Transposones conjugativos - Facultad de Medicina
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Genética Bacteriana y Mecanismos de la Transferencia Horizontal Genética Dra Daniela Centrón Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Objetivos • Conocer el concepto de especie bacteriana y especiación • Conocer los elementos del genoma bacteriano • Comprender la dinámica de los Mecanismos involucrados en la Transferencia Horizontal de Genes y la Pato-adaptación ¿PARA QUE SIRVE CLASIFICAR A LAS BACTERIAS? • • • • • Ordenar los conocimientos Lenguaje común Descubrir organismos no descriptos Caracterizar aislamientos (por ejemplo patógenos) Estudios evolutivos ¿Cómo definimos una especie bacteriana? “Una especie bacteriana es una categoría que circunscribe un grupo genéticamente cohesivo (en estrecha relación) de aislamientos individuales que comparten un alto grado de similaridad en características independientes”. Definición en revisión continua Definición de especie en bacterias Actualmente el criterio es POLIOFÁSICO. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc) Genotípicos: -clásicos: % G+C - moleculares: hibridación DNA-DNA Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S Bases del criterio polifásico Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres: Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc) Genotípicos: -clásicos: % G+C - moleculares: hibridación DNA-DNA Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S Un individuo de cada especie posee: GENOTIPO: conjunto de características genéticas de una bacteria FENOTIPO: conjunto de características genéticas que se expresan FILOGENIA: determina relaciones de parentesco entre las especies Fenotipo • Morfología: forma, tamaño y tinción • Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S • Movilidad: tipo y disposición de flagelos • Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad Genotipo Hibridación ADN-ADN - depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados - es el criterio actual de definición de especie Taxones Dominio Phylum Clase Orden Familia Género Especie Sub-especie Sistema binomial de nomenclatura (Linneo) Escherichia coli o E. coli Nomenclatura Categorías de clasificación a nivel de subespecie (tipificación) •serovariedad o serotipo (antígenos distintos) •fagovariedad (tipificación por fagos) •biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas) •patovariedad (patogenicidad) •morfovariedad (diferencias morfológicas) •genomovariedad (grupos con ADN similares) Filogenia Especies evolutivas son grupos que evolucionan de forma separada de otros ; los linajes poseen funciones unitarias y tendencias. CONCEPTO EVOLUTIVO DE ESPECIE Secuencia del ARNr 16S Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de proteínas: función ancestral Evolución de las formas de vida: los tres dominios propuestos por Karl Woese. Árbol filogenético obtenido por secuenciación de ARN ribosomal. Bacteria Archea Eukarya Hongos Animales Bacterias Entamebas mucosos verdes no Hongos sulfurosas Methanosarcina Plantas Methanobacterium Halófilas Bacterias Ciliados Gram Methanococcus Positivas Proteobacterias Thermoproteus Pyrodictium Thermococcus Cianobacterias Flagelados Flavobacterias Tricomónadas Thermotogales Microsporidios Diplomónadas LUCA (Last Universal Common Ancestor) ELEMENTOS DEL GENOMA BACTERIANO • Cromosoma • Plásmidos • Bacteriófagos Es el conjunto de elementos genéticos autorreplicativos que tiene una bacteria, o sea que todos sus elementos son replicones. I-Cromosoma