Síntesis por inducción y actividad antimicrobiana de bacteriocinas

Síntesis por inducción y actividad antimicrobiana de
bacteriocinas de B. thuringensis
Norma Margarita de la Fuente Salcidoa,c, Gabriela Morales Pérezb, Ma. Guadalupe
Alanís-Guzmánc, Rubén Salcedo Hernándezb y J. Eleazar Barboza Coronab*
([email protected]; [email protected]*)
Universidad Autónoma de Coahuila, Escuela de Ciencias Biológicas, Torreón, Coahuila; b
Universidad de Guanajuato, Instituto de Ciencias Agrícolas, Departamento de Ingeniería en
Alimentos; cUniversidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas,
a, b
Resumen
En este trabajo se encontró que las bacteriocinas (morricina 269, kurstacina 287, kenyacina
404, entomocina 420 y tolworthcina 524) producidas por cepas mexicanas de B. thuringiensis
tienen actividad contra diversas bacterias de importancia en alimentos tales como B. cereus,
Staphylococcus xylosus, Enterobacter cloacae y Vibrio cholerae, entre otras. Se demostró
que B. thuringiensis requiere o no estar en contacto con una bacteria indicadora para
incrementar la síntesis de bacteriocinas. Sin embargo, el estar en contacto con la bacteria
indicadora permite que se origine un aumento en la producción y una disminución en el
tiempo de producción máxima. También demostramos que la inducción en la síntesis de las
bacteriocinas es ocasionada por proteínas termoresistentes que pueden ser secretadas o
bien estar asociadas a la membrana de B. cereus.
Palabras clave: Bacilus thuringiensis, bacteriocina, co-cutivo, inducción
Abstract
In this work we found that bacteriocins (morricin 269, kurstacin 287, kenyacin 404, entomocin
420, tolworthcin 524) synthesized by Mexican strains of Bacillus thuringiensis had activity
against important food-borne pathogenic bacteria such as B. cereus, Listeria inoccua y
Staphylococcus xylosus, Enterobacter cloacae and Vibrio cholerae. Additionally, it was
demonstrated that B. thuringiensis strains either require or not require the presence of an
inducer bacterium to increase the bacteriocin synthesis. When B. thuringiensis cultures were
supplemented with B. cereus, there was an increment in the bacteriocin production and a
reduction of the time of maximal synthesis. Alternatively, we showed that bacteriocin
induction synthesis was stimulated by thermo resistant proteins that could be secreted or
being associate to the B. cereus membrane.
Key words: Bacillus thuringiensis, bacteriocin, co-culture, induction
Introducción
Las bacteriocinas representan el grupo más abundante de compuestos antimicrobianos
sintetizados facultativamente por las bacterias (Riley and Wertz 2002), son de naturaleza
proteica sintetizadas a nivel ribosómico y su actividad inhibitoria es efectiva contra especies
relacionadas. La importancia de las bacteriocinas está centrada en la acción antibacteriana
que ejercen contra microorganismos patógenos presentes en alimentos como por ejemplo
Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Yersinia enterocolítica, Staphylococus
aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus (Paik y col. 1997;
Escudero-Abarca and Sánchez Esquivel 2002; Simon y col. 2002; Matthewes 2004). Las
investigaciones sobre su actividad contra patógenos ha sugerido y demostrado con éxito su
aplicación, lo que ha enfatizado su gran potencial como conservadores naturales en
alimentos (Campos 2002; Chen y Hoover 2003, Schillinger y col. 1996) y al mismo tiempo
incrementado nuevas investigaciones científicas que aportan datos relevantes sobre su
biosíntesis,
modo de acción, producción, estabilidad y las aplicaciones específicas que
dependerán de su rango de acción y nivel de actividad (Oscáriz and Pisabarro 2001;
Alvarado y col. 2005). Este rango de acción puede ser muy diverso y particular para cada
bacteriocina. Se ha reportado que algunas tienen un espectro de actividad muy estrecho tal
como las lactococcinas A, B, y M que inhiben únicamente a Lactococcus (Ross y col 1999), o
muy amplio como en la nisina A y la mutacina B-Ny266 (Mota-Meira y col. 2000). Con
respecto al mecanismo biosintético de las bacteriocinas sabemos que es muy complejo y su
producción puede requerir o no la presencia de una cepa sensible que funciona como
inductor (Maldonado y col. 2004, Demain 1998). En investigaciones previas reportamos la
síntesis de cinco bacteriocinas por cepas mexicanas de Bacillus thuringiensis y su actividad
contra Bacillus cereus y otras bacterias gram positivas de importancia en alimentos
(Barboza-Corona y col. 2007), y con el propósito de ampliar el conocimiento específicamente
sobre su probable mecanismo biosintético y la relación con su espectro de actividad, en este
trabajo determinamos experimentalmente las condiciones óptimas que permiten incrementar
su producción a través de la coinducción y además, determinamos la actividad inhibitoria
contra diversas bacterias patógenas de importancia en alimentos y contra algunos hongos
previamente no reportados.
