Normas internacionalessobre métodos y sueros de referencia

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1998,17 (2), 542-549
Normas internacionales sobre métodos y sueros
de referencia para pruebas de diagnóstico por
detección de anticuerpos
P.F. W r i g h t
Canadian Food Inspection Agency, National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street,
Suite T2300, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canadá
Resumen
Las normas internacionales son necesarias para garantizar que las pruebas de
diagnóstico que aplican las distintas partes implicadas en una transacción
comercial cumplen unos requisitos mínimos de rendimiento diagnóstico. Las
pruebas empleadas para autorizar el traslado internacional de animales deben
ofrecer un margen holgado de confianza en que los animales que arrojan un
resultado negativo, y cuyo traslado por consiguiente se autoriza, estén
efectivamente libres de un determinado agente infeccioso. Sin la elaboración de
estándares internacionales para pruebas de diagnóstico es imposible alcanzar
un cierto nivel de armonización internacional. En lo que se refiere a métodos y
sueros, las normas sirven para establecer un marco de referencia a partir del cual
pueda inferirse el rendimiento diagnóstico que presenta una prueba concreta
realizada en un laboratorio determinado. Los ensayos estándar internacionales
sientan un patrón de rendimiento analítico y diagnóstico al que deberá ajustarse
cualquier nuevo reactivo o nueva metodología. Los sueros de referencia
internacionales, por su parte, constituyen sueros primarios de referencia, útiles a
un tiempo para calibrar ensayos y reactivos y como prototipo para preparar
sueros de referencia tanto nacionales como de trabajo. Para la mayoría de los
métodos de análisis serológico es preciso instituir tres sueros de referencia: uno
fuertemente positivo, uno débilmente positivo y uno negativo. Esos estándares se
utilizan como patrón para calibrar el intervalo de detección y la sensibilidad
analítica de la prueba en cuestión. Los ensayos así calibrados tenderán a
presentar una sensibilidad y una especificidad de diagnóstico que coincidan con
las del ensayo de referencia, lo que a su vez facilitará un mayor grado de
armonización internacional.
Palabras clave
Comercio internacional - Ensayo inmunoenzimático - Especificidad - Estándares de
referencia - Fijación del complemento - Inmunodifusión en gel de agar - Neutralización
viral - Sensibilidad - Técnicas serológicas.
Introducción
Uno de los principales cometidos de la Oficina Internacional
de Epizootias (OIE) es la armonización de las normas que
regulan el comercio de animales o productos de origen animal
entre sus Países Miembros. Las pruebas de diagnóstico
empleadas para autorizar el traslado internacional de animales
o productos de origen animal son parte integrante de esa
normativa. A efectos de comercio internacional, la OIE
reconoce dos categorías distintas de pruebas diagnósticas. En
la primera categoría figuran las pruebas «prescritas», cuya
aplicación previa al traslado internacional de animales es
exigida por el Código Zoosanitario Internacional de la OIE (5).
Sin embargo, en la actualidad no existen pruebas prescritas
para todas las enfermedades que figuran en las Listas A y B de
la OIE (5). Por tal motivo hay una segunda categoría, la de las
pruebas «de sustitución», que son adecuadas para
diagnosticar una enfermedad en ciertos contextos locales y
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pueden usarse, previo acuerdo bilateral entre las partes
implicadas, para la importación o exportación de animales.
Con independencia de la categoría de la que se trate, es
patente la necesidad de disponer de sueros y ensayos de
referencia internacional para las pruebas de diagnóstico. Este
artículo aborda algunos de los aspectos más importantes
relativos a la elaboración de esos estándares internacionales
para pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos
contra agentes infecciosos.
Rendimiento diagnóstico
Valor predictivo
Los estandares internacionales son necesarios para garantizar
que las pruebas de diagnóstico que aplican las partes
implicadas en una transacción comercial cumplen unos
requisitos mínimos de rendimiento diagnóstico. Las pruebas
empleadas para autorizar el traslado internacional de animales
deben ofrecer un margen holgado de confianza en la
probabilidad de que los animales que arrojan resultado
negativo, y cuyo traslado por consiguientes se autoriza, estén
efectivamente libres de un determinado agente infeccioso. Ese
margen de confianza es lo que suele conocerse como el «valor
predictivo» del resultado de una prueba. Aunque tanto los
resultados positivos como los negativos sean importantes, y
aunque ambos posean su propio valor predictivo, el de un
resultado negativo reviste una importancia capital para los
intercambios internacionales, pues representa la probabilidad
de que un animal que arroja un resultado negativo se
encuentre realmente libre de la infección.
