Pruebas Bioquímicas

Pruebas Bioquímicas
Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son
empleadas principalmente la identificación y clasificación
de bacterias y hongos.
Pruebas Bioquímicas
E + S ↔ ES ↔ E + P
Se pueden resumir en los siguientes puntos:
•Sustrato (contenido en el medio de cultivo)
•Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del
microorganismo)
•Producto
•Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)
Los fundamentos completos de estas pruebas y demás información pueden
encontrarlos en el libro: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias
de importancia clínica de Jean F. MacFaddin, Editorial Médica Panamericana.
Hidrólisis del Almidón
Prueba negativa
Prueba positiva
El almidón es producido
principalmente por
plantas superiores, está
compuesto de amilosa y
amilopectina. Diversas
enzimas amilolíticas
hidrolizan almidón y sus
productos.
Agar Almidón
Sustrato: Almidón (polímero de glucosa).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Glucosa.
Revelador: Lugol.
El lugol con el almidón forman un complejo color café-púrpura
que desaparece cuando el almidón ha sido degradado.
Degradación de la caseína
Agar Leche Descremada
Sustrato: Caseína (proteína).
Enzima: Caseinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminoácidos.
Revelador: No requiere.
Prueba negativa
Prueba positiva
Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de
proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere el
color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el
color blanco alrededor del crecimiento microbiano.
Hidrólisis de la lecitina y
reducción del telurito
Agar yema de huevo/Agar Baird Parker
Sustrato: Lecitina.
Enzima: Lecitinasa.
Producto: Fosforilcolina.
Revelador: No requiere.
Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la
lecitina (fosfolípido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias
productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor.
El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y
cuantificación de estafilococos cuagulasa positivos, al que se
adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias
típicas de S. aureus son oscuras por la reducción del telurito,
además presentan el halo de hidrólisis de la lecitina.
Licuefacción de la gelatina
Gelatina Nutritiva
Sustrato: Gelatina (proteína).
Enzima: Gelatinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminoácidos.
Revelador: No requiere o puede
emplearse el carbón activado en
polvo.
Prueba negativa
Prueba positiva
La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de gelificar,
cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminoácidos que la
componen pierde su característica de gelificar. Se pueden
emplear varios medios que permiten la visualización
macroscópica como la gelatina adherida a carbón activado.
Fermentación de carbohidratos
Medio base rojo de fenol más
carbohidrato o polialcohol, con
campana de fermentación (Durham).
Sustrato: Carbohidrato o polialcohol.
Vía: Fermentativa.
Producto: Ácidos orgánicos.
Indicador: Cualquier indicador de pH.
Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG)
Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes)
deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados
en monómeros y transportados a la célula para posteriormente
en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía
fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto
orgánico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la
formación de gas capturado en la campana de fermentación.
Oxidación/Fermentación
Hugh and Leifson
Sustrato: Carbohidratos.
Vías: Fermentativa y/u Oxidativa.
Producto: Acido pirúvico.
Indicador: Azul de bromotimol u
otro indicador ácido/base.
Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos
metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la
necesidad de oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por
prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con
aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno.
La fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza las vías
de la Glucólisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas
fosfato y Entner-Doudoroff.
Oxidación/Fermentación
La oxidación de la glucosa
produce ácido pirúvico por una
vía de derivación (Shunt), ocurre
en condiciones aerobias y no
requiere de fosforilación inicial.
La producción de ácido se observa por el vire del indicador al
amarillo. En los tubos positivos puede haber generación de gas.
Reacción
Tubo con reacción positiva
Tubo abierto
Tubo sellado
Oxidación
Abierto
Amarillo (+)
Verde (-)
Fermentación
Sellado
Verde
Amarillo
Ni fermentación,
ni oxidación
Ninguno
Azul o verde
Verde
Fermentación y
oxidación
Ambos
Amarillo
Amarillo
Rojo de Metilo/Voges Proskauer
Caldo RM/VP
Sustrato: Glucosa.
Vías: Fermentación ácida o neutra.
Producto: Acido orgánicos o acetoína.
Reveladores: Solución de Rojo de Metilo,
Alfa Naftol y KOH 40%.
Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos
orgánicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del
medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo
(pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4
moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido láctico y dos
las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del
acetato pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 en
cantidades iguales.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer
Fermentación butilenglicólica: en ésta,
parte del piruvato se metaboliza
produciendo cantidades menores de
ácido láctico, fórmico y acético, la
mayor parte del piruvato se condensa
formando acetilmetilcarbinol, que es
reducido a 2,3-butilenglicol, productos
que son neutros.
Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba
de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de α-naftol al 5% en
etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le añade
(KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita
fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la parte
superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración).
Utilización de citrato
Prueba negativa
Prueba positiva
Medio de Citrato de Simmons
Sustrato: Citrato de sodio.
Vía: Varias dependientes del pH del
medio.
Producto: Acetato/formato en
condiciones alcalinas y Acetato,
CO2, lactato/Acetoína y CO2 en
condiciones ácidas.
Indicador: Azul de bromotimol.
Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única
fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del
medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de
nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
Agar hierro de Kligler
Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y
Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína.
Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato
reductasa y cisteína desulfurilasaProductos: Ácidos mixtos y H2S.
Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+ .
