Clase Exocitosis

Exocitosis, Endocitosis y
R i l d Vesicular
Reciclado
V i l
Exocitosis Æ Secreción
Exocitosis: proceso por el cual uno o más compuestos
sintetizados dentro de la célula y transportados en
vesículas son liberados o expuestos al medio
extracelular luego de la fusión de la membrana
vesicular con la pplasmática .
Endocitosis
Exocitosis
endosoma
Funciones de la exocitosis (constitutiva o activada por Ca2+)
™Excreción de un pproducto tóxico ((exocitosis lisosomal))
™Formación de una interfase de comunicación
y/o protección (glicocálix, proteínas matriz extracelular,
mucus))
™Reciclado de Proteínas de membrana (p
(por exocitosis))
™Secreción de sustancias mensajeras
j
al
medio extracelular (activada por calcio)
Exocitosis
Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas
por un paso irreversible (la fusión).
CONSTITUTIVA
NSF, SNAP
INESTABLE
Se libera en reposo
a baja [Ca2+]i
Sorensen, Pflugers Arch 448 2003.
Exocitosis
Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas
por un paso irreversible (la fusión).
DISPARADA
POR Ca2+
NSF, SNAP
ESTABLE
Velocidad baja en reposo
Y muy alta cuando ↑Ca2+
Sorensen, Pflugers Arch 448 2003.
EXOCITOSIS ASOCIADA SECRECION HORMONAL O DE
NEUROTRANSMISORES: DOS TIPOS DE VESÍCULAS
Las hormonas hidrofílicas son almacenadas en vesículas
Vesículas sinápticas
Pequeñas (40 nm) y claras
Sinapsis convencionales
Neurotransmisores clásicos
Vesículas Secretorias
grandes (200 nm) y densas al ME
células neurosecretoras
y ciertas terminales nerviosas
catecolaminas, neuropéptidos
Tipo de vesícula
100-200 nm
vesículas
í l secretorias
i
o gránulos densos
-
+
- +
+ - +
+ - +
Altas concentraciones
de proteína soluble muy
condensada
- +
50 nm
vesículas sinápticas
Bajas
j concentraciones
de proteína soluble
Ciclo de las vesículas sinápticas en terminales presinápticas
Ciclo de las vesículas secretorias en células endócrinas
Origen y reciclado vesicular
MODOS DE FUSION
Colapso completo vs. Kiss
Kiss-and-Run
and Run
K&R
C.C.
Colapso completo, Kiss-and-Run, Exocitosis Compuesta
Similitudes entre secreción de NTs desde terminal sináptica y
d hhormonas ddesde
de
d una célula
él l neuroendócrina
dó i
- Dependencia del calcio
- Mecanismo acoplado a cambios del potencial de membrana
- Maquinaria exocítica
COMPARTIDO CON PROCESOS
CONSTITUTIVOS
- Maquinaria
q
Endocítica
Diferencias entre secreción desde una célula
neuroendócrina
dó i y lla lib
liberación
ió de
d NTs
NT en
presinapsis.
- Polarización celular
Polarización en la distribución vesicular
Diferencias entre secreción desde una célula endocrina
(cromafín) y la liberación de NTs en presinapsis.
Presinapsis
Cromafín
Fuertemente polarizada
Prácticamente no polarizada
Vesículas muy localizadas
Distribución vesicular difusa
Generación
G
ió vesicular
i l a partir
ti de
d endosoma
d
de reciclado
G
Generación
ió vesicular
i l a partir
ti de
d Golgi
G l i
Vesículas sinápticas
Vesículas secretorias densas
Altoo acople
cop e con
co estímulo
es u o
Pools
oo s ves
vesiculares
cu es co
con acople
cop e variado
v do
Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular
Terminales Presinápticas
Célula Cromafín
Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular
PLACA
NEUROMUSCULAR
Liberación espontánea
minis
Liberación evocada
EPPs
Kat & Miledi
Katz
19
PLACA NEUROMUSCULAR
Liberación cuántica
QuickTime™ and a
TIFF (Uncompressed) decompressor
are needed to see this picture.
m = np
cuantos liberados = nro de cuantos liberables x probabilidad de liberación
20
Placa Neuromuscular
Vesiculas presinapticas
El Nro
N de
d cuantos
t liberados
lib d correlaciona
l i
con el numero de vesiculas fusionadas
.
