anomalías cromosómicas estructurales y técnicas de citogenética
Anuncio
TEMA 1 ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES Y TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL Victoria Simón García Programa de Formación Continuada a Distancia 2014 ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES Y TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL. Dr. Victoria Simón García. Doctora en Farmacia. Especialista en Análisis Clínicos. Laboratorio de Análisis Clínicos. Hospital La Plana. Vila-real (Castellón). INDICE 1. INTRODUCCIÓN. 1.1. Nomenclatura para cromosomas normales y anomalías cromosómicas constitucionales. 1.2. Mosaicismo 2. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES. CLASIFICACIÓN 2.1 Anomalías estructurales balanceadas o equilibradas. 2.1.1 Translocaciones Recíprocas 2.1.2 Translocaciones Robertsonianas 2.1.3 Inversión 2.1.4 Inserción 2.2 Anomalías estructurales no balanceadas o desequilibradas 2.2.1 Deleción 2.2.2 Duplicación 2.2.3 Adición 2.2.4 Anillos 2.2.5 Isocromosoma 2.2.6 Cromosoma Derivado 2.2.7 Cromosomas marcadores 3. DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO PRENATAL. 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.2 3.3 4. 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.2 4.3 4.4 5. 6. Obtención de tejido fetal para el análisis citogenético Amniocentesis Biopsia de vellosidades coriónicas. Funiculocentesis. Cultivo de líquido amniótico Indicaciones clínicas del diagnóstico prenatal citogenético. INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR FISH (hibridación in situ fluorescente) Sondas locus-específicas (LSI). Sondas centroméricas (o alfoides) Sondas subteloméricas Sondas de pintado cromosómico. FISH multicolor o M-FISH SKY CGH VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS DISTINTAS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS RESUMEN BIBLIOGRAFÍA ENLACES DE INTERÉS CASOS CLÍNICOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS: En este tema, veremos más a fondo las anomalías cromosómicas estructurales (ya que las numéricas fueron estudiadas en el Tema 1 de FC AEFA 2013) e introduciremos el concepto de mosaicismo, importante para entender las repercusiones de algunas de estas anomalías. Así mismo, se tratará en el tema la citogenética en el diagnóstico prenatal, la forma de obtención de las muestras para realizar estos estudios y algunas peculiaridades del cultivo de tejido fetal. Por último, realizaremos un acercamiento a las técnicas de citogenética molecular, y dada su importancia, podría ser objeto de un tema a tratar posteriormente en toda su extensión. Después de completar esta unidad didáctica, los participantes deben ser capaces de: 1. Conocer e identificar los tipos de Anomalías Cromosómicas, sobre todo las estructurales, que nos podemos encontrar en el campo de la Citogenética Humana. 2. Adquirir habilidades en le campo del Diagnóstico Citogenético Prenatal, conocer con qué tipos de tejido podemos trabajar, las peculiaridades de cada uno de ellos, así como, las Indicaciones Clínicas para realizar este tipo de estudios. 3. Comprender la metodología de las Técnicas de Citogenética Molecular, el alcance y las limitaciones de estos estudios cromosómicos, así como, conocer e interpretar los resultados obtenidos a partir los mismos. 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Nomenclatura para cromosomas normales y anomalías cromosómicas constitucionales El método de bandeo más usado para la identificación individualizada de los cromosomas es el bandeo GTG que produce las bandas G, de forma que cada cromosoma en las células somáticas humanas está formado por una serie de bandas continuas. Cada banda es parte de un cromosoma, que es fácilmente distinguible de los segmentos adyacentes, por aparecer más clara o más oscura con una o más técnicas de bandeo. Estas bandas se ubican en regiones a lo largo de los brazos cromosómicos, de forma que las bandas y las regiones se numeran desde el centrómero hacia el telómero del brazo correspondiente. Para definir una banda en particular se requiere: número del cromosoma, símbolo del brazo (p: brazo corto del cromosoma, q: brazo largo), número de la región y número de la banda dentro de la región. Ej: 2q34 indica banda 4 de la región 3, del brazo largo del cromosoma 2.(Fig. 1) Las técnicas de bandeo de alta resolución (850 bandas) permiten descubrir sub-bandas y éstas también se nombran con un número (creciente de centrómero a telómero) que se coloca después de un número decimal que sigue al numero de la banda. Ej.: 2q34.2 indica sub-banda 2, de la banda 4 de la región 3, del brazo largo del cromosoma 2. En la descripción del cariotipo (fórmula cromosómica), se registra el número de cromosomas, seguido de una coma, tras la cual se escriben los cromosomas sexuales. Ej. 46,XY (cariotipo masculino normal). Si existen anomalías numéricas éstas se escriben a continuación, tras otra coma. Ej. 47,XX,+21 (el signo (+) o (-), colocado delante del número del autosoma indica ganancia o pérdida de ese cromosoma completo. Aquí se lee: cariotipo anormal femenino con 47 cromosomas y un cromosoma 21 adicional). Si existen anomalías estructurales, se escribe el símbolo de ésta, tras otra coma. A continuación se coloca el número del cromosoma involucrado (Ej.: inv(7), inversión del cromosoma 7). Si están involucrados dos cromosomas, se colocan los dos dentro del paréntesis separados por punto y coma (Ej.: t(8;14), translocación ocho catorce). A continuación, se especifica el lugar donde se ha/n producido el/los cortes y se colocan entre paréntesis, separadas entre sí por punto y coma, inmediatamente a continuación de la anomalía. (Ej.: t(8;14)(q12;q22), se lee translocación ocho catorce, con puntos de ruptura en la banda 2, región 1, del brazo largo del cromosoma 8 y la banda 2, región 2, del brazo largo del cromosoma 14). Siempre se pone en primer término el cromosoma de número menor. Figura 1. Ideograma del cromosoma 2 1 Algunos de los símbolos utilizados para la descripción de las reorganizaciones: add.- material adicional de origen desconocido pat.- origen paterno del.- deleción q.- brazo largo der.- cromosoma derivado r.- cromosoma en anillo dic.- dicéntrico p.- brazo corto dir.- directa rob.- trans. Robertsoniana dir dup.- duplicación directa t.- translocación dup.- duplicación tan.- tándem i.- isocromosoma ? - asignación dudosa ins.- inserción mar.- cromosoma marcador inv.- inversión mat.- origen materno inv ins.- inserción inversa mos.- mosaico rep.