En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de
proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos
microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se
forma en condiciones ácidas y reacciona con el citrato de
amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de
sulfuro ferroso metálico.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
No fermentadores
No fermenta
pH = 7.4
O2
Péptidos Aminas
Pico de flauta
alcalino y fondo
alcalino
No fermentadores de lactosa
Glucosa
O2
Ácidos Mixtos
Péptidos Aminas
Glucosa
O2
Ácidos Mixtos
Péptidos Aminas
Reacción inicial:
Pico de flauta
ácido y fondo
ácido
Reacción final:
Pico de flauta
alcalino y
fondo ácido
Fermentadores de lactosa
Glucosa +
Lactosa
Ácidos Mixtos
O2
Péptidos Aminas
Pico de flauta
ácido y fondo
ácido
•Las bacterias incapaces de
fermentar utilizan las peptonas y
liberan aminas que alcalinizan todo el
medio.
•Las bacterias que solo fermentan la
glucosa, inicialmente también utilizan
aeróbicamente la glucosa. Debido a
la baja concentración de glucosa
(0.1%), metabolizan las peptonas
alcalinizando la superficie del medio.
•Las bacterias fermentadoras de
glucosa y lactosa, fermentan la
glucosa 0.1% y al término de esta,
fermentan la lactosa 1%, permitiendo
la acidificación completa del medio.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
El medio de Kligler está
diseñado para la
identificación de
enterobacterias y otras
bacterias Gram negativas.
•Interpretación:
Tubo
C
1
2
3
4
4A
5
Fermentación de Glucosa
-
-
+
+
+
+
+
Producción de gas de la
fermentación
-
-
-
+
+
+
+
Fermentación de Lactosa
-
-
-
-
+
+
+
Producción de H2S
-
-
-
+
-
-
+
Medio SIM
(Sulfhídrico Indol Movilidad)
Medio SIM (medio semisólido)
Sustratos: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano.
Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y tiptofanasa.
Producto: H2S e Indol.
Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA).
En presencia de tiosulfato en el medio o la
degradación de proteínas liberando
aminoácidos azufrados, algunos microorganismos
forman H2S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas
incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio
férrico para producir un precipitado negro
insoluble de sulfuro ferroso metálico.
Prueba positiva
Prueba negativa
Medio SIM
(Sulfhídrico Indol Movilidad)
Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano
para formar tres metabolitos: indol, metil indol y
ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el
indol producido formado un compuesto
quinónico color violeta, que se observa por la
aparición de un anillo en la superficie del medio.
Prueba positiva
Prueba negativa
El medio de cultivo tiene consistencia semisólida
por lo que la movilidad se observa por el
crecimiento del microorganismo en todo el tubo,
más allá de la zona de inoculación (picadura).
Los microorganismos inmóviles solo crecerán en
la zona inoculada.
Prueba negativa
Prueba positiva
Ureasa
Caldo urea o agar urea de
Cristensen.
Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa.
Producto: Amoníaco.
Indicador: Rojo de fenol.
La hidrólisis de la urea por la enzima
ureasa libera dos moléculas de
amoniaco que alcaliniza el medio,
entonces se vira el indicador de pH,
en el caso del rojo de fenol una
prueba positiva es color bugambilia.
Prueba negativa
Prueba positiva
Reducción de Nitratos
Caldo nitratos
Sustrato: Nitrato de sodio.
Enzima: Nitrato reductasa.
Producto: Nitritos.
Revelador: Reactivos de Griess.
•Nitrato reductasa (NAR).
-
-
N03 → NO2 → NO → N2O → N2
•Nitrito reductasa (NIR).
•NO reductasa (NOR).
•N2O reductasa (N2OR).
Reducción de Nitratos
El nitrito reacciona
con dos reactivos:
ácido sulfanílico y
dimetil-a-naftilamina
(o a-naftilamina). La
reacción de color
se debe a la
formación de un
compuesto
diazonio, psulfobenceno-azoα-naftilamina.
N
NH2
N
+
SO3H
HNO2
+ H2 O
+
Acido nitroso
Acido sulfanílico
(incoloro)
NH2
SO3H
α-naftilamina
(incolora)
Acido sulfanílico diazotizado
(sal de diazonio)
N
N
Acoplamiento
+ H2 O
SO3H
NH2
p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina
(colorante rojo azo hidrosoluble)
Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba
del zinc para reducir químicamente los nitratos presentes a nitritos
y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.
Descarboxilasas
Medio base de descarboxilasas u otros
medios como LIA o MIO.
Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o
arginina).
Enzimas: Descarboxilasas.
Producto: Amoníaco.
Indicador: Púrpura de bromocresol.
Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en
diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador
(púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas
son útiles en la diferenciación de enterobacterias.
Prueba de la coagulasa
Plasma de conejo
Sustrato: Factores de la coagulación.
Enzima: Coagulasa
(estafilocoagulasa).
Producto: Coagulo.
Revelador: No requiere.
Prueba positiva
Prueba negativa
La enzima producida por S. aureus es excretada al medio
extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta
enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el
plasma y formar un coagulo visible.
Oxidasa
Cultivo de medio nutritivo
Sustrato: Compuesto reducido.
Enzima: Oxidasa.
Producto: Compuesto oxidado.
Revelador: Reactivo de Kovacs,
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
(TPD) al 1%, solución incolora.
Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa
intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de citocromo
oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el
oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de
electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de
electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del
reactivo incoloro en pocos segundos formándose un producto
colorido.