: los que contienen los cuatro dominios (BH1‐BH4) en su estructura y los que carecen de uno o más de estos dominios. En el primer grupo, además de la proteína que le da nombre a la familia se encuentran Bcl‐XL, Bcl‐w y Mcl1, que tienen función anti‐apoptótica. Por otro lado, los miembros pertenecientes al segundo grupo, con función pro‐apoptótica, a su vez se dividen en dos: la subfamilia de Bax, que incluye a Bax y a Bak, los cuales poseen los dominios BH1, BH2 y BH3; y la sub‐familia que posee sólo el dominio BH3, que tiene como miembros a las proteínas Bad, Bid y Bim, entre otras [438]. Los dominios BH1, BH2 y BH3 forman una hendidura hidrofóbica en donde puede introducirse una α‐hélice BH3 anfipática [439]. Este tipo de interacción mediada por BH3, similar a una unión ligando‐receptor, es la responsable de las interacciones que presentan todos los miembros de la familia Bcl‐2 entre sí [440]. Estas proteínas regulan la apoptosis por diversos mecanismos, aunque el más estudiado las involucra directamente con la liberación de factores mitocondriales. Los miembros con función anti‐apoptótica se encuentran principalmente asociados a las membranas mitocondrial, nuclear y de retículo endoplásmico; e inhiben la liberación del citocromo C desde la mitocondria hacia el citoplasma [261]. Por otro lado, las proteínas pro‐apoptóticas, que se localizan principalmente en el citosol en ausencia de una señal de muerte; frente a un estímulo apoptótico se relocalizan en la membrana mitocondrial externa, induciendo la liberación de citocromo C y en consecuencia activando la vía intrínseca de la apoptosis [437]. 140
Capítulo 2: Antecedentes
Además, los miembros de esta familia son capaces de interactuar entre sí a través de sus dominios BH3 para formar homo o heterodímeros y, según la composición de los mismos, la función resultante será anti o pro‐apoptótica. Por ejemplo, los oligómeros de Bax son capaces de generar canales en liposomas y producir la liberación del citocromo C tanto en mitocondrias aisladas [441] como en mitocondrias in vivo [442]. En cambio, los heterodímeros Bcl‐2/Bax y Bcl‐
XL/Bax son anti‐apoptóticos, dado que impiden la homo u oligomerización de Bax [443]. Por lo tanto, los niveles relativos de las proteínas anti/pro apoptóticas son los que determinarían el destino celular hacia la muerte o la supervivencia. Un aumento de los niveles de Bcl‐2 en ausencia de un cambio en los niveles de las demás proteínas previene la apoptosis, mientras que un aumento en los niveles de Bax, la promueve [444]. Asimismo, se demostró que el perfil de expresión de los miembros de la familia cambia ante un estímulo apoptótico, y que este cambio difiere en función del tipo celular y la etapa del ciclo en la que la célula se encuentre [444,445]. En resumen, los miembros anti y pro‐apoptóticos funcionan entre sí como un reóstato y, dependiendo de la abundancia relativa de cada uno de ellos, se inducen o no cambios de permeabilidad de la membrana mitocondrial que determinarían la liberación al citoplasma del citocromo C, desencadenando finalmente la muerte celular [260,444,445]. 2.2 Apoptosis de timocitos inducida por glucocorticoides: relevancia de Bax Es un hecho establecido que el receptor de glucocorticoides es esencial en el proceso de apoptosis de células de timo [446]. Si bien se sabe que este proceso requiere de la síntesis de proteínas [447], aún se encuentra en discusión el mecanismo por el cual este ocurre. Una posibilidad es que el GR actúe como transactivador de genes que induzcan la muerte. En este sentido, en ratones en donde el GR endógeno ha sido reemplazado por el GRdim, el cual no puede transactivar, éstos presentan un timo normal, pero insensible al tratamiento con glucocorticoides [198]. Contrariamente, otra alternativa es que el GR funcione como transrepresor de genes esenciales para la supervivencia, mediante un cross‐talk con otros factores de transcripción [271]. En dicho sentido, el uso de otra forma transcripcionalmente inactiva del GR, pero que puede interactuar con factores de transcripción como AP‐1, es capaz de iniciar la señal de apoptosis en células T Jurkat [448]. Recientemente, se ha descripto que el GR en presencia de ligando, además de ir hacia el núcleo, puede translocar a la mitocondria tanto en células linfoides como no linfoides, iniciando directamente la cascada apoptótica [184,449‐451]. En este sentido, 141
Capítulo 2: Antecedentes
se ha demostrado que en timocitos CD4+CD8+ el GR transloca en mayor proporción a mitocondria que a núcleo [452]. Si bien los mecanismos involucrados en este proceso permanecen aún desconocidos, las hipótesis actuales abarcan desde una interacción directa con miembros de la familia bcl‐2, hasta la regulación génica del GR en sitios GRE en el genoma mitocondrial [453‐
455]. Más allá de estas últimas evidencias presentadas, la familia de proteínas de Bcl‐2 desempeñaría un papel regulador de la iniciación de la apoptosis en este sistema. Además, varios autores ya han descripto que la expresión de algunos de sus miembros es controlada por hormonas esteroides [355,456‐459]. Si bien se han propuesto varios sitios de acción para Bcl‐2, se acepta actualmente que esta proteína y su familia regulan el camino mitocondrial de apoptosis en timocitos tratados con glucocorticoides. De hecho, ratones knock out para bcl‐2 presentan apoptosis generalizada en el timo y una marcada aceleración de la muerte inducida por dexametasona [460]. Más aún, la sobre‐expresión de bcl‐2 inhibe la muerte celular inducida por glucocorticoides [445]. Por otro lado, se demostró que la proteína Bcl‐XL se redistribuye luego del tratamiento con dexametasona, localizándose exclusivamente en membranas celulares [461]. Experimentos realizados por nuestro grupo indican que el tratamiento hormonal aumenta la expresión de bax en timocitos de ratón [355]. Estos resultados correlacionan con la liberación del citocromo C desde mitocondria a citoplasma, la redistribución de fosfatidilserinas hacia la cara externa de la membrana plasmática y el aumento en el grado de fragmentación del ADN, todos ellos parámetros apoptóticos [462]. Numerosas evidencias apoyan la idea de que la proteína Bax es uno de los miembros de esta familia que actúa como mediador de la apoptosis en timo. Mientras que ratones knock out para bax presentan una hiperplasia de dicho órgano [463], la sobre‐expresión de esta proteína provoca una disminución del número de células T maduras [464], y aumenta la apoptosis de timocitos inducida por dexametasona [465]. De hecho, durante este mismo proceso, la dexametasona induce la translocación de Bax a mitocondria, junto con la liberación del citocromo C al citoplasma [466]. Por último, estudios de nuestro grupo demostraron que los glucocorticoides aumentan los niveles de Bax y de su correspondiente ARNm en cultivos primarios de timocitos de ratón [355]. En contraposición a nuestros resultados, se ha descripto que ratones knock out para bax son sensibles a la muerte de timocitos inducida por glucocorticoides [463]. Sin embargo, en otro 142
Capítulo 2: Antecedentes
estudio se ha demostrado que si bien ratones que no expresan Bax o Bak no presentan grandes alteraciones fenotípicas, cuando ambas proteínas están ausentes, los ratones mueren perinatalmente, y presentan hiperplasia de órganos linfoides [467]. De hecho, la pérdida combinada de Bax o Bak con Bim, otro miembro de la familia, sinergiza los defectos causados sobre la apoptosis de timocitos [468]. Esto sugiere que estas tres proteínas tendrían un rol redundante en el proceso apoptótico de ese sistema, y que en ausencia de una, la presencia de otra es suficiente para inducir la muerte celular. Por último, algunos estudios vinculan también el tratamiento con glucocorticoides y la expresión de Bax en otros sistemas. Se ha demostrado que la cortisona aumenta el número de células positivas para Bax en células de hueso y cartílago [469], e induce su transcripción junto con la muerte celular en células del hipocampo [470]. En este contexto, el objetivo principal propuesto para este capítulo es dilucidar el mecanismo a través del cual el GR induce la expresión de bax. 2.3 Objetivos particulares En base a los antecedentes expuestos, los objetivos particulares de este capítulo son: • Analizar la acción de los glucocorticoides sobre la transcripción del gen bax • Identificar los posibles elementos de respuesta dentro del promotor del gen bax, responsables de la inducción mediada por glucocorticoides en timocitos de ratón. • Analizar la posible acción de los glucocorticoides sobre la estabilidad del ARNm de bax.
143
Capítulo 2: Resultados
RESULTADOS
2.4 Análisis in silico del promotor de bax Como se mencionó anteriormente, estudios realizados por nuestro grupo demostraron que la dexametasona aumenta los niveles de Bax tanto a nivel de proteína como de ARNm, en cultivos primarios de timocitos de ratón [355]. Sin embargo, aún no se ha estudiado si el GR es capaz de regular en forma directa la expresión de dicho gen. En este sentido, el análisis de la secuencia de su región promotora reveló algunos sitios consenso de reconocimiento del GR, entre otros posibles sitios de unión a otros factores de transcripción (figura 47). Figura 47. Alineamiento de las secuencias del promotor de Bax de ratón, rata y humano. Se muestra algunas zonas del promotor de ratón desde ‐2264 hasta ‐445 respecto del ATG iniciador. Además se alinearon las regiones correspondientes de los promotores de rata y humano. Se indican los sitios GRE, CRE, RORα, AP‐1 y p53 potenciales, analizados con el programa Matinspector. Los asteriscos indican identidad de secuencia entre las 3 especies. 144
Capítulo 2: Resultados
Esta observación sugiere que la regulación de la expresión de bax por dexametasona podría ocurrir a través de la interacción directa del GR con elementos de respuesta presentes en la región promotora del gen. Otra posibilidad es que induzca la expresión de un factor de transcripción intermediario de la acción glucocorticoide. Por otro lado, se ha descripto que la actividad del promotor de bax es regulada por NF‐κB, AP‐1, SP1 y c‐Myc [471‐474], pero no por p53 [376]. En este contexto, es posible que bax pueda ser regulado a través de un cross talk entre el GR y alguno de estos factores, como se ha descripto en otros sistemas [475,476]. 2.5 Análisis in vivo de la actividad del promotor de bax Con el objeto de identificar la zona promotora responsable del efecto inductor de los glucocorticoides sobre la expresión del gen bax, se utilizaron tres vectores plasmídicos conteniendo el gen reportero luciferasa bajo el control de diversos fragmentos del promotor de dicho gen [376] (figura 48). De esta manera, mediante transfecciones transitorias de esos vectores y posterior tratamiento con la hormona, se intentó acotar la región de ADN responsable de la inducción de bax dependiente de glucocorticoides. Promotor de Bax
6500 pb
2675 pb
Gen reportero
Luciferasa
pBax I
Luciferasa
pBax III
Luciferasa
pBax II
1040 pb
Figura 48. Esquema de los vectores reporteros para la región promotora del gen bax. Se muestra la región promotora de Bax para cada vector (celeste) y la ubicación aproximada de los posibles sitios GRE (en rojo). Se indica el largo de la secuencia promotora, en relación al primer ATG codificante.
Los cultivos primarios son modelos muy difíciles de transfectar. En particular, pese a realizar diversos intentos, no se obtuvieron niveles aceptables de transfección para los cultivos primarios de timocitos, modelo en donde encontramos originalmente que la dexametasona aumenta los niveles de Bax [355]. Como se mencionara anteriormente, los glucocorticoides pueden ejercer efectos muy diversos dependiendo del contexto celular [27]. De esta manera, es sumamente probable que el efecto de la dexametasona sobre la expresión de bax dependa del tipo y/o contexto celular. Por lo tanto, decidimos utilizar un modelo que responda a dexametasona en forma similar a los 145
Capítulo 2: Resultados
timocitos de ratón, y que a su vez permita la transfección transitoria de vectores reporteros. En este sentido, recurrimos a la línea celular S49, derivada de linfoma T de ratón [477]. Antes de comenzar el estudio de la acción del GR sobre la expresión de bax en células S49, evaluamos en este nuevo modelo experimental algunas de las respuestas a glucocorticoides que previamente habíamos observado en timocitos [355]. En primera instancia, analizamos si las células S49 son susceptibles a la apoptosis inducida por glucocorticoides. Para ello, se trataron estas células en presencia o ausencia de dexametasona, para luego ser sometidas al ensayo de fragmentación del ADN como medida de la muerte celular programada. Los resultados (figura 49) muestran un incremento en la cantidad de ADN fragmentado cuando se tratan a las células con hormona. Esto indica que, al igual que en timocitos, los glucocorticoides inducen apoptosis en este modelo celular. Figura 49. La dexametasona induce apoptosis en células S49. Medición de apoptosis por fragmentación del ADN. Se trataron células S49 por 24 horas con vehículo (control) o 10 nM dex. Se extrajo el ADN fragmentado según se detalla en Materiales y Métodos. Se corrieron las muestras en un gel 1.5% agarosa. Se muestra un gel representativo (n=3). En segundo lugar, mediante ensayos de RT‐PCR en tiempo real y de Western blot estudiamos el efecto de los glucocorticoides sobre los niveles de Bax en este nuevo modelo. Los resultados muestran que la dexametasona incrementa tanto el ARNm de bax, como la proteína (figura 50). 146
Capítulo 2: Resultados
Figura 50. La dexametasona induce a bax en células S49. A. Ensayo de RT‐PCR en tiempo real. Se trataron células S49 durante 4 hs en presencia o ausencia de 10 nM dex. Se extrajo ARN y se realizó RT‐PCR en tiempo real para bax y el gen control GAPDH. El gráfico muestra la media ± ES de las veces de inducción respecto al control, de los niveles de bax/GAPDH. Se realizaron 4 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas por tratamiento. B. Ensayo de Western blot. Se trataron las células S49 durante 8 hs en presencia o ausencia de 10 nM dex. Se extrajeron proteínas y se realizó un Western blot con anticuerpos anti‐Bax y anti‐Actina. Se muestra un gel representativo de 3 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas por tratamiento. El gráfico muestra la media ± ES de las veces de inducción respecto al control de los niveles de bax/Actina. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Estos resultados son consistentes y similares a los observados previamente en timocitos [355]. Por lo tanto, y por lo menos para nuestra hipótesis de trabajo, consideramos que la línea S49 representa satisfactoriamente al modelo de timocitos de ratón. A continuación, y con el objeto de identificar la zona promotora responsable del efecto inductor de los glucocorticoides sobre la expresión del gen bax, se realizaron transfecciones transitorias en células s49 con los vectores reporteros que contienen diversos fragmentos del promotor de bax. Sorprendentemente, la figura 51A muestra que ninguna de las construcciones utilizadas respondieron al tratamiento con dexametasona en células S49. Más aún, en ensayos similares realizados sobre las líneas celulares Cos‐7, HC11 o BHK (figura 51B‐D) tampoco se encontraron diferencias significativas en los niveles de luciferasa, ya sea en presencia o ausencia de hormona. 147
Capítulo 2: Resultados
Figura 51. El promotor de bax no responde a glucocorticoides. Ensayo de actividad transcripcional del promotor de bax. A. Se transfectaron células S49 con los vectores reporteros pBax I, pBax II o pBax III. Luego de la transfección se agregó vehículo (control) o 100 nM dex por 8 hs. Se lisaron las células y se determinó la actividad de luciferasa. Se muestra las veces de inducción respecto del control ± ES de la actividad de luciferasa (normalizada a la cantidad de proteínas). Se realizaron entre 2 y 5 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas independientes entre sí. B‐D. Se transfectaron células HC11 (B), Cos‐7 (C) o BHK (D) con los vectores reporteros pBax I, pBax II, o pBax III. Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron a las células por 18 hs en presencia o ausencia de 10 nM dex. Se determinó la actividad de luciferasa y de βgal. Se muestra las veces de inducción respecto del control ± ES de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). 148