Materiales y Métodos.
Material Biológico y condiciones de cultivo
Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni (LBIT 269) B. thuringiensis subsp. kurstaki (LBT 287)
B. thuringiensis subsp. kenyae (LBIT 404), B. thuringiensis subsp. entomocidus (LBIT 420) y
B. thuringiensis subsp. tolworthi (LBIT 524) forman parte de la colección de cepas del
CINVESTAV, Irapuato, México, y fueron utilizadas para producir respectivamente la morricina
269, kurstacina 287, kenyacina 404, entomocina 420 y tolworthcina 524 (Barboza-Corona y
col 2007). Para la producción de bacteriocinas, las cepas se incubaron en caldo de soya
tripticasa (CST) siguiendo las condiciones reportadas en Barboza-Corona y col. 2007. La
cepa B. cereus 183 se utilizó como cepa indicadora en los ensayos de inducción y en la
determinación de actividad por fluorescencia (De la Fuente-Salcido y col. 2007). Para
corroborar la actividad y el peso molecular de las bacteriocinas las muestras fueron
separadas en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes y analizadas tal y
como se reportó previamente (Barboza-Corona y col. 2007). La actividad de las 5
bacteriocinas se ensayó contra la bacterias Pseudomona aeruginosa ATCC 27853,
Staphylococcus xylosus ATCC 700404, Staphylococcus aureus ssp aureus ATCC 25923,
Enterobacter cloacae ATCC 13047, Proteus vulgaris ATCC 13315, Listeria innocua, B.
cereus 183, Salmonella sp, Shigella flexneri, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
pneumaniae; además se probó contra los hongos Rhizophus sp, Trichoderma sp SD3,
Trichoderma sp SH1, Mucor rouxii y Fusarium oxisporum
Actividad antimicrobiana de las bacteriocinas contra patógenos en alimentos
Utilizamos el método modificado de difusión en pozos para establecer la actividad
antibacteriana de las bacteriocinas parcialmente purificadas contra las bacterias patógenas
en alimentos ya mencionadas. Las cepas se incubaron toda la noche a 37°C a 180 rpm en
caldo de cultivo específico para su desarrollo como CST, Caldo Luria (CL) o Caldo Nutritivo
(CN). 105 µl de este cultivo se mezcló por duplicado con agar para prueba de difusión en una
proporción por cada 15 ml de medio fundido y temperado, se dejó solidificar se formaron
pocillos de 0.8 cm de diámetro y se incubó por 2 hr a 37°C para eliminar humedad. Después
se depositó 100 µL de cada bacteriocina en cada pozo y se incubaron toda la noche a 4°C
para permitir la difusión la muestra, y se incubó por 24 hr a la temperatura óptima para cada
bacteria ensayada. Finalmente medimos el diámetro de los halos de inhibición. Para nuestros
propósitos definimos una unidad (U) de actividad es igual a 1mm2 de la zona de inhibición de
crecimiento de la bacteria indicadora (Delgado y col 2005; Barboza-Corona y col 2007).
Actividad contra diferentes hongos
La actividad antagonista contra Rizophus sp, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii,
Trichoderma sp SH1, Trichoderma sp SD3 se determinó en Agar de Papa y Dextrosa (PDA).
En cajas petri con PDA se hicieron pozos de 8 mm de diámetro y se dejan 2 horas a 37 °C
para eliminar la humedad. Después se deposita en el centro de cada caja un disco de 8 mm
de diámetro obtenido por horadación de un cultivo de cada hongo crecido por 5 a 7 días.
Finalmente se añade en cada pozo 100 µl de cada bacteriocina cruda y se incuban a 28°C
por 5-7 días, monitoreándose la inhibición del crecimiento o cambios morfológicos.
Determinación del número de células inductoras (B. cereus) necesarias para promover
la síntesis de bacteriocinas.
Para determinar el número de células requeridas para inducir la síntesis de las bacteriocinas
se co-cultivo una cantidad fija (10–8 cel ml-1) de cada cepa de B. thuringiensis con cantidades
ascendentes (103 a 107 cel ml-1) en CST, y los cultivos se incubaron a 28°C y 180 rpm por un
período de 8 horas, tomando alícuotas cada dos horas. Estas alícuotas se centrifugación a
4000 rpm, por 10 minuos a 4°C y en los sobrenadantes se determinó la actividad de las
bacteriocinas por el método fluorogénico (De la Fuente-Salcido y col, 2007).
Caracterización parcial del inductor de la síntesis de bacteriocinas
Para determinar si el inductor es un componente de excreción o interno producido por la
cepa indicadora, se cultivó B. cereus 183 en CST toda la noche a 28°C y 180 rpm, se
separaron las células del sobrenadante por centrifugación y filtración en membrana millipore
0.45 µl (Fisherbrand). Se realizaron cuatro ensayos en CST de la siguiente manera: en el
primer ensayo se inoculó 1% de B. thuringiensis, en el segundo 1% de B. thuringiensis y 5%
de de B. cereus 183, en el tercero 1% de B. thuringiensis más 50 µl de sobrenadante libre de
células de B. cereus 183, y en el cuarto 1% de B. thuringiensis más 50 µl de células
sometidas al calor (121°C/15 min). En todos los ensayos se tomaron muestras cada dos
horas por duplicado durante 8 horas, para determinar la actividad con el método fluorogénico
descrito anteriormente (De la Fuente-Salcido y col, 2007). Para estimar en el posible inductor
la susceptibilidad a enzimas proteolíticas, se inoculó B. cereus 183 en CST toda la noche a
28°C y 180 rpm, se centrifugó el cultivo y el paquete celular se resuspendió en buffer de
fosfatos 50 mM pH 7.0. 50 µl del sobrenadante libre de células se mezcló con la misma
cantidad de buffer de fosfatos 100 mM, pH 7.0 y 1 U ml-1 de proteasa K (Invitrogen). Además
50 µl de células de B. cereus calentada a 55°C por 10 minutos, agregándose la misma
cantidad de proteasa K. Se realizaron controles con la misma cantidad de sobrenadante libre
de células y céluas sin agregar proteinasa K. Las mezclas se incubaron a 37°C por una hora
y se calentaron a 100°C por 10 minutos para detener la reacción. Todas las cepas de B.
thuiringiensis se sembraron en 50 ml de CST adicionado con los 4 tratamientos descritos
anteriormente, se incubaron por 8 horas para finalmente determinar la actividad de las
bacteriocinas por el método fluorogénico.
Resultados y discusión.
Producción de las bacteriocinas
Para obtener las bacteriocinas para los ensayos antimicrobianos se cultivaron cepas de B.
thuiringiensis en CST por 24 horas y para la detección de actividad se utilizó B. cereus como
cepa indicadora. Se obtuvieron curvas de crecimiento y cinéticas muy similares a lo que
anteriomente habiamos reportado (Barboza-Corona, y col 2007). La máxima producción de
bacteriocinas se obtuvo a las ~24 horas para LBIT 269 y LBT 287 y a las 15 horas para LBIT
404, LBIT 420 y LBIT 524. A estos tiempos las bacteriocinas se concentraron y analizaron
por electroforesis (SDS-PAGE) para corroborar la actividad contra B. cereus, encontrando
como se esperaba, que cada cepa mexicana de B. thuringiensis produce una bacteriocina
activa de 10 KDa aproximadamente. Estas bacteriocinas se utilizaron en las pruebas contra
bacterias patógenas de alimentos y contra algunos hongos coleccionados en nuestro
laboratorio.
Actividad antimicrobiana
Para el espectro de la actividad antimicrobiana se probaron las bacteriocinas por el método
de difusión en pozos, mostrándo actividad contra diversas bacterias Gram-positivas como B.
cereus, Listeria inoccua y Staphylococcus xylosus, mostrando también efecto contra algunos
Gram-negativos
como
Enterobacter
cloacae,
Klebsiella
pneumoniae,
Pseudomona
aeruginosa y Vibrio cholerae. Resulta de interés la susceptibilidad de Streptococcus
pyogenes y Shigela flexneri a la morricina 269 y kurstacina 287, así como la inhibición del
crecimiento en Enterococcus faecium por la acción de la kenyacina 404, entomocina 420 y
tolworthcina 524. No se detectó actividad contra S. aureus, Streptococcus pneumoniae,
Proteus vulgaris y Salmonella sp. Cuando ensayamos la actividad de las bacteriocinas contra
hongos fitopatógenos, microparásitos y degradadores de alimentos, solo encontramos
inhibición de la esporulación en Trichoderma sp después de siete días de incubación a 28°C.
Producción de bacteriocinas y determinación de número de células inductoras
requeridas para promover la producción de bacteriocinas.
Al co-cultivar las cepas de B. thuiringiensis con B. cereus 183 (Barboza-Corona y col 2007)
se observó un incremento en la producción de bacteriocinas comparado con el control. La
máxima producción de morricina 269 y kurstacina 287 se obtuvo a las 6 y 4 hrs utilizando
respectivamente 1x106 y 1x103 células ml-1, y en la kenyacina, entomocina y tolworthcina fue
a las 8 horas utilizando 1x103 1x107 y 1x106 células ml-1de células inductoras. Con la
inducción se obtuvo un incremento de aproximadamente 42% en morricina 269 y 65% en
kurstacina 287, 68% en kenyacina, 90% en entomocina y 79% en tolworthcina (Figura 1),
comparada con las cepas sin inducir. Es interesante comentar que de manera rutinaria
cuando las cepas de B. thuiringiensis se usan para la producción de bacteriocinas, sin usar
una bacteria inductora se presenta una producción de bacteriocinas a un rango de ~170 a
~200 Unidades de fluorescencia (De la Fuente-Salcido y col, 2007) a las 15 o 24 horas
dependiendo de cada cepa. Estos valores son similares a los obtenidos cuando las cepas se
inducen con B. cereus, pero el tiempo de máxima producción se reduce a 4 o 8 horas.
% de inducción
80
60
40
20
0
Morricina 269
Kurstacina 287 Kenyacina 404 Entomocina 420 Tolworthcin 524
Figura 1 Inducción en la producción de bacteriocinas de diversas cepas de B. thuringiensis en
presencia de la cepa sensible B. cereus 183. Se observa incrementos de 65% en morricina 269, 65%
en kurstacina 287, 68% en kenyacina, 90% en entomocina y 79% en tolworthcina con respecto a las
mismas cepas sin inducir.
Caracterización parcial del inductor ( autoinductor) de la síntesis de bacteriocinas
Aunque las cepas mexicanas de B. thuiringiensis utilizadas en este estudio producen
bacteriocinas aun sin estar en contacto con la cepa susceptible (ver producción de
bacteriocinas), la síntesis puede ser inducida por células calentadas a 55°C o por
sobrenadantes libres de células (Figura 2). Tal como puede observarse en todos los casos la
inducción de las bacteriocinas es ocasionada tanto por las células como por el sobrenadante.
Cuando las células y el sobrenadante fueron tratadas con proteasa K se observó que tanto
para la kurstacina 269, kenyacina 404, entomocina 420 y tolworthcina 524 hubo un
decremento en la actividad comparada con muestras no tratadas con proteasa, lo cual indica
que B. cereus puede producir dos inductores de naturaleza proteíca, termoresistente, uno de
los cuales puede ser una proteína de secreción y el otro una proteína asociada a membrana.
Por otro lado, cuando a LBIT 269 se le adicionó sobrenadante de B. cereus tratado con
proteasa K hubo un decremento en la síntesis de la morricina 269 en comparación cuando al
sobrenadante no se le dio ningún tratamiento. Esto indica que la bacteria indicadora secreta
un inductor de naturaleza protéica. Resulta interesante que cuando esta bacteria (LBIT 269)
fue suplementada con células tratadas por calentamiento y tratadas con proteasa K, hubo un
incremento en la actividad con relación a células no tratadas. Este resultado implica que B.
cereus pudiera producir una proteína de membrana termoresistente, que al ser tratada con
proteasa libera un fragmento proteasa resistente que actúa como mejor inductor que cuando
la proteína está intacta.
SLC con Proteasa K
SLC sin Proteasa K
Células con Proteasa K
Células sin Proteasa K
300
280
260
240
% de inducción
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Morricin 269
Kurstacin 287
Kenyacin 404 Entomocin 420 Tolworthcin 524
Figura 2. Inducción en la producción de bacteriocinas de diversas cepas de B. thuringiensis
empleando células o proteínas de secreción (sobrenadantes) de B. cereus (bacteria inductora).
Rectángulos: negro, sobrenadante tratado con proteasa K; blanco, sobrenadante sin proteasa K; gris,
células calentadas a 55 C y tratadas con proteasa K; gris con rayas, células calentadas a 55°C sin
proteasa K.
Conclusión
Las bacteriocinas producidas por cepas mexicanas de B. thuringiensis tienen actividad
contra diversas bacterias patógenas de importancia en alimentos. Demostramos que las
cepas mexicanas de B. thuringiensis pueden o no requerir estar en contacto con una bacteria
indicadora para incrementar la síntesis de bacteriocinas. Sin embargo, al estar en contacto
permite que haya un aumento en la producción y una disminución en el tiempo de
producción máxima. También demostramos que la inducción en la síntesis de las
bacteriocinas es ocasionada por proteínas termoresistentes que pueden ser de secreción o
bien estar asociadas a la membrana de B. cereus.
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