- recíproca, normalmente translocación 1.2. Mosaicismo Cuando una persona presenta una anomalía cromosómica, generalmente está presente en todas sus células en cultivo. Sin embargo, a veces se detectan dos o más fórmulas cromosómicas diferentes. Esta situación se denomina mosaicismo. El mosaicismo puede ser numérico (el tipo más común) o estructural. Así, mosaicismo, se define como la presencia en un individuo o en un tejido de al menos dos líneas celulares, que difieren desde el punto de vista genético, pero derivan de un solo cigoto. Una causa frecuente de mosaicismo es la no disyunción de una división mitótica poscigótica temprana. Por ejemplo, un cigoto con un cromosoma 21 adicional puede perder el cromosoma extra en una división mitótica y continuar su desarrollo como un mosaico 46/47,+21. En los mosaicos deben describirse todas las líneas celulares, primero las anormales y por último la normal. Ej: mos 45,X/46,XX. Dependiendo del momento en que se produce esta anomalía, y de la viabilidad de las líneas celulares resultantes, cada una de estas líneas celulares se encontrará en el adulto en una determinada proporción que se puede indicar escribiendo entre corchetes después de la descripción de cada línea celular diferente el número absoluto de las células analizadas. Ej: mos 45,X[23]/46,XX[60]. Normalmente estos individuos mosaico están menos gravemente afectados (menor expresión fenotípica) que los individuos trisómicos no afectados por el mosaicismo. El significado del hallazgo del mosaico a menudo resulta difícil de valorar, especialmente si se identifica prenatalmente. 2. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES. CLASIFICACIÓN Las anomalías estructurales son reordenamientos estructurales que se originan por una rotura cromosómica seguida de reconstitución en una combinación anormal. Son muy variadas y sus efectos son más complejos de predecir que las anomalías numéricas. Pueden afectar a varios cromosomas y al igual que las anomalías numéricas, pueden estar presentes en todas las células de una persona o en forma de mosaico. Se pueden dividir en balanceadas o equilibradas y no balanceadas o desequilibradas. (Tabla 1) 2.1. Anomalías estructurales balanceadas o equilibradas. Son aquellas donde no existe pérdida o ganancia de material genético (los conjuntos cromosómicos tienen el complemento normal de información genética) y habitualmente no se acompañan de efecto fenotípico, pero pueden tener un riesgo incrementado de anomalía cromosómica en la descendencia, aunque los individuos afectos sean fenotípicamente normales. Entre ellas, por ejemplo, tenemos las translocaciones, las inversiones y las inserciones. 2 ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES Translocaciones Recíprocas Intercambio de material cromosómico. Translocaciones Robertsonianas Translocación donde se produce la fusión de dos cromosomas acrocéntricos. Inversión Cambio de sentido de un segmento dentro del mismo cromosoma Inserción Transferencia de un segmento delecionado de un cromosoma a otro. EQUILIBRADAS Deleción Duplicación Adición DESEQUILIBRADAS Anillo Isocromosoma Cromosoma Dicéntrico Cromosomas Marcadores Pérdida de un segmento de un cromosoma Repetición una o varias veces de un fragmento cromosómico Hallazgo de material extra en un cromosoma (de otro cromosoma) Deleción de ambos brazos cromosómicos y unión del segmento medio en una estructura circular. Pérdida completa de un brazo de un cromosoma y duplicación del otro brazo. Cromosoma con dos centrómeros Pequeños elementos supernumerarios Tabla 1. Anomalías Cromosómicas Estructurales. Las translocaciones pueden ser translocaciones recíprocas (intercambio de fragmentos cromosómicos entre cromosomas) y robertsonianas (donde se intercambia material cromosómico entre los cromosomas acrocéntricos). Las inversiones se producen por una doble rotura de un cromosoma y reunión de nuevo tras un giro (inversión de 180°). Pueden ser inversiones paracéntricas, si las dos roturas afectan a un mismo brazo cromosómico (no cambia la morfología del cromosoma), o pericéntricas, si cada rotura afecta a un brazo cromosómico (cambia la morfología del cromosoma). -Repercusión fenotípica de las alteraciones cromosómicas estructurales equilibradas Generalmente, los reordenamientos cromosómicos no tienen efecto fenotípico aparente si son equilibrados, ya que toda la información genética está presente, aunque su empaquetamiento sea distinto. Sin embargo, estas alteraciones cromosómicas equilibradas hay que analizarlas individualmente ya que dependiendo del cromosoma o cromosomas implicados y del tamaño del fragmento 3 cromosómico comprometido tendrán un comportamiento determinado en la meiosis, pudiendo constituir una amenaza para la siguiente generación, por lo que es probable que los portadores de estas anomalías equilibradas produzcan una alta frecuencia de gametos desequilibrados y, por tanto, tengan un riesgo incrementado (riesgo teórico del 2 al 12%) de tener descendencia anormal con cariotipos desequilibrados. Además, siempre existe la posibilidad de que se produzca un fenotipo anómalo debido a que una de las roturas cromosómicas produzca una disrupción o alteración (mutación) de un gen, o bien cambios por efectos de posición. La frecuencia con la que se ha observado alteraciones clínicas en individuos portadores de alteraciones cromosómicas balanceadas varía de unas publicaciones a otras (por ejemplo, entre un 6% y un 9% para las translocaciones recíprocas). Es importante conocer el riesgo que supone el ser portador de estos reordenamientos equilibrados para informar a los pacientes. 2.1.1. Translocaciones Recíprocas Este tipo de reordenamientos se originan por roturas de cromosomas no homólogos con intercambio recíproco de los fragmentos rotos. Generalmente, se produce un intercambio mutuo entre segmentos terminales de los brazos de 2 cromosomas El número cromosómico total no cambia y como no hay pérdida de material cromosómico en los puntos de intercambio, el reordenamiento nuevo es, en principio, genéticamente balanceado. Son relativamente frecuentes. 1 de 500 neonatos. Las translocaciones se nombran con una t, seguida entre paréntesis con el número de los 2 cromosomas, y un segundo paréntesis indicando los puntos de ruptura, como en el ejemplo de la figura 2. 2.1.2. Translocaciones Robertsonianas Son translocaciones donde se produce la fusión de 2 cromosomas acrocéntricos (cromosoma 13, 14, 15, 21 o 22) por una zona muy cercana al centrómero, dando lugar a un cromosoma metacéntrico o submetacéntrico. Se fusionan los brazos largos de los 2 acrocéntricos, teniendo como consecuencia la pérdida sistemática e inmediata de los brazos cortos (el número de cromosomas del individuo quedaría reducido a 45 si no se le suman otras anomalías. El individuo con 45 cromosomas tendrá un fenotipo normal). Robertson propuso que los puntos de rotura de la translocación eran p10 y q10 resultando una translocación simétrica con pérdida inmediata del cromosoma pequeño portador de los brazos cortos. Sybenga propuso que los puntos de rotura era en p10 en ambos cromosomas resultando una translocación asímétrica (los dos brazos cortos sin centrómero se perderían inmediatamente y los dos centrómeros con los brazos largos se unirían formando una unidad funcional; esta propuesta parece que se encuentra más frecuentemente). Se nombran con las abreviaturas t o con rob seguida entre paréntesis, de los números de cada uno de los 2 cromosomas seguidos de una q (por ejemplo. t(13q10;14q10)). (Fig. 3) Figura 2. Ejemplos de translocaciones. A: traslocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas 7 y 13. B: translocación recíproca entre el brazo largo del cromosoma 4 y el brazo corto del cromosoma 12. 