Tres son los factores básicos que influyen sobre el valor
predictivo de una prueba, ya se trate de un diagnóstico
positivo o negativo:
a) la sensibilidad de diagnóstico,
b) la especificidad de diagnóstico,
c) la prevalencia de la enfermedad ( 1 , 9 ) .
La sensibilidad y la especificidad de diagnóstico son rasgos
característicos del ensayo. La prevalencia de la enfermedad
guarda obviamente relación con las circunstancias sanitarias
que reinan en el país exportador y rodean la aplicación de la
prueba.
Sensibilidad de diagnóstico
La sensibilidad de diagnóstico de una prueba equivale a la
proporción de animales a ciencia cierta infectados que arrojan
un resultado positivo, esto es, la proporción de resultados
verdaderos positivos. Los resultados negativos arrojados por
animales infectados se consideran falsos negativos. Para
estimar la sensibilidad de diagnóstico es necesario analizar el
mayor número posible de muestras, con objeto de obtener
una representación lo más amplia posible del espectro de
títulos de anticuerpos que se espera en una población
infectada (9). Habida cuenta de la gama infinita de títulos de
anticuerpos que pueden hallarse, resulta extremadamente
difícil realizar esta estimación con cierto margen de confianza.
Especificidad de diagnóstico
La especificidad de diagnóstico de una prueba se define como
la proporción de animales a ciencia cierta no infectados que
dan resultados negativos, esto es, la proporción de resultados
verdaderos negativos. Se considera falso positivo a todo
resultado positivo arrojado por un animal no infectado. Por
regla general, la estimación precisa de este parámetro exige el
análisis de miles de muestras procedentes de animales no
infectados (9). Los resultados falsos positivos suelen ser
infrecuentes e impredecibles, y pueden darse en proporciones
de uno o dos por cada mil muestras examinadas.
Conviene señalar que los valores predictivos, tanto los
positivos como los negativos, se calculan a partir de la
prevalencia de la enfermedad y de estimaciones de. la
sensibilidad y especificidad de diagnóstico. Los errores en
dichas estimaciones se acumulan pues en el cálculo del valor
predictivo, razón más que suficiente para realizar las
estimaciones de la manera más exacta posible.
La sensibilidad y especificidad de diagnóstico vienen influidas
a su vez por dos factores:
a) la sensibilidad analítica,
b) la especificidad analítica.
Ambos parámetros son inherentes al ensayo y dependen a su
vez de los reactivos que se elijan y del método analítico al que
se apliquen.
Sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica de una prueba serológica mide la
cantidad más pequeña de anticuerpos que puede detectarse
en una muestra de ensayo. «Anticuerpo» es un término
funcional, referido a toda inmunoglobulina inducida en
respuesta a la infección por un determinado agente patógeno
y capaz de reconocer a un antígeno presente en dicho agente o
derivado de él. En esta categoría se inscriben las
inmunoglobulinas de cualquier isotipo (por ejemplo, IgM,
lgG
lgG , IgA, etc.). No todos los isotipos se detectan
necesariamente con igual eficiencia. Ello dependerá del
método de prueba del que se trate. La sensibilidad analítica
suele calcularse determinando la dilución que corresponde al
punto final en las muestras examinadas. En otros casos se
infiere a partir del tiempo que media entre la infección y el
primer momento en que el anticuerpo es detectable.
lt
2
Especificidad analítica
La especificidad analítica de un ensayo serológico mide la
capacidad de la prueba para detectar
anticuerpos
especialmente significativos para el diagnóstico de la infección
en cuestión, esto es, la capacidad de la prueba para detectar
anticuerpos que identifiquen exclusivamente al agente
etiológico, y no otros anticuerpos cuya presencia pueda venir
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inducida por antigenos de otros microorganismos
(emparentados o no con el agente en cuestión) provistos de
reactividad cruzada. Existen diversas formas de influir en la
especificidad analítica de un ensayo. Los sistemas más
comúnmente utilizados consisten en: utilizar antígenos
formados por subunidades específicas; diseñar el ensayo de tal
manera que detecte isotipos de anticuerpos singularmente
específicos y significaüvos para el diagnóstico; o utilizar
anticuerpos monoclonales de gran especificidad en ensayos de
competición o bloqueo. La especificidad analítica se
determina analizando paneles de muestras procedentes de
animales infectados por un agente infeccioso del que se sabe
que expresa antígenos con reactividad cruzada.