Capítulo 2: Resultados
Este resultado podría explicarse al menos por las siguientes hipótesis alternativas: • El efecto de la dexametasona sobre la expresión de bax no sería a nivel transcripcional sino a nivel de la estabilidad del ARNm. • La región promotora analizada no contiene el/los elemento/s responsables del efecto inductor de los glucocorticoides. • La región promotora analizada contiene la zona responsable del efecto inductor, pero la técnica utilizada no es lo suficientemente sensible, o el mecanismo de acción es dependiente del contexto genómico. Con respecto a la primera hipótesis, varios trabajos han descripto que los glucocorticoides afectan la estabilidad de algunos ARNm [478]. Por ejemplo, incrementan la estabilidad del ARNm de la hormona de crecimiento en hipófisis [479] y la sintasa de ácidos grasos en pulmón fetal [480]. Sin embargo, la mayoría de los efectos informados hasta el momento, corresponden a la desestabilización de ARNm, como es el caso de algunas citoquinas (IL‐1b, IL‐6, IL‐8), TNFα, Ccl2 y reguladores del ciclo celular como la ciclina D3, entre otros [481‐485]. De todas maneras, es posible entonces que la regulación de bax por glucocorticoides se deba a una estabilización del ARNm de bax y no a un aumento de la transcripción del gen. Esto explicaría la ausencia de efecto observada de la dexametasona sobre el promotor de bax. Por otro lado, si se asume que la regulación de bax ocurre a nivel de la transcripción del gen, es posible que la región responsable de dicho efecto pueda encontrarse río arriba de la región promotora analizada (por ejemplo un enhancer muy alejado), o quizás río abajo de la misma (por ejemplo dentro de un intrón). Finalmente, el efecto del GR podría depender de la re‐estructuración de la cromatina. Como los plásmidos no necesariamente se cromatinizan de la misma manera que el gen endógeno [147,486,487] podría ocurrir que dentro de la región analizada se encuentre la zona responsable de la inducción pero que al usar episomas no podamos evaluar este efecto. En las próximas secciones intentaremos analizar algunas de estas hipótesis. 2.6 Estudios sobre la estabilidad del ARNm de bax La vida media de los transcriptos está controlada principalmente por secuencias específicas presentes en las mismas moléculas de ARNm. Estos elementos en cis influyen en la estabilidad de 149
Capítulo 2: Resultados
los transcriptos a través de interacciones con proteínas (elementos en trans) que promueven la estabilización o degradación de los mismos. Los elementos regulatorios pueden encontrarse tanto en la región 3´ no codificante (untranslated region, UTR) [488] como en la región 5´‐UTR [489]. Incluso pueden localizarse en la región codificante del transcripto [490]. Además, la cola de poliadenosinas, presente en prácticamente todos los ARNm son esenciales para la estabilidad de los mismos [491‐493]. Uno de los elementos regulatorios en cis más estudiados hasta el momento son las regiones de secuencia ricas en adenosina y uracilo, denominadas secuencias ARE. Los AREs son secuencias de 50 a 150 nucleótidos, y han sido divididos en 3 grupos de acuerdo al número y distribución de los pentámeros AUUUA [494]. Los AREs que se agrupan en la clase I contienen de 1 a 3 copias del motivo AUUUA dentro de las regiones ricas en U. Los AREs pertenecientes a la clase II poseen al menos 2 nonámeros UUAUUUA(U/A)(U/A) solapados. La clase III está compuesta de regiones ricas en uracilo, carentes del motivo AUUUA [494]. Así como la mayoría de los factores que actúan en cis, los AREs median sus efectos sobre la estabilidad de los transcriptos interactuando con proteínas intracelulares. Si bien se han identificado algunas de estas proteínas, llamadas colectivamente proteínas de unión a elementos ricos en AU (AUBPs), sólo se han demostrado roles funcionales para algunas pocas. Por ejemplo, algunas incrementan la estabilidad de los transcriptos como HuR [489], mientras que otras se relacionan con su desestabilización, como tristetraprolina (TTP) [495]. Asimismo, algunas aparentan tener funciones opuestas según el entorno celular, como la proteína de unión a elementos ricos en AU 1 (AUF1) [496]. Por otro lado, existen trabajos que indican que la expresión de algunas AUBPs y su localización subcelular está regulada por hormonas esteroides [497‐499]. En particular, ha sido descripto que la dexametasona induce la expresión de TTP en células de pulmón [500]. En este sentido, y teniendo en cuenta que los glucocorticoides podrían regular a Bax mediante la estabilización de su transcripto, evaluamos si algunas AUBPs eran inducidas por dexametasona en nuestro modelo experimental. Si bien el extremo 3’UTR del ARNm de bax presenta algunas zonas ricas en adenina y timina (figura 52A), ninguna de ellas aparenta tener un consenso clásico de reconocimiento de sitios AREs. Más aún, los niveles de los transcriptos de TTP y HuR no parecen modificarse frente al agregado de dexametasona, al menos en los tiempos utilizados (figura 52B). Por lo tanto, dado que no existe consenso ARE en el ARNm de bax, y que los niveles del mismo aumentan entre las 3 y las 5 horas de estímulo mientras que TTP y HuR se mantienen constantes durante ese mismo 150
Capítulo 2: Resultados
período, es poco probable que estas proteínas estén involucradas en una posible regulación de la estabilidad del transcripto de bax. Figura 52. La dexametasona no afecta los niveles del ARNm de TTP o HuR en células S49. A. Se muestra la región 3´no codificante del ADNc de Bax. Los números indican la posición respecto al +1 de la transcripción. Se destacan el codón STOP de la traducción (tga, en azul); la señal de corte y poliadenilación (subrayado); y las zonas ricas en Adenina y timina. Ninguna región presenta un consenso clásico de reconocimiento ARE. B. Se trataron células S49 con dexametasona (Dex) o vehículo (Control) por los tiempos indicados. Se extrajo ARN y se midieron los niveles de Bax, TTP y HuR por RT‐PCR semicuantitativa. A continuación, decidimos evaluar si efectivamente existe una regulación diferencial en la estabilidad del ARNm de bax frente al estímulo con dexametasona. Para ello, se determinaron los niveles de bax en presencia del inhibidor de la transcripción Actinomicina D. Debido a que todavía no sabemos si el efecto del GR sobre la expresión de bax es directo (sobre el gen) o indirecto (induce a otro gen necesario para regular a bax) en todos los casos realizamos un pre‐
tratamiento con la hormona durante 4 horas (el tiempo necesario para ver un efecto a nivel de ARNm), para luego agregar el inhibidor de la transcripción (esquema figura 53A). De esta manera, podremos ver el efecto sobre la estabilidad del transcripto, independientemente del mecanismo de acción del GR. Es decir, si fuese indirecto, entonces con este diseño no estaremos inhibiendo la transcripción del supuesto gen que mediaría la regulación de bax. Dado que el aumento neto en los niveles del transcripto se detecta entre las 3 y las 5 horas de tratamiento (ver figura 50 y 52B), es lógico asumir que si efectivamente existe un efecto 151
Capítulo 2: Resultados
en la estabilidad del ARNm, éste debe tener una vida media menor o igual a esos tiempos. En este sentido, decidimos hacer un primer ensayo durante esa ventana temporal. Figura 53. Estabilidad del ARNm de bax a tiempos cortos. A. Diseño experimental. Se trataron células S49 por 4 horas en ausencia o presencia de dex 100 nM. A continuación, se agregó actinomicina D y se tomaron alícuotas en los tiempos indicados. B‐C. De cada alícuota se extrajo ARN y se realizaron ensayos de RT‐PCR semicuantitativa (B) o cuantitativa por RT‐PCR en tiempo real (C). El gráfico muestra los niveles de Bax/Actina expresados como el valor porcentual relativo al tiempo cero de cada tratamiento. Como se observa en la figura 53B‐C, los niveles del ARNm de bax se mantienen constantes a lo largo del experimento ya sea en presencia o ausencia de dexametasona. Este resultado plantea dos alternativas: o bien la vida media de este mensajero es mayor a los tiempos evaluados, o bien la Actinomicina D no está inhibiendo la transcripción. Con el objeto de discernir entre estas dos posibilidades, se realizó un ensayo semicuantitativo a tiempos más largos, pero solamente evaluando la estabilidad del ARNm de bax frente al inhibidor de la transcripción. Los resultados muestran que recién entre las 8 y las 24 horas de inhibida la transcripción comienza a detectarse una disminución en los niveles del ARNm de bax (figura 54). Este resultado sugiere que la Actinomicina D inhibe efectivamente la transcripción en este modelo, y que la vida media de este transcripto es relativamente larga, al menos mayor a 8 horas. 152
Capítulo 2: Resultados
Figura 54. El ARNm de Bax tiene una vida media mayor a las 8 horas. Se trataron a las células S49 con Actinomicina D y luego de los tiempos indicados se extrajo ARN y se realizó una RT‐PCR semicuantitativa para bax y Actina. Se muestra el diseño experimental utilizado (A) y un gel representativo (B). Finalmente, se realizó el experimento con Actinomicina D evaluando los niveles del transcripto de bax a tiempos mayores, en presencia o ausencia de dexametasona (ver esquema figura 55A). Figura 55. La dexametasona no regula a Bax mediante la estabilización de su ARNm. A. Diseño experimental. Se trataron células S49 por 4 horas en ausencia o presencia de dex 100 nM. A continuación, se agregó actinomicina D y se tomaron alícuotas en los tiempos indicados. A cada alícuota se le extrajo ARN y se realizaron ensayos de RT‐PCR en tiempo real. B. Niveles del transcripto de Bax en función del tiempo. El gráfico muestra los niveles del transcripto de bax (normalizados a la cantidad de ARN ribosomal) expresados como %
respecto del tiempo cero de cada tratamiento. C. Cálculo de la vida media del ARNm de bax. Para el cálculo del tiempo de vida media se realizó una regresión lineal de los datos expresados como log
10 de los niveles de bax normalizados. D. Se muestra un gel representativo de la electroforesis realizada sobre el ARN total. Las dos bandas corresponden al ARN ribosomal (ARNr), utilizado para la normalización. Se realizaron tres experimentos independientes. 153
Capítulo 2: Resultados
A partir de los resultados ilustrados en la figura 55, se calculó el tiempo de vida media (t1/2) del ARNm de bax, el cual resultó de 12.8±3.5 horas sin tratamiento hormonal y de 11.8±3.9 horas cuando se estimuló con dexametasona. Por lo tanto, por un lado observamos que el t1/2 del transcripto de bax es mucho mayor que el tiempo que tarda la dexametasona en generar una diferencia en los niveles totales del mensajero. Además, la adición de la hormona no tiene un efecto diferencial sobre el tiempo de vida media. En su conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que los glucocorticoides no regulan a bax mediante la estabilización de su ARNm. 2.7 Análisis in silico de los intrones de Bax La ausencia de un efecto inductor de los glucocorticoides sobre las primeras 6.5 kb del promotor de bax (figura 51A) abre la posibilidad de que el elemento responsable del incremento no se encuentre en el promotor, sino en regiones río abajo del mismo. De hecho, se ha encontrado un enhancer en uno de los intrones de bax para el factor de transcripción p53 [501]. Inspirados en este hallazgo, decidimos realizar un análisis in silico de los intrones del gen bax en busca de elementos de respuesta a glucocorticoides. El gen bax de ratón contiene 6 exones y 5 intrones (figura 56). Figura 56. Esquema de la estructura génica de bax. Se muestran los exones (rectángulos) y los intrones (rayas) con sus respectivos tamaños en pares de bases. Además se muestra en rojo la localización aproximada de los sitios GRE putativos de la tabla 5. Se indica también la localización aproximada del primer ATG de la traducción y del codón stop (TGA). Según el análisis realizado con el programa MatInspector [394], se encontraron cinco sitios putativos de unión al GR distribuidos en cuatro de los cinco intrones del gen (tabla 5). Además, dos de los potenciales GREs presentan un valor mayor a 0,90 (máximo 1) para el parámetro Matrix Similarity, lo que significa que hay una muy buena correlación en cuanto a la secuencia nucleotídica presente con respecto a las secuencias de unión consenso. Este hecho abre la intrigante posibilidad de que efectivamente el GR podría regular a bax uniéndose a un enhancer localizado dentro de un intrón. 154
Capítulo 2: Resultados
Intrón Sitio GRE 1 2 3 3 5 aggggtcctagGGTTcttg gaaccaagcggTGTTctga ctgggcactgtTGTTcttc gctggtccttgtGTCCttc acccatctctctGTTCtca Ubicación Matrix (pb) Similarity 33 0,807 37 0,892 47 0,879 553 0,928 1413 0,903 Tabla 5. Busqueda in silico de sitios GRE en los intrones del gen Bax. Se analizaron las regiones intrónicas del gen Bax con el programa MatInspector (Genomatix). Se muestra en la tabla el sitio GRE hallado y la ubicación en pares de bases con respecto al +1 de cada intrón. El índice de confianza del Software utilizado también se indica (Matrix Similarity). 2.8 Mecanismo de acción del GR sobre la expresión de bax Como se mencionara previamente, aún no se ha dilucidado si el GR es capaz de regular en forma directa a bax. De hecho, el GR podría inducir otro gen, cuyo producto proteico es necesario para la inducción de bax. Asimismo, también podría ocurrir que el receptor de glucocorticoides reprima la expresión génica de una proteína que a su vez se encuentre inhibiendo la transcripción de dicho gen. Con el objeto de evaluar efectivamente si el GR actúa de manera directa o indirecta sobre este gen pro‐apoptótico, se realizaron ensayos utilizando el inhibidor de la síntesis proteica Anisomicina [502]. De esta manera, si el GR actúa en forma directa no debería observarse ningún efecto de esta droga sobre el aumento del ARNm de bax dependiente de glucocorticoide. Por el contrario, si el efecto del GR es indirecto, inhibir la capacidad de traducción de la célula debería inhibir también el efecto de la dexametasona sobre la expresión de bax. Por lo tanto, se pre‐
incubaron células S49 durante 30 minutos en ausencia o presencia del inhibidor de la síntesis proteica y luego se las trató con vehículo o dexametasona. Se determinaron los niveles de ARNm de bax por RT‐qPCR. Los resultados se ilustran en la figura 57. Existen al menos dos maneras de interpretar los resultados obtenidos con Anisomicina. Por un lado, al graficar y comparar los datos relativizados a cada uno de los controles (Dex vs control; Dex+An vs Control+An, figura 57A) estaríamos analizando el efecto de la Anisomicina sobre la capacidad de la dexametasona de inducir a bax. Estos resultados indican aparentemente que el inhibidor de la síntesis proteica se encuentra bloqueando el efecto inductor de la dexametasona, ya que al agregar Anisomicina no se observa un aumento en los niveles de bax en presencia del glucocorticoide. Esto apoya la hipótesis que propone que el GR actuaría de manera 155
Capítulo 2: Resultados
indirecta en la regulación de la expresión de bax. Sin embargo, si observamos los mismos datos, pero esta vez los representamos todos relativizados al control sin el inhibidor (figura 57B), podemos ver que la Anisomicina posee un efecto inductor per se sobre los niveles de bax. Entonces surge la posibilidad que ‐ aunque el efecto del GR sea directo ‐ en realidad la Anisomicina incremente los niveles de bax a un determinado valor, tal que el efecto inductor de la dexametasona no pueda ser visualizado. Figura 57. Efecto de la Anisomicina sobre la regulación de Bax dependiente de glucocorticoides. Se pre‐
incubaron células S49 en ausencia (‐An) o presencia (+An) del inhibidor de la síntesis proteica Anisomicina (An) 1 µM por 30 minutos y luego se trataron con vehículo (Control) o 100 nM dexametasona (dex) por 4 horas. Se extrajo ARN y se realizó RT‐PCR en tiempo real para bax y GAPDH. A. El gráfico muestra las veces de inducción ± ES de los niveles de bax/GAPDH relativos a cada control. B. El gráfico muestra las veces de inducción ± ES de los niveles de bax/GAPDH relativos al control (sin ninguna droga). Se realizaron 4 experimentos, cada uno con 2 réplicas independientes por tratamiento. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). 156
Capítulo 2: Resultados