4 Figura 3. Mujer con translocación robertsoniana entre los cromosomas 13 y 14 en el que se observan también los cromosomas 15 normales. La fórmula cromosómica sería 45,XX,t(13;14)(q10;q10) Figura 4. Mujer con trisomía 21 derivado de translocación robertsoniana 13;21 Figura 5. Paciente varón con trisomía13 derivado de translocación robertsoniana 13;14, Aunque un portador de una translocación Robertsoniana es fenotípicamente normal, existe un riesgo de producir gametos desequilibrados, y por tanto de descendencia desequilibrada. Así, por ejemplo, las translocaciones Robertsonianas que afectan a los cromosomas 13 y/o 21 producen embriones viables con trisomías 13 o 21. (Fig. 4 y 5) 2.1.3. Inversión Las inversiones suponen dos rupturas en un mismo cromosoma, un giro de 180º y posterior reunión del segmento fragmentado pero de manera invertida. Es la consecuencia de la rotura de un cromosoma y su reparación según los mecanismos moleculares de reparación del ADN pero invirtiendo la orientación del segmento implicado. 5 Figura 6. Imagen e ideograma de inversión pericéntrica. A: Cr 1: inv(1)(p13q21), B: Cr 5: inv(5)(p11.3;q13.1) Figura 7. Inversión del cromosoma 9. inv(9)(p11q12) En cuanto a las consecuencias de las inversiones, al ser una reestructuración equilibrada no tiene efectos fenotípicos nocivos para el individuo pero sí puede ser causa de esterilidad, abortos de repetición y producir descendencia con desequilibrio cromosómico o con alteraciones fenotípicas como consecuencia de que en los sobrecruzamientos meióticos, en el lazo de inversión se formaran gametos recombinantes con duplicaciones, deleciones, cromosomas dicéntricos, etc. También se conocen casos de efectos fenotípicos producidos por el propio cambio en la situación relativa de los genes dentro del cromosoma (efecto de posición), ya que los cromosomas que poseen alguna inversión no cambian de tamaño pero sí cambia la ordenación lineal de los genes como consecuencia de la misma. El símbolo utilizado en la formulación cromosómica es inv, seguido entre paréntesis con el número del cromosoma, y en un segundo paréntesis se indica los puntos de ruptura implicados. Las inversiones se clasifican en atención a que incluyan o no al centrómero; las que lo incluyen se llaman pericéntricas (los dos puntos de ruptura implicados está situados en lados opuestos del centrómero, y la unión invierte un segmento cromosómico que incluye el centrómero) (Fig.6) y las que no lo incluyen y se localizan en un solo brazo cromosómico se denominan paracéntricas. Algunas inversiones pericéntricas son muy frecuentes, denominándose cromosomas variantes. Por ejemplo la inv(9)(p11q12), es la inversión más común encontrándose en el 1% de los individuos examinados (con una gran variación geográfica). Esta inversión no tiene efectos deletéreos conocidos en los portadores y parece que no está asociada con riesgo significativo de aborto o descendencia desequilibrada; por lo tanto generalmente se considera una variante polimórfica normal. No se ha encontrado descendencia con formás desbalanceadas. 2.1.4. Inserción Anomalía estructural caracterizada por el desplazamiento de un segmento, dentro del mismo cromosoma o de un cromosoma (donante) a otro (receptor). Se produce porque se deleciona un fragmento intersticial de un cromosoma y se transfiere a una nueva posición en otro cromosoma, ocasionalmente en su homólogo, o en cualquier otro cromosoma. Las inserciones pueden ser 6 directas (dir) si las bandas (la información genética) presentan la misma ordenación que tenían en su posición original, siempre respecto al centrómero, o inversas (inv) si están colocadas al revés. Aunque aparentemente se trata de un reordenamiento balanceado, puede dar lugar a trisomías y monosomías parciales en la descendencia produciendo alteraciones en el fenotipo por anomalías durante la gametogénesis. El símbolo utilizado en la formulación cromosómica es ins (Fig. 8), seguido entre paréntesis del número del cromosoma que recibe el fragmento precediendo al número del cromosoma que lo dona (si es diferente). En un segundo paréntesis se indica el punto de ruptura donde se ha insertado, seguido de los 2 puntos de ruptura que definen al segmento delecionado. (por ejemplo: ins(2)(p13;q31q34) e ins(5;2)(p12;q31q34): el segmento q31q34 del cromosoma 2 se ha insertado respectivamente en p13 del cromosoma 2, y en p12 del cromosoma 5). 2.2. Anomalías estructurales no balanceadas o desequilibradas Las Anomalías estructurales desbalanceadas o desequilibradas son aquellas donde sí existe pérdida o ganancia de material genético y se acompañan de efecto fenotípico en menor o mayor medida ya que no conservan el complemento cromosómico íntegro. 2.2.1. Deleción Es el cambio estructural que tiene como resultado la pérdida de un trozo de cromosoma y de la información genética que en él se contiene. Las deleciones pueden ser de dos tipos. Si la pérdida es de un segmento terminal (que incluya un telómero) se llaman terminales o deficiencias. Si la pérdida es de un segmento no terminal (no incluye telómero alguno y suponen dos puntos de ruptura) se llaman intersticiales o deleciones. En ambos casos el símbolo utilizado para su formulación es del, seguido entre paréntesis con el número de los cromosomas, y en un segundo paréntesis se indican el/los punto(s) de ruptura de la región delecionada (por ejemplo del(5)(q14q34)). Cuando la deleción es intersticial se indican los 2 puntos de ruptura; cuando la deleción parece que es terminal se puede indicar sólo 1 punto de ruptura. Como consecuencia siempre hay pérdida de material cromosómico que se traduce en monosomías parciales y que generalmente tienen un efecto fenotípico adverso y conlleva un riesgo para la descendencia. Las alteraciones 4p-, 5p-, 13q-, 17p-, 18p-, 18q-, tienen cada una su propia entidad sindrómica por sus características fenotípicas. Figura 8. Inserción entre el Cr. 4 y el Cr. 20. 7 Figura 9. Sdre. Wolf Hirschhorn. Deleción de cromosoma 4. del(4)(p15,2) Cromosoma 5 Figura 10. Sdre. Cri-Du-Chat. Deleción del cromosoma 5. del(5)(p13.2) Ejemplos de ello: Síndrome de Wolf-Hirschhorn. Deleción brazo corto del cromosoma 4. (Fig.9) • Rasgos faciales peculiares: nariz en forma de “casco griego”, microcefalia, frente alta con glabela prominente, hipertelorismo ocular, cejas arqueadas, filtrum corto, boca en V invertida, micrognatia, orejas simplificadas • Hipotonía • Retraso en el desarrollo/retraso mental • Espasmos 50-100% • Anomalías esqueléticas 60-70%. Cardiopatías congénitas 50%. Sordera >40% Síndrome de Cri-Du-Chat. (o Síndrome de Maullido de Gato). Deleción brazo corto del cromosoma 5. (Fig.10). Es probable que se supriman múltiples genes en dicho cromosoma. Uno de los genes suprimidos llamado transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) está comprometido en el control del crecimiento celular y puede jugar un papel fundamental en la forma en que se desarrollan algunas de las características de este síndrome. • Microcefalia, cara alargada. Hipertelorismo. Micrognatia • Pliegues epicánticos. Orejas de implantación baja • Hipotonía y Retraso psicomotor severo • Retraso mental severo • Grito o llanto característico (similar al de un gato) Síndrome de Smith-Magenis. Deleción intersticial brazo corto del cromosoma 17. (Fig. 11) • Peso y talla normales • Nariz corta, labio superior evertido, boca en carpa, micrognatia • Retraso del desarrollo • Dificultades de aprendizaje. Retraso mental leve/moderado • Anomalías del comportamiento 8 Cromosoma 17 Figura 11. Sdre. Smith-Magenis. Deleción del cromosoma 17. del(17)(p11.2) Cromosoma 11 Figura 12. Ideograma e imagen de una duplicación del cromosoma 11. 