Evidentemente, todos los parámetros hasta aquí descritos
están relacionados entre sí y dependen unos de otros. Todos
ellos influyen sobre el rendimiento diagnóstico total de una
prueba dada y, en última instancia, sobre la confianza que es
posible depositar en un resultado. Sin la elaboración de
normas que encuadren tanto los métodos de prueba como los
productos de referencia, nunca será posible alcanzar un cierto
nivel de armonización internacional. En lo que se refiere a
métodos y sueros, los estándares internacionales sirven para
establecer un marco de referencia a partir del cual pueda
inferirse el rendimiento diagnóstico que presenta una prueba
concreta realizada en un laboratorio determinado.
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Los estándares internacionales en ensayos son importantes en
este contexto porque ofrecen valores de referencia para la
sensibilidad y especificidad de diagnóstico y para la
preparación
y
caracterización de
sueros
estándar
internacionales. Algunas de las pruebas serológicas clásicas,
como las de fijación del complemento, aglutinación,
precipitación o neutralización viral, constituyen desde hace
décadas pruebas prescritas para el comercio. Con el paso de
los años, la obtención de reactivos más refinados y el progreso
de las técnicas de laboratorio sobre las que esas pruebas
reposan se han traducido en un incremento de su rendimiento
analítico y diagnóstico. Ahora bien, considerando los enormes
esfuerzos invertidos en el desarrollo de ensayos de fijación
primaria, especialmente en el ámbito de las técnicas
inmunoenzimáticas, es sorprendente el escaso número de
tales ensayos que constituyen pruebas prescritas para el
comercio internacional. Tal situación está sin embargo
cambiando hoy en día, gracias a la elaboración de normas
internacionales referidas concretamente a las mencionadas
técnicas inmunoenzimáticas y, de manera más general, a la
validación de todo tipo de ensayos (17). Estas son sólo dos de
las razones por las cuales la OIE ha creado una red de
Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores, dedicada
a concebir y estandarizar nuevos métodos de prueba y a
coordinar la validación de esos métodos a nivel internacional.
Documentación
Ensayos de referencia
Los métodos de diagnóstico por detección de anticuerpos que
se describen en el Manual of standards for diagnostic tests and
vaccines de la OIE (citado a continuación como el Manual de
la OIE) (8) y vienen definidos en él como pruebas prescritas
constituyen los estándares internacionales actualmente
vigentes. Las pruebas prescritas ofrecen un margen de
confianza aceptable en la probabilidad de que los animales
que arrojan un resultado negativo estén efectivamente libres
de un agente infeccioso concreto. Con fines comerciales
también se pueden utilizar, previo acuerdo bilateral entre las
partes implicadas, pruebas «de sustitución», aunque es
posible que estas pruebas no ofrezcan un margen de confianza
igual al de las pruebas prescritas, o que no hayan sido
validadas de manera tan rigurosa como lo exige la Comisión
de Normas de la OIE.
Decir que todas las pruebas prescritas ofrecen un mismo
margen de confianza seria exagerado, pues no todas ellas
presentan idéntico nivel de rendimiento analítico o
diagnóstico. No obstante, una prueba prescrita actualmente
aceptada como método de referencia constituye una
herramienta muy útil para el diagnóstico de una enfermedad
infecciosa. Pero es preciso recordar que hay muchas
enfermedades para las cuales no existe hoy por hoy ninguna
prueba prescrita, y que por consiguiente las pruebas de
diagnóstico no son el único elemento de decisión a la hora de
autorizar el traslado internacional de animales.
Un ensayo estándar internacional debe venir referenciado y/o
documentado de manera detallada y exhaustiva. Es preciso
describir con sumo detalle los reactivos biológicos, sobre todo
los aspectos relacionados con su composición, pureza,
actividad biológica y nivel de seguridad o inocuidad biológica.
Cuando los reactivos biológicos se hayan obtenido a partir de
cultivos o cepas de referencia, será necesario especificarlos.
Deben citarse todas las referencias pertinentes para la
preparación y estandarización de cualquier reactivo biológico.
Debe indicarse asimismo qué proveedores comerciales
proporcionan reactivos biológicos de calidad aceptable, y
detallar los protocolos de titulación necesarios para optimizar
la actividad de esos reactivos. Es preciso describir la pureza
química, formulación, pH y fuerza iónica de cualquier
reactivo químico o solución tampón, e indicar todos los
parámetros físicos de tiempo, temperatura, incubación, etc.,
que intervienen en el ensayo. También será objeto de
minuciosa descripción el instrumental y el material
desechable que deben utilizarse, sobre todo cuando su
sustitución pueda afectar el rendimiento del ensayo. No
faltarán tampoco orientaciones relativas a los procedimientos
de control interno de calidad, al cálculo de los resultados y a la
interpretación de los datos. Las descripciones de métodos de
referencia contenidas en los diversos capítulos del Manual de
la OIE cumplen en su mayoría todos estos requisitos.
