Ácido D-málico - R

Ácido D-málico
BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM
Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis
Método UV
Para la determinación de ácido D-málico en
alimentos y otros materiales
Para uso in vitro solamente
Cat. No. 11 215 558 035
Test-Combinado para 3 x 11
determinaciones
Principio (Ref. A1)
El ácido D-málico (D-malato) se oxida a oxalacetato por
nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD) en presencia de D-malato
deshidrogenasa (D-MDH). El oxalacetato es inmediatamente clivado
por la misma enzima a piruvato y dióxido de carbono.
D-Malato + NAD
+
⎯ -D-MDH-dcarb. → piruvato + CO2 + NADH + H
+
La cantidad de NADH formado es estequiométrica con la cantidad de
D-malato. El aumento en NADH se mide por medio de su
absorbancia a 334, 340 ó 365 nm.
El test combinado contiene
1. Botella 1 con aprox. 30 ml de solución de:
1
Buffer HEPES , pH aprox. 9.0
2. Botella 2 con aprox. 210 mg de NAD liofilizado.
3. Tres Botella 3 con D-MDH decarb., liofilizado, cada una aprox. 8 U
4. Botella 4 con solución de ácido D-málico para control del ensayo
(la medición de la solución control no es necesaria para el cálculo de
los resultados del ensayo). Utilice la solución control sin diluir (fecha
de vencimiento: ver etiqueta)
Preparación de las soluciones
1. Usar los contenidos de la Botella 1 sin diluir.
2. Disolver el contenido de la Botella 2 con 4 ml de agua destilada.
3. Disolver el contenido de una Botella 3 con 0.6 ml de agua
bidestilada.
Estabilidad de los reactivos
El contenido de la Botella 1 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta).
Llevar la Solución 1 a 20-25ºC antes de su uso.
El contenido de la Botella 2 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta).
La solución 2 es estable por 3 semanas a 2-8ºC, ó por 2 meses de
–15 a –20ºC.
El contenido de la Botella 3 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta).
La solución 3 3s estable por 5 días a 2-8ºC.
Procedimiento
2
Longitud de onda :
3
Cubeta de vidrio :
Temperatura:
Volumen final:
Leer contra aire
Soluc. de muestra:
340 nm, Hg 365 nm ó Hg 334 nm
1.00 cm de paso de luz
20-25ºC
2.950 ml
(sin cubeta en el paso de luz) ó contra
agua
4
1-50 ug de ácido D-málico/ensayo (en
0.100-1.800 ml de volumen de muestra)
Almacenar a 2-8° C
Esta traducción en español has sido realizada por R−Biopharm
Latinoamérica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el
procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no
pueden remplazar las instrucciones en inglés. Las instrucciones de
uso que son válidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemán y
en Inglés, dado que están escritas e impresas por el fabricante
(Roche). Refiérase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit.
Pipetear en la cubeta
solución 1
solución 2
sol. muestra*
agua bidestilada
Blanco
1.000 ml
Muestra
1.000 ml
0.100 ml
0.100 ml
-
0.100 ml
1.800 ml
1.700 ml
Mezclar **, leer las absorbancias de las soluciones (A1)
luego de aprox. 6 min. Iniciar la reacción con el agregado
de:
solución 3
0,050 ml
0,050 ml
Mezclar **, esperar a la finalización de la reacción (aprox. 20
min.) leer las absorbancias del blanco y de las muestras
(A2).
* Enjuagar el tip de la pipeta con solución de muestra antes de dispensar la solución de
muestra.
** Por ejemplo, con una espátula plástica ó por agitación después de cubrir la cubeta con
Parafilm (marca registrada de la American Can Company, Greenwich, Ct., USA).
Determinar la diferencia de absorbancias (A2 – A1) para el blanco y
las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancia del blanco de la
diferencia de absorbancia de la muestra correspondiente.
∆A = (A2 – A1)muestra - (A2 – A1)blanco
Las diferencias en las medidas de absorbancia debe, como regla,
ser al menos de 0.100 unidades de absorbancia para obtener
suficiente precisión en los resultados (ver “Instrucciones para el
rendimiento del ensayo” y “Sensibilidad y límite de detección”, punto
4).
Cálculos
De acuerdo a la ecuación general del cálculo de las concentraciones:
V x MW
c = --------------------------- x ∆A (g/l)
ε x d x v x 1000
V
v
MW
d
ε
= volumen final (ml)
= volumen de muestra (ml)
= peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol)
= paso de luz (cm)
= coeficiente de extinción del NADH a:
-1
-1
340 nm = 6.3 (l x mmol x cm )
-1
-1
Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol x cm )
-1
-1
Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol x cm )
Corresponde para ácido D-málico:
2.950 × 134.09
3.956
c = ----------------------------- x ∆A = ---------- x ∆A (g D-málico /l sol. de
ε x 1.00 x 0.100 x 1000
ε
muestra)
Si la muestra se ha diluido durante la preparación, los resultados
deben multiplicarse por el factor de dilución F.
1
HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico
La absorción máxima de NADH es a 340 nm. En espectrofotómetros las mediciones se
toman a la máxima absorción, si se utilizan fotómetros espectrales equipados con lámpara
de vapor de mercurio, las mediciones se toman a 365 nm ó 334 nm.
3
Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de cubetas de vidrio.
4
Ver instrucciones para el rendimiento del kit
2
Cuando se analizan muestras sólidas ó semisólidas que se pesan
para la preparación de la muestra, los resultados se calculan a partir
de la cantidad pesadas:
c D-málico (g/l de sol.)
Contenido D-málico = ---------------------------------------- x 100 (g / 100g)
peso muestra en g/l sol.
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1. Instrucciones para el funcionamiento del ensayo
La cantidad de ácido D-málico presente en el ensayo debe ser entre
2 ug y 50 ug (medidos a 365 nm) ó 1 ug y 30 ug (medidos a 340, 334
nm) respectivamente. Para obtener una diferencia de absorbancias
suficiente, la solución de muestra debe diluirse para dar una
concentración de ácido D-málico entre 0.1 y 0.5 g/l ó 0.06 y 0.3 g/l
respectivamente.
Vino:
r ~ 5%, corresponde a r = 0.05 × xi
R ~ 10%, corresponde a R = 0.10 × xi
xi = contenido de ácido D-málico en g/l
r = 0.05 × xi
R = 0.1 × xi
xi = contenido de ácido D-málico en g/l
Tabla de dilución
7. Interferencias / fuentes de error
Los taninos contenidos en la muestra pueden generar una pequeña
inhibición del ensayo:
La presencia de 50 ug de pirogalol retarda la conversión de ácido Dmálico por aprox. 5 min.
Aparece una reacción “creep” con colorantes vegetales. Utilizar un
blanco de muestra si es necesario: el blanco contiene todos los
componentes del ensayo menos la enzima iniciadora; la absorbancia
del blanco, la muestra y el blanco de muestra deben medirse
inmediatamente una tras la otra y se utilizan para el cálculo de las
diferencias de absorbancia:
∆A = (A2-A1)muestra – (A2-A1)blanco de reactivo – (A2-A1)blanco de muestra
También aparece una reacción “creep” de 0.5 mA/min con 2oxoglutarato a una concentración de 100 ug/ensayo.
También se reconoce inhibición con iones plomo, 0.1 ug/ensayo:
luego de 20 min bajo las condiciones del ensayo, se encuentra
aprox. 80% del ácido D-málico.
Cantidad estimada de ácido D- Dilución con
málico por litro
agua
medido a
340 ó 334 nm
365 nm
< 0.3 g
< 0.5 g
0.3-3.0 g
0.5-5.0 g
3.0-30.0 g
5.0-50 g
> 30g
>50g
1+9
1 + 99
1 + 999
Dilución
factor F
1
10
100
1000
Si la diferencia de absorbancia medida (∆A) es muy baja (ej. 0.100),
la solución de muestra debe prepararse nuevamente (pesar mas
muestra ó diluir menos) ó el volumen de muestra que se pipetea en
la cubeta se puede aumentar hasta 1.800 ml. El volumen de agua
agregado debe, en dicho caso, reducirse para obtener el mismo
volumen final en el ensayo para muestra y blanco. El nuevo volumen
de muestra v debe tomarse en cuenta en los cálculos.
2. Información técnica
2.1 Para el caso de análisis de ácido D-málico en niveles de trazas,
todos los reactivos utilizados para la preparación de muestra deben
estar absolutamente libres de ácido D-málico.
2.2. Al hacer los cálculos, debe indicarse claramente si los
resultados se van a expresar como ácido D-málico (masa molar
134.09 g/mol) ó como D-malato (masa molar 132.07 g/mol). (en las
mediciones enzimáticas, también se mide el ión D-malato).
3. Especificidad Ref. 1)
El ácido D-málico reacciona muy rápido. Una actividad secundaria
de la enzima es su reacción, a baja velocidad, con ácido L-tartárico.
A concentraciones iguales de ácido L-tartárico y D-málico, aparece
una leve reacción “creep” que puede eliminarse por extrapolación. A
altas concentraciones de ácido L-tartárico, proceder como se
describe para la determinación de ácido D-málico en vino y jugo de
uva.
Nota:
El ácido D-málico comercial contiene aprox. 1-4% de ácido L-málico
(Ref. 1)
4. Sensibilidad y límite de detección (Ref. 1.2)
La mínima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de
0.005 unidades de absorbancia. Este valor corresponde a una
concentración de ácido D-málico de 0.2 mg/l de solución de muestra
con un volumen máximo de muestra v = 1.800 ml y medición a
340 nm (si se utiliza un v = 0.100 ml, esto corresponde a 3 mg/l por
litro de solución de muestra).
El límite de detección de 0.35 mg/l deriva de la diferencia de
absorbancia de 0.010 (medida a 340 nm) y un máximo de volumen
de muestra de v = 1.800 ml.
5. Linealidad
La linealidad de la determinación es desde aproximadamente 1 ug
de ácido D-málico /ensayo (0.35 mg ácido L-málico /l de solución de
muestra, volumen de muestra v = 1.800 ml) hasta 50 ug de ácido Lmálico /ensayo (0.5 g de ácido L-málico /l de solución de muestra,
volumen de muestra v = 0.100 ml).
6. Precisión
En una determinación de ácido L-málico por duplicado utilizando una
única solución de muestra, pueden obtenerse diferencias de 0.005 a
0.010 unidades de absorbancia. Con un volumen de muestra de v =
0.100 ml y medido a 340 nm, esto corresponde a una concentración
aproximada de ácido D-málico de 3-6 mg/l. (Si la muestra se diluye
durante la preparación, el resultado debe multiplicarse por el factor
de dilución F. Si la muestra se pesa durante la preparación, ej. usar
1 g de muestra /100 ml = 10 g/l, se puede esperar una diferencia de
0.03-0.06 g/100 g).
En la literatura se han publicado los siguientes datos:
x = 31.3 uM Sol. muestra ∆E339 nm = 0.199 CV = 1.01 % n = 10
x = 61.7 uM Sol. muestra ∆E339 nm = 0.387 CV = 0.83 % n = 10
x = 125.4 uM Sol. muestra ∆E339 nm = 0.791 CV = 0.79 % n = 10
(Ref. 1)
(Ref. 2.1)
(Ref. 2.2)
8. Reconociendo interferencias durante el desarrollo del ensayo
8.1 Si la conversión de ácido D-málico se completa de acuerdo al
tiempo estipulado en “Procedimiento”, se puede concluir,
generalmente, que no han ocurrido interferencias.
8.2 Al finalizar la reacción, la determinación puede reiniciarse
agregando ácido D-málico (cualitativa ó cuantitativamente): si la
absorbancia se altera subsecuentemente a la adición del material
estándar, es también indicio que no han ocurrido interferencias.
8.3 Se pueden reconocer errores de operatividad ó interferencia de
la determinación por la presencia de sustancias presentes en la
muestra realizando una doble determinación utilizando dos
volúmenes diferentes (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las diferencias
medidas de absorbancia deben ser proporcionales a los volúmenes
de muestra utilizados.
Cuando se analizan muestras sólidas, se recomienda pesar
diferentes cantidades (ej. 1 g y 2 g) en recipientes de 100 ml. Las
diferencias medidas de las absorbancias y los pesos de las muestras
utilizados deben ser proporcionales para volúmenes idénticos de
muestra.
8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias en la muestra
causadas por sustancias contenidas en ella utilizando estándares
internos como control: además de la determinación de la muestra,
blanco y estándar, se debe llevar a cabo una determinación con
muestra y solución control del ensayo en la misma largada. La
recuperación debe luego calcularse a partir de las diferencias de
absorbancias medidas.