2.2.2. Duplicación Es un reordenamiento desbalanceado, producen un exceso de material genético, lo cual puede dar lugar a una trisomía parcial del cromosoma involucrado que generalmente produce alteraciones fenotípicas y conllevan un riesgo para la descendencia. Aunque en general, la duplicación parece ser mucho menos nociva que la deleción igual que las trisomías parecen ser menos nocivas que las monosomías. En origen, se producen por una duplicación de material cromosómico, probablemente por un sobrecruzamiento desigual entre cromosomas homólogos durante la profase I de la meiosis I. El símbolo utilizado en la formulación para indicar duplicación es dup, seguido entre paréntesis con el número del cromosoma, y en un segundo paréntesis se indica el(los) punto(s) de la región duplicada. Ej.: 46,XY,dup(7)(q22q34). Atendiendo a su localización se pueden clasificar en: Duplicaciones en tándem cuando el segmento duplicado se encuentra adyacente con el original y duplicaciones desplazadas cuando el segmento duplicado no está adyacente con el original. Atendiendo a su orientación las duplicaciones pueden clasificarse en directas (dir) o invertidas (inv). Son directas aquellas en las que la información del segmento duplicado tiene la misma orientación que el original tomando como referencia el centrómero y se consideran inversas o invertidas aquellas en las que la disposición de la información genética, respecto al centrómero, en el segmento duplicado es al revés de la disposición en el original. (Fig. 12). 2.2.3. Adición Se produce cuando se encuentra material extra de origen desconocido en un cromosoma, porque la ausencia de marcadores morfológicos en el segmento adicionado impide conocer su origen. La abreviatura es add y en la formulación sólo es necesario indicar el lugar donde se encuentra el aumento. Ej.: 46,XY,add(20)(q13). Hombre con material de origen desconocido en el extremo distal del brazo largo del cromosoma 20. Suelen ser material procedente del producto de la translocación equilibrada de algunos de sus progenitores. (Fig. 13) 9 Figura 13. add(5)(p15). Cromosomas procedentes de un feto de sexo femenino con material de origen desconocido en el extremo distal del brazo corto del cromosoma 5. Figura 14. Paciente varón con un cromosoma 13 en anillo cuya fórmula cromosómica sería 46,XY,r(13)(p12q33) 2.2.4. Anillos Anomalía estructural consistente en la pérdida de dos segmentos cromosómicos que incluyen ambos telómeros, formándose un cromosoma circular. Es una doble deleción terminal con circularización del cromosoma. Debido a estos cambios que se producen en el cromosoma, a menudo conducen a problemas en la mitosis, acompañadas de continuos cambios en el tamaño y composición del anillo. Es por tanto, muchas veces, un reordenamiento inestable. Debido a esta inestabilidad mitótica, es frecuente encontrar cromosomas en anillo en mosaico. El producto “de novo” es el más frecuente, y es en muy raras ocasiones transmitido a la descendencia. Las repercusiones en el fenotipo son variables, con signos de trisomías, bien monosomías o de deleciones. Los cromosomas en anillo son muy raros, pero se han detectado para cada cromosoma humano. El anillo más frecuente es el que afecta al cromosoma 13. El símbolo utilizado en la formulación para este tipo de cromosomas es r, seguida entre paréntesis con el número del cromosoma, y en un segundo paréntesis se indica los puntos de ruptura, si han podido ser identificados . Un ejemplo de ello sería el anillo del cromosoma 13, r(13)(p12q33). (Fig. 14) 2.2.5. Isocromosoma Cromosoma con brazos homólogos (los brazos son imágenes especulares). Se produce una pérdida completa de un brazo de un cromosoma, "reemplazado" por la duplicación del otro brazo (equivale a la monosomía de un brazo y a la trisomía del otro, es decir, es parcialmente monosómico y parcialmente trisómico), por tanto, generan fenotipos alterados y conllevan un riesgo para la descendencia. La abreviatura en formulación es i. 10 Figura 15. Isocromosoma X. La fórmula cromosómica sería 46,XX,i(X)(q10). Figura 16. Paciente Mujer con cromosoma 9 derivado de dos deleciones de los extremos distales de ambos brazos, desde 9p12 y desde 9q31. Fórmula cromosómica: 46,XX,der(9)del(9)(p12)del(9)(q31). La formación de los isocromosomas puede ser por procesos diferentes desde una translocación robertsoniana entre cromosomas homólogos hasta una misdivisión (anormalidad en la disyunción de cromátidas hermanas durante anafase II de la meiosis II); en todo caso el punto de rotura y reunión, el centrómero, se formulará q10 o p10 dependiendo de que se trate de un isocromosoma de brazo largo o brazo corto respectivamente. Ej.: 46,XY,i(18)(q10). Hombre con 46 cromosomas y con isocromosoma del brazo largo del cromosoma 18. Esta alteración cromosómica es frecuente en el brazo largo del cromosoma X (en el Síndrome de Turner con i(Xq)). (Fig. 15) 2.2.6. Cromosoma Derivado Cromosoma con reordenamientos que implican a dos o más cromosomas o con múltiples anomalías cromosómicas (en un solo cromosoma). En los casos con dos anomalías en un cromosoma después de la abreviatura der se especifica el cromosoma entre paréntesis y a continuación el tipo de anomalías que tiene (en orden de extremo de brazo corto a extremo de brazo largo). (Fig.16) 2.2.7. Cromosomas Marcadores Cromosoma autónomo, con centrómero y aparentemente funcional, que no se puede identificar en ninguna de sus partes (suelen ser muy pequeños). Se representan abreviadamente mar en la formulación precedido del signo +. Ej.: 47,XX,+mar. (Fig.17). Pueden ser pequeños elementos supernumerarios detectados en el cariotipo constitucional, con frecuencia en un estado de mosaico, con o sin repercusión en el fenotipo, ya que muchas veces consisten en poco más que heterocromatina céntrica, pero que suponen un problema en el diagnóstico prenatal ya que es difícil evaluar la importancia clínica de un marcador, y el hallazgo de uno de ellos en un cariotipo fetal puede originar un serio problema para el consejo genético, sobre todo si se ha producido ”de novo”. La frecuencia prenatal de cromosomas marcadores supernumerarios de novo se estima aproximadamente de 1 de cada 2500 embarazos. 11 Figura 17. Cariograma e imagen ampliada de una paciente femenina con cromosoma marcador extra. 