Validación
También es preciso validar de forma adecuada los métodos de
referencia. Además de figurar en el Manual de la OIE (9), esta
cuestión está tratada con todo lujo de detalles en otro artículo
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de este número de la Revista científica y técnica (4), razón por
la cual no será discutida. No está de más recordar, sin
embargo, que la Comisión de Normas de la OIE exige la
validación exhaustiva de cualquier ensayo que se proponga
como prueba prescrita. Ello significa que hay que presentar
datos sobre la sensibilidad y especificidad analíticas del
método en cuestión, así como estimaciones de su sensibilidad
y especificidad de diagnóstico, obtenidas a partir de
experimentos sobre el terreno con un sólido fundamento
estadístico. También deben presentarse datos sobre la
repetibilidad del ensayo, esto es, la concordancia de los
resultados obtenidos con réplicas de una única muestra tanto
en el curso de una misma serie como durante series distintas
del ensayo. Para
que
el método
sea
aceptado
intemacionalmente es preciso ofrecer datos sobre su
reproductibilidad, es decir, la capacidad del ensayo para
arrojar resultados coherentes cuando diferentes laboratorios
de varios países distintos lo aplican a alícuotas de una misma
muestra.
Nunca se insistirá demasiado en la importancia fundamental
de los ensayos de referencia. En todo lo que atañe a los
intercambios internacionales, el método estándar constituye el
patrón de rendimiento diagnóstico. Además, proporciona un
modelo de comparación a los laboratorios que preparan sus
propios reactivos y diseñan sus propios protocolos, y
establece los niveles mínimos aceptables de rendimiento
analítico y diagnóstico a los que es preciso atenerse a la hora
de concebir nuevas metodologías.
Sueros de referencia
Los sueros estándar internacionales son modelos originales de
referencia, necesarios para armonizar y estandarizar las
pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos
específicos de un agente infeccioso. Sirven a la vez como
productos de referencia para calibrar ensayos y reactivos y
como prototipos para preparar sueros estándar tanto
nacionales como de trabajo (2).
En el curso de una reunión de consultores auspiciada por la
División Mixta del Organismo Internacional de Energía
Atómica y la Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación (OIEA/FAO), celebrada en
enero de 1 9 9 2 en Viena, uno de los puntos tratados fue el de
los sueros de referencia internacionales para la detección de
anticuerpos mediante técnicas inmunoenzimáticas ( 1 7 ) .
Todas las opiniones coincidieron en señalar la necesidad de
definir tres sueros de referencia: uno fuertemente positivo,
uno débilmente positivo y uno negativo. Los sueros positivos
deben proceder de animales que exhiban una respuesta
humoral típica al microorganismo en cuestión. Los sueros
negativos deben tomarse de animales que jamás se hayan visto
expuestos al microorganismo ni hayan sido vacunados contra
él. Estos sueros de referencia no deben requerir ningún tipo
de dilución previa ni tratamiento especial por parte del
laboratorio receptor antes de su empleo en una prueba
inmunoenzimática. Al preparar los sueros de referencia
positivos, es aceptable efectuar una única dilución (en suero
de referencia negativo) de la reserva inicial de suero positivo,
con objeto de obtener una reactividad determinada que quede
dentro de los límites de detección del ensayo.
Los sueros de referencia se utilizarán para calibrar las técnicas
inmunoenzimáticas de la manera siguiente:
a) el suero de referencia fuertemente positivo se utilizará para
determinar el límite superior de detección exacta;
b) el suero de referencia débilmente positivo se utilizará para
determinar el límite inferior de detección exacta o la
sensibilidad analítica del ensayo;
c) el suero de referencia negativo, utilizado para preparar
diluciones de los sueros positivos, sirve además de referencia
o control paralelo de los sueros positivos.