Como vimos en el primer capítulo de este trabajo, el análogo rígido 21OH‐6,19OP es un glucocorticoide disociado: mientras que en ensayos de transactivación se comporta como antagonista del GR, en estudios de transrepresión posee actividad agonista. Por lo tanto, este esteroide puede utilizarse como herramienta para dilucidar si el GR induce a bax mediante un mecanismo de transactivación (como homodímero) o mediante un mecanismo de transrepresión (como heterodímero con otro factor de transcripción). En este sentido, se crecieron células S49 en presencia de dexametasona y/o 21OH‐6,19OP y se determinó por Western blot la cantidad de proteína Bax presente. Como se observa en la figura 58, mientras que la dexametasona aumenta los niveles proteicos de Bax, el análogo rígido per se no tiene efecto alguno. Sin embargo, el agregado conjunto de ambas drogas produce la inhibición del efecto inductor de dexametasona. El hecho de que 21OH‐6,19OP se comporta como antagonista en este sistema sugiere que el GR induce a bax mediante la unión directa a elementos de respuesta a glucocorticoides, ya sea sobre el propio gen bax, o indirectamente sobre algún otro gen blanco. Figura 58. 21OH‐6,19OP inhibe el aumento de bax dependiente de dexametasona. Se trataron células S49 con vehículo (control), dex 10 nM y/o 10 µM 21OH‐6,19OP por 8 hs. Se extrajeron proteínas y se realizó un ensayo de Western blot utilizando anticuerpos anti‐bax y anti‐actina. Se muestra un gel representativo (A) y la cuantificación de 3 experimentos independientes (B), expresado como veces de inducción ± ES de los niveles de Bax/Actina respecto al control. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). 157
Capítulo 2: Discusión
DISCUSIÓN 2.9 Mecanismos involucrados en la inducción de bax mediada por GR Como se mencionó anteriormente, numerosas evidencias apoyan la idea de que la proteína Bax actúa como mediador de la apoptosis en timo. El hallazgo previo de nuestro grupo describiendo que la dexametasona aumenta los niveles de bax en ese modelo [355], nos llevó a investigar los mecanismos por los cuales el GR media este incremento, principal objetivo de este capítulo. El análisis in silico del promotor del gen bax reveló algunos sitios potenciales de respuesta a glucocorticoides (figura 47), lo cual nos llevó, naturalmente, a proponer la hipótesis de que Bax es inducido por el GR en forma directa, a través de la vía clásica de transactivación. Consecuentemente, comenzamos con una estrategia estándar para la identificación de aquellos sitios responsables. La adquisición de vectores de expresión, conteniendo un gen reportero bajo el control de distintos fragmentos de la región promotora de bax (figura 48), nos permitió analizar la expresión de este gen reportero en respuesta a glucocorticoides a fin de acotar la región responsable de dicha respuesta dentro del promotor. Una vez acotada esa región, haríamos un estudio de los sitios GRE candidatos utilizando la técnica de EMSA, y posteriormente la confirmación in vivo a través de inmunoprecipitación de cromatina. En paralelo, mediante mutagénesis dirigida evaluaríamos si esos sitios eran efectivamente necesarios para la inducción de Bax dependiente de glucocorticoides. Dada la imposibilidad técnica de introducir los plásmidos en cultivos primarios de timocitos, el primer paso consistió en el establecimiento de un modelo experimental, como lo fue el de la línea S49, la cual, al menos en nuestro paradigma experimental, se comportó de forma similar a los cultivos de timocitos: sensibilidad a la apoptosis inducida por glucocorticoides (figura 49) y aumento de los niveles de bax frente al estímulo hormonal (figura 50). Sin embargo, y para nuestra sorpresa, cuando realizamos las transfecciones con los distintos vectores encontramos que la región promotora de bax, cuando menos las primeras 6.5 kb, no son responsables del efecto inductor de la dexametasona (figura 51). Esto nos obligó a cambiar por completo el diseño original, y replantear nuevas hipótesis de trabajo. Si bien existen varios trabajos describiendo el efecto del GR sobre la estabilidad de ARN mensajeros [479,483,503‐505], nuestros resultados sugieren fuertemente que este mecanismo 158
Capítulo 2: Discusión
no está involucrado en el aumento neto de los niveles de bax frente al tratamiento con dexametasona (figura 55), si no que avalan la hipótesis de que el GR induce la transcripción de Bax. Sin embargo, es necesario llevar a cabo otros estudios como por ejemplo experimentos de Nuclear Run On para confirmarlo. Los estudios de actividad transcripcional del GR, mostrados en el capítulo anterior describen al ligando 21OH‐6,19OP como un glucocorticoide disociado: en ensayos de transactivación se comporta como un antagonista mientras que en ensayos de transrepresión actúa como un agonista. Por lo tanto, decidimos ensayar también este ligando para determinar cuál de estos mecanismos de acción del GR regula la expresión de Bax. Los resultados muestran un efecto antagónico de 21OH‐6,19OP sobre la acción de dexametasona (figura 58), sugiriendo entonces que el GR induce a bax mediante un mecanismo de transactivación. De todas maneras, los resultados anteriores no descartan la posibilidad de que el efecto inductor del GR sobre el gen pro‐apoptótico sea indirecto, es decir, mediante la transactivación de otro gen, cuyo producto proteico esté involucrado a su vez directa o indirectamente en la respuesta final. Ejemplos de este tipo de mecanismo ya han sido demostrados, entre otros, para la ciclooxigenasa‐2 (Cox‐2), donde sus niveles de ARNm se encuentran regulados por lo glucocorticoides a través de la inducción génica de DUSP1, una fosfatasa de la MAPK p38, la cual es finalmente responsable de los niveles del transcripto de Cox‐2 [482,506]. En este contexto, con el objeto de evaluar la posibilidad de un mecanismo similar sobre la regulación de Bax, utilizamos el inhibidor de la síntesis proteica Anisomicina [502]. De esta manera, si el GR requiere de la síntesis de novo de un factor intermediario, el inhibidor debería anular el efecto inductor de la dexametasona sobre Bax. Los resultados, sin embargo, no son concluyentes debido a un efecto per se del inhibidor sobre los niveles del transcripto de bax (figura 57). En este sentido, se ha descripto que la Anisomicina induce la apoptosis de algunos tipos celulares [507‐512], entre los que se incluye a la línea S49 [513]. Este inhibidor de la síntesis proteica promueve la translocación de Bax a la mitocondria, la liberación de Citocromo C y la activación de caspasa 8 [514]. Además, también se demostró que promueve la transcripción de varios genes a través de la activación de la vía de MAPK [515,516]. Por lo tanto, es posible que el aumento en los niveles de bax por Anisomicina sea consecuencia indirecta de su efecto apoptótico sobre las células S49. De esta forma, si bien la Anisomicina bloqueó el efecto de lo glucocorticoides sobre bax, este experimento no nos permite descartar la posibilidad de una regulación indirecta del GR sobre el gen pro‐apoptótico. 159
Capítulo 2: Discusión
Además, tanto el análisis in silico de los intrones de bax (tabla 5), así como ejemplos hallados en la bibliografía [501] abren la posibilidad de que el elemento regulador responsable de la inducción de bax se encuentre dentro de un intrón del gen. Si aceptamos la hipótesis de un efecto indirecto del GR, la búsqueda de este factor desconocido requerirá la evaluación funcional de cada región intrónica del gen. En conclusión, durante la búsqueda de los mecanismos moleculares involucrados en la inducción de Bax en células S49 encontramos que el GR actuaría mediante un mecanismo de transactivación, ya sea de manera directa sobre bax, o indirectamente a través de la inducción transcripcional de un intermediario. De todas maneras, la región responsable del aumento transcripcional del gen bax sería a través de un enhancer que no se encuentra localizado en las primeras 6.5 kb del promotor. 160
CAPÍTULO 3 Antagonismo entre la melatonina y los glucocorticoides. “Science is always wrong. It never solves a problem without creating ten more”. George Bernard Shaw (1856‐1950). Escritor Irlandés. Premio Nobel de literatura, 1925. Capítulo 3: Antecedentes
Antagonismo entre la melatonina y los glucocorticoides ANTECEDENTES 3.1 Melatonina y glucocorticoides: mecanismos de acción Como se mencionó en la introducción, numerosas observaciones experimentales permiten postular la existencia de una acción antagónica entre los glucocorticoides y la melatonina. En particular, nuestro grupo demostró que la melatonina inhibe la acción apoptótica de los glucocorticoides en timocitos de ratón, al menos a través de una inhibición en los niveles de expresión de la proteína pro‐apoptótica Bax, siendo esta proteína uno de los blancos en la acción apoptótica de los glucocorticoides [355]. Posteriormente, en trabajos realizados durante mi Tesis de licenciatura encontramos que, mientras que la melatonina no es capaz de inhibir la unión de la dexametasona al GR in vitro (figura 59A); si es capaz de inhibir su translocación al núcleo en timocitos de ratón in vivo (figura 59B). Por otro lado, también pudimos observar que el efecto antagónico no ocurre en cualquier tipo celular: ensayos de actividad transcripcional del GR realizados en células Cos‐7 (figura 59C) o HC11 (derivadas de epitelio normal de ratón) (figura 59D) mostraron que la melatonina no pudo inhibir la actividad transcripcional del receptor. Sin embargo, en estudios realizados sobre la línea celular SL2 de Drosophila, si se ha demostrado que la melatonina inhibe la transcripción inducida por activación del GR, y que este efecto podría estar mediado por el receptor Mel1a [348]. Más aún, otros autores también han descripto que el metoxiindol es capaz de antagonizar a los glucocorticoides en células MCF‐7 [349] y HT22 [517]. 162
Capítulo 3: Antecedentes
Figura 59. Antecedentes sobre los estudios del antagonismo entre melatonina y glucocorticoides. A. Ensayo de competencia entre dexametasona (Dex) y melatonina (Mel) por el GR. Se incubaron 600 µg de una fracción proteica de timo por 16 h a 4°C con dexametasona tritiada ([3H]Dex): 350,000 dpm (Ae =75 Ci/mmol) en ausencia o presencia de 5 µM Dex y 5 µM Mel. El gráfico muestra la media de las desintegraciones por minuto (DPM) ± ES. B. Inmunofluorescencia indirecta para GR por microscopía confocal. Se incubaron timocitos de ratón en presencia o ausencia de 10 nM Dex o 10 nM Mel durante 30 minutos. Se utilizó un anticuerpo primario anti‐GR y un anticuerpo secundario acoplado al fluoróforo Alexa flúor 488 (fluorescencia verde). Simultáneamente, las células se incubaron con ioduro de propidio con el objeto de marcar los núcleos (fluorescencia roja). C‐D. Actividad transcripcional del GR en células Cos‐7 y HC11. Se transfectaron células Cos‐7(C) o HC11 (D) con el plásmido pMMTV‐LUC. Se utilizó pCMV‐
LacZ como control de la transfección. Se trataron las células con 10 nM dexametasona (Dex) en presencia o ausencia de 10 nM Melatonina (Mel) y se determinó la actividad de luciferasa y la actividad de β‐galactosidasa. Se muestra la media ± ES de las veces de inducción respecto al control, de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Se realizaron 3 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas independientes entre sí. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Adaptado de [518]. 3.2 Objetivos particulares En base a los antecedentes mostrados, los objetivos particulares de este capítulo son: • Dilucidar qué punto, dentro del proceso de activación del GR, es bloqueado por acción de la melatonina. 163
Capítulo 3: Antecedentes
• Estudiar si el efecto antagónico de la melatonina sobre los glucocorticoides es general o específico del tipo celular. • Evaluar las vías de señalización por las cuales la melatonina modula la actividad del receptor de glucocorticoides. 164
Capítulo 3: Resultados
RESULTADOS 3.3 Modulación de la actividad del GR por melatonina en timocitos de ratón y células de timoma murino S49 3.3.1 Ensayos de competencia in vivo Un posible mecanismo, involucrado en el efecto antagónico que la melatonina ejerce sobre los glucocorticoides, podría ser que el metoxiindol inhiba la unión del esteroide a su receptor. De esta manera, el GR no se activaría, y en consecuencia no se observaría el efecto biológico (mediado por receptor) que los glucocorticoides producen. Previamente demostramos que la melatonina no es capaz de desplazar la unión de la dexametasona al GR (proveniente de extractos proteicos de timocitos de ratón) in vitro (figura 59A). Sin embargo, dada la naturaleza del diseño experimental utilizado no podíamos descartar que ese proceso no se encuentre ocurriendo dentro de la célula. Por lo tanto, e inspirados en trabajos de otros laboratorios [519,520] realizamos ensayos de competencia entre melatonina y dexametasona in vivo. Para ello, se ensayó la capacidad de un cultivo primario de timocitos de retener [3H]‐Dex en presencia o ausencia de melatonina. Figura 60. La Melatonina no afecta la unión de la dexametasona al GR in vivo. Ensayo de competencia entre dexametasona y melatonina por el GR. Se incubaron timocitos durante 1 hora 3
a 37°C con 5 nM de dexametasona tritiada ([ H]‐Dex, 440000 dpm, Ae = 26.5 Ci/mmol) y 2.5 µM de dex no radiactiva, 500 nM de RU486, o 500 nM de Melatonina (Mel) según se indica. La figura muestra la media ± desvío estándar de las desintegraciones por minuto (DPM) medidas en contador de centelleo líquido. 165
Capítulo 3: Resultados
Los resultados (figura 60) muestran que tanto RU486 así como un exceso de dexametasona radioactiva son capaces de reducir la cantidad de [3H]‐Dex acumulada en las células. Por el contrario, la melatonina no fue capaz de disminuir los niveles de radioactividad intracelular. Estos resultados, aunque preliminares, sugieren que el metoxiindol no inhibe la capacidad de la dexametasona de unirse a su receptor in vivo. 3.3.2 Estudios de disociación del complejo GR‐Hsp90 Un segundo punto susceptible de ser regulado dentro del mecanismo de activación del GR, es la capacidad del mismo de translocar a núcleo luego de la interacción con su ligando. Dado que la melatonina no afecta la unión de la dexametasona al receptor de glucocorticoides, nos preguntamos si su acción antagónica podría afectar la redistribución subcelular del complejo dex‐
GR. Si este fuera el caso, el receptor podría tener comprometida su actividad como factor de transcripción. Durante mi Tesis de licenciatura evaluamos esta hipótesis realizando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta analizada por microscopía confocal y encontramos que la melatonina inhibe la translocación del receptor de glucocorticoides inducida por dexametasona en timocitos de ratón (figura 59B). Como se mencionó anteriormente, la proteína Hsp90 forma parte del heterocomplejo del GR y su asociación es esencial para que el receptor adquiera una conformación tal que le permita unir ligando [101,102]. Además, Hsp90 juega un papel relevante durante la translocación del heterocomplejo al núcleo: por un lado su unión al GR oculta la señal de localización nuclear, y por otro lado parece actuar como nexo con el sistema de transporte mediado por microtúbulos [99,112]. En este contexto, se decidió evaluar el estado de asociación entre el GR y la Hsp90 en presencia o ausencia de melatonina con el propósito de hallar un posible mecanismo molecular que explicara el antagonismo generado por el metoxiindol. Se incubaron timocitos durante 45 minutos en presencia o ausencia de dexametasona y/o melatonina, y se inmunoprecipitó el GR para evaluar el estado de asociación/disociación del complejo GR‐Hsp90. 166
Capítulo 3: Resultados