47,XX,+mar 3. DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO PRENATAL Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (1980) el diagnóstico prenatal consiste en: “todas aquellas acciones prenatales que tengan por objeto el diagnóstico de un defecto congénito, entendiendo por tal toda anomalía del desarrollo morfológico, estructural, funcional o molecular presente al nacer (aunque puede manifestarse más tarde). El diagnóstico prenatal es una empresa multidisciplinaria que abarca desde el análisis citogenético, bioquímico y molecular hasta la asistencia médica. El propósito del Diagnóstico prenatal no es solo detectar anomalías en la vida fetal y permitir la interrupción del embarazo cuando se encuentra que el feto tiene un defecto, más bien esta técnica tiene el objetivo de permitir a las parejas en riesgo de tener un hijo con un defecto especifico, comenzar un embarazo con el conocimiento de que puede detectarse la presencia o ausencia del trastorno en el feto, así como tranquilizar y reducir la ansiedad, en especial entre grupos de alto riesgo. Los grupos de alto riesgo son aquellas parejas, entre otros, que son portadores de alteraciones cromosómicas estructurales por ejemplo translocaciones, inversiones..etc, o que presentan malformaciones fetales detectadas ecográficamente. Los grupos que presentan un riesgo moderado son, por ejemplo, las mujeres de 38 años o más y las parejas que han tenido previamente un hijo con una cromosomopatía, sobre todo si es estructural. Mientras que los grupos de riesgo bajo son, por ejemplo, las mujeres de 35 a 38 años, o bien mujeres que han tenido previamente un mortinato o un malformado sin estudio cromosómico o bien parejas con una esterilidad idiopática. Evidentemente y debido al alcance de este tema, nos centraremos solamente en los aspectos citogenéticos del diagnóstico prenatal. 3.1. Obtención de tejido fetal para el análisis citogenético Se realiza mediante métodos invasivos, procedimientos quirúrgicos que irrumpen en el interior de la madre y penetran en el espacio en el que se encuentra el feto o los tejidos a su alrededor, como son el útero o el cordón umbilical, con el fin de extraer diferentes tipos de material según el análisis requerido. 3.1.1. Amniocentesis: La amniocentesis es una técnica de diagnóstico prenatal invasiva que consiste en la punción del amnios, membrana más interna de la placenta que rodea el feto, para extraer el líquido amniótico por vía transabdominal por medio de una jeringa guiada por ultrasonido que se suele realizar alrededor de la semana 16 de gestación (15-18) con el fin de obtener células fetales útiles para el 12 análisis e implica un riesgo de aborto de aproximadamente un 0,5%. Con esta técnica se obtienen cromosomas con una buena calidad citogenética y el resultado se obtiene en 3-4 semanas. Los problemas que podemos encontrar al realizar una amniocentesis son por ejemplo la no presencia de células fetales así como el fracaso de crecimiento celular o la contaminación con células maternas. La infección materna constituye una complicación rara. Para su realización es necesaria la obtención, en condiciones estériles, de 10-20 ml de líquido amniótico (LA) (se aconseja extraer 1 ml por semana de gestación como máximo). (Fig. 18). 3.1.2. Biopsia de vellosidades coriónicas. La biopsia de vellosidades coriónicas consiste en la obtención de material coriónico mediante el aspirado de tejido trofoblástico del área vellositaria del corion por vía transcervical o transabdominal a partir de la novena semana de embarazo, normalmente entre la semana 9 y la 12.(Fig 19). El resultado del informe de la biopsia de corion es más rápido, aunque la tasa de pérdidas fetales debida a ella es es un poco mayor que en la amniocentesis y alcanza hasta un 1% si se practica en la edad gestacional indicada. Otro problema que puede surgir con este método es que no se obtenga suficiente material o que éste esté degenerado, además de la posible contaminación con tejido materno y que pueden con frecuencia observarse clones discrepantes. 3.1.3. Funiculocentesis: La funiculocentesis o cordocentesis es un procedimiento empleado para obtener una muestra de sangre fetal directamente del cordón umbilical con apoyo ecográfico. (Fig. 20). Se usa para proporcionar un resultado rápido (entre 4 y 6 días) cuando por ejemplo el cultivo de células del liquido amniótico por amniocentesis ha fallado. Se realiza a partir de la semana 19. El inconveniente de esta técnica es que el índice de abortos tras su práctica es casi del 2% además de un riesgo alto de contaminación de la muestra con células maternas. Figura 18. Amniocentesis y cultivo celular Figura 19. Representación de una biopsia de corion transcervical e imagen del tejido. 13 Figura 20. Cordocentesis Figura 21. fibroblasto y célula epitelial de líquido amniótico Figura 22. Colonia de Fibroblastos. 3.2. Cultivo de líquido amniótico La muestra de LA contiene distintos tipos celulares, procedentes de la descamación de las membranas que rodean al feto y del propio feto. Dicha celularidad es variada y escasa y, además, la mayoría, son células viejas o muertas, no útiles para un cultivo celular. Los tres tipos celulares más significativos son (Fig 21): - Las células típicas del líquido amniótico o amnióticos - Los fibroblastos y - Las células epiteliales del feto. Morfológicamente, las células amnióticas son muy parecidas a los fibroblastos, pero de menor tamaño. Los fibroblastos son células típicamente alargadas y son las que se cultivan cuando se hace una amniocentesis por sus características especiales de crecimiento, ya que cuando un fibroblasto contacta lateralmente con alguna célula, deja de crecer en ese plano pero puede hacerlo en otro diferente (por arriba, abajo y en todas direcciones) dando a la colonia celular un aspecto caótico de crecimiento (Fig. 22). En cambio, las células epiteliales típicas y los amniocitos se inhiben por contacto con mucha mayor facilidad, dejando de crecer en la dirección en que contactaron y en todas las demás, dando lugar a colonias más pequeñas. Esta particularidad junto con el hecho de que los fibroblastos presentan un índice mitótico mayor que el del resto de tipos celulares consigue que, a la hora de hacer subcultivos celulares para estudios citogenéticos a partir de una muestra de líquido amniótico, haya una selección de un solo tipo celular que además de dividirse rápidamente, lo hace en todas direcciones, minimizando e inhibiendo el crecimiento del resto. 14 Siguiendo las recomendaciones de la Guía de Práctica Clínica Prenatal, Prenatal Diagnostic Best Practice Guidelines (2009), y si el volumen de muestra lo permite, ésta se divide en dos o incluso tres tubos (estériles), obteniendo así posteriormente 2 o 3 líneas de cultivo (normalmente 2). Además, para minimizar el riesgo de contaminación u otros problemas en el cultivo, estas lineas de cultivo deben mantenerse independientes y deben ser manipuladas por separado, mantenidas en dos incubadores distintos y a ser posible sembradas y cultivadas con distinto lote de medio de cultivo. Además, se recomienda que los cultivos de muestras prenatales y no prenatales (por ejemplo líquido amniótico y sangre periférica o médula ósea) deben incubarse por separado, en distinto incubador para minimizar el riesgo de contaminación microbiana cruzada. Los tubos conteniendo los especímenes de LA se centrifugan con el fin de recuperar en el botón aquellas pocas células viables para cultivarlas. Una vez resuspendido el botón, se añade 2.5 ml de medio de cultivo similar al utilizado para el cultivo de sangre periférica, el cual contiene sales, hormonas, vitaminas, glucosa y un pH y presión osmótica