8.5 Se pueden reconocer posibles pérdidas durante la determinación
llevando a cabo ensayos de recuperación: la muestra debe
prepararse y analizarse con y sin el material estándar. La cantidad
adicionada debe recuperarse cuantitativamente con el mismo rango
de error que el método.
9. Riesgo de los reactivos
Los reactivos utilizados en la determinación de ácido D-málico no
son materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de
Sustancias Peligrosas, las Leyes Químicas ó la Regulación
67/548/EEC de la CEE y subsecuentes Guías de alteraciones,
suplementos y adaptaciones. Aún así, deben cumplirse todas las
medidas de seguridad generales que se aplican a todas las
sustancias químicas.
Luego de su utilización, los reactivos deben desecharse con el
descarte del laboratorio, pero deber observarse siempre las
regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en
recipientes destinados al reciclado.
10. Información general sobre la preparación de muestra
Al llevar a cabo el ensayo:
Usar muestras líquidas límpidas, incoloras y prácticamente
neutras directamente ó luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de
dilución, y usar un volumen hasta 1.800 ml.
Filtrar soluciones turbias;
Desgasear muestras que contengan dióxido de carbono (ej. por
filtración);
Ajustar muestras ácidas a un pH aproximado de 8-9 por el
agregado de una solución de hidróxido de sodio ó de potasio
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Ajustar muestras ácidas y poco coloreadas a pH aprox. 8-9 por el
agregado de una solución de hidróxido de sodio ó potasio e
incubación por aprox. 30 min;
Medir la muestras “coloreadas” (si es necesario ajustar el pH a 89) contra blanco de muestra (= buffer ó agua destilada + muestra),
ajustar el fotómetro a 0.000 con el blanco en el haz de luz;
Tratar las muestras “altamente coloreadas” que se usan sin diluir
ó en grandes volúmenes con carbón activado, ej. 6 g/100 ml ó con
polivinilpolipirrolidona (PVPP, ej. 8-20 g/100ml);
Muela ú homogeneice las muestras sólidas ó semisólidas, extraer
con agua ó disolver en agua y filtrar si es necesario.
11. Ejemplos de aplicación
Determinación de ácido D-málico en jugos de fruta (Ref. 3.1)
a) Jugos incoloros ó ligeramente coloreados (jugos cítricos, de pera,
piña, durazno, manzana):
Ajustar 25 ml de jugo de fruta a pH 7-8 con KOH (2 M) y llevar a 50
ml con agua bidestilada. Agregar 3 g de carbón activado ó 4 g de
PVPP, mezclar, agitar por 2 min y filtrar. Utilizar de 1.000 a 1.800 ml
del filtrado para la determinación.
b) Jugos intensamente coloreados (cereza, grosella negra y blanca):
Ajustar 25 ml de jugo de fruta a pH 7-8 con KOH (2 M) y llevar a 50
ml con agua bidestilada. Agregar 3 g de carbón activado ó 4 g de
PVPP, mezclar, agitar por 2 min y filtrar. Utilizar de 0.100 a 0.200 ml
del filtrado para la determinación.
c) Jugo de uva blanca:
Agregar 250 mg de hidróxido de calcio y 10 ml de etanol (aprox.
98%) a 50 ml de jugo de fruta y agitar por 2 min. Ajustar el pH a 7-8
con HCl (2 M). Transferir el líquido cuantitativamente en un
recipiente volumétrico de 100 ml, llevar a volumen con agua, mezclar
y filtrar. Utilizar de 0.500 a 1.500 ml del filtrado para la
determinación.
d) Jugo de uva negra:
Agregar 250 mg de hidróxido de calcio y 10 ml de etanol (aprox.
98%) a 50 ml de jugo de fruta y agitar por 2 min. Ajustar el pH a 7-8
con HCl (2 M). Transferir el líquido cuantitativamente a un recipiente
volumétrico de 100 ml, llevar a volumen con agua bidestilada,
mezclar y filtrar. Agregar 3 g de carbón activado, agitar por 2 min y
filtrar nuevamente. Utilizar de 0.100 a 0.200 ml del filtrado para la
determinación.
agua bidestilada hirviendo. Hervir por 10 min y dejar enfriar a 2025ºC. Ajustar el pH a 7-8 con solución de hidróxido de potasio (1 M).
Transferir el contenido del recipiente cuantitativamente a un
recipiente volumétrico de 100 ml y llevar a volumen con agua
bidestilada. Mezclar la solución y filtrar utilizando papel de filtro
plegado. Agregar 0.6 g de carbón activado a 10 ml del filtrado, agitar
por 2 min y filtrar utilizando un papel de filtro plegado. Utilizar un
volumen v = 0.500 ml del filtrado claro para el ensayo.
12. Otras aplicaciones
El método también puede utilizarse para investigación cuando se
analizan muestras biológicas. Para detalles de muestreo, tratamiento
y estabilidad de la muestra, ver Gutmann, I. & Wahlefeld, A. W.
(1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd
ed., vol. 3, pp. 1586-1587, Verlag Chemie, Weinheim/Academic
Press, Inc., New York and London, así como Ref. 1.2, pp. 43-44
References
1. Beutler, H.-O. & Wurst, B. (1990) A New Method for the Enzymatic Determination of
DMalic Acid in Foodstuffs, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 86, 341-344 und 386-389
2.1 Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts, Complément no
1 à l'édition officielle de juin 1990, OFFICE INTERNATIONAL DE LA VIGNE ET DU VIN,
Annexe A, S. 1-3
2.2 Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 272 (3. Oktober 1990)
Rechtsvorschriften: Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 der Kommission vom 17. September
1990 zur Festlegung gemeinsamer Analysenmethoden für den Weinsektor (S. 106-108)
Official Journal of the European Communities L 272 (3 October 1990), Commission
Regulation (EEC) No 2676/90 of 17 September 1990 determining Community methods for
the analysis of wines (pp. 106-108) ; L 99 (14. April 1999) Commission Regulation (EU) No
761/ 1999 of 12 April 1999 for the change of the Commision Regulation (EEC) No 2676/90
determining Community methods for the analysis of wines
2.3 Europäische Norm/European Standard EN 12138 (Dez. 1997) Frucht- und
Gemüsesäfte: Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an D-Äpfelsäure –
Spektralphotometrische Bestimmung von NAD (Fruit and vegetable juices - Enzymatic
determination of D-malic acid content - NAD spectrometric method)
2.4 Deutsche Norm DIN EN 12138 (1997) Frucht- und Gemüsesäfte, Teil 13: Enzymatische
Bestimmung des Gehaltes an D-Äpfelsäure; Spektralphotometrische Bestimmung von NAD
2.5 International Federation of Fruit Juice Producers (IFU, Methods of Analysis, no. 641995); contained in "Code of Practice for Evaluation of Fruit and Vegetable Juices" (1996)
edited by Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of
the European Economic Community (A.I.J.N.)
3.1 Beutler, H.-O. & Ara, V. (1992) Enzymatische Bestimmung von D-Äpfelsäure in
Fruchtsäften, Flüssiges Obst 59, 552-554; Enzymatic Determination of D-Malic Acid in Fruit
Juices, Fruit Processing 2, 140-141
3.2 Hunger, Ch., Schuch, R. & Hörtner, H., Bundesanstalt für Lebensmitteluntersuchung und
-forschung, Wien (1995) Enzymatic Determination of D-Malic Acid in Wine and Fruit Juices,
in Current Status and Future Trends in Analytical Food Chemistry, Proceedings of the Eight
European Conference on Food Chemistry (EURO FOOD CHEM VIII), Vol. 3, 715-718
Determinación de ácido D-málico en vino (según Beutler, Ref. 1.)
Mezclar 25 ml de vino, 125 mg de hidróxido de calcio y 5 ml de
etanol (aprox. 98%) por 2 min, ajustar el pH a 7-8 con solución de
hidróxido de potasio; transferir cuantitativamente a un recipiente
volumétrico de 50 ml y llevar a volumen con agua bidestilada. Filtrar
y utilizar la solución clara incolora con un volumen de v = 1.0001.800 ml para el ensayo.
Los filtrados altamente coloreados ó aquellos que presentan
reacciones “creep” deben decolorarse y tratarse como sigue:
Mezclar 10 ml del filtrado con 2 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP)
húmeda, agitar por 2 min y filtrar utilizando papel de filtro plegado.
Utilizar el filtrado con un volumen v = 1.000 – 1.800 ml para el
ensayo. Si la reacción no se detiene (ej. en el análisis de vino) luego
de 20 min, leer la absorbancia a intervalos de 2 min hasta que el
aumento de la absorbancia sea constante durante 2 min.
Determinación de ácido D-málico en vino y jugo de fruta (según
Hunger y Col., Ref. 3.2)
Pesar 2.5 g de cloruro de potasio (sólido) en un recipiente
volumétrico de 50 ml, agregar 25 ml de vino ó jugo de uva y disolver
el cloruro de potasio por agitación vigorosa del recipiente ó por
agitación magnética. Agregar 0.5 ml de ácido acético glaciar,
mezclar, llevar a volumen con porciones de etanol (96% v/v).
Mezclar y almacenar el recipiente en refrigerador durante toda la
noche. Filtrar la solución, ajustar 20 ml del filtrado a pH 9 con KOH
(primero con KOH 2 M, luego con KOH 0.2 M hasta pH 9), transferir
a un recipiente volumétrico de 25 ml y llevar a volumen con agua
bidestilada. Para la decoloración agregar 0.5 g de carbón activado,
mezclar y filtrar a través de filtro de 0.2 um. Utilizar el filtrado para la
determinación (La adición de carbón activado también se
recomienda para el análisis de vino blanco).
Nota:
Las muestras que no contengan ácido L-tartárico se preparan como
sigue: Ajustar 20 ml de muestra a pH – con KOH, transferir a un
recipiente volumétrico de 25 ml y llevar a volumen con agua
bidestilada. Para la decoloración, agregar 0.5 g de carbón activado,
mezclar y filtrar a través de filtro de 0.2 um. Utilizar el filtrado para la
determinación.
Determinación de ácido D-málico en manzanas
Moler y homogeneizar las manzanas. Pesar aprox. 40 g del material
de muestra en un recipiente de 100 ml y agregar aprox. 20 ml de
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Solución control de ácido D-málico (Botella 4)
Concentración: ver etiqueta de la botella
La Solución control de ácido D-málico es una solución acuosa
estabilizada de ácido D-málico. Sirve como control del ensayo
enzimático para la determinación de ácido D-málico en alimentos y
otros materiales.
Aplicación:
1. Adición de la solución control de ácido D-málico a la mezcla de
reacción:
La solución control se utiliza en el ensayo en el lugar de la solución
de muestra.
2. Reiniciar la reacción, cuantitativamente:
Luego de finalizada la reacción con la solución de muestra y la
medición de A2, agregar 0.050 ml de solución control del ensayo a la
mezcla de reacción. Leer la absorbancia A3 luego de finalizada la
reacción (aprox. 20 min.). Calcular la concentración de la diferencia
(A3-A2) de acuerdo a la ecuación general para el cálculo de la
concentración. Debe tomarse en cuenta la variación en el volumen
total. Aunque hay una dilución de la mezcla de reacción por el
agregado de la solución control del ensayo, los resultados no difieren
significativamente de los datos estipulados en la etiqueta de la
botella.
3. Estándar interno:
La solución control del ensayo puede utilizarse como estándar
interno para controlar el correcto funcionamiento del ensayo (errores
groseros) y para ver si la solución de muestra está libre de
sustancias interferentes.
Pipetear dentro
Muestra +
de la cubeta
Blanco
Muestra
Estándar
estándar
Solución 1
1.000 ml
1.000 ml
1.000 ml
1.000 ml
Solución 2
0.100 ml
0.100 ml
0.100 ml
0.100 ml
Solución
0.100 ml
0.050 ml
muestra
0.100 ml
0.050 ml
Control ensayo
1.800 ml
1.700 ml
1.700 ml
1.700 ml
Agua destilada
Mezclar, leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de aprox.
6 min. Continuar como se describe el esquema de pipeteo bajo
“Procedimientos”. Seguir las instrucciones descriptas en
“Instrucciones para el desarrollo del ensayo” y en las notas al pie.
La recuperación del estándar se calcula de acuerdo a la siguiente
fórmula:
2 x ∆A muestra + estándar - ∆A muestra
Recuperación = ----------------------------------------------- x 100 (%)
∆A estándar
También disponible:
Test-Combinado ácido L-málico , Cat. Nro. 10 139 068 035
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