4-AP: 4-aminopiridina
Heuser y col, 1979.
21
Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular
Técnica de patch clamp-whole cell para medición de
corrientes de Ca2+ y capacitancia
C=ε. A
d
Técnica de patch clamp-whole cell para medición de
corrientes
i
de
d Ca
C 2+ y capacitancia
i
i
ΔV
Diálisis
de Ca2+
Inducción de
Corriente de Ca2+
Augustine and Neher. 1992
Tren de estímulos en voltage clamp
Tenemos un claro acople de la exocitosis con la entrada de Ca2+
…además
además de la exocitosis clásica que “gasta”
gasta la
Vesícula tendríamos el mecanismo de Kiss and Run
Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular
Amperometría
p
Red
Ox + ne-
E = Eo – RT ln [Ox]
nF
[Red]
Aplicación de trenes de APs a frecuencia alta (fight or flight) y basal (breed and feed).
40 mV
80 mV
20 ms
Fulop, Radabaugh y Smith, 2005
Metodologías para el registro de la exocitosis vesicular
Utilización de fluoróforos e imaging: marcadores de fase fluida, de membrana y anticuerpos
(Sulforhodamine B)
A proposed mechanism for activitydependent differential transmitter
release in adrenal chromaffin cells..
Fulop, Radabaugh y Smith, 2005
Colapso completo, Kiss-and-Run, Exocitosis Compuesta
Cm
1 vesícula: 1-2 fF
0.1 fF
1 vesícula:
í l 0.1
0 1 fF
Proteínas de la maquinaria de fusión
La maquinaria de fusión es universal para exocitosis regulada y constitutiva
9SNAREs (soluble NSF attachment protein receptors): Sintaxina
y SNAP-25 (tSNARE) y sinaptobrevina o VAMP (vSNARE).
Membrana plasmática
vesícula
Utilización de capacitancia, amperometría y toxinas específicas
para el estudio de las proteínas involucradas en la exocitosis
Liberación de Ca por flash fotólisis
Cliva SNAP-25
Cliva SNAP-25
Xu, Binz, Niemann y Neher, 1998
Cliva Sintaxina+SNAP-25
Cliva Sinaptobrevina
Cliva Sinaptobrevina
Xu, Binz, Niemann y Neher, 1998
Fusión y ciclado de proteínas SNARE
A partir de experimentos de FRET, Lin y Scheller, 1997
Nterminal Æ Cterminal
Dependencia de la Exocitosis con el Ca2+
D
Dependencia
d i sigmoidea:
i
id implica
i li varios
i sitios
iti de
d unión
ió a Ca
C 2+.
(Kd ~ 20 μM)
((Kd ~ 100 μ
μM))
Si Ca2+ es el disparador
SENSOR de Ca2+
Clásico: sinaptotagmina
p
g
2+
C2A
une
3
Ca
2 dominios citosólicos
C2B une 2 Ca2+
En Rta a Ca:
une membranas (en ms)
une SNAREs
Bai y Chapman, 2004
Tokuoka y Goda, 2003
B i y Chapman,
Bai
Ch
2004
Pools vesiculares
organización espacial
¿organización espacial?
Pools vesiculares
Experimentos
p
flash pphotolysis
y + capacitancia
p
(UV)
Exocytotic
Burst
(2000-5000 vesículas)
Pool de
reserva
Intracelular
f [Ca]i
SRP (130)
RRP (170)
Fusión
us ó
(en respuesta a ↑Ca)
Fusión
(en respuesta a ↑Ca)
Extracelular
Una fracción de vesículas hacen “docking”
…… pero esta fraccíon es bastante mayor a RRP y SRP sumados.
Ashery y col, EMBO J 19:3586, 2000.
Pool de
reserva
UP (>400)
( 400)
(docking pero no priming)
Extracelular
SRP
Fusión
us ó
(en respuesta a ↑Ca)
RRP
Fusión
us ó
(en respuesta a ↑Ca)
Secuencia lineal de reacciones reversibles de maduración seguidas
por un paso irreversible
i
ibl (la
(l fusión).
f ió )
NSF, SNAP
ATP
Ca2+
C
ESTABLE
Velocidad baja en reposo
Y muy alta cuando ↑Ca2+
Sorensen, Pflugers Arch 448 2003.
Y de donde viene el calcio???
Dialisis
Augustine and Neher, 1992
Liberación de
Ca2+ desde el RE
10 s
Activación
de CCDV
Robinson y col, 1995
ENDOCITOSIS
Internalización de componentes de la membrana
plasmática, asociada a ligandos y fluído.
Saheki, De Camilli, 2012
Clasificación por Morfología
Clásica
80 nm
Cubierta
Electrodensa
Requiere clatrina,
Dinamina,AP2,
actina, etc
Endocitosis
Clásica (multiples
funciones
No Clásicas
60 nm – Flask-shape
l k h
Sin cubierta.
Requiere caveolin 1,
actina, dinamina
Estables
transcytosis
Estructuras
Tubulares (~500 nm)
Hasta 5 μm de diámetro
Sin cubierta
Glicolípidos
B-Shiga toxin (STB)
Sin cubierta.
cubierta
Independiente de actina
Internalizacion de
glicolípidos. Fase
fliuida
li
en la
l
Respuesta a pliegues
membrana
Incorporación de fase fluída.
FUNCIONES DE LA ENDOCITOSIS
Mantenimiento de la homeostasis de la membrana plasmática
- Superficie
- Proteínas (turnover) Æ via lisosomal
constitutiva
Incorporación
ió de
d nutrientes:
i
ej.
j transferrina
f i (mediada
( di d por receptor))
Regulación de receptores de membrana (internalización receptores)
Reciclado de p
pools vesiculares asociados a señalización
Fagocitosis
Pinocitosis (incorporación de fases líquidas)
señalización
Acoplada a exocitosis
regulada por Ca2+
Reciclado de vesículas sinápticas o secretorias
Endocitosis
Exocitosis
endosoma
Reciclado de vesículas sinápticas o secretorias
Endocitosis Clásica o Mediada por Clatrina
Freeze-fracture electron microscopic
(EM) images of frog neuromuscular
junctions
triskelion
ENDOCITOSIS
AP2
dinamina
Dinamina
El role de la endocitosis mediada por clatrina en el reciclado de vesículas sinapticas
se ha demostrado p
por diferentes estrategias
g experimentales.
p
(1) La inducción de un “burst” de exocitosis resulta en una acumulación transtoria
de vesículas cubiertas de clathrina. Microscopía electrónica (Heuser and Reese
1973; Gad et al. 1998).
(2) El bloqueo de la endocitosis mediada por clatrina resulta en el bloqueo del
reciclado de vesículas sinápticas. Electrofisiología, imaging con marcadores de
membrana (Shupliakov et al. 1997; Kim and Ryan 2009).
(3) Intervenciones que bloquean el reciclado de vesículas sinápticas provocan la
acumulación de vesículas cubiertas de clatrina. (Shupliakov et al. 1997;
Raimondi et al. 2011).
(4) Vesículas cubiertas de caltrina purificadas de cerebro presentaron como
principal ‘cargo’ a proteínas de las vesículas sinápticas (recicladas). (Maycox et
al. 1992; Blondeau et al. 2004)
Saheki, De Camilli, review 2012
Neuronas corticales en cultivo
cáliz de Held
synaptopHluorin: pHluorin + synaptobrevin
Nicholson-Tomishima and Ryan 2004
Lou et al. 2008
Células cromafines
La endocitosis dependiente de
clatrina es compensatoria
La endocitosis dependiente de clatrina
es dependiente de la entrada de Ca2+
Ca2+ - Calmodulina
Calcineurina
Dinamina-P
(y otras fosfinas)
Dinamina
Pi
Fisión
Ante la aplicación de un potencial de acción ….
Dynasore (inh. dinamina)
Exocitosis muy rápida.
Dinamina dependiente
Caltrina independiente
p
Kiss-and Run?
Chlorpromazine
(inhibidor clatrina)
2 fF
Suma de eventos individuales?
Colapso completo
< 20 ms
K&R
100-200 ms
Kiss and Run: Dinamina estabilizaría el poro.
poro Luego cortaría.
cortaría
estímulos breves
PA a baja frecuencia
estímulos más fuertes.
PA a alta frecuencia
estímulos muy fuertes.
¿suprafisiológicos?