controlados. Este medio se está suplementado con suero fetal bovino, antibiótico y L-glutamina. Todo el contenido se siembra en frascos de cultivo. El cultivo se mantiene en una estufa a 37ºC y al 5% de CO2. Durante este proceso de incubación debe llevarse a cabo un control del crecimiento celular: a los 3-4 días se realiza la adición de 2.5 ml de medio de cultivo fresco. Al sexto y al noveno día se le realizan cambios completos del medio de cultivo. A los 9-11 días de la siembra se debe evaluar el crecimiento de las colonias de células en el fondo del frasco. Se selecciona el frasco que contenga colonias de mejor calidad y se subcultiva. El subcultivo tiene como finalidad sincronizar el crecimiento del cultivo de forma que se obtengan el mayor número de células posibles en el estadio de la división que nos interesa, además de realizar una selección de un solo tipo celular que tenga la capacidad de dividirse rápidamente. Para ello, se añade tripsina, la cual se encarga de romper las uniones intercelulares ya que se pretende levantar los fibroblastos adheridos al fondo del frasco en el que se va a hacer el subcultivo. Posteriormente se le añaden 10 ml de medio de cultivo (la acción antitripsina del suero fetal bovino del medio de cultivo hace que pare la acción de la tripsina y que sedimenten las células, consiguiendo así un cultivo celular en monocapa), se divide el cultivo en dos frascos de cultivo y se incuban ambos frascos durante 24 h. a 37 ºC en estufa de CO2. Transcurrido este tiempo, si el crecimiento y el índice mitótico es el adecuado, se sacrifica el cultivo mediante la adición de colchicina y tras una incubación de 90-120 minutos, se recolectan las células y se procesan , de una forma similar a la utilizada para el procesado de células de sangre periférica, es decir, se somete la suspensión celular a un choque hipotónico con cloruro potásico precalentado a 37 ºC, seguido de una prefijación con solución Carnoy (mezcla de ácido acético y metanol) y dos fijaciones más con la misma solución, tras lo que se obtiene una suspensión celular lista para la preparación de extensiones. (Ver tema 1, Formación Continuada de AEFA 2013). El otro frasco de cultivo se devuelve a la estufa y se mantiene en cultivo por si es necesario comprobar la fórmula cromosómica observada o descartar la presencia de un mosaicismo o pseudo-mosaicismo. A este frasco se le llama “muestra virgen”. 3.3. Indicaciones clínicas del diagnóstico prenatal citogenético El Diagnóstico Prenatal Citogenético en tejido fetal se pueden solicitar siguiendo los criterios que se indican: 1. Cribado combinado del primer trimestre positivo: Edad materna, Translucencia nucal, β-HCG libre y PAPP-A (riesgo > 1/270). 2. Edad materna avanzada. 3. Antecedente de hijo o feto anterior afecto de anomalía cromosómica o malformación asociada a cromosomopatía. 4. Padres portadores de alteraciones cromosómicas. 5. Malformación fetal actual asociada a cromosomopatía (anomalías cardiovasculares, digestivas, genitourinarias o en el pliegue nucal). 6. Antecedente de enfermedad cromosómica. 7. Ansiedad materna (valorado en consulta de diagnóstico prenatal). 15 4. INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR A veces, es difícil identificar ciertas anomalías cromosómicas, tales como cromosomas marcadores, translocaciones no balanceadas de novo o algunas regiones anormalmente bandeadas, ya sea en células somáticas o de diagnóstico prenatal. Otro inconveniente de las técnicas citogenéticas habituales proviene del hecho de que el análisis cromosómico se realiza en células que se están dividiendo y los cromosomas deben detenerse en metafase. Esto significa que el proceso requiere un tiempo y trabajo para obtener células que estén en fase de división y poder realizar el estudio. Por último, la selección que realicemos de las células, puede en ocasiones conducir a errores, debido a que las células que proliferan in vitro, pueden no representar la población original (neoplatonicismo). Desde su inicio, hacia 1980, las técnicas de citogenética molecular basadas en la hibridación in situ fluorescente (FISH) y sus variantes tecnológicas han permitido la detección e identificación precisa de un gran número de anomalías cromosómicas, que hasta ese momento pasaban desapercibidas, como las reorganizaciones cromosómicas complejas, las microdeleciones y las reorganizaciones crípticas, alteraciones cromosómicas que por su tamaño < 3-5 Mb son muy difíciles de identificar mediante las técnicas de bandas convencionales. Estas modernas técnicas de citogenética molecular, basadas en la FISH y que combinan la citogenética convencional con la genética molecular, así como otras técnicas surgidas posteriormente como la Hibridación Genómica Comparada, intentan paliar dichas limitaciones. 4.1. FISH (hibridación in situ fluorescente) Muchas de las dificultades anteriormente enumeradas han podido solventarse con la introducción de la hibridación fluorescente in situ (FISH –fluorescent in situ hybridization–). Esta tecnología, relativamente nueva, proporciona una ayuda importante a las técnicas citogenéticas clásicas, debido al hecho de valorar simultáneamente información citogenética y molecular además de que permite el diagnóstico rápido de anomalías cromosómicas tanto en cromosomas, como en núcleos interfásicos mediante la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos, lo cual nos permite la posibilidad de disponer de un test diagnóstico en 24-48 horas, en contraste con la gran cantidad de tiempo requerido para algunas técnicas citogenéticas (Tabla 2). La metodología de la FISH se basa en la complementariedad entre las 2 cadenas de ADN de doble hélice además de en la capacidad de una hebra sencilla de ADN (sonda), para unirse o hibridar con su secuencia específica complementaria. Diagnóstico prenatal. Detección de aneuploidías más frecuentes. Diagnóstico de diferentes aneuploidías en abortos espontáneos Caracterización de reestructuraciones cromosómicas. P.e.: Detección e identificación de Translocaciones no balanceadas “de novo” Detección de Marcadores cromosómicos Utilidades y aplicaciones clínicas de la FISH. Detección de Deleciones, duplicaciones e isocromosomas. En general, detección de anomalías cromosómicas en células en interfase Estudio de anomalías cromosómicas “sutiles” o “crípticas” en zonas subteloméricas (anomalías subteloméricas). Identificación de cromosomas marcadores Parejas con abortos de repetición Sospecha de síndrome de microdeleción en retraso mental Tabla 2. Utilidades y aplicaciones clínicas de la FISH 16 Figura 23. Esquema de la FISH La técnica consiste en someter la muestra con los núcleos a calor, para desnaturalizar o abrir la doble cadena de ADN, y entonces unirla con una sonda. La sonda es la secuencia de ADN complementaria a la que queremos localizar, la cual hemos construido usando nucleótidos modificados químicamente que están marcadas con moléculas fluorescentes que permitirán visualizarla con luz ultravioleta una vez hibridada. Cuando ponemos el ADN abierto en contacto con la sonda, ésta, como es más pequeña, se une antes que la propia cadena, y así el cromosoma queda marcado. (Fig. 23) Las células o