A la hora de calibrar un ensayo, el uso de tres sueros de
referencia permite definir las características mínimas
aceptables de la relación dosis/respuesta y proporciona una
mayor confianza en que el ensayo exhiba niveles de
sensibilidad y especificidad de diagnóstico paralelos a los del
método de referencia con el que se caracterizaron
originalmente dichos sueros. Los ensayos que se calibran
frente a un único suero de referencia positivo no ofrecen el
mismo margen de confianza. En sus directrices para la
preparación de sueros de referencia internacionales (6), la
Comisión de Normas de la OIE adopta este criterio y
recomienda que se establezcan tres sueros de referencia para
todas las técnicas inmunoenzimáticas, y también para la
mayoría de las demás pruebas prescritas para el comercio.
Sueros de referencia para técnicas
inmunoenzimáticas
En la mayor parte de las aplicaciones diagnósticas de técnicas
inmunoenzimáticas, las muestras se analizan a dilución única
en lugar de utilizar bancos de diluciones. A dilución única, las
técnicas inmunoenzimáticas traducen la actividad de
anticuerpos de modo semicuantitativo. En pruebas
inmunoenzimáticas de competición o bloqueo, la actividad de
anticuerpos se expresa como el porcentaje de inhibición que
experimenta un anticuerpo competidor específico. Para
ensayos imunoenzimáticos (enzyme-linked
immunosorbent
assay: ELISA) indirectos, se ha propuesto expresar la actividad
de anticuerpos como porcentaje de positividad respecto al
suero de referencia positivo ( 1 7 ) . Ello sirve para unificar la
escala (de 0% a 100%) en la que se expresarán los datos, que
quedarán así normalizados
para
cualquier
ensayo
inmunoenzimático.
Utilizando la brucelosis bovina como ejemplo, se ha descrito
un modelo de trabajo para seleccionar y definir títulos de
anticuerpos estándar para el ELISA indirecto ( 1 8 ) . Se
selecciona un suero positivo tal que, tras preparar diluciones
de razón 2 en un suero negativo y someterlo al método ELISA
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estándar a la dilución normal de diagnóstico, arroje una curva
dosis/respuesta típica. Tras determinar la porción lineal de la
curva dosis/respuesta, se selecciona el suero de referencia
fuertemente positivo como aquella dilución que represente
títulos de anticuerpos intermedios entre el punto superior y el
punto central de la porción lineal de la curva. El suero de
referencia débilmente positivo, por su parte, corresponde a la
dilución que caiga a medio camino entre el punto central y el
inferior. Dado que ambos sueros de referencia positivos se
preparan en forma de diluciones en suero negativo, este
último se incluye como suero de referencia negativo. El suero
fuertemente positivo representa un 100% de positividad, y se
utiliza para normalizar el resto de datos brutos. El suero de
referencia débilmente positivo se emplea para definir la
sensibilidad analítica mínima de la prueba. La sensibilidad
analítica de un ELISA indirecto depende de diversas variables,
entre otras el antígeno, la antiglobulina y el marcador
enzimático que se elijan. Ahora bien, con independencia de
las variables de cualquier índole que puedan presentar este
tipo de ensayos, el suero de referencia débilmente positivo
debe arrojar un resultado inequívocamente positivo cuando se
analiza a su dilución especificada.
para detectar anticuerpos bovinos contra Brucella abortus, el
actual estándar internacional es el denominado Segundo
suero estándar internacional contra B. abortus (International
standard B. abortus serum, ISABS) (10). Al nivel de actividad
de anticuerpos de este suero, que exhibe una curva
dosis/respuesta típica, se le ha asignado un valor de 1.000
Unidades Internacionales de FC (UIFC) por ml. A una
dilución de 1/200, este suero se utiliza para titular la
concentración óptima de antígeno que debe usarse en la
prueba de FC. Haciendo tal cosa, se calibra también la
sensibilidad analítica de la prueba. En su forma no diluida, el
Segundo ISABS equivale al suero fuertemente positivo que se
recomienda para las pruebas inmunoenzimáticas. A una
dilución de 1/200, equivale al suero de referencia débilmente
positivo recomendado para dichas pruebas, con la salvedad
de que el usuario tiene que diluirlo en solución tampón en
lugar de suero negativo. El Segundo ISABS es también muy
importante a efectos de comercio internacional, dado que
permite normalizar los datos de cualquier prueba de FC en
forma de UIFC.
De forma análoga debe procederse a la hora de seleccionar y
definir anticuerpos de referencia para ensayos inmunoenzimáticos de competición o bloqueo. El factor crucial en
cualquier ensayo de ese tipo reside en el anticuerpo
competidor, que suele ser una preparación de anticuerpos
monoclonales. Cada una de estas preparaciones poseerá una
sensibilidad y una especificidad analíticas propias. Como en el
caso del ELISA indirecto, se selecciona un suero positivo tal
que, tras preparar diluciones de razón 2 en un suero negativo
y someterlo al método de prueba estándar a la dilución
normal de diagnóstico, arroje una curva dosis/respuesta
típica. Por regla general, las curvas dosis/respuesta de estos
ensayos tienden a mostrar una pendiente mucho más
pronunciada que las del ELISA indirecto, y la porción lineal
de la curva suele abarcar muy pocas diluciones. Se
recomienda (17) que el suero de referencia fuertemente
positivo represente la dilución más elevada capaz de inducir
reiterada e inequívocamente el máximo nivel de inhibición
(esto es, el 100%) del anticuerpo monoclonal competidor de
referencia. El suero de referencia débilmente positivo debe
corresponder a una dilución que induzca un nivel de
inhibición superior al 5 0 % e inferior al 1 0 0 % . Definir este
estándar resultará más o menos difícil en función del ensayo y
de la pendiente de la curva dosis/respuesta, aunque deberá
resultar inequívocamente positivo en cualquier circunstancia
y momento.
Los sueros de referencia para ensayos de precipitación, como
por ejemplo la inmunodifusión en gel de agar (IDGA), deben
inducir reacciones típicas cuando se someten no diluidos al
método de prueba de referencia. Como en el caso de las
técnicas inmunoenzimáticas, los sueros de referencia deben
incluir un suero fuertemente positivo, uno débilmente
positivo y uno negativo. Al reaccionar con una dilución
óptima de antígeno, el estándar fuertemente positivo debe
inducir la formación de una línea de precipitación nítida, que
constituirá el patrón con el que luego habrán de cotejarse las
líneas de precipitación resultantes de cualquier muestra de
ensayo. El suero de referencia débilmente positivo, por su
parte, debe inducir el nivel mínimo de reacción detectable por
el ensayo. Debe procurarse, siempre que sea posible, que el
suero débilmente positivo sea un suero no diluido. En su
defecto, dicho suero se preparará por predilución en el suero
de referencia negativo. El estándar débilmente positivo reviste
una importancia capital en las pruebas de IDGA, pues su
reactividad define la sensibilidad de diagnóstico del ensayo.
Sueros de referencia para técnicas de dilución
extrema
Para ensayos de dilución extrema como la prueba de
neutralización viral (NV) o la de fijación del complemento
(FC), un suero de referencia positivo debe deparar una curva
dosis/respuesta típica cuando para titularlo se utilice el
método de prueba estándar. En el caso de la prueba de FC
Sueros de referencia para técnicas de
precipitación
Para las pruebas de precipitación se utilizan subunidades
antigénicas solubles, que pueden contener más de un tipo de
antígeno en función del sistema utilizado para prepararlo y de
la pureza de la preparación. Valga como ejemplo el caso de la
leucosis bovina enzoótica (LBE) (3, 11): la prueba de IDGA
permite detectar fácilmente anticuerpos contra dos antígenos
solubles, las glicoproteínas gp-51 y p-24. Los anticuerpos
anti-gp51 suelen ser más precoces, persistentes y regulares. La
preparación antigénica que se utiliza en el ensayo estándar
contiene mayoritariamente gp-51, aunque también puede
contener p-24. Se emplean dos sueros de referencia. El suero
E l carece de un nivel suficiente de anticuerpos anti-p24 para
que puedan detectarse por el método IDGA de referencia. No
diluido, este suero estándar se utiliza para titular el antígeno y
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determinar su concentración óptima para la prueba de IDGA.
El suero E 4 , por su parte, contiene anticuerpos contra ambos
antígenos, y se emplea para calibrar la sensibilidad analitica de
la prueba. Llevado a una dilución 1/10 en suero negativo, el
suero E4 debe inducir una reacción inequívocamente positiva.
En el ejemplo de la LBE, los dos sueros de referencia positivos
se han preparado a partir de fuentes distintas. No diluido, el
suero E l equivale al estándar fuertemente positivo que se
recomienda para las técnicas inmunoenzimáticas. Diluido en
suero negativo, el suero E 4 equivale al suero estándar
débilmente positivo.
Definición de un suero «típico»
Las consideraciones anteriores sobre el calibrado de las
pruebas hacen frecuente alusión al concepto de «típico».
¿Qué es un suero típico? Los sueros de referencia deben ser
representativos de la mayor parte de muestras que habrán de
someterse de forma sistemática a un ensayo determinado. En
este sentido, y dada la existencia de una serie de variables que
dependen del animal huésped y que pueden influir sobre la
composición sérica normal o básica, los sueros deben ser
típicos en lo que concierne a su composición normal o básica
(8). Deben ser típicos también en lo que atañe a los isotipos, la
especificidad y el espectro de títulos de anticuerpos que cabe
esperar en el curso de un episodio infeccioso natural ( 1 4 ) .
Resulta difícil definir el término «típico». No todos los isotipos
de anticuerpo fijan el complemento, neutralizan virus,
aglutinan bacterias o precipitan antígenos solubles. En las
distintas fases de una infección, no todos los isotipos estarán
representados por un igual en términos de especificidad,
concentración o avidez. Lo importante es que los anticuerpos
significativos para el diagnóstico se hallen representados de
una forma que sea típica de la respuesta inmunitaria humoral
que elabora el huésped frente a la infección por un
microorganismo dado. Para ciertas aplicaciones puede ser
necesario
seleccionar estándares
séricos que
sean
representativos de las primeras fases de la infección. De todos
modos, habida cuenta de los requisitos de cuarentena y demás
factores atenuantes que figuran en los certificados
zoosanitarios de importación/exportación, es preferible
interpretar «típico» en el sentido de la respuesta media o
mediana a la infección (18). Cuando exista más de un posible
método de prueba, el hecho de que el suero candidato exhiba
una reactividad típica a los distintos métodos brindará una
mayor confianza en que dicho suero sea representativo del
curso natural de la infección. En ocasiones podrá ser necesario
infectar o inmunizar experimentalmente a los animales con
microorganismos inactivados. En tal caso, sin embargo, a la
hora de caracterizar la respuesta inmunitaria convendrá
ceñirse únicamente a los sueros que remeden el perfil de la
infección natural.
También los sueros de referencia negativos deben ser típicos
en lo que respecta a su composición sérica normal o básica.
Hay que cerciorarse de que dichos sueros no contienen
anticuerpos con reactividad cruzada frente al microorganismo
en cuestión, y de que su reactividad es la propia de una
reacción negativa al ensayo del que se trate.
Tanto el suero de referencia positivo como el negativo pueden
proceder de un solo animal o constituir una mezcla de sueros.
En este último caso, es preciso comprobar de antemano que
cada uno de los sueros que componen la mezcla exhibe una
curva típica, y hacer después otro tanto con la mezcla final
resultante.
A fin de evitar cualquier tipo de sesgo en la elección y
caracterización de los sueros de referencia, el laboratorio de
referencia debe enviar los sueros candidatos a diversos
laboratorios colaboradores para que éstos los sometan a
prueba. En el caso de los sueros de referencia internacionales,
dichos
establecimientos
colaboradores
deberán
ser
acreditados en sus respectivos países. Conviene que todos los
laboratorios utilicen, siempre que sea posible, un mismo
método de prueba estándar, o cuanto menos ensayos que
ofrezcan parecidos niveles de sensibilidad y especificidad de
diagnóstico. Además, todos ellos deben caracterizar los sueros
candidatos de igual manera, y proporcionar datos sobre la
repetibilidad. Ateniéndose a los resultados obtenidos por el
conjunto de laboratorios, el Laboratorio de referencia
(coordinador del estudio) deberá evaluar la reproductibilidad.
Cuando no exista un único ensayo estándar adoptado de
manera generalizada, puede ser necesario buscar un consenso
para instituir los sueros de referencia internacional. Tal ha
sido el caso de los sueros de referencia para las técnicas de
neutralización viral e inmunoenzimáticas utilizadas para el
diagnóstico serológico de la rinotraqueítis infecciosa bovina.
El Manual de la OIE (12) contiene las descripciones de
algunas de las modalidades de dichas técnicas, que además de
pruebas prescritas representan, por defecto, los métodos de
referencia. Sin embargo, diversos laboratorios de diagnóstico
vienen aplicando estas pruebas con modificaciones varias en
su práctica cotidiana. Un estudio a nivel europeo puso de
manifiesto notables diferencias en la sensibilidad analítica que
proporcionaban muchas de esas pruebas de detección de la
rinotraqueítis infecciosa bovina (15). Como consecuencia, se
realizó un proyecto encaminado a consensuar tres sueros de
referencia internacionales a partir de los resultados de diversos
laboratorios colaboradores, cada uno de los cuales utiliza su
propia versión modificada de la prueba estándar (16).
Seguridad y estabilidad
De acuerdo con las directrices elaboradas por la Comisión de
Normas de la OIE (6), es necesario preparar los sueros de
referencia internacionales de tal manera que queden exentos
de productos infecciosos. Se recomienda que los sueros
provengan de animales libres de patógenos específicos o,
cuando sea posible, de animales gnotobióticos. A la hora de
efectuar el traslado internacional de los sueros de referencia,
se aconseja irradiarlos con dosis de entre 25 y 3 0 kilogray (de
2,5 a 3,0 Mrad). Los sueros bovinos deben proceder de una
• fuente libre de encefalopatía espongiforme bovina. Para
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asegurar su estabilidad se recomienda liofilizarlos, e incluir un
diluyente estéril para la reconstitución. Después de la
liofilización será preciso reconstituir varios frascos de los
sueros estándar y evaluarlos de nuevo.
Sueros de referencia nacionales y de trabajo
Los sueros internacionales de referencia suelen prepararse en
forma de grandes lotes de pequeñas alícuotas (de 0,5 ml a
1 ml). Constituyen una mercancía valiosa, y como tal es
preciso considerarlos y tratarlos. No deben utilizarse más que
para ciertos fines específicos ( 1 3 ) . Como queda dicho, los
sueros de referencia internacionales han de servir para calibrar
métodos de prueba en el laboratorio nacional de referencia.
Hecho esto, se utilizarán los sueros de referencia a modo de
prototipos para la preparación y estandarización cruzada de
los sueros de referencia nacionales. La preparación de esos
sueros nacionales o secundarios es competencia de la
autoridad nacional correspondiente. Esos estándares se
utilizarán luego para calibrar ensayos en laboratorios
regionales, provinciales o estatales. El suero de referencia
nacional servirá para la estandarización cruzada de los sueros
terciarios o de trabajo, que luego servirán para la aplicación
cotidiana del ensayo en el laboratorio de diagnóstico.
También pueden utilizarse para elaborar curvas de referencia
o a modo de control interno de calidad.
Notas de información
Como lo recomiendan las directrices elaboradas por la
Comisión de Normas de la OIE (7), para facilitar la elección
y/o preparación de reactivos de referencia nacionales las notas
de información deben presentar los siguientes datos:
a) descripción del animal donante del suero positivo o
negativo, con indicación de su especie, edad, estado
reproductivo y origen (esto es, producción natural, libre de
agentes patógenos específicos, gnotobiótico, etc.);
b) carácter de la respuesta inmunitaria (inducida por
infección natural, infección experimental, inmunización,
etc.);
c) detalles sobre el microorganismo utilizado para inducir la
respuesta inmunitaria (origen, cepa, serotipo, etc.);
d) detalles sobre la infección experimental o los protocolos de
inmunización (vía de administración, dosis, sistemas de
inmunización, método y períodos de recolección de muestras,
etc.);
Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2)
e) ensayos de referencia utilizados para seleccionar los sueros
candidatos positivos y negativo y para caracterizar la respuesta
inmunitaria (ELISA, IDGA, NV, etc.);
f) muestra de las curvas de titulación de los sueros positivos y
criterios para la selección de diluciones adecuadas para un
determinado nivel de actividad;
g) eventual presencia de anticuerpos heterólogos, si se tiene
conocimiento de ello, y pruebas utilizadas para detectarlos;
h) descripción de los métodos de esterilización, incluido el
tipo y la dosis de irradiación y el estado de la muestra en el
momento de su esterilización (esto es, líquido, congelado,
liofilizado, etc.);
i) número de lote y fecha de preparación;
j) condiciones recomendadas
manipulación y conservación.
para
su
reconstitución,
Conclusión
Las normas internacionales para los métodos de ensayo y los
sueros de referencia son necesarias para garantizar la
conformidad de las pruebas de diagnóstico utilizadas por las
distintas partes implicadas en una transacción comercial con
unos requisitos mínimos de rendimiento de diagnóstico. Estos
métodos normalizados y sueros de referencia permiten
establecer un marco a partir del cual pueda inferirse el
rendimiento diagnóstico de una prueba concreta realizada en
un laboratorio determinado. Se describió en este artículo los
aspectos esenciales que se deben considerar a la hora de
elaborar, evaluar y documentar técnicamente los métodos de
ensayo normalizados y los sueros de referencia utilizados en
las pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos. Estas
consideraciones deberían conducir a mejorar la armonización
internacional de las pruebas de diagnóstico y a obtener
resultados más confiables en los diagnósticos realizados en el
ámbito de los intercambios internacionales.
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Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2)
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