Introduction to Genetic Analysis CLASE 04

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Introduction to Genetic Analysis
Ninth Edition
Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, and Sean B. Carroll
CLASE 04-05
Mutaciones y reparación del DNA
Como surgen las variantes génicas?
Introducción
●
●
●
Joven, desarrolla una
enfermedad, su piel es
muy sensible a la luz.
Diagnóstico: enfermedad
autosómica recesiva,
llamada Xeroderma
pigmentoso.
Varios genes se
encuentran asociados a
esta enfermedad, los
cuales mutados generan la
enfermedad
Que ocurre para los pacientes
sanos?
●
Los genes que
contribuyen a
procesos bioquímicos
en la célula que
responden al daño
químico del DNA y lo
reparar antes de que
se formen nuevas
mutaciones
●
Que vamos a
entender?
Como mutaciones en
el sistema de
reparación conducen
a enfermedades
genéticas
Análisis genético
●
Identificación de una propiedad biológica … encontrar
gen o los genes en el genoma que influyen o
determinan esa propiedad “descubrimiento del gen
asociado” y de alli como actua etc,y continuar con
mayor investigación.
Análisis genético
Relación biología-genética: análisis genético
●
●
Una de las formas mas difundidas es la detección
de los patrones de herencia de genes simples.
Patrones de herencia pueden reconocidos en la
progenie de ciertos cruces controlados. Elementos
principales: Mutantes: que son formas alteradas de
una propiedad normal y Tipos silvestres.
Si no existieran las variantes génicas no
existiría el análisis genético
●
●
Cómo surgen las
variantes génicas?
Cuales son los dos
procesos mas
importantes para el
origen de la
variación?
●
La mutación produce
nuevas cartas de
juego y la
recombinación las
intercambia
produciendo
diferentes manos de
juego. Capítulo de
citogenética.
Las principales fuentes de la variación son:
la mutación y la recombinación
●
●
Mutación: es el
cambio en la
secuencia del DNA
en un gen.
La Mutación es la
fuente del cambio
evolutivo.
●
Nuevos alelos surgen
en todos los
organismos algunos
por mutación
expotanea y otros por
efecto de la radiación
y sustancias químicas
entre otros.
Interacción de genes
●
El producto de
múltiples genes son
activos, funcionales
en caminos
biosintéticos que
determinan
propiedades
biológicas tales como
el color del ojo
●
●
El ojo normal del
Drosophila es rojo, pero es
el producto de interacción
de diferentes pigmentos
sintetizados en diferentes
caminos.
El gen normal en el cual
ocurre la mutación white
funciona corriente abajo en
el camino de la formación
del pigmento.
Interacting mutations affect eye color in Drosophila
A malfunctioning enzyme leads to albinism
Variantes génicas
●
●
En el ambiente celular el
DNA no es
completamente estable,
y cada bp tiene cierta
probabilidad de mutar.
Los nuevos alelos
producidos por la
mutación son el material
básico para un segundo
nivel de variación
efectuado por el proceso
de recombinación.
●
La recombinación es
el resultado de
procesos celulares
que genera que
alelos de diferentes
genes se agrupen en
nuevas
combinaciones.
Mutaciones
●
●
La mutaciones varían
desde cambios en
una base, cambio de
pares de bases,
deleciones de
regiones
cromosómicas
Hasta desaparición
de un cromosoma
total
Eventos mutacionales que afectan
genes individuales
●
●
●
Células han
evolucionado
sofisticados sistemas
de reparación.
Sin embargo siempre
es tolerado un bajo
nivel de mutación
Cuales son la
consecuencias
fenotípicas de las
mutaciones?
●
Por qué?
●
Cuál es su relación
con la evolución?
Mecanismos asociados
●
●
●
Replicación del DNA
Sistemas de
reparación pueden
introducir mutaciones.
Otras mutaciones
pueden ser
devastantes como el
rompimiento de una
hebra sencilla.
Mutuaciones puntuales:
Sustituciones de bases , indel
Reflexión sobre la lectura del código genético
Propiedades del código genético
●
●
●
●
El código genético es degenerado, en el sentido
en que mas de un tRNA decodifica varios
aminoaćidos
No tiene ambiguedades en el sentido que cada
triplete especifica para un aminoácido
El codigo no es solapado, una vez inicia el
proceso de transcripción siempre es leido en
tripletas
El código es casi universal, casi todos los
organismos usan este diccionario
Reconocimiento de los tRNAs
Overview: traducción
●
●
●
Etapas de Iniciación: IF (initiation factors),
tRNAfMet i,
Etapas de elongación: Ef (elongation factors)
Etapa de terminación: Rf (release factors)
reconocen los anticodones de terminación.
Tipos de mutaciones puntuales: cap.15
Efecto:
●
●
●
sinonimas (el codon alterado codifica para el
mismo aminoácido.)
No sinonimas (missense) (el codon alterado
codifica para otro aminoacido. Conservativa o
no conservativa).
Sin sentido (nonsense) (el codon alterado es
un codon de parada)
Mutaciones: sustituciones y indel
●
Sustituciones: subtipos: transiciones y
transversiones
Definición teniendo en cuenta su efecto en la
hebra complementaría.
Transiciones: reemplazamiento de la base por
una de la misma categoria: Pu X Pu, Py X Py
A:T
T:A
C:G
G:C
Mutaciones:sustituciones, indel
●
Transversiones: opuesto a sustituciones.
Reemplazamiento de la base es una base de
otra categoría química: Pu X Py y Py X Pu.
A:T
T:A
C:G
G:C
El efecto debe observarse sobre la
doble hélice
●
●
Referirse a la mutación asi efecto en la doble
hélice:
Transicion: G:C
A:T
●
●
Transverciones: G:C
T:A
Inserciones y deleciones: insertar o
quitar un par de nucleótidos
●
●
Indel mutations (insertion:deletions).
Consecuencias moleculares de las
mutuaciones puntuales en la región codificante
●
●
●
Considerar cuales son las consecuencias cuando la
mutación ocurre en la región que codifica para el
polipeptido: que propiedades del código genético
funcionan aqui: degeneración y la existencia de codones
de terminación
Sinonimas: no alteran la secuencia del polipepetido
(silenciosas)
No-sinonimas y sin sentido: la severidad del efecto
depende: conservativa o no. El efecto real se observa
en la estructura de la proteína y su función.
Cambios que incativan proteinas
están relacionados por mutaciones
en los sitios de splicing
Mutaciones de cambio de lectura
Cambian la secuencia corriente abajo del sitio de mutación y la
secuencia producida no tiene relación con la secuencia original,
esperada.
Consecuencias moleculares de mutaciones
puntuales en regiones no codificantes
●
Si crea o altera un sitio de unión. Si altera
región regulatoria (cantidad de producto de
expresión).
Resumen
●
Consecuencias moleculares de las mutaciones
puntuales (sustituciones, indel):
1. Si ocurren en la región codificantes
2. Si ocurren en las regiones no
codificantes
Cambios que inactivan proteinas
están relacionados por mutaciones
en los sitios de splicing
Cuales serían las consecuencias de
mutuaciones puntuales en regiones
no codificantes?
●
Si crea o altera un sitio de unión. Si altera
región regulatoria (no expresión, cantidad de
producto de expresión modificada).
Consecuencias de las mutaciones
puntuales en productos de genes
Detección de moléculas usando
sondas marcadas
Las bases moleculares de
mutaciones expontaneas
●
●
●
Las mutaciones en los genes pueden surgir de
forma espontanea o pueden ser inducidas.
Mutaciones espontaneas: ocurren de forma
natural.
Mutaciones inducidas: surgen a travez de la
acción de ciertos agentes, llamados mutágenos
que incrementan la velocidad a la cual la
mutación ocurre.
La mutación es un proceso al azar,
cualquier alelo de una célula puede mutar
●
Fuentes:
1. Proceso de
replicación.
2. Ambiente celular
puede producir un
cambio. Lesiones
espontaneas.
3. Inserciones de
elementos
transponible
Visión molecular de las mutuaciones
puntuales: errores en la replicación
Tautomeros
●
Tautomeros: las bases del DNA
pueden aparecer en diferentes
formas. Difieran la posición de sus
átomos y los enlaces entre los
átomos. Comunmente migraciónde
un átomo de Hidrógeno o de un
protón. Cambio de enlace sencillo a
doble. Mecanismos de reparo por la
función de edición de la polimerasa.
Y los que escapan son reparados por
“Sistemas de reparación”. Que tipo
de mutación es ?
Los cambios tautoméricos puden
causar mutaciones
Indel: resultan en cambio del marco
de lectura “replication slippage.
Video 15.10”
Lesiones espontaneas
●
Depurinación:
Rompimiento del enlace
glicosilico entre la base y
el azucar. 10.000 purinas
por ciclo celular son
perdidas en células de
mamiferos.
●
Corregido por los
sistemas de reparación.
Lesiones espontaneas
●
●
Deaminación de la
citosina produce
uracilo, el cual aparea
con A en la
replicación (G: C →
A: T).
Dibuje el esquema de
replicación para la
primera y segunda
progenie
Lesiones espontaneas: radicales
libres
●
●
●
Productos del
metabolismo normal
aeróbico (H202, .OH,
radicales super oxido)
producen daño oxidativo
tanto al DNA como al
GTP.
A: bloquea la replicación
B: produce aparemiento
con A, resultando
incremento de
transverciones G→T.
A
B
Mutaciones espontaneas:
Enfermedades de repeticiones de
tripletas
●
●
Sindrome del cromosoma
X fragil: (CGG)n
Enfermedad de
Huntington:(CAG)n
Bases moleculares de las
mutaciones inducidas: mutagenos
●
3 Tipos principales:
1. Reemplazan una base en el DNA
2. Alteran una base talque genera
apareamiento incorrectos con otras base.
3. Daño cuando una base no puede
aparearce con ninguna otra base bajo
circunstancias normales.
Mecanismos de mutagénesis
inducidas
●
Incorporación de análogos de bases: son
compuestos similares a las bases
nitrogenadas: 5-bromouracil (análogo a timina).
La forma inestable aparea con G.
Mecanismos de mutagénesis
inducidas
●
●
Mutagenos no incorporados al DNA, sino que
alteran una base y ésta puede generar un mal
apareamiento: agentes alquilantes (EMS etil
metano sulfonato) y Nitrosoguanidina (NG),
transfieren grupos alkilos (etil y metil)
Mecanismos de mutaciones
inducidas
●
Agentes intercalantes:
Naranja de acridina (causar
indel)
●
Daño de las bases:
Luz ultravioleta: fotoproductos
●
●
Moleculas ionizadas: peroxidos
producidos por ionización por
radiación.
Formación de sitios apurínicos
por rompimiento del enlace
glicosidico
Fotoproductos
Los mecanismos de reparación
biológica
Despues de observar diferentes fuentes de error
de daño de DNA: (dentro de la células):
replicación, productos del metabolismo y externos
(luz UV, radiaición por ionización, mutagenos)
Cómo la vida ha sobrevivido millones de años?
Mecanismos de corrección de
errores
●
Tipo 1. Función
prueba de lectura de
DNA polimerasas.
DNA polimerasa I y III
son capaces de
eliminar bases mal
apareadas.
Mecanismos de reparación del DNA
●
●
Tipo II: hacer reversa la
mutación. Ciclobutano
pirimidine dimero
(CPD) (reversible por
la enzime CPD
fotoliasa).
Metiltransferasas que
remueven los grupos
alkil recien incertados
Mecanismos de reparación del DNA
●
Tipo III: Reparación por
escición de la base:
(Sistemas de reparación
dependientes de
homología.) . Secuencias
(crear sitios apurinicos AP
por la ruptura DNA
glicosilasa, AP
endonucleasa,
Deoxiribofosfodiesterasa
elimina el esqueleto PD.
Ligasa sella )
Mecanismos de reparación del DNA
●
●
●
●
●
Tipo IV: Reparación por
escisión del nucleótido.
Reconocimiento del daño:
parada o retención de los
complejos de replicación y
transcripción.
Ensamble del complejo de
multiproteinas en el sitio
Corte de la hebra dañada 30
nt up and down stream.
Uso de la hebra no dañada
como moldel para DNA
polimerasa seguida por
ligación.
Mecanismos de reparación del DNA
●
●
●
Tipo IV: Reparación por escisión
del nucleótido. Activados por
parada o retención de los fork de
replicación y transcripción:
En el sindrome de Cockayne las
proteinas de reconocimiento de
retención de la transcripción están
mutadas activando frecuentemente
la apopotisis.
En Xeroderma pigmentosum: XPB
y XPD se encuentran defetuosas y
no se puede dar reparación del
daño y se acumulan las
mutaciones.
Mecanismo de reparación postreplicación
●
●
La tasa de error en la
replicación es 10 -5 .
Con la prueba de lectura de
la 3' – 5' de la polimerasa se
reduce a
10 -7.
●
Nos queda un error que
puede mantenerse, pero el
mecanismo de reparación de
no-coincidencias “mismatch
repair” lo disminuye a 10-9
Mecanismo de reparación post-replicación:
reparación de no coincidencias:modelo en E.coli
●
●
●
Esta asociado a
metilación del DNA en
E.coli regiones inestables
por presencia de indel,
loops.
Se asocia a la metilación
de la hebra molde para
hacer reconocimiento de
la hebra nueva.
MutS, MutL, MutH y UvrD
Mecanismo de reparación post-replicación:
reparación de no coincidencias:modelo en E.coli
●
●
●
●
Reconocimiento de
mistmatch (MutS).
Atrae a MutL, MutH y
UvrD
Reconocimiento y corte
de la hebra que posee el
nucleótido incorrecto
(MutH), la no metilada es
la nueva.
UvrD tiene actividad
helicasa mientras se da
el corte
Otros mecanismos
●
●
●
Sintesis de DNA por
translesión.
Reparación de
rupturas de doble
hélice
Mecanismos de
reparación en meiosis
en la recombinación.
Guia para el laboratorio: Enzimas
de restricción
●
Generación de Moléculas
recombinantes:
●
DNA donor
●
Enzimas de restricción
●
Formación de la molécula
recombinante
●
Transformación
●
Amplificación
Cortar el DNA: de gran tamaño a
pequeños tamaños
●
●
●
Uso de enzimas de
restricción bacteriana.
Características:
cortan secuencias
específicas del DNA,
llamadas sitios de
restricción.
Por azar cualquier
genoma tiene sitios
de restricción
●
5'-GAATTC-3'
●
3'-CTTAAG-5'
●
●
●
Segmentos
palíndromes
Pareamiento de
extremos libres …
hibridación