los cromosomas en metafase que van a ser estudiados se preparan en portaobjetos para ser evaluados al microscopio, motivo por el que la FISH se llama in situ, porque se hace en un portaobjetos, dónde se fijan las células a estudio. Estas preparaciones se obtienen mediante las técnicas habituales para los estudios citogenéticos de rutina. En el diagnóstico prenatal, pueden utilizarse células amnióticas, de vellosidades coriales o sangre fetal obtenida por punción percutánea del cordón umbilical. Sin embargo, y esto es uno de los avances más importantes, la FISH no necesita preparaciones obligatoriamente en metafase como sucede con las técnicas citogenéticas standard. Al contrario, puede realizarse un diagnóstico rápido, de gran utilidad sobre todo para el diagnóstico prenatal y para muestras tumorales, estudiando células inmovilizadas en interfase que se obtienen directamente de las muestras o de una extensión/sección y posterior fijación de la muestra. Como cada cromosoma ocupa un territorio dentro del núcleo en interfase, es posible determinar el número de cromosomas o determinadas regiones cromosómicas contando el número de señales presentes. Para la observación del FISH al microscopio se requiere de un microscopio de fluorescencia (con luz ultravioleta) y de un sistema de filtros adecuados de acuerdo con la longitudes de onda de las señales fluorescentes (los más comunes: dapi, verde, rojo, aqua) La capacidad para detectar y caracterizar anomalías cromosómicas mediante FISH ha aumentado y mejorado en los últimos años por el rápido incremento y perfeccionamiento de sondas cromosómicas específicas. En la actualidad, pueden detectarse regiones de 1-10 kilobases (Kb) de tamaño. Existen sondas diferentes dependiendo de las distintas necesidades para la detección de anomalías cromosómicas. La elección de la sonda variará con cada aplicación particular en cuestión. En la actualidad hay un gran número de sondas comerciales disponibles, ofreciendo todas ellas un resultado rápido y fiable en la caracterización de determinadas anomalías cromosómicas. En general, se distinguen cuatro tipos de sondas, en función de las estructuras que son capaces de detectar en el núcleo celular o en metafase: 17 4.1.1. Sondas locus-específicas (LSI). Estas sondas hibridan con una secuencia única de ADN, es decir, son específicas para un locus determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific identifier) o sondas de secuencia única. Las sondas locus-específicas tienen su aplicación dirigida a la detección de aneuploidías, pero también permiten detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas e identificar deleciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Megabases (Mb). No obstante, su aplicación requiere conocer a priori la región que se desea estudiar. En función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 Kb, como los plásmidos, o son vectores más largos de 80 Kb -1 Mb como los Bacterial artificial chromosomes (BACs) o Yeast artificial chromosomes (YACs). Es el ejemplo de la sonda LSI para los cromosomas 13 y 21 utilizada comercialmente, la cual es un vector de E.coli que contiene una mezcla de secuencias de DNA únicas que se hibridan en la región 13q14 del cromosoma 13 y en las regiones 21q22.13 a 21q22.2 del brazo largo del cromosoma 21. (Fig. 24) 4.1.2. Sondas centroméricas (o alfoides) El DNA satélite o repetitivo constituye aproximadamente del 10 al 20% de todo el DNA humano. En particular, los cromosomas llevan de 105 a 106 pares de bases de secuencias DNA centroméricas o pericentroméricas cortas repetidas en tándem. Las unidades monoméricas que forman estas secuencias satélites alfa, a pesar de ser prácticamente idénticos para todos los cromosomas, varían de tal manera (en 2-3% de su secuencia) que muchas son cromosoma-específico lo que permite que la mayor parte de los centrómeros individuales puedan ser distinguidos, a excepción de las parejas de centrómeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros de los cromosomas 14 y 22. Se han aislado y clonado sondas para estas secuencias específicas para la mayoría de los cromosomas humanos y están comercialmente disponibles, de forma que se pueden detectar e identificar alteraciones de tipo numérico (monosomías, trisomías...). Se conocen como sondas CEP (chromosome enumeration probe). Es el ejemplo de la sonda CEP 18/X/Y, plásmido de E.coli utilizado para detectar secuencias satélite alfa en las regiones centroméricas de los cromosomas 18, X e Y en el screening de aneuploidías en líquido amniótico. (Fig. 25). Figura 24. Sondas de secuencia única 13/21 Figura 25. Sonda CEP 18/X/Y 18 4.1.3. Sondas subteloméricas Los telómeros son una zona del genoma humano con alta concentración de genes y, por tanto, pequeñas alteraciones en esa zona podrían afectar a genes candidatos a producir síndromes que conlleven retraso mental. La mayoría de estas anomalías teloméricas son indetectables para la citogenética convencional, de ahí el nombre de “crípticas” o “sutiles”. Esto es debido a que el tamaño y el patrón de bandas de estas regiones cromosómicas son muy similares y no se pueden distinguir convenientemente como ocurriría en el caso de una translocación, o bien, puede ser debido a que el tamaño de la anomalía es tan pequeño que supera el límite de resolución de las actuales técnicas de bandas. Por ello se utilizan sondas subteloméricas, que contienen secuencias específicas de ADN que se encuentran aproximadamente a 100-300 Kb del extremo del cromosoma y se usan en la identificación de deleciones y rearreglos teloméricos submicroscópicos. Poseen una alta resolución que varía según la medida de la sonda utilizada (30-100 Kb). (Fig. 26) 4.1.4. Sondas de pintado cromosómico. Las sondas painting o de pintado cromosómico, también conocidas como sondas WCP (whole chromosome painting) son sondas complejas que utilizan una mezcla de diferentes secuencias de DNA que son homólogas a muchas zonas a lo largo de un cromosoma específico, y que son generadas a partir de cromosomas microdiseccionados que se obtienen mediante separación cromosómica por citometría de flujo y se marcan y amplifican directamente mediante DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primer-Polimerase Chain Reaction). Esto permite que el cromosoma sea pintado o decorado tanto en metafase como en el núcleo en interfase. Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado cromosoma se consiguen pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes (con excepción de las regiones centroméricas y teloméricas), permitiendo así detectar de forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales intercromosómicas que afecten a ese cromosoma específico, como por ejemplo, detectar translocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética convencional, así como para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma derivado o en pequeños marcadores supernumerarios. (Fig. 27). Figura 26. FISH con sonda subtelomérica 11p (D11S2071, Cytocell) Figura 27. Sonda de pintado del cromosoma 6 en color verde, WCP 6 Spectrum Green (Vysis). 