Figura 61. La melatonina previene la disociación de hsp90 inducida por dexametasona. A. Coinmunoprecipitación entre GR y Hsp90. Se incubaron timocitos en presencia o ausencia de Dex (10 nM) y/o Mel (10 nM) por 45 min a 37°C. Luego, se inmunoprecipitaron extractos proteicos con un anticuerpo anti‐GR (Ab) como se describe en Materiales y Métodos. B. Se analizó la cantidad de Hsp90 asociada al GR; el gráfico muestra la media ± ES para los niveles de hsp90/GR (unidades arbitrarias) de tres experimentos independientes. Como se ilustra en la figura 61, los experimentos de coinmunoprecipitación muestran que la dexametasona induce la disociación entre el GR y Hsp90 (calle 2 vs calle 1), mientras que el tratamiento con melatonina impide la disociación de la chaperona (calle 3 vs calle 2). Estos resultados sugieren que el metoxiindol previene la transformación del receptor al bloquear la disociación del complejo GR‐Hsp90. 3.3.3 La línea celular S49 como modelo de antagonismo entre melatonina y glucocorticoides Los ensayos de coinmunoprecipitación in vivo constituyen una herramienta muy poderosa para determinar si existe interacción ‐ al menos indirecta ‐ entre proteínas. Sin embargo, estos ensayos requieren en general de una gran cantidad de muestra. En particular, nuestros experimentos demandan aproximadamente 1 mg de proteína por tratamiento, por réplica. Dado que para la obtención de esta cantidad de muestra es necesario el sacrificio de un gran número de animales, se decidió seguir con los experimentos en un modelo celular, en donde no exista limitación de material biológico. En este sentido, optamos por la utilización de la línea celular S49, como en el capítulo anterior. Antes de poder continuar con los estudios de los mecanismos moleculares subyacentes al antagonismo entre la melatonina y los glucocorticoides, fue necesario comprobar que este nuevo modelo se comporte de manera similar a lo previamente observado en cultivos primarios de timocitos, en lo que respuesta a melatonina se refiera. Se ha descripto que la melatonina inhibe la apoptosis de timocitos inducida por glucocorticoides [345], siendo esta mediada al menos en 167
Capítulo 3: Resultados
parte por un aumento en la expresión del gen que codifica para la proteína pro‐apoptótica Bax [355]. En este sentido, se propuso verificar si en este nuevo modelo experimental la melatonina también inhibe estos procesos. Para ello, se trataron células S49 en presencia o ausencia de dexametasona y/o melatonina, para luego analizar el grado de fragmentación del ADN como medida de apoptosis (figura 62A); y la cuantificación mediante Western blot de los niveles proteicos de la proteína Bax (figura 62B). Figura 62. La línea celular S49 como modelo de antagonismo entre melatonina y glucocorticoides. A. Medición de apoptosis por fragmentación del ADN. Se trataron células S49 por 24 horas con 10 nM dex y/o 10 nM Mel. Se extrajo el ADN fragmentado y se corrieron las muestras en un gel 1.5% agarosa. Se muestra un gel representativo (n=3). B. Medición de Bax por Western blot. Se trataron células S49 por 8 horas con 10 nM dex y/o 100 nM Mel; y se midieron los niveles de Bax y de actina mediante ensayos de western blot. El gráfico muestra la media ± ES de los niveles de Bax/Actina de tres experimentos independientes, con 2 réplicas independientes por tratamiento. C. Coinmunoprecipitación entre GR y Hsp90. Se incubaron células s49 en presencia o ausencia de dex (10 nM) y/o mel (100 nM) por 45 min a 37°C. Luego, se inmunoprecipitaron extractos proteicos con un anticuerpo anti‐GR como se describe en Materiales y Métodos. Estos resultados muestran que la melatonina revierte parcialmente tanto la apoptosis inducida por dexametasona así como el aumento en los niveles de Bax. Por otro lado, ensayos de coinmunoprecipitación en esta línea celular muestran los mismos resultados que los observados en timocitos: la melatonina inhibe la disociación Hsp90‐GR (figura 62C). En su conjunto, los resultados sugieren que la línea S49 es un buen modelo para estudiar el efecto antagónico de la melatonina sobre los glucocorticoides. 168
Capítulo 3: Resultados
3.3.4 Estudios de disociación del heterocomplejo del GR Como se mencionó en la introducción, las inmunofilinas (INM) constituyen una familia de proteínas con capacidad de unir drogas inmunosupresoras como FK506, rapamicina, y ciclosporina A [521]. Se han encontrado varias INM asociadas al complejo GR‐Hsp90, como por ejemplo FKBP52, FKBP51, CyP‐40 y PP5 [522,523]. Uno de los modelos de transporte retrógrado del GR propone que en ausencia de hormona, el heterocomplejo tiene asociada la inmunofilina FKBP51, incapaz de unir la proteína motor dineína [524]. Luego de la unión del ligando, se produce un rápido intercambio en el heterocomplejo, en donde la FKBP51 es reemplazada por la FKBP52, esta última con la capacidad de unir dineína. Este intercambio es el que permitiría que dicho complejo se una a las proteínas motor, y viaje a través de los microtúbulos hacia el núcleo. Una vez en núcleo, el GR se liberaría de las chaperonas para unirse al ADN a través de los elementos de respuesta presentes en los promotores de sus genes blanco [124]. En este contexto, y dado el rol de estas proteínas en el proceso de translocación del GR, decidimos estudiar el estado de asociación de algunas proteínas que forman parte del heterocomplejo, en función de la presencia de melatonina. Para ello, realizamos ensayos de coinmunoprecipitación del GR en células S49 previamente tratadas durante 45 minutos con dexametasona, melatonina o una combinación de ambas hormonas. Los resultados se ilustran en la figura 63. Figura 63. Estudios de disociación del heterocomplejo del GR. A. Coinmunoprecipitación entre GR y Hsp70, FKBP51, FKBP52 y PP5. Se incubaron células S49 en presencia o ausencia de dex (10 nM) y/o mel (100 nM) por 45 min a 37°C. Luego, se inmunoprecipitaron extractos proteicos con un anticuerpo anti‐GR como se describe en Materiales y Métodos; y se revelaron las proteínas interactoras según se indica. B. Se analizó la cantidad de las proteínas asociadas al GR; el gráfico muestra la media ± ES para los niveles de proteínas interactoras/GR (respecto al control) de cinco experimentos independientes. 169
Capítulo 3: Resultados
El conjunto de los datos obtenidos desafortunadamente no permite un análisis estadístico debido a la falta de cumplimiento de ciertos supuestos que el modelo estadístico adecuado necesita (ver Materiales y Métodos4). Por lo tanto, solo podremos sacar conclusiones cualitativas sin relevancia estadística. En primer lugar, si observamos el comportamiento de FKBP52, los resultados muestran un aumento considerable en el grado de asociación con el GR en presencia de dexametasona (calle 3 vs calle 2), el cual es inhibido parcialmente por la presencia de melatonina (Calle 4 vs calle 3). En segundo lugar, si observamos el estado de asociación de la co‐chaperona Hsp70 y de PP5 con el GR, los resultados muestran que no parecen ocurrir cambios considerables en ninguno de los tratamientos, a excepción quizás de un leve descenso, probablemente no significativo (aunque esperado), de la Hsp70 en presencia de dexametasona, el cual de todas maneras sería revertido por la melatonina. En tercer lugar, el estado de asociación de FKBP51 con el GR presenta un leve incremento, probablemente no significativo, ante cualquier estímulo hormonal. Finalmente, si comparamos el efecto per se de la melatonina (calle 5 vs 1) podemos observar lo que aparenta ser un leve incremento de las INM FKBP51 y FKBP52. En conclusión, la melatonina parece revertir cualquiera de los cambios causados por el efecto de la dexametasona, e interesantemente, aparenta tener un efecto per se sobre el grado de asociación de dos proteínas clave durante el proceso de translocación del GR. 3.3.5 Identificación de proteínas asociadas al GR mediante espectrometría de masa MALDI‐TOF 3.3.5.1 Diseño experimental Los resultados de la sección anterior sugieren que la melatonina podría estar modificando la composición del heterocomplejo del GR. Por lo tanto, nos propusimos identificar las proteínas que interactúan con el receptor, en función de los distintos estímulos hormonales. La localización subcelular del receptor condicionará considerablemente la capacidad del mismo de interactuar con ciertas proteínas específicas, y es por esto que consideramos apropiado comparar solo los tratamientos que promuevan la misma localización subcelular. En este sentido, esperamos encontrar a priori importantes diferencias entre los complejos del GR en ausencia o presencia de dexametasona, dado que esta hormona modula su localización. Por el 4
Sección 27 170
Capítulo 3: Resultados
contrario, la presencia de melatonina restringe la ubicación del GR al citoplasma, permitiendo su comparación con el tratamiento control, o con el agregado de ambos estímulos. Según nuestra hipótesis de trabajo, el heterocomplejo del GR tendrá una composición diferente a la del control, cuando las células se estimulen con melatonina. El objetivo del experimento consiste entonces en identificar los potenciales cambios que la melatonina promueva al heterocomplejo, y posiblemente avanzar en la identificación del mecanismo de acción de esta hormona. Para tal fin, se trataron las células S49 durante 45 minutos con dexametasona y/o melatonina; y a continuación se inmunoprecipitó el receptor con un anticuerpo anti‐GR. Las muestras resultantes se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y se tiñeron las proteínas con el colorante azul de Coomasie coloidal. Para poder identificar la mayor cantidad de proteínas posibles, se dividió cada tratamiento en dos, y se sembró cada alícuota en un gel con diferente concentración de acrilamida, pudiendo así resolver proteínas con distintos rangos de peso molecular. En la figura 64A‐B podemos observar una gran cantidad de bandas teñidas, correspondientes a proteínas que o bien interactuaron en forma directa/indirecta con el GR, o bien precipitaron en forma inespecífica durante la inmunoprecipitación. El tratamiento NI (no inmune) corresponde a la inmunoprecipitación sin el uso de anticuerpo, y al parecer solo una pequeña fracción de las bandas presentes resultaron ser inespecíficas. En términos cualitativos, a lo largo del gel se pudo observar bandas diferentes entre los tratamientos, o incluso bandas que si bien se encuentran presentes en más de un tratamiento, difieren en su intensidad relativa. Debido a que las uniones entre las beads y el anticuerpo no son covalentes, éste último también es liberado a la solución de proteínas durante la desnaturalización con SDS. Consecuentemente, se observan dos bandas intensas correspondientes a la cadena pesada (50 kDa) y liviana (25 kDa) del anticuerpo, respectivamente. Luego de la tinción, se procedió al aislamiento de las bandas para su posterior identificación. Se decidió realizar cortes paralelos a lo largo de todo el gel, como se ilustra en la figura 64C‐D. De cada fila aislada, se separaron en forma perpendicular el fragmento correspondiente a cada tratamiento. Se realizó un total de 21 cortes, obteniendo 84 fragmentos 171
Capítulo 3: Resultados
(21 x 4 tratamientos) para ser identificados por espectrometría de masa. Los principios de la identificación mediante esta técnica se describen en Materiales y Métodos5. A
MW
C
01
02
225 kDa
MW
225 kDa
03
150kDa
04
150kDa
05
102kDa
76kDa
06
07
08
09
10
11
102kDa
76kDa
12
13
14
52 kDa
52 kDa
*
B
MW
D
52 kDa
38kDa
31kDa
24kDa
MW
52 kDa
15
16
17
18
19
38kDa
*
31kDa
20
24kDa
21
17kDa
17kDa
12 kDa
12 kDa
**
Figura 64. Ensayo de coinmunoprecipitación del GR. Gel desnaturalizante teñido con Azul de Coomasie colidal. Se trataron células S49 durante 45 minutos en presencia o ausencia de 10 nM dex y/o 100 nM Mel. Se sometieron las muestras al protocolo de inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti‐GR según se detalla en Materiales y Métodos. Las muestras para cada tratamiento se dividieron en dos y se separaron en un gel de acrilamida al 7% (A) o al 15% (B). Se muestra en amarillo las líneas de corte realizadas para la purificación y posterior identificación por MALDI‐TOF (C y D). La banda marcada con * corresponde a la cadena pesada de la IgG mientras que la marcada con ** corresponde a la cadena liviana de la inmunoglobulina. NI = muestra inmunoprecipitada en ausencia de anticuerpo. MW = marcador de peso molecular (en kDa). 3.3.5.2 Potenciales proteínas interactoras del GR Para generar la lista de potenciales proteínas interactoras del GR se procedió a la digestión tríptica de las proteínas aisladas de cada fragmento del gel, y se las analizó con un 5
Sección 24.1 172
Capítulo 3: Resultados
espectrómetro de masa MALDI‐TOF. Este trabajo fue realizado en el CEQUIBIEM, FCEN‐UBA. El diseño experimental original consistía en la identificación individual de cada banda aislada, de manera tal de obtener una lista de proteínas interactoras para cada uno de los tratamientos hormonales. Desafortunadamente, la calidad de los espectros obtenidos no fue la adecuada como para cumplir ese objetivo. Por lo tanto, se decidió cambiar el criterio original de identificación, no pudiendo entonces generar un interactoma para cada tratamiento hormonal, sino la mera identificación de alguna de las proteínas presentes en el gel. Utilizando los espectros conjuntos de todos los tratamientos, se intentó al menos realizar la identificación proteica de cada una de las líneas de corte (líneas 1, 2, 3, …, 21 de la figura 64C‐D), independientemente del tratamiento hormonal efectuado. De esta manera, mediante el análisis combinado de todos los espectros se utilizaron aquellos picos que fuesen exclusivos de la fila, y que no se encuentren en las otras. Además, se realizó un análisis de MS/MS con los pocos iones que cumplían con los criterios necesarios para la espectrometría en tándem. De las proteínas identificadas se descartaron aquellas identificaciones que –si bien significativas – su peso molecular teórico no fuese consistente con el peso molecular aparente en el gel de acrilamida. Los resultados se muestran en la tabla 6. Peso # % Valor e Molecular péptidos cobertura (Da) 12 5 0,0087 227414 Nombre de la proteína # acceso CAC85955 NP_038587 6 9 0,018 97359 heat shock protein 105 NP_031933 10 16 0,019 96222 AAD17518 10 15 0,00011
87599 BAE28187 7 17 0,021 71041 eukaryotic translation elongation factor 2 pyrroline‐5‐carboxylate synthetase short isoform heat shock protein 70 P63039 4 14 0,026 61074 NP_001029046 XP_130050 60 kDa heat shock protein, mitochondrial precursor (Hsp60) (60 kDa chaperonin) (CPN60)
12 22 0,024 55437 adenylate kinase‐like CAA27396 8 31 39446 put. beta‐actin (aa 27‐375) EAW88699 8 29 32262 prohibitin 2 NP_032857 6 25 0,00054
2,30E‐
06 0,032 29859 CAP19193 3 26 0,049 18809 prohibitin ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d nonmuscle heavy chain myosin II‐A Tabla 6. Potenciales proteínas interactoras de GR identificadas por espectrometría de masa. Para cada proteína identificada se muestra el número de acceso en el banco de datos; el número de péptidos identificados que corresponden exclusivamente a esa proteína (# péptidos); la cobertura que se obtuvo de la secuencia total de la proteína (% cobertura); el expectation value (valor e), probabilidad de obtener ese péptido por azar; y el peso molecular teórico de la proteína (en Da). 173
Capítulo 3: Resultados
A continuación se hará una breve descripción de cada una de las proteínas identificadas, y su posible relación con el receptor de glucocorticoides. nonmuscle heavy chain myosin II‐A Las miosinas constituyen una gran superfamilia de motores moleculares dependientes de actina [525]. Los vertebrados poseen dos genes que codifican para las cadenas pesadas de miosina no‐musculares, denominados Miosina IIA y IIB [526]. Su localización subcelular varía según el tipo celular, aunque generalmente se localizan en fibras de estrés, en células estacionarias [527‐529]. Algunos trabajos remarcan la importancia de las miosinas no‐musculares en generar fuerzas dentro de las células [530]. Si bien no se ha encontrado todavía un vínculo con el receptor de glucocorticoides, se ha reportado la interacción del heterocomplejo del GR con microfilamentos de actina [531]. heat shock protein 105 Las proteínas del choque térmico o heat shock proteins se dividen principalmente en las familias HSP105/110, HSP90, HSP70, HSP60 y HSP27[532]. Hsp105 se localiza principalmente en el citoplasma celular [533] y se la ha encontrado asociada al complejo Hsp70/Hsc70 en células de mamífero [534]. Más aún, se ha descripto que suprime la actividad chaperona de Hsp70, surgiendo como un posible modulador negativo de la misma [534,535]. Dado que el ensamblado del heterocomplejo del GR depende de la actividad de Hsp70 [99], haber encontrado una posible interacción entre el GR y la Hsp105 abre la posibilidad de que esta chaperona posea un rol regulatorio sobre el heterocomplejo del GR. Por otro lado, mediante estudios de doble híbrido se ha encontrado que Hsp105 interactúa con tubulina α [536] y la cadena liviana de dineína 2A [537], ambas involucradas en el transporte retrógrado del GR [112,123,128]. eukaryotic translation elongation factor 2 El factor de elongación de la traducción eEF‐2 es una proteína que cataliza la translocación del ribosoma, la cual resulta en el movimiento del mismo con respecto al ARNm que se está traduciendo [538]. Hasta el alcance de nuestro conocimiento, no existe hasta el momento ninguna descripción sobre una posible interacción del GR con esta proteína. De hecho, 174
Capítulo 3: Resultados
dada su gran abundancia celular, es probable que esta proteína haya inmunoprecipitado en forma inespecífica y no mantenga relación funcional directa con el GR. pyrroline‐5‐carboxylate synthetase short isoform Esta enzima se localiza en la membrana interna mitocondrial, y cataliza la reducción de glutamato, un paso esencial para la síntesis de novo de prolina y ornitina [539]. Si bien parece sorprendente encontrar al GR potencialmente asociado a una proteína mitocondrial, varios trabajos han descripto que el GR transloca a mitocondria, además de translocar al núcleo celular [180,181,183,184]. Con respecto a una posible relación funcional entre el GR y esta enzima, se ha encontrado que el tratamiento con cortisol aumenta la actividad de Pirrolina 5‐carboxilasa sintetasa en enterocitos de cerdo [540,541], mientras que su expresión génica es modulada negativamente por dexametasona [542]. heat shock protein 70 Esta proteína ha sido ampliamente descripta en la introducción de este trabajo y ya hemos analizado el papel que la misma juega en la regulación por melatonina mediante experimentos de coinmunoprecipitación (figura 63). 60 kDa heat shock protein, mitochondrial precursor (Hsp60) Esta chaperona se la conoce principalmente por su papel en el correcto plegado de proteínas mitocondriales. Sin embargo, hoy se sabe que Hsp60 también está presente en el citoplasma de muchos tipos celulares, regulando procesos como la apoptosis. De hecho, Hsp60 interactúa con Bax, Bak y BclXL pero no con Bcl‐2 [543]. Por otra parte, algunos estudios sugieren un posible uso de esta chaperona como agente terapéutico en enfermedades como la artritis reumatoidea [544,545]. Curiosamente, los glucocorticoides también son utilizados en este tipo de enfermedades [20]. adenylate kinase‐like Esta proteína fue hallada durante un screening en búsqueda de genes que regulen ciertos parámetros fisiológicos como la presión arterial [546]. No se encontraron más datos bibliográficos concernientes a esta proteína. 175
Capítulo 3: Resultados
Beta‐actina La actina es una conocida proteína que forma parte del citoesqueleto celular [388]. Con respecto a su relación con el receptor de glucocorticoides, como mencionamos recientemente se ha descripto su interacción con el heterocomplejo del GR indirectamente a través de Hsp90 [531]. Además, en estudios de proteómica también se ha encontrado que actina β co‐
inmunoprecipita con el GR [547]. En términos funcionales, la sobreexpresión de una mutante de actina incapaz de polimerizar, o el agregado de un disruptor del citoesqueleto de actina disminuye la función del GR [548]. En este mismo estudio, la sobreexpresión de cofilina‐1 (un regulador de la despolimerización de actina) modula la localización subcelular del GR, en ausencia de ligando. Prohibitin y prohibitin 2 Las prohibitinas (Phb1 y Phb2) son proteínas altamente conservadas en las células eucariotas, y se encuentran presentes en varios compartimentos celulares [549]. Su función más caracterizada es la de chaperonas de proteínas mitocondriales [550]. De hecho, Phb1 y Phb2 pueden formar una estructura macromolecular en forma de anillo en la membrana interna mitocondrial [551]. Se las ha encontrado también en membrana plasmática [552,553], gotas lipídicas [554] y balsas lipídicas [555]. Incluso se las ha descripto en circulación sanguínea en humanos [556]. Además, también se las ha observado en núcleo [557], jugando papeles potenciales como supresor de tumores, regulación del ciclo celular, proliferación y apoptosis [558]. Ambas prohibitinas modulan la transcripción génica, en particular afectando la actividad de receptores de esteroides [559‐562]. Por ejemplo, son un potente co‐represor de los receptores de ER [563], PR y AR [564]. Con respecto al GR, la prohibitina reduce su actividad transcripcional en células Cos‐1 [564], definiéndose así también como un co‐represor del mismo. ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d La ATP sintasa es un complejo multiproteico de aproximadamente 500 kDa, localizado en la matriz mitocondrial interna. Esta enzima utiliza la energía proveniente del gradiente de H+ generado durante la cadena respiratoria para sintetizar ATP [388]. En relación con los glucocorticoides, el tratamiento con dexametasona induce un estado hipercatabólico 176
Capítulo 3: Resultados
caracterizado por un aumento de la gluconeogénesis en el hígado [565]. En el mismo sentido, la actividad respiratoria en las mitocondrias hepáticas es alterada por la dexametasona, que disminuye la eficiencia en la fosforilación oxidativa de esas mitocondrias [566]. De hecho, los glucocorticoides parecen inhibir a la ATP sintasa [567]. Por otro lado, la utilización de un ARN antisentido contra la subunidad 6 de la ATP sintasa inhibe la apoptosis inducida por dexametasona [568]. En conclusión, los resultados aquí presentados sugieren nuevos posibles interactores del GR. Si bien es necesaria la confirmación directa de cada una de estas proteínas como interactoras del receptor, los resultados abren la posibilidad de algunos nuevos e interesantes mecanismos de regulación para el GR, así como un cross‐talk con otros caminos de señalización. 3.4 Antagonismo entre glucocorticoides y melatonina en otros tipos celulares Como ya se mencionara en la introducción, los glucocorticoides ejercen efectos biológicos sobre la gran mayoría de los tejidos de mamíferos [2], pudiendo incluso generar efectos totalmente opuestos entre distintos tipos celulares. Por ejemplo, mientras que inducen apoptosis en timo [265]; en epitelios glandulares tienen funciones anti‐apoptóticas [27,569]. Es probable que esta gran variedad de efectos esté relacionado con la interacción del GR (y/o de sus genes blanco) con diversos factores presentes en el tejido que está siendo afectado. En este contexto, se investigó si la melatonina tiene un efecto antagónico sobre los glucocorticoides de manera tejido‐específica, o si, por el contrario, este efecto también ocurre en otros tipos celulares. Esta hipótesis de trabajo comenzó a abordarse durante mi Tesis de licenciatura, en donde se analizaron las líneas celulares Cos‐7 y HC11. Se eligió la línea Cos‐7 no sólo por la ductilidad de esas células para ser transfectadas, sino también porque al no presentar respuesta per se a melatonina ni a glucocorticoides [570,571], permitiría evaluar si la acción de la melatonina sobre la respuesta a GC involucra sólo al metoxiindol o requiere de algún factor. Por otro lado, se utilizaron las células HC11 por presentar respuesta a glucocorticoides [572] y porque se ha sugerido que en epitelio mamario melatonina tendría efectos antagónicos con otras hormonas esteroides [573]. Los experimentos realizados en estas líneas celulares demostraron que la melatonina no inhibe la transcripción de un gen reportero bajo el control del promotor MMTV (figura 59C‐D), lo que sugiere que el antagonismo entre estas dos hormonas podría ser de hecho 177
Capítulo 3: Resultados
específico del tipo celular. Además, se estudió la localización subcelular del GR endógeno (en el caso de las HC11) o de GFPGR (en el caso de Cos‐7) en presencia o ausencia de dexametasona y/o melatonina. Figura 65. La melatonina no afecta la translocación del GR en células HC11. Inmunofluorescencia indirecta para el receptor de glucocorticoides. Se incubaron células HC11 en presencia y/o ausencia de dex 10 nM o Mel 10 nM durante 30 minutos. Se utilizó un anticuerpo primario anti‐
GR y un anticuerpo secundario acoplado al fluoróforo Alexa flúor 488 (fluorescencia verde). Las imágenes fueron obtenidas por microscopía confocal. Barra de escala = 50 µm. Figura 66. La melatonina no afecta la translocación de GFPGR en Cos‐7. Análisis por microscopía confocal. Se transfectaron células Cos‐7 con el vector pEGFPGR. Se incubaron las células con vehículo (Control), 10 nM dex o 10 nM dex + 100 nM mel por 30 minutos. Se tomaron imágenes por microscopía confocal. La figura muestra una célula representativa para cada tratamiento. 178
Capítulo 3: Resultados
Como se observa en las figuras 65 y 66, la dexametasona induce la translocación del GR en ambos líneas celulares independientemente de la presencia o ausencia del metoxiindol. Este resultado es consistente con el hecho que en estas líneas celulares la melatonina no inhibe la actividad transcripcional de los glucocorticoides. Siguiendo con esta línea de investigación, se buscaron otros modelos experimentales en donde la melatonina pudiese antagonizar a los glucocorticoides. Por un lado se evaluó la línea celular L929, derivada de fibroblastos provenientes de tejido conectivo de ratón; y por otro lado la línea MCF‐7, proveniente de adenocarcinoma humano de glándula mamaria, en donde ya se ha descripto un efecto antagónico del metoxiindol sobre los GCs [349]. En estos experimentos (al igual que los realizados sobre HC11 y Cos‐7) se transfectaron estas células en forma transiente con el vector pMMTV‐LUC, y se trataron durante 24 horas con vehículo (control), dexametasona, melatonina, o ambas hormonas. Figura 67. La melatonina no afecta la actividad transcripcional del GR en células L929 o MCF‐7. Se transfectaron células L929 (A) o MCF‐7 (B) con el plásmido pMMTV‐LUC. Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron las células con 10 nM dex en presencia o ausencia de 10 nM mel; y se determinó la actividad de luciferasa y la actividad de β‐
galactosidasa. Se muestra la media ± ES de las veces de inducción respecto al control, de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Se realizaron 3 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas independientes entre sí. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). 179
Capítulo 3: Resultados
Al igual que lo obtenido para las líneas Cos‐7 o HC11, en las células L929 (figura 67A) la melatonina no fue capaz de antagonizar el efecto del glucocorticoide sobre la actividad transcripcional del MMTV. Sorprendentemente, tampoco se observó un efecto antagónico del metoxiindol en células MCF‐7 (figura 67B), pese a que ya había sido previamente reportado [349]. Finalmente, evaluamos la activación del promotor de MMTV en una última línea celular derivada de riñón de hámster, la línea BHK. Sorprendentemente, en este caso si pudimos observar una inhibición significativa por parte del metoxiindol sobre la actividad del gen reportero inducida por dexametasona (figura 68). Figura 68. La melatonina inhibe la actividad transcripcional del GR en células BHK. Se transfectaron células BHK con el plásmido pMMTV‐LUC. Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron las células con 10 nM dex en presencia o ausencia de 10 nM Mel; y se determinó la actividad de luciferasa y la actividad de β‐galactosidasa. Se muestra la media ± ES de las veces de inducción respecto al control, de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Se realizaron 3 experimentos independientes, cada uno con 3 réplicas independientes entre sí. Las barras con diferentes letras (a o b o c) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). En su conjunto, los resultados indican que el efecto antagónico de la melatonina sobre los glucocorticoides dependería del contexto celular. De hecho, durante el desarrollo de esta tesis se ha descripto el efecto inhibitorio de la melatonina sobre los glucocorticoides en células HT22, un modelo neuronal [517]. Esto sugiere que los mediadores necesarios para que el metoxiindol inhiba al GR probablemente no sean componentes celulares generales, sino algunos presentes en sólo ciertos tipos de tejidos o células. Durante la siguiente sección abordaremos el estudio de los mecanismos moleculares que median la acción de la melatonina sobre los glucocorticoides en las células BHK. 180
Capítulo 3: Resultados
3.5 Modulación de la actividad de GR por melatonina en células BHK 3.5.1 Estudios de la translocación El descubrimiento del efecto inhibitorio de la melatonina sobre los GCs en células BHK expande el blanco de acción de esta hormona. Es por ello que decidimos profundizar el estudio de su mecanismo de acción en este nuevo modelo, debido en parte a la facilidad de su manipulación experimental. Tanto en timocitos (figura 59B) como en células HT22 [517], el efecto inhibitorio ocurre a nivel de la translocación del GR. Por lo tanto, pusimos a prueba la hipótesis de que en células BHK el metoxiindol también inhibe el pasaje del GR desde el citoplasma al núcleo celular. Sorprendentemente, cuando determinamos la capacidad del receptor de translocar al núcleo observamos que – a diferencia de lo ocurrido en timocitos – el GR transloca aún en presencia del metoxiindol (figura 69). Figura 69. La melatonina no afecta la translocación de GFPGR en BHK. Análisis por microscopía confocal. Se transfectaron células BHK con el vector pEGFPGR. Se incubaron las células con vehículo (Control), 10 nM dex, 10 nM dex + 100 nM mel o 100 nM mel por 30 minutos. Se tomaron imágenes por microscopía confocal. La figura muestra una célula representativa para cada tratamiento. Dado que no contamos con anticuerpos que reconozcan al GR endógeno de hámster, para evaluar la translocación del receptor se transfectaron las células con la quimera GFPGR. Una posibilidad que podría explicar el resultado anterior es que la proteína quimera utilizada no se comportara de la misma manera que la proteína endógena (wildtype), siendo por alguna razón 181
Capítulo 3: Resultados
inmune a los efectos de la melatonina. Bajo este supuesto, es posible que la translocación del GR endógeno sea de hecho inhibida, pero nuestro experimento no nos permite evaluarlo. Para poner a prueba dicha hipótesis, decidimos realizar el ensayo de actividad transcripcional de la figura 68, pero esta vez sobreexpresando la proteína GFPGR. Si efectivamente esta quimera no responde a melatonina, entonces debería funcionar como un dominante negativo, eliminando el efecto inhibitorio del metoxiindol sobre la transcripción del MMTV en células BHK. Figura 70. Actividad transcripcional de GR en BHK sobreexpresando GFPGR. Se co‐transfectaron células BHK con el vector pEGFPGR y el vector reportero MMTV‐LUC. Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron por 18 hs con vehículo (Control), 10 nM dex, o 10 nM dex + 10 nM Mel. Se realizaron 2 experimentos independientes, cada uno con 3 réplicas independientes entre sí. Se muestra las veces de inducción respecto del control ± ES de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Las barras con diferentes letras (a o b o c) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Como se observa en la figura 70, en presencia de GFPGR la melatonina continúa inhibiendo la actividad transcripcional del GR, sugiriendo entonces que la proteína quimera es sensible a los efectos del metoxiindol. En su conjunto, los resultados indican que en células BHK el mecanismo molecular por el cual la melatonina antagoniza a los glucocorticoides no ocurre a nivel de la translocación del receptor como ocurre en células linfoides. Por lo tanto, el metoxiindol modula la actividad de GR por mecanismos diferentes, dependiendo del tipo celular. 3.5.2 Distribución intranuclear del GR Durante las siguientes secciones se presentarán los resultados que obtuvimos al intentar develar el mecanismo involucrado en el efecto inhibitorio de la melatonina sobre la acción del GR 182
Capítulo 3: Resultados
en células BHK. En principio, cualquier paso durante el proceso de activación del GR, subsiguiente a la translocación del receptor podría llegar a estar afectado por el metoxiindol. Al igual que en el capítulo 1, nos preguntamos si la distribución intranuclear del receptor podría modificarse en presencia de melatonina. Para ello, transfectamos las células con el vector pEGFPGR y analizamos su distribución intranuclear en función de las hormonas presentes. La figura 71 muestra que la melatonina no parece modificar el tipo de distribución observada para el complejo dex‐GR. Los cálculos del CV no mostraron diferencias significativas entre ambos tratamientos. Figura 71. Distribución intranuclear del GR en presencia de melatonina.
Se transfectaron células BHK con el vector pEGFPGR. Se incubaron las células con 10 nM dex o 10 nM dex + 100 nM mel por al menos 40 minutos y se tomaron imágenes por microscopía confocal (n=20 por tratamiento). La figura muestra células representativas para cada tratamiento y el coeficiente de variación (CV) medio ± ES, calculado como se describe en Materiales y Métodos.
3.5.3 Oligomerización del GR en presencia de melatonina A continuación, nos preguntamos si la melatonina podría estar impidiendo la dimerización del GR y por lo tanto, inhibiendo su actividad transcripcional. En este sentido, realizamos 183
Capítulo 3: Resultados
experimentos de N&B como los descriptos en el capítulo 1, pero esta vez ensayamos el efecto de dex en presencia del metoxiindol. Figura 72. Análisis de oligomerización in vivo del GR en presencia de melatonina. Análisis de N&B. Se transfectaron células BHK con el vector pEGFPGR y se incubaron en presencia de vehículo (control), 10 nM dex o 10 nM dex + 100 nM mel. Las imágenes se tomaron entre 40 min y 4 hs luego del agregado de los estímulos. Para cada célula (11 ≤n≤15 por tratamiento) se calculó el brillo aparente como se describe en Materiales y Métodos. La figura muestra la veces de aumento del brillo real (ε) relativo al citoplasma de cada tratamiento. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Los resultados (figura 72) muestran un incremento similar en los valores de brillo entre el núcleo y el citoplasma de células BHK tratadas con dexametasona, o bien con dexametasona y melatonina. Por lo tanto, podemos concluir que la melatonina no parece estar afectando la homodimerización del GR en este modelo. 3.5.4 Estudios de unión y disociación del GR al ADN in vitro Continuando con la búsqueda del mecanismo de acción que media el efecto de la melatonina sobre los glucocorticoides en células BHK, nos propusimos investigar el efecto del metoxiindol sobre la capacidad del GR de interactuar con el ADN. Como se mencionó en la introducción, una vez que el GR transloca al núcleo, este puede unirse a sitios GRE en promotores de ciertos genes y activar la transcripción de los mismos. Por lo tanto, la melatonina podría inhibir la capacidad del GR de interactuar con el ADN, y de esta manera antagonizar a los glucocorticoides en este modelo. En este sentido, evaluamos la capacidad de unión del GR al ADN in vitro en presencia de melatonina, realizando ensayos de retardo en gel (EMSA) utilizando una 184
Capítulo 3: Resultados
sonda que contiene el sitio de unión a glucocorticoides del promotor del MMTV [209] en forma similar a lo descripto en el capítulo 1. Figura 73. Efecto de melatonina sobre la unión del GR al ADN in vitro. Ensayo de retardo en gel (EMSA). Se realizó un EMSA con extractos nucleares de células BHK tratadas en presencia o ausencia de 10 nM dex y/o 100 nM mel por 30 minutos. Calle 1: sin extracto proteico. Calles 2, 5, 8 y 11: extractos proteicos incubados con una sonda marcada radiactivamente con [32P] conteniendo el sitio consenso GRE. Calles 3, 6, 9 y 12: competencia con 200x de sonda no radiactiva no específica. Calles 4, 7, 10 y 13: competencia con 200x de sonda no radiactiva específica. Las flechas indican la sonda de ADN libre y los complejos GR‐ADN. Al igual que lo obtenido anteriormente (figura 40), el GR es capaz de formar una doble banda retrasada tanto en ausencia como en presencia de dexametasona. Asimismo, la melatonina per se o en combinación con dexametasona no es capaz de inhibir la formación de estos complejos (figura 73). A continuación, decidimos evaluar si la cinética de disociación GR‐ADN se encuentra alterada en presencia de melatonina. Si el metoxiindol retrasara la cinética de disociación del complejo, esto podría alterar el reclutamiento de nuevos complejos de iniciación transcripcionales y por lo tanto, inhibir la capacidad del GR de inducir la expresión génica. Para evaluar dicha hipótesis, realizamos un experimento idéntico al realizado en el capítulo 1 (figuras 42‐43). 185
Capítulo 3: Resultados
Figura 74. Efecto de la melatonina sobre la disociación entre el GR y el ADN in vitro. Ensayo de retardo en gel (EMSA). Se incubaron los extractos proteicos provenientes de células tratadas con 10 nM dex, o 10 nM dex + 100 nM Mel por 30 minutos junto con una sonda radiactiva conteniendo el sitio consenso GRE. Luego de 20 minutos, se agregó un exceso de sonda no radiactiva y alícuotas tomadas en los tiempos indicados se sembraron en un gel corriendo a 200 V. Se muestra geles representativos para los distintos tratamientos (A). Las curvas de disociación (media ± ES) de tres experimentos independientes muestran la fracción unida (relativa al tiempo cero) expresadas como el cociente entre el complejo GR‐ADN y la sonda libre (B). Las flechas indican la sonda de ADN libre y los complejos GR‐ADN. Los resultados de la figura 74 muestran que la cinética de disociación in vitro entre el GR y el ADN no es alterada en presencia de melatonina, sugiriendo que el metoxiindol no inhibe al receptor mediante este mecanismo. 3.5.5 Estudios de interacción del GR con TIF2 Varios estudios han propuesto un rol relevante del coactivador TIF2 sobre la actividad transcripcional mediada por el GR [192,193,574]. En ese sentido, y con el objeto de evaluar si la melatonina podría estar alterando la capacidad del GR de interactuar con TIF2, se realizaron ensayos de coinmunoprecipitación entre estas dos proteínas en presencia o ausencia del metoxiindol. Como se especificó en el capítulo 1, para poder realizar este estudio se transfectaron células BHK con los vectores correspondientes para la expresión de hGR y TIF2. Posteriormente, luego de tratar a las células se extrajeron proteínas y se sometieron a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti‐TIF2. 186
Capítulo 3: Resultados
Figura 75. Interacción TIF2‐GR en presencia de melatonina. Ensayos de coinmunoprecipitación in vivo. Se co‐
transfectaron células BHK con los vectores de expresión para hGR y TIF2. Se trataron a las células con vehículo (Control), 10 nM dex, o 10 nM dex y 100 nM Mel por 90 minutos. Luego, se inmunoprecipitaron extractos proteicos con un anticuerpo anti‐TIF2 (αTIF2) como se describe en Materiales y Métodos. El input corresponde al 10% de la muestra previa al protocolo de inmunoprecipitación. Se muestra un gel representativo revelado contra hGR (A). El gráfico muestra la cuantificación (media ± ES) de tres experimentos independientes, como niveles de GR respecto al tratamiento con dex (B). Las flechas en el gel “input” indican las tres isoformas del αGR (GRA; GRB; GRC) descriptas anteriormente [384,413]. La figura 75 muestra el ensayo de Western blot contra el GR humano. Los resultados indican que la melatonina parece inhibir el reclutamiento de TIF2 por el GR activado por dexametasona. Esto podría explicar, al menos en parte, el efecto antagónico del metoxiindol en esta línea celular. En conclusión, los resultados observados sobre las células BHK sugieren que –a diferencia de lo que ocurre en timocitos – la melatonina no modula la translocación del GR sino que inhibe al receptor en un paso posterior en su camino de señalización, al menos impidiendo la interacción con el coactivador TIF2. 3.6 Estudio de las vías de señalización de melatonina A lo largo de este capítulo nos hemos enfocado en responder la pregunta del “dónde” la melatonina inhibe la acción del GR, ya sea al impedir la disociación de la Hsp90 en timocitos o mediante la inhibición de la interacción con el coactivador TIF2 en células BHK. En esta sección, estudiaremos el “cómo” la melatonina, es decir, a través de que vías de señalización ejerce el antagonismo sobre los glucocorticoides. La melatonina puede actuar mediante al menos tres mecanismos de acción: por un lado, al ser una molécula altamente lipofílica, puede atravesar las membranas celulares con gran facilidad y actuar en forma directa. Por otro lado, se han descripto receptores de 7 pasos de 187
Capítulo 3: Resultados
membrana en mamíferos para el metoxiindol, denominados Mel1a y Mel1b [289]. Finalmente, es capaz de unir y activar receptores nucleares como el factor de transcripción RORα [313]. Para comenzar a identificar la vía de señalización por la cual la melatonina ejerce su acción antagónica sobre los glucocorticoides, comenzamos por evaluar la presencia o ausencia de los receptores Mel1a y RORα en alguno de los modelos celulares utilizados. Para ello, se extrajo ARN total de cada uno de los tipos celulares y se realizó una RT‐PCR en busca de la expresión de dichos receptores. Como se observa en la figura 76, todas las células analizadas expresan los receptores Mel1a y RORα, al menos a nivel de ARNm. Sin embargo, sólo en los cultivos primarios de timocitos y las células S49 la melatonina es capaz de antagonizar a los glucocorticoides. Esta ausencia de correlación entre la presencia de los receptores y la existencia del antagonismo demuestra que la presencia, tanto de RORα como Mel1a, no son suficientes para mediar la señalización del efecto inhibitorio del metoxiindol. Figura 76. En busca de las vías de señalización de melatonina. Medición por RT‐PCR de RORα y Mel1a. Se extrajo ARN de timocitos (Timo), S49, HC11, o L929 y se midieron los niveles de los receptores de melatonina y actina por RT‐PCR. El receptor Mel1a está acoplado a una proteína G inhibitoria, y su activación produce una disminución en los niveles de AMPc intracelulares [289]. Sin embargo, experimentos realizados por nuestro grupo demostraron que tanto la dexametasona como la melatonina disminuyen los niveles de AMPc en timocitos de ratón [355]. Este hecho implica que la señalización mediada por este segundo mensajero (a través de la activación del Mel1a) no estaría involucrada en el efecto inhibitorio de la translocación del GR por melatonina. Con respecto a células BHK, hasta nuestro conocimiento no existe información alguna sobre la presencia de este receptor, o sobre los efectos de los GCs en los niveles de AMPc. Por lo tanto, determinamos los niveles de este segundo mensajero mediante la técnica de radioinmunoensayo (RIA) en células BHK tratadas en presencia o ausencia de melatonina y dexametasona. 188
Capítulo 3: Resultados
Figura 77. Efecto de la dexametasona y la melatonina sobre los niveles de AMPc en células BHK.
Radioinmunoensayo. Se trataron células BHK con 10 nM dex y/o 100 nM mel por 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se realizó un RIA según se detalla en Materiales y Métodos. Una alícuota de cada tratamiento se utilizó para medir cantidad de proteínas totales. El gráfico muestra los niveles de AMPc en fmoles/µg de proteína. Se realizaron 2 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas independientes por tratamiento. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Los niveles de AMPc disminuyen significativamente en presencia de dexametasona (figura 77). Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en timocitos de ratón [355], la melatonina per se no modifica los niveles basales de este segundo mensajero, ni antagoniza el efecto producido por los GCs (figura 77). Estos resultados demuestran que el efecto antagónico del metoxiindol en células BHK no es mediado por el AMPc. 3.7 Luzindole… ¿un nuevo antagonista del GR? El Luzindole (LUZ), comparte ciertas similitudes estructurales con la melatonina (figura 78). A su vez, es una herramienta útil en los estudios relacionados con la señalización intracelular mediada por esta hormona, ya que inhibe específicamente la activación de la proteína G acoplada a los receptores Mel1a y Mel1b [575]. Con el propósito original de evaluar si estos receptores de membrana están involucrados en el efecto antagónico observado en células BHK, se analizó la actividad transcripcional del GR realizando transfecciones transitorias con el vector pMMTV‐LUC en presencia o ausencia de este inhibidor. En este sentido, si los receptores Mel1a o Mel1b estuviesen mediando el antagonismo del metoxiindol, el agregado de Luzindole debería al menos disminuir el efecto inhibitorio de la melatonina sobre la actividad transcripcional del GR. 189
Capítulo 3: Resultados
Figura 78. Estructura de la melatonina (N‐acetil‐5‐metoxitriptamina) y el Luzindole (N‐acetil‐2‐benziltriptamina). Sorprendentemente, los resultados muestran un efecto inhibitorio per se del Luzindole sobre la actividad transcripcional del GR inducida por dexametasona, no observándose un efecto aditivo combinando Mel y LUZ en las concentraciones utilizadas (figura 79). Por lo tanto, si bien no fue posible evaluar con este experimento la participación de los receptores de melatonina en el antagonismo del metoxiindol sobre el GR; a la luz de estos resultados, surge la hipótesis de que el Luzindole sería antagonista de la acción de glucocorticoides. Figura 79. Efecto del Luzindole sobre la actividad transcripcional del GR en células BHK. Se transfectaron células BHK con el plásmido pMMTV‐LUC. Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron las células con 10 nM dex, 100 nM Mel, 20 µM Luzindole (LUZ) o una combinación de ellas; y se determinó la actividad de luciferasa y de β‐galactosidasa. Se muestra la media ± ES del % de inducción respecto a dex, de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Se realizaron 8 experimentos independientes, cada uno con 2‐3 réplicas independientes entre sí. Las barras con diferentes letras (a o b o c) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). A continuación se decidió determinar los niveles de AMPc en células BHK en presencia o ausencia de Luzindole. Los resultados (figura 80) muestran la misma disminución previamente observada en los niveles de AMPc en presencia de dexametasona, pero en esta ocasión, a 190
Capítulo 3: Resultados
diferencia de lo ocurrido con melatonina (figura 77), el Luzindole revierte a valores control los niveles del segundo mensajero. Estos resultados indican que Mel y LUZ actúan por mecanismos diferentes, al menos a lo que regulación de niveles de AMPc GR‐dependientes se refiere. Asimismo, el Luzindole per se (al igual que la melatonina) no modifica los niveles de este segundo mensajero (figura 80). Figura 80. Efecto de la dexametasona, la melatonina y el Luzindole sobre los niveles de AMPc en células BHK. Radioinmunoensayo. Se trataron células BHK con 10 nM dex, 100 nM mel y/o 20 µM Luzindole (LUZ) por 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se realizó un RIA según se detalla en Materiales y Métodos. Una alícuota de cada tratamiento se utilizó para medir cantidad de proteínas totales. El gráfico muestra los niveles de AMPc en fmoles/µg de proteína. Se realizaron 2 experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas por tratamiento. Las barras con diferentes letras (a o b) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Como ya hemos evaluado con anterioridad, la melatonina no antagoniza a los glucocorticoides en todos los tipos celulares. Por ejemplo, en células Cos‐7 esta hormona fue incapaz de inhibir la actividad transcripcional del GR (figura 59C). Para nuestra sorpresa, cuando analizamos el efecto del Luzindole en este modelo, nos encontramos con que esta droga disminuye en forma significativa la actividad transcripcional del GR (figura 81). Estos resultados no sólo apoyan la idea de que LUZ y Mel actúan de distinta manera en nuestras condiciones experimentales, sin que en su conjunto avalan la hipótesis en donde el Luzindole surge como un nuevo antagonista de los glucocorticoides. 191
Capítulo 3: Resultados
Figura 81. Efecto del Luzindole sobre la actividad transcripcional del GR en células Cos‐7. Se transfectaron células Cos‐7 con el plásmido pMMTV‐LUC. Se utilizó pCMV‐LacZ como control de la transfección. Se trataron las células con vehículo (control), 10 nM dex y/o 20 µM Luzindole (LUZ) y se determinó la actividad de luciferasa y de β‐galactosidasa. Se muestra la media ± ES de las veces de inducción respecto al control, de la actividad de luciferasa (normalizada a la actividad de βgal). Se realizaron seis experimentos independientes, cada uno con 2 réplicas independientes entre sí. Las barras con diferentes letras (a o b o c) son significativamente diferentes entre sí (p<0.05). Por último, y (paradójicamente) como comienzo en el estudio de los mecanismos moleculares involucrados en el antagonismo entre el Luzindole y los glucocorticoides, evaluamos la localización subcelular del GR en presencia o ausencia de LUZ. Como se observa en la figura 82, LUZ no es capaz de inducir la translocación del GR ni de inhibir su transporte retrógrado mediado por la dexametasona tanto en células BHK como en células Cos‐7. Figura 82. El luzindole no afecta la translocación de GFPGR en BHK o Cos‐7. Análisis por microscopía confocal. Se transfectaron células BHK y Cos‐7 con el vector pEGFPGR. Se incubaron las células con vehículo (Control), 10 nM dex, 10 nM dex + 20 µM LUZ o 20 µM LUZ por 30 minutos. Se tomaron imágenes por microscopía confocal. La figura muestra una célula representativa para cada tratamiento. 192
Capítulo 3: Discusión
DISCUSIÓN Como se mencionó en la introducción de este trabajo, numerosas evidencias permiten postular la existencia de un antagonismo entre los glucocorticoides y la melatonina [346‐
348,350]. Sin embargo, los mecanismos involucrados en dicho proceso todavía no han sido dilucidados, y su estudio ha sido el principal objetivo en esta última parte del trabajo. 3.8 Mecanismos involucrados en la modulación del GR por melatonina Mediante ensayos de competencia in vitro e in vivo, demostramos que la melatonina no afecta la unión de [3H]‐Dex a su receptor en timocitos de ratón. Si bien algunos trabajos proponen que cambios en la afinidad del receptor, modulados al menos parcialmente por melatonina podrían explicar el antagonismo en células del timo [356‐358], nuestros resultados son consistentes con los establecidos por Familari y colaboradores, quienes sugieren que la melatonina no sería un antagonista competitivo del GR [576]. Por otra parte, experimentos realizados con el receptor de estrógenos demostraron que, si bien la melatonina inhibe la unión de este receptor al ADN en células MCF7, el metoxiindol tampoco afecta la capacidad de unión del ER a su ligando [573]. De todas maneras, los ensayos de competencia no nos permiten descartar que la melatonina se una directamente al GR (en algún sitio distinto del que interactúa con el ligando), pero podemos afirmar que si existiese tal unión, esta no afecta la capacidad de la hormona de unirse al receptor. En este sentido, se ha propuesto que al menos para el caso del MR existiría un segundo sitio de unión que regula la actividad del receptor, en donde la 11,19‐
oxidoprogesterona modularía precisamente a través de este sitio la actividad de este receptor [58]. Por lo tanto, dada la relación evolutiva entre ambos receptores, es posible que el GR también presente un segundo sitio regulatorio, y que la melatonina pueda unirse a él. De esta manera, no estaría compitiendo por el mismo sitio de unión que la dexametasona, hecho consistente con nuestros resultados. En ese sentido, serían necesarios estudios de unión de melatonina al GR. El efecto inhibitorio de la melatonina sobre la activación del GR ha sido descripto en numerosos trabajos. Sin embargo, esos estudios no precisan qué parte del proceso, desde la unión del ligando hasta la inducción de la expresión génica, se encuentra afectado. En este último capítulo, demostramos que en timocitos de ratón y en células S49 la melatonina antagoniza la 193
Capítulo 3: Discusión
respuesta glucocorticoidea inhibiendo la disociación del GR con la Hsp90. En este punto, sin embargo, todavía no podemos determinar si la inhibición en la translocación del GR demostrada previamente por nuestro grupo es causa o consecuencia de que el heterocomplejo permanezca unido. La retención citoplasmática del GR como mecanismo inhibitorio de su señalización ha sido sugerido por Goleva y colaboradores, donde demostraron que el heterodímero GR‐STAT5 previene la importación nuclear del complejo dex‐GR en la línea celular HT2, cuando estas células son tratadas con IL‐2 [577]. Además, luego de que nosotros demostráramos la inhibición de la translocación del GR por melatonina en timocitos, otro grupo mostró el mismo fenómeno para el modelo celular HT22 [517]. Como se describió anteriormente, los procesos involucrados en el transporte del GR hacia el núcleo son sumamente complejos y se encuentran altamente regulados [128]. En principio, la melatonina podría inhibir cualquiera de los procesos implicados en el transporte del receptor desde el citoplasma hacia el núcleo. Una posibilidad es que la melatonina, ya sea de manera directa, o a través de la unión a algún factor, altere en alguna forma la composición del heterocomplejo GR‐hsp90. Si bien el heterocomplejo es capaz de unir ligando (a juzgar por los ensayos de competencia), la unión a las proteínas motoras podría, quizás, estar comprometida. En este sentido, los resultados de coinmunoprecipitación aquí realizados (figura 63) sugieren que la melatonina per se incrementa los niveles de asociación de FKBP52 y posiblemente también de FKBP51 con el GR, ambas involucradas en el transporte retrógrado6. De esta manera, la melatonina, al alterar la composición original del complejo, podría afectar en alguna forma la capacidad del GR de translocar al núcleo. Es interesante destacar que el aumento observado en el grado de asociación de FKBP52 con el GR inducido por dexametasona es, cuando menos, inesperado en nuestras condiciones experimentales. El tiempo de inducción con hormona durante esos experimentos fue de 45 minutos, tiempo más que suficiente para inducir la translocación completa del receptor (ver figura 59B) y la disociación total de la Hsp90 (ver figura 62C). En el trabajo de Davies y colaboradores, en donde se describió el intercambio entre FKBP51 y FKBP52 como unos de los primeros pasos en la transformación del receptor, el experimento se llevó a cabo en frío, disminuyendo así la velocidad del proceso de translocación, con el objeto de poder visualizar el intercambio [124]. En nuestras condiciones experimentales, el GR en presencia de dex se localiza principalmente en el núcleo (figura 59B), en su mayoría disociado de la Hsp90 (figuras 61, 62C), proteína nexo entre el GR y la inmunofilina [112]. Por lo tanto, es posible que la asociación GR‐
6
Ver introducción, sección 2.5
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Capítulo 3: Discusión
FKBP52 observada ocurra en núcleo, en forma Hsp90 independiente. En este sentido, se ha propuesto que FKBP52 podría acompañar al GR dentro del núcleo [126] y de hecho se han encontrado en ese compartimiento celular ambas proteínas co‐localizadas [578]. Además, existen evidencias que apoyan la idea de que FKBP52 se une directamente al GR [132]. Más aún, la mayoría de las moléculas de FKBP52 se encuentran en el núcleo [579‐581], y se ha demostrado que esta INM modula la transactivación del GR [582]. De todas maneras, el aumento en el grado de asociación FKBP52‐GR inducido por dex es marcadamente disminuido en presencia del metoxiindol. Sin embargo, al igual que lo concluido para la retención de Hsp90, no podemos discernir si este fenómeno es causa o consecuencia de la inhibición de la translocación. La identificación de posibles proteínas interactoras del GR mediante espectrometría de masa nos abre la posibilidad de conocer qué otras proteínas pueden estar involucradas. La identificación potencial de la Hsp105, que además de interactuar con tubulina α [536] y con la cadena liviana de dineína 2A [537] es moduladora de la actividad de Hsp70 [534,535], sugiere que Hsp105 podría estar afectando la composición del heterocomplejo. Sin embargo, al menos en nuestras condiciones experimentales, no encontramos alteraciones en la asociación Hsp70‐GR para ningún tratamiento. Otra posibilidad es que el metoxiindol altere de alguna manera el patrón de fosforilación del GR. Como vimos en la introducción7, el GR está sujeto a modificaciones post‐traduccionales que modulan su actividad [240]. En este sentido, se ha encontrado que el estado de fosforilación del receptor correlaciona con su localización subcelular [82]. En células T humanas, por ejemplo, la fosforilación del GR mediada por ERK1/2 inhibe su translocación en presencia de dexametasona [583]. Por lo tanto, es posible que la presencia de melatonina afecte el estado de fosforilación del GR, con la consecuente inhibición en su translocación. La inmunofilina PP5 presenta actividad de fosfatasa, lo cual sería relevante en el tráfico subcelular del GR [112]. Si bien en este trabajo no se evaluó el grado de fosforilación del receptor, al menos podemos concluir que la presencia de PP5 en el heterocomplejo no resultó afectada frente a ningún tratamiento, aunque no podemos descartar una regulación en la actividad enzimática de esta proteína. Si bien una de las propiedades características de la melatonina es su efecto antioxidante [276], es poco probable que dicha función sea la causante en la inhibición de la translocación del GR. Por un lado, los estudios que involucran a la melatonina como agente protector contra el 7
Sección 2.12 195
Capítulo 3: Discusión
daño producido por radicales libres se realizaron utilizando concentraciones farmacológicas de la hormona (entre 10‐3 M y 10‐6 M) [289]. Estas concentraciones superan ampliamente las utilizadas en esta Tesis, lo que nos permite al menos sugerir que la capacidad de la melatonina como antioxidante no está relacionada con lo observado en nuestros experimentos. Por otro lado, el hecho de que la melatonina no inhiba la acción de los glucocorticoides en Cos‐7, HC11, L929 y MCF7 sugiere que su efecto antagónico es específico de tejido. Este resultado no es compatible con el efecto ubicuo de un capturador de radicales libres. Por otro lado, no podemos descartar una acción directa de la melatonina en la inhibición de la translocación del GR. Si bien la interacción directa del metoxiindol con los microtúbulos ha sido previamente descripta [311,312], su unión directa con las inmunofilinas (capaces de unir drogas inmunosupresoras) podría ser causa de la alteración en la composición del heterocomplejo. Sin embargo, el hecho de que en las líneas celulares Cos7, HC11, L929 y MCF7 no se observe el antagonismo de la melatonina sobre los glucocorticoides, sugiere que algún factor presente en timo sería responsable del efecto del metoxiindol. Como se mencionó previamente, la melatonina puede unirse tanto a receptores específicos de membrana como a receptores solubles [289]. Se ha descripto la presencia del receptor de membrana Mel1a en timo, así como de los receptores nucleares RZR/RORα, RZRβ y RORγ [296,313]. Es posible que la melatonina ejerza sus efectos antagónicos a través de alguno/s de estos receptores. El receptor Mel1a está acoplado a una proteína G inhibitoria, y su activación produce una caída en los niveles de AMPc intracelulares [289]. Experimentos realizados en células SL2 de Drosophila han demostrado que la melatonina inhibe la transcripción inducida por activación del GR, y que el receptor Mel1a es necesario para producir este efecto [348]. Sin embargo, experimentos realizados por nuestro grupo demostraron que tanto la dexametasona como la melatonina disminuyen los niveles del AMPc en timocitos de ratón [355]. Este hecho implica que la señalización mediada por este segundo mensajero (a través de Mel1a) no estaría involucrada en el efecto inhibitorio sobre la translocación del GR. También se ha descripto que la activación de Mel1a regula los niveles de otros segundos mensajeros como el GMPc [289,304] y el ión Ca2+ [294]. Por lo tanto, no podemos descartar que el receptor Mel1a esté involucrado en la inhibición del transporte retrógrado del GR, a través de algún segundo mensajero distinto del AMPc. Los receptores nucleares de la familia RZR/ROR constituyen ‐ en principio‐ candidatos viables para explicar los efectos antagónicos de la melatonina en timo. Sin embargo, su 196
Capítulo 3: Discusión
localización subcelular es mayoritariamente nuclear [264], lo que dificulta explicar cómo un factor que se encuentra principalmente en el núcleo puede inhibir la translocación de una proteína localizada en el citoplasma. De hecho, en este trabajo se determinó la presencia o ausencia de estos receptores en algunas de las líneas celulares estudiadas (figura 76). La falta de correlación entre su presencia y la observación de un efecto inhibitorio sugiere que ni RORα ni Mel1a estarían involucrados en el mecanismo antagónico, o que al menos no serían suficientes. Otro candidato posible de mediar el efecto de melatonina es la calmodulina (CaM). Este mediador de la señalización de calcio es una proteína altamente conservada, ubicua, cuyas múltiples funciones abarcan desde la regulación de la actividad de enzimas hasta la modulación del citoesqueleto, incluyendo funciones en la replicación y reparación del ADN [361,584]. Se la ha vinculado a la regulación de la actividad de los receptores de esteroides, demostrando una interacción directa y funcional con el GR [361] y el ER [585], así como con la Hsp90 [586,587]. Curiosamente, FKBP52 presenta un dominio putativo de unión a CaM [126], y su deleción reduce la afinidad de unión entre FKBP52 y Hsp90 [588]. El agregado de un antagonista de CaM altera la composición del complejo GR‐Hsp90, inhibiendo su capacidad de unir ligando [362]. Hace varios años que se ha descripto que melatonina se une directamente a CaM, regulando su función [307‐
309]. De hecho, se ha propuesto que la melatonina inhibe la actividad transcripcional del ER al actuar como un antagonista de CaM, alterando el complejo entre estas dos proteínas e inhibiendo consecuentemente la unión del ER al ADN [363]. Por lo tanto, esta proteína surge como un posible candidato a mediar el efecto del metoxiindol sobre el GR. La evaluación de esta hipótesis es todavía una meta pendiente de nuestro grupo. Finalmente, existe la posibilidad de que la melatonina interactúe con algún factor, presente en timo, hasta ahora no identificado, que inhiba la translocación del GR al núcleo y la disociación de la Hsp90. A lo largo de este capítulo utilizamos diversas líneas celulares, con el objeto de examinar si el efecto inhibitorio que ejerce la melatonina sobre los glucocorticoides depende del tipo celular, o bien ocurre en forma generalizada. Los resultados de este trabajo, así como los de otros grupos de investigación avalan la hipótesis de una dependencia del contexto celular. Así, mientras que en células como las HT22 [517], SL2 transfectadas con el receptor Mel1a [348], S49 (figura 62) y BHK (figura 68) la melatonina antagoniza a los GC, en otras líneas como Cos‐7 (figura 59C), HC11 (figura 59D) y L929 (figura 67A) el metoxiindol no presenta antagonismo. Con respecto a la línea MCF7, mientras que en este trabajo no se encontró efecto alguno de la melatonina (figura 67B), Kiefer y colaboradores describen un efecto antagónico del metoxiindol 197
Capítulo 3: Discusión
[349]. Sencillamente no tenemos una clara explicación de esta contradicción, aunque diferencias en las condiciones de cultivo, estado de la línea celular, o concentraciones de las hormonas utilizadas podrían llegar a explicar esta aparente discrepancia. De todas maneras, en su conjunto, la sumatoria de las evidencias presentadas avala la teoría de que la melatonina no inhibe a los glucocorticoides en forma generalizada, y que probablemente el efecto no sea directo, sino mediado por factores presentes, únicamente, en algunos tipos celulares. Mas allá de la dependencia del tipo celular que aparenta presentar el metoxiindol en su papel como antagonista del GR, durante este trabajo encontramos evidencias que nos permiten afirmar que los mecanismos moleculares por los cuales la melatonina antagoniza a los GC también varían según el tipo celular. Así, encontramos que –contrariamente a lo que ocurre en timocitos, S49, o HT22‐ la melatonina no inhibe la translocación del GR en células BHK (figura 69). Por lo tanto, pese a que el metoxiindol inhibe la actividad transcripcional del receptor en este modelo celular (figura 68 y 70), el bloqueo debe ocurrir en un paso posterior a su importación nuclear. Con el objeto de identificar este paso, realizamos una búsqueda sistemática de algunos de los procesos involucrados en la activación del receptor, posteriores a su entrada al núcleo. La melatonina no modifica la distribución intranuclear del GR (figura 71), ni es capaz de inhibir su dimerización en ensayos in vivo de N&B (figura 72). A su vez, tampoco encontramos un efecto del metoxiindol sobre la capacidad del GR de interactuar con el ADN in vitro, ya sea evaluando la asociación o incluso la cinética de disociación GR‐ADN (figuras 73‐74). Finalmente, mediante ensayos de coinmunoprecipitación (figura 75), encontramos que la melatonina inhibe la capacidad del complejo dex‐GR de unir TIF2. De esta manera, aunque el GR sea capaz de unirse a sitios GRE, no podría inducir la expresión génica por no poder reclutar a coactivadores de la transcripción. El hecho de que la melatonina antagonice a los glucocorticoides por mecanismos diferentes dependiendo del tipo celular nos resultó intrigante. Asumiendo que el metoxiindol actúa indirectamente sobre el receptor, una posibilidad es que opere a través de mecanismos de señalización diferentes para cada tipo celular, por ejemplo mediante receptores de membrana en un caso y vía receptores nucleares en otro. De esta manera, cada camino de señalización termina afectando un paso distinto en la vía de activación del receptor. De hecho, ninguno de los resultados aquí presentados excluye la posibilidad de que en timocitos o células S49 podrían estar operando ambos mecanismos (en caso de existir), pero podemos afirmar que en BHK solo funcionaría uno. Otra posibilidad es que estos mecanismos moleculares de acción alternativos se 198
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deban a una diferencia cuantitativa o cualitativa en cada tipo celular, de las proteínas que participan de la señalización del GR; y no en las vías de señalización de melatonina. Algunos autores proponen que la interacción de Hsp90 con el complejo ligando‐GR mimifica la unión del receptor con coactivadores transcripcionales [152]. En este contexto, si la melatonina en células S49, directa o indirectamente, modula la conformación del GR y por lo tanto su unión o estabilidad del heterocomplejo GR‐Hsp90, es posible que el mismo mecanismo explique a su vez la falta de interacción GR‐TIF2 en células BHK. La localización subcelular del GR en timocitos se realizó evaluando a la proteína endógena, mientras que en BHK la falta de anticuerpos para GR de hámster nos obligó a introducir exógenamente GFPGR. Por lo tanto, el desbalance producido por la sobreexpresión de GFPGR podría provocar que no se vea un efecto inhibitorio sobre la translocación, evidenciándose el “segundo mecanismo”, o sea, la falla en el reclutamiento de TIF2. Una evaluación de la localización subcelular del GR endógeno en BHK resulta necesaria para comenzar a poner a prueba esta hipótesis. Como se mencionó en la introducción, a los efectos no genómicos se los define como aquellos efectos rápidos (segundos‐minutos) de los glucocorticoides, independientemente de la acción del receptor como factor de transcripción [169]. Uno de ellos es la regulación de los niveles intracelulares de AMPc. Se ha observado que el cortisol disminuye los niveles de este segundo mensajero en la hipófisis de peces cíclidos [589] y en células de Leydig en ratón [590]. Además, la dexametasona inhibe el incremento de AMPc causado tanto por adrenalina en células epiteliales tímicas [591], como por foskolina en la línea tumoral corticotrofa AtT20 [592]. Los mecanismos por los cuales el GR regula a este nucleótido cíclico permanecen aún desconocidos. En timocitos, nuestro grupo observó una disminución del AMPc intracelular al tratarse con dexametasona, melatonina, o ambas hormonas [355]. En esta Tesis, el tratamiento de células BHK con dexametasona también disminuyó los niveles intracelulares de AMPc, pero a diferencia de lo ocurrido en timocitos, la melatonina no alteró los niveles de este segundo mensajero, ni pudo revertir el efecto causado por la dexametasona (figura 77). Más allá de la falta de un marco teórico que relacione al AMPc con la inhibición de la interacción GR‐TIF2 inducida por el metoxiindol, estos resultados indican que el efecto antagónico de la melatonina en células BHK no sería mediado por el AMPc; y sugieren que el receptor Mel1a tampoco participa del mecanismo de señalización de melatonina, al menos no mediante la modulación de este segundo mensajero. Por otra parte, se ha descripto que el receptor nuclear de melatonina, RORα, 199
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interactúa con TIF2 [360], abriendo la posibilidad de que esta proteína participe de hecho, en la modulación del GR. Experimentos futuros pondrán a prueba dicha hipótesis. 3.9 El Luzindole: ¿un nuevo antiglucocorticoide? El Luzindole es un conocido antagonista de receptores de melatonina. De hecho, esta sustancia posee afinidad por los receptores de membrana Mel1a y Mel1b, siendo la misma mayor para este último que para Mel1a [593,594]. De esta manera, dependiendo de la concentración utilizada, puede usarse como inhibidor específico de Mel1b [593], o como inhibidor inespecífico de ambos receptores [575]. Además, el Luzindole también presenta afinidad por la quinona reductasa (MT3) [595]. A pesar de su uso extensivo, muchos aspectos farmacológicos de esta sustancia permanecen aún desconocidos [596]. Por ejemplo, se han descripto posibles variaciones dosis‐dependiente en respuesta a este antagonista [597], e incluso en células leucémicas humanas HL‐60 se ha sugerido que esta droga presenta actividad agonista parcial [598]. Por último, es un antioxidante que se comporta – al igual que melatonina – como un capturador de radicales libres [596]. En busca de los mecanismos de señalización de melatonina en nuestro modelo experimental, encontramos que el Luzindole, sorprendentemente, posee un efecto antagónico per se sobre la actividad transcripcional del GR (figura 79). Más aún, nuestros resultados también sugieren que los mecanismos por los cuales Mel y LUZ antagonizan a este esteroide son diferentes. En primer lugar, a pesar de que ambas sustancias no modifican per se los niveles intracelulares de AMPc en células BHK, Mel no es capaz de revertir la disminución de este nucleótido cíclico por glucocorticoides (figura 77), mientras que LUZ sí inhibe completamente el efecto de la dexametasona (figura 80). En segundo lugar, el hecho de que la melatonina no antagonice a los glucocorticoides en Cos‐7 (figura 59C), mientras que LUZ presenta un efecto inhibitorio (figura 81), argumenta a favor de que las vías de señalización y/o los mecanismos de acción de ambas sustancias son diferentes. Finalmente, con respecto al mecanismo de acción de LUZ, podemos concluir que al menos no inhibe la translocación del GR (figura 82), afectando entonces un paso posterior dentro del camino de señalización del receptor. Igualmente, independientemente del mecanismo de acción, este hallazgo abre nuevas posibilidades para el uso de esta droga como un novedoso antiglucocorticoide.
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CONLUSIONES FINALES “The particular field which excites my interest is the division between the living and the non‐living, as typified by, say, proteins, viruses, bacteria, and the structure of chromosomes. The eventual goal, which is somewhat remote, is the description of these activities in terms of their structure, i.e. the spatial distribution of their constituent atoms, in so far as this may prove possible. This might be called the chemical physics of biology”. Francis Crick (1916‐2004). Físico y biólogo Británico. Premio Nobel de medicina, 1962. Conclusiones finales
Conclusiones finales Los glucocorticoides cumplen funciones muy variadas en el organismo, muchas de las cuales son esenciales para la vida. Por sus potentes propiedades antiinflamatorias han sido utilizados farmacológicamente desde hace más de medio siglo, y desde su descubrimiento han sido una de las clases de drogas más prescriptas y exitosas de la historia [20]. Actualmente, si bien existen muchos glucocorticoides aprobados en el mercado que son utilizados en una gran cantidad de tratamientos clínicos, los graves efectos secundarios que produce su uso crónico limitan su utilidad. ¿Existe la posibilidad de aumentar los efectos benéficos y al mismo tiempo disminuir o eliminar los adversos? El conocimiento preciso de las bases moleculares de la acción de los glucocorticoides resulta crítico para la obtención de nuevas drogas con el perfil de actividad deseado. Sin embargo, esta investigación debería realizarse en un marco global que considere todos los posibles modos de acción del GR y que tenga en cuenta aquellos aspectos relacionados a la selectividad del tejido. Desde el clonado del GR en 1985 [599], mucho se ha avanzado en el conocimiento acerca de las bases moleculares de acción de los glucocorticoides, aunque todavía falta mucho camino por recorrer. El GR es un factor de transcripción activado por ligando que puede regular la expresión génica a través de una gran diversidad de mecanismos. Estos mecanismos no sólo dependen de la estructura del ligando o de la región promotora de sus genes blanco, sino también de las múltiples proteínas que interactúan directa o indirectamente con el receptor, como chaperonas, cofactores y otros factores de transcripción, entre otros; así como también por el grado de modificaciones post‐traduccionales que el GR sufra a lo largo de su activación. Además, el subconjunto de todas las posibles proteínas interactoras del GR está limitado a priori por el tipo y el contexto celular en el cual los glucocorticoides actúan, generándose así otro nivel mayor de complejidad a considerar en la diversidad de acción de estos esteroides. A lo largo de esta tesis hemos estudiado al GR desde diferentes “ángulos”, utilizando una considerada diversidad de técnicas experimentales. Así, desde las hipótesis de trabajo generadas a partir de simulaciones por dinámica molecular, hasta la evaluación empírica mediante la utilización de técnicas recientemente desarrolladas como la de N&B, intentamos profundizar los conocimientos sobre algunos de los aspectos moleculares que median la activación de este receptor. Por un lado, en la primer parte de esta tesis evaluamos el efecto de la estructura del ligando sobre algunos pasos claves en el proceso de activación del GR. Por otro lado, a lo largo 202
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del segundo capítulo intentamos caracterizar cómo los glucocorticoides inducen la expresión del gen pro‐apoptótico bax, lo que reveló niveles de complejidad superiores a los previamente esperados. Finalmente, profundizamos los conocimientos sobre cómo la melatonina es capaz de modular al GR en forma tejido‐específica, evaluando la capacidad del receptor de interactuar con varias proteínas que participan a lo largo de su vía de señalización. La homodimerización del receptor, considerada un paso esencial del mecanismo de activación del GR, acorde a nuestros resultados no sería un paso suficiente como para definir al receptor como un factor de transcripción activo, dado que en presencia de antagonistas competitivos como RU486, 21OH‐6,19OP, o incluso de antagonistas no competitivos como la melatonina el GR continúa oligomerizando, proceso que sería entonces independiente de la estructura del ligando, de la unión a coactivadores, y muy probablemente de la unión al ADN. De hecho, el conjunto de nuestros resultados nos permiten especular que son los cambios conformacionales que adquiere el receptor, es decir, aquellas conformaciones que favorezcan o impidan la interacción con coactivadores como TIF2 las que influyen directamente en la actividad transcripcional del GR. De esta manera, la capacidad de unirse a TIF2 sería un punto clave en la relación conformación‐actividad del GR como factor de transcripción, y no tanto su acción como homodímero o monómero. De hecho, si bien se ha propuesto que la actividad de los moduladores selectivos del GR radica en la capacidad diferencial de reclutar un determinado subconjunto de cofactores [35], para la gran mayoría de los ligandos esto no ha sido determinado [153]. En este sentido, en este trabajo encontramos que tanto el glucocorticoide disociado 21OH‐
6,19OP, así como la melatonina en células BHK, inhiben la actividad transcripcional del GR al menos no permitiendo la interacción de éste con TIF2. Sin embargo, éste mecanismo no es exclusivo de todos los antagonistas del GR, ya que RU486 continúa promoviendo el reclutamiento de TIF2, al menos cuando éste se encuentra sobreexpresado. Su capacidad de inhibir al GR residiría entonces en la habilidad del mismo de modular la cinética de disociación GR‐ADN, o de la incapacidad de interactuar con otros cofactores. Asimismo, la melatonina en modelos linfoides inhibe la disociación de la Hsp90, quizás alterando algunas proteínas del heterocomplejo. Nuestros resultados son compatibles con el modelo que plantea que el GR puede adoptar un gran número de conformaciones posibles, cada una capaz de interactuar dinámicamente sólo con ciertas moléculas (ADN, cofactores, chaperonas, etc.). Un determinado ligando probablemente seleccionará un pequeño subconjunto de las conformaciones posibles que puede adoptar el 203
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receptor, generándose entonces una capacidad diferencial del GR, ligando dependiente, de regular la expresión génica de sólo un determinado subset de genes. A la hora de estudiar las relaciones estructura‐actividad de un esteroide en un determinado sitio de unión, no sólo juegan un papel clave los grupos funcionales presentes y su orientación, sino también la flexibilidad del esqueleto esteroidal, que determinará en última instancia el comportamiento de la molécula. Así, por ejemplo, el agregado de un grupo hemisuccinato en la posición 21 del antagonista 21OH‐6,19OP produce un nuevo análogo rígido con actividad agonista. Por otra parte, la estructura rígida de 21OH‐6,19OP, generada por la introducción del puente 6,19 epóxido podría explicar, al menos en parte, la especificidad de acción de este ligando por el GR, y no por otros receptores de esteroides. La síntesis y caracterización de un ligando funcionalmente selectivo no es un proceso sencillo. De hecho, los experimentos in vitro no garantizan que tal ligando contenga el perfil de actividad deseada in vivo [35]. En este trabajo caracterizamos a 21OH‐6,19OP como un glucocorticoide que, si bien no puede inducir la transcripción de genes regulados por sitios GRE, puede actuar como monómero reprimiendo a factores como NFκB y AP‐1. Esto lo caracteriza (bajo el modelo disociado) como un ligando con potencial interés farmacológico. Por otro lado, el antagonismo de la melatonina sobre los glucocorticoides, dependiente del tipo celular, definen a este metoxiindol como un modulador selectivo, no competitivo, del GR. Incluso, su mecanismo de acción también varía de acuerdo al modelo experimental utilizado, inhibiendo la disociación GR‐Hsp90 en modelos linfoides o impidiendo la interacción GR‐TIF2 en células BHK. Por último, también presentamos al Luzindole, un antagonista de los receptores de melatonina, como un nuevo antagonista del GR. En conclusión, para poder caracterizar el comportamiento biológico de un dado glucocorticoide resulta necesario considerar las múltiples formas en que el complejo GR‐ligando puede regular la expresión génica. Debido en parte al modo en que se fueron descubriendo los mecanismos de acción de los SR [600], o incluso quizás a la tendencia reduccionista inherente de la biología molecular, conceptos extremadamente simplificados sobre el mecanismo molecular de acción del GR han sido adoptados. Un ejemplo de éste fenómeno es el modelo clásico de transformación citoplasmática y movimiento por difusión, el cual se lo ha utilizado de manera heurística por años para favorecer nuestra comprensión del mecanismo de acción de receptores de esteroides, sin haberse presentado evidencias experimentales concluyentes sobre dicho modelo. De hecho, como vimos en la introducción, modelos alternativos, más complejos, han 204
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surgido para explicar el mecanismo de translocación nuclear del GR, involucrando al heterocomplejo de chaperonas liderado por la Hsp90. El modelo disociado de acción glucocorticoide, ampliamente discutido en la introducción, es otro claro ejemplo de cómo se intenta explicar la complejidad del modo de acción del GR mediante sólo dos posibilidades: transactivación y transrepresión. El comportamiento de muchos glucocorticoides, la actividad específica de tejido, los efectos no genómicos y la acción del GR en otros compartimentos celulares como por ejemplo la mitocondria, necesitan ser explicados mediante modelos más complejos acerca del modo de acción de este sorprendente sistema ligando‐receptor. Lic. Diego M. Presman
(Tesista)
Dra. Adali Pecci
(Directora)
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