Bacteriano ESTRUCTURA TERCIARIA • • • • • ADN doble cadena (1mm long), 1 ó 2 cromosomas Circular Condensado (“supercoiled” o superenrollado) Haploide De 1000 a 6000 kilobases. La bacteria más pequeña tiene 140.000 pares de bases (Carsonella ruddii) Las principales funciones del cromosoma bacteriano son: la replicación y la expresión de los genes. La unidad funcional del cromosoma es el gen REGION REGULATORIA Codón de iniciación Codón de terminación ¿Qué es un gen? Un segmento de ADN que contribuye a un fenotipo/función. En ausencia de una función demostrable, un gen puede ser caracterizado por secuencia, transcripción u homología. Human Gene Nomenclature Committee En Procariotas..... Los genes se hallan ordenados en Operones. La transcripción es policistrónica (ARNm de varios genes). II-Plásmidos Portan información que ayuda a la bacteria a adaptarse al medio circundante y a su evolución. Forman parte del “moviloma”. Funciones de los plásmidos E. coli comensal E. coli enteropatógena E. coli enteroinvasiva E. coli enterotoxigénica Confieren una característica que la bacteria receptora NO poseía Plásmidos de relevancia asociados a virulencia Factores de Virulencia 182 kb Factor edema Antígeno protectivo Factor letal cápsula operón gerX relacionado con el proceso de germinación de las esporas. • • • • • • • • Replicación, reparación, recombinación Fertilidad Restricción y modificación Resistencia a antibióticos Resistencia a metales tóxicos y detergentes Resistencia a bacteriófagos Metabolismo de azúcares y compuesto aromáticos Adhesión celular, factores de virulencia. Algunos plásmidos pueden integrarse al cromosoma bacteriano III-Bacteriófagos Son los virus que infectan a las bacterias, y cumplen un ciclo de multiplicación dentro de la célula bacteriana pudiendo conducir a las lisis de la misma. Bacteriófagos Múltiples fagos pueden infectar y ser parte del genoma bacteriano Algún gen del bacteriófago puede expresarse y dar una característica especial a la célula hospedadora. Ej.: Fago T12 que lisogeniza cepas de S. pyogenes y produce la escarlatina ELEMENTOS MÓVILES DEL GENOMA BACTERIANO • Clase I: retrotransposones ya que poseen un intermediario de ARN para su movilización • Intrones • Clase II: transposones, en los cuales el ADN es cortado e insertado en forma directa. • • • • • • Secuencias de Inserción o Elementos IS (IS1, IS2, IS3, etc) Transposones compuestos (Tn5, Tn10, etc) Transposones simples (familia Tn3) Transopsones conjugativos Bacteriófagos (Mu, lambda, P22, etc) Cassettes (de integrones) Clase I-Intrones en las bacterias En las bacterias, los intrones son elementos móviles Alelo con intrón Exón 2 Exón 1 Exón 3 Exón 4 Nuevo alelo atacado Transcripción / Splicing Traducción/Actividad de Transcriptasa Reversa/Identificación de secuencia blanco Clase II-Transposones bacterianos Clase II-Transposones bacterianos 1er Transposón identificado en el maíz Los transposones son los elementos más abundantes en la naturaleza Qué es un transposón? Dador Transposón Transposón Blanco Transposición Transposón 1. Interacción de la transposasa con el sitio blanco 2. Identificación del sitio blanco 3. Transposición al sitio blanco Transposasa Transposasa Blanco de ADN Elementos móviles del genoma bacteriano • Clase II: transposones, en los cuales el ADN es cortado e insertado en forma directa. • • • • • • Secuencias de Inserción o Elementos IS (IS1, IS2, etc) Transposones compuestos (Tn5, Tn10, etc) Transposones simples (familia Tn3) Transposones compuestos Bacteriófagos (Mu, lambda, P22, etc) Cassettes (de integrones) Secuencias de Inserción o Elementos IS ADN Blanco Transposición Transposones compuestos Resistencia a gentamicina IS140 IR tnpA IR aac(3)-IIa IS140 IR tnpA FRAGMENTO DE ADN RODEADO DE DOS SECUENCIAS DE INSERCIÓN (ISs) IR Transposones simples intI2 dfrA1 sat2 aadA1 orfX tnsE tnsD tnsC tnsB tnsA Tn7 RUTAS DE TRANSPOSICIÓN PLÁSMIDOS CROMOSOMA Transposones conjugativos Se transfieren de una bacteria a otra y se insertan en el cromosoma. Son el paradigma de las llamadas islas genómicas Bacteriófagos El fago se replica y produce la lisis bacteriana. El fago se considera que está en estado de “profago”. Ciclo Lítico Ciclo Lisogénico En la bacteria lisogenizada, algún gen del profago puede expresarse y dar una característica especial a la célula hospedadora. Bacteria Fago Gen/es Fenotipo Vibrio cholerae Fago CTX toxina colérica Escherichia coli Fago lambda toxina shigalike Cólera Síndrome Urémico Hemolítico-Diarrea Botulismo Clostridium botulinum Corynebacterium diphtheriae Streptococcus pyogenes Fago clostridial toxina botulínica Fago Beta Fago T12 toxina diftérica toxinas eritrogénicas Difteria Escarlatina Cassettes Gen elemento de 59-pb o sitio attC cassette Estimación de la abundancia de cassettes en muestras de suelo 2343 cassettes diferentes en 50 m2 de superficie de suelo Los cassettes se movilizan gracias a los Integrones Pant attI intI Pint Integrones Integrasa cassette -lactámicos, todos los aminoglicósidos, cloranfenicol, eritromicina, estreptotricina, rifampicina, fosfomicina, lincomicina, fluoroquinolonas, factores de patogenicidad, etc. Integrones movilizables asociados a resistencia antibiótica Más de 100 diferentes cassettes de resistencia a antibióticos Resistencia a ß-lactámicos Resistencia a aminoglicósidos Resistencia a cloranfenicol Resistencia a trimetoprima Resistencia a estreptotricina Resistencia a rifampicina Resistencia a eritromicina Resistencia a antisépticos 34 Cassettes 38 Cassettes 12 Cassettes 13 Cassettes 2 Cassettes 1 Cassette 2 Cassettes 5 Cassettes Dónde se localizan los integrones? Integrones de clase 1-Tn402 intI1 blaVIM-2 aac(6´)-Ib tniR tniQ tniB tniA attI1 tnpA tnpR res merD merE Tn21 IRtnp Tn21 TRANSPOSONES merA merP merR merC merT Tn21 IRmer A su vez ..... Integrones de clase 1-Tn402 PLÁSMIDOS R Y también en cromosoma!!! Integrones de clase 1-Tn402 Salmonella enterica serovar Typhimurium SGI1 Acintetobacter baumannii ISLAS GENÓMICAS DE RESISTENCIA ANTIBIÓTICA Integrones localizados en cromosomas y ubicuos de especie Genoma de Vibrio cholerae SI Integrones localizados en cromosomas y ubicuos de especie También llamados intI4 o VchintIA inf C rp mI rp lT IF 3 L35 L20 -integron sto nt eg rasa mrhA 126 Kb, 179 cassettes, 3% del genoma : VCR 121-123 nt RYYYAAC inverse core site GTTRRRY core site 76% identical (Mazel, D et al (1998) Science 280:605; Heidelberg, Jet al. (2000) Nature 406:477; Rowe-Magnus et al. (1999) Res Mic 150:641) En síntesis............“El MOVILOMA” TRANSFERENCIA HORIZONTAL GENÉTICA (THG) GENOMA “Elementos adquiridos” Duplicación Transferencia Horizontal de genes -Recombinación homóloga -Recombinación no-homóloga -Recombinación sitio-específica “Elementos perdidos” Pérdida de genes El contenido genómico es dinámico Diversificación genómica Cómo se detecta la THG? Arboles filogenéticos. Caulobacter Brucella Caulobacter Sinorhizobium Sinorhizobium Yersinia Escherichia Yersinia Brucella Escherichia Salmonella árbol de especies (usualmente 16S) Salmonella árbol de genes Se comparan árboles de especies con árboles de genes La THG al comparar varios genomas procariontes El largo de las barras representa la cantidad de ADN codificante. ADN Nativo es celeste. ADN de Elementos Móviles es amarillo. ADN foráneo no identificado como elementos móviles es rosa. Los números representan el % de ADN foráneo. (Ochman, et al 2000) La THG al comparar linajes de una especie, 2002 MG1655 (K-12) no patogénica CFT073 uropatógena Genoma Flexlible Genoma Core Pan-genoma Total de proteínas=7638 2996 (39,2%) en los 3 genomas 911 (11,9%) en 2 de los 3 3554 (46,5%) en 1 de los 3 EDL933 (O157:H7) enterohemorrágica (Welch et al.,PNAS, 2002) La THG al comparar linajes de una especie, 2009 20 genomas de E.coli secuenciados poseen solo el 11% de genes en común. (Touchon et al.,Plos, 2009) Islas genómicas o alienígenas, localizadas en cromosoma o plásmidos Poseen un porcentaje G+C diferente al resto del genoma bacteriano Isla de Patogenicidad de Escherichia coli enteroptógena, produce borrado de microvellosidades Isla de Patogenicidad de Clostridium difficile, producen la colitis pseudomebranosa ¿Dónde queda el concepto de especie bacteriana? Tal vez se pueda considerar especie al conjunto de bacterias que comparten un mismo genoma básico • Pangenoma: conjunto de genomas de cepas secuenciadas de una especie • Genoma Core: conjunto de genes que pueden ser base de una taxonomía • Genoma Flexible: genes adquiridos por la transferencia horizontal de genes MECANISMOS DE LA THG • • • • • Transformación Transducción Conjugación Fusión de Células (Archaea) Teoría Endosimbiótica (Eucarya) Fusión de Células (Archaea) El 24% de los genes de la arquea Thermatoga maritima tiene homólogos a proteínas de las bacterias termófilas. En las bacterias mesófilas vamos a encontrar muchos menos homólogos: NO COMPARTEN EL NICHO. Teoría Endosimbiótica Ocurrió hace 2 mil millones de años. mitochondria chloroplasts www.youtube.com/watch?v=o_RfwX7ZiIc Adapted from Doolittle, 1999 (Science, 284:2124-2128) (Margulis L, 1980, Rivera and Lake, 2004) Teoría Endosimbiótica seriada Sucesiva incorporación simbiogenética de diferentes bacterias de vida libre. La arquea que englobó a las protobacterias, (las primeras en tener respiración aeróbica), dieron lugar a las mitocondrias, y las arqueas que englobaron a las cianobacterias (fotosíntesis), dieron lugar a los cloroplastos. Teoría Endosimbiótica La ameba Pelomyxa palustris carece de mitocondrias, pero alberga una población permanente de bacterias aerobias que desempeñan un papel muy similar. Microsporidia y Giardia: carecen de mitocondria, son parásitos obligados, tienen genoma un poco mayor que los procariotas. Teoría Endosimbiótica Posteriormente hubo transferencia de los genes mitocondriales y de los cloroplastos al ADN de la célula eucarionte. (Martin et al, 1998) Etapas de la THG A nivel celular, entre una bacteria y, • ADN libre o Célula a Célula por transformación • otra bacteria por conjugación • un bacteriófago por transducción Etapas de la THG LUEGO, a nivel molecular, dentro de una célula, transposones cassettes recombinación homóloga recombinación no-homóloga recombinación sitio-específica replicación y mantenimiento del plásmido transferido LAS SECUENCIAS ADQUIRIDAS DEBEN SER INCORPORADAS POR EL RECEPTOR O ASOCIARSE A UN ELEMENTO REPLICATIVO AUTÓNOMO Etapas de la THG Posteriormente a la incorporación, dentro de una célula, expresión de los caracteres adquiridos Etapas de la THG A nivel poblacional, selección del ADN exógeno que pudo ser “fijado”, y herencia vertical. TRANSFORMACIÓN DESCUBIERTA POR GRIFFITHS EN 1928 Células L vivas Bacteria Inyección Células L Células R muertas por vivas calor cápsula Células L muertas por calor junto a células R vivas “factor de transformación” Resultados Transformación con colonias rugosas y con colonias lisas de Streptococcus pneumoniae. TRANSFORMACIÓN En 1944, Oswald Avery, MacLeod y McCarty identifican que el ADN purificado es “el factor de transformación” y la base química de la herencia. El ADN de las células lisas de Sreptococcus pneumoniae “transformaba” a las rugosas. Puede incorporarse por transformación ADN cormosómico o plásmidos completos. TRANSFORMACIÓN • Transformantes naturales • Bacterias Gram-positivas • Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, B. subtilis, B. cereus, B. Stearothermophilus • Bacterias Gram-negativas • Neisseria gonorrhoeae, Acinetobacter baumannii, Moraxella osloensis, M. urethans • Psychrobacter sp., Azotobacter agilis, Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae, Pseudomonas stutzeri • Transformación Artificial • Escherichia coli, Salmonella Thyphimurium, Pseudomonas aeruginosas y muchas otras. Etapas de la TRANSFORMACIÓN en Neisseria gonorrhoeae • A diferencia de las otras especies, el estado de competencia es continuo en esta especie. • El ADN donado puede provenir de autolisis de una bacteria donante, o a través del Sistema de Secreción de Tipo IV (SSTIV) que libera ADN al medio. lisis bacteriana Liberación de ADN al medio exterior por parte de Neisseria spp. A través del SSTIV (Hamilton HL et al., Mol Microb, 2006) Etapas de la TRANSFORMACIÓN en Neisseria gonorrhoeae • Unión inespecífica de todos los tipos de ADN doble cadena a la membrana externa. • Reconocimiento de una secuencia de 10 pb (GCCGTCTGAA), llamadas DUS (por DNA uptake sequence) presentes frecuentemente en el cromosoma del género Neisseria. • Hay 1965 copias de DUS en el genoma de la cepa FA1090, con una copia de DUS cada 1096 pb. Medio exterior Citosol bacteriano Etapas de la TRANSFORMACIÓN en Neisseria gonorrhoeae • La incorporación del ADN, luego de ser reconocido, es llevada a cabo por el SSTIV. • El ADN entra lineal doble cadena (ADNdc) y también como ADN simple cadena (ADNsc) al citosol bacteriano. Etapas de la TRANSFORMACIÓN en Neisseria gonorrhoeae • Una vez en el citosol bacteriano, el ADNdc puede ser digerido por las enzimas de restricción o procesado por las nucleasas RecBCD. • El ADNsc se une a RecA, quien media Recombinación Homóloga con el ADN cromosomal de Neisseria gonorrhoeae. A AA A B C D RecA Etapas de la TRANSFORMACIÓN en Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae no solo toma el ADNdc libre del medio exterior, sino que además comete “fraticidio”, evento que consiste en lisar a las bacterias de S. pneumoniae que no se hallan en estado de competencia, para luego captar su ADN. (Claverys et al, 2007) FENOTIPOS TRANSFORMACIÓN DEPENDIENTES DE RELEVANCIA Neisseria gonorrhoeae • La tasa de transformación es tan alta que la estructura poblacional es panmíctica. • El alto grado de recombinación es necesario para generar diversidad antigénica en su nicho ecológico, el ser humano. (Hamilton HL et al., Mol Microb, 2006) FENOTIPOS TRANSFORMACIÓN DEPENDIENTES DE RELEVANCIA Streptococcus pneumoniae • Estructura en mosaico del gen de la PBP2b de aislamientos resistentes a penicilina. PBP 2B PBP 1A,2X PBP 1A,2X,2B PBP 1A,2X,2B,2A ) S. pneumoniae = Streptococcus ? (Science 1994;264:388-393) CONJUGACIÓN Identificada en 1946, por Lederberg y Tatum. CONJUGACIÓN Mecanismos • A través de los Sistema de Secreción Tipo IV • Transposones conjugativos • Plásmidos de respuesta a las feromonas CONJUGACIÓN Etapas de la CONJUGACIÓN • Síntesis del pili. • Ensamblado del pili, el cual tiene como función acercar a las dos células. • El pili puede reconocer diferentes receptores en la célula receptora. Etapas de la CONJUGACIÓN • Transferencia de una sola cadena de ADN, la cual va del extremo 5´ y es acompañada por la síntesis continua de la cadena de ADN complementaria en la célula donante. • El ADN pasa por un SSTIV. Etapas de la CONJUGACIÓN • Mientras tanto en la célula receptora, el ADN simple cadena transferido sirve como templado para la síntesis discontinua de la cadena complementaria. PLÁSMIDOS CONJUGATIVOS DE RELEVANCIA A veces se transfieren TRANSPOSONES CONJUGATIVOS por el SSTIV Son islas genómicas capaces de codificar su escisión de un replicón, de transferirise a otra célula por conjugación, y de integrarse en el replicón de la célula receptora, cualquiera que sea la especificidad y el mecanismo de integración y de conjugación. Etapas de la Movilidad de los transposones conjugativos Una integrasa de la familia Lambda, en conjunto con otras proteínas que se encuentran codificadas en los transposones conjugativos, promueven la escisión y circularización del Transposón Conjugativo Escisión (Doublet et al., Mol Microb., 2005) Etapas de la Movilidad de los transposones conjugativos El sistema de conjugación, provisto en trans, permite la transferencia de la Isla Genómica a la célula receptora. La misma integrasa, en conjunto con otras proteínas codificadas Transferencia e Integración por el huésped, es capaz de integrar al transposón conjugativo en el mismo sitio del genoma receptor. Transposones conjugativos de relevancia La isla genómica SGI1 de 43 kb es una isla de resistencia a antibióticos, posee variable cantidad de genes que codifican para todas las familias de antibióticos de uso clínico. TRANSPOSONES CONJUGATIVOS DE RELEVANCIA Se identificaron 35 transposones conjugativos en el genoma de Streptococcus agalactiae. (Brochet M et al., J. Bact., 2008) Plásmidos inducibles por feromonas Las feromonas inducen el contacto íntimo entre las células, lo cual permite la posterior conjugación. PLÁSMIDOS INDUCIBLES POR FEROMONAS DE RELEVANCIA • La “sustancia de agregación” AS, que se encuentra codificada en los plásmidos inducibles por feromonas, incrementa considerablemente la adherencia e internalización enterocóccica en los macrófagos. • El plásmido pCF10 confiere resistencia a la tetraciclina. TRANSDUCCIÓN Identificada en 1951, por Lederberg y Zinder, trabajando en un modelo de Salmonella spp.. TRANSDUCCIÓN Bacteriófago T4 infectando a Escherichia coli. FENOTIPOS TRANSDUCCIÓN DEPENDIENTES DE RELEVANCIA Resistencia a la meticilina en S. aureus EJEMPLO DE LA THG Y EL PROCESO DE PATO-ADAPTACIÓN: MEJOR EJEMPLO DEL PROCESO PRESIÓN-SELECCIÓN-ADAPTACIÓN GENÓMICA Y FENOTÍPICA: LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS • Fenómeno reciente: 60 años • Extremadamente documentado • 80% de las resistencias debido a THG 90.000 muertes por año por Infección Intrahospitalaria 40.000 muertes por año por cáncer de Mamas 17.000 muertes por año por SIDA/HIV Datos de USA publicados por el Center for Disease Control “No es la más fuerte de las especies la que sobrevive, ni tampoco la más inteligente, sino aquella que responde más rápido al cambio” Charles Darwin GRACIAS!!!!!! MUCHAS GRACIAS!!!!!! [email protected]