19 Los principales inconvenientes de la utilización de estas sondas son la no detección de inversiones paracentroméricas y su baja resolución, que impide detectar pequeñas deleciones, duplicaciones y translocaciones (< 2-3 Mb). Con el pintado cromosómico múltiple se consigue pintar de forma simultánea todos los cromosomas pero en metafases independientes. 4.2. FISH multicolor o M-FISH En los últimos años, se han perfeccionado las técnicas de FISH, y han aumentado el número de sondas comercialmente disponibles. Ello nos permite en la actualidad utilizar distintas sondas marcadas de manera diferente en una misma preparación, utilizando diferentes colores para la fluorescencia de las diferentes sondas, etc. Hoy por ejemplo, disponemos del Multicolor painting (más conocido como multicolor FISH o M-FISH) que nos permite analizar en una misma preparación sondas que “dibujarían” con 6-8 colores diferentes todos los cromosomas de una metafase, de forma simultánea, pintando cada pareja de cromosomas homólogos de un color distinto, es decir, permite el análisis directo de todos los cromosomas en un único experimento de FISH. De esta forma, se obtiene un cariotipo en colores (Fig. 28) que permite detectar y clasificar, de forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales intercromosómicas que provocan un cambio en el patrón característico de pintado de cada cromosoma. 4.3. SKY Paralelamente, se ha desarrollado una metodología similar a la M-FISH, que permitía obtener el denominado cariotipo espectral (Spectral Karyotyping, SKY), mediante el cual se consigue el rastreo del genoma humano completo mediante definición espectral definida para cada cromosoma La diferencia entre ambas técnicas radica en el modo de adquisición y análisis de las imágenes. Mientras la M-FISH utiliza filtros ópticos específicos para la captura de cada fluorocromo en particular, el SKY, haciendo uso de un interferómetro, realiza una interpretación basándose en el espectro píxel a píxel a lo largo de todo el cromosoma. (Fig. 29). Figura 28. M-FISH Figura 29. SKY 20 4.4. CGH La CGH o Hibridación Genómica Comparada o comparativa es una técnica de citogenética molecular que nos permite la identificación de ganancias o pérdidas cromosómicas por rastreo del genoma completo en una simple etapa. Tiene la ventaja de poder realizar una búsqueda de anomalías a lo largo de todo el genoma sin necesidad de disponer de información previa acerca de la anomalía cromosómica en cuestión. Ha sido la primera técnica combinada de citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis global del genoma. Esta técnica consiste en la hibridación in situ simultánea de dos ADN en igualdad de proporciones, el ADN genómico de la muestra de un paciente con un ADN humano normal (ADN de referencia o control) en una extensión cromosómica. Ambos ADNs están marcados con diferentes fluorocromos. Así se marca el ADN problema del paciente con un fluorocromo rojo y el ADN normal control con un fluorocromo verde. Posteriormente se mezclan y se añade DNA cot-1 que es un DNA placentario rico en secuencias de repetición capaz de bloquear las hibridaciones no específicas que se puedan dar. Esta mezcla de DNAs se hace hibridar con cromosomas normales en metafase. Se produce una reacción por competencia, donde si la cantidad de ADN es similar (las marcas rojas y verdes son equitativas) el color resultante es amarillo. Sin embargo, en presencia de deleciones o duplicaciones existe una mayor proporción de color verde o rojo, respectivamente. Es decir, si existe una deleción en una zona del genoma del paciente, ésta aparecerá con un color verde porque hay una mayor proporción relativa del ADN control (verde), y rojo si existe una duplicación porque hay una mayor proporción relativa del ADN problema (rojo). (Fig. 30). La visualización de las señales fluorescentes son detectadas y analizadas mediante un software específico y adecuado que realiza un análisis digital, donde se observan las ganancias y pérdidas comparando las desviaciones de señal con respecto a un valor estándar. A partir del análisis de un mínimo de 10-12 células se obtiene el valor promedio y se generan los perfiles de ganancias y pérdidas (por encima del umbral 1.25 de fluorescencia relativa se considera ganancia y por debajo del 0,75 pérdida). Debido a que la CGH se basa en análisis del DNA, no son importantes ni el cultivo de la muestra ni la disponibilidad y la calidad de las metafases. Incluso puede utilizarse en tejidos no viables. Esto hace que esta técnica sea muy útil en el laboratorio de citogenética, sobre todo en las muestras en las que el cariotipo no puede ser completado por las técnicas convencionales. Figura 30. Esquema de la técnica CGH convencional 21 La sensibilidad de la CGH aún está sometida a controversia, pero según los diversos autores la CGH puede detectar anomalías de 2-10 Mb de ADN. Las anomalías que se puede detectar con la CGH son aneuploidías parciales, bien en forma de marcadores cromosómicos, deleciones parciales o duplicaciones. Una de las grandes desventajas de la CGH es que no puede detectar anomalías cromosómicas balanceadas, ya que sólo detecta pérdida o ganancia de material cromosómico. Otra desventaja es que la información que nos proporciona tiene escaso valor en algunos casos de mosaicismo, sobre todo los de baja proporción, ya que las anomalías cromosómicas sólo se detectan si existen en la mayoría de las células de la muestra La técnica de CGH descrita ha sido reemplazada, actualmente, por la técnica aCGH o CGH array, la cual, es similar al de CGH, pero la hibridación se realiza en una matriz inmovilizada o arrays, en lugar de extensiones cromosómicas. Posteriormente, estos arrays son escaneados y los datos analizados con un software adecuado que permite detectar las diferencias en el número de copias entre el ADN del paciente y el ADN control. (Fig.31 y 32). Figura 31. Escaneado de un microarray CGH . Se muestran los canales rojo y verde a vista completa y con zoom Figura 32. Vista cromosómica (abajo) y génica (arriba) del resultado de un aCGH mostrando el caso de una microdeleción del cromosoma 16 (del16p13.3) 22 Esta hibridación genómica comparativa empleando arrays o cariotipo molecular, como se la ha denominado, permite examinar todo el genoma en un simple chip con una gran resolución, 10 veces mayor que los cromosomas prometafásicos de 750 bandas, detectando ganancias y pérdidas de material cromosómico, sin necesidad, además, de cromosomas metafásicos. Es una técnica enteramente molecular, con aplicación en citogenética y puede considerarse un “híbrido” de ambas para la cual deben trabajar expertos de las dos disciplinas. La mayoría de las plataformas de arrays se diseñan para detectar aneuploidías, síndromes de microdeleción y microduplicación así como rearreglos subteloméricos desbalanceados. La aplicación de estas técnicas está recomendada en individuos con retraso mental pero con cariotipo aparentemente normal, retraso en el desarrollo no explicado, autismo, rasgos dismórficos y anomalías congénitas múltiples de causa desconocida. 5. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS DISTINTAS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS Técnicas Aplicaciones Bandeo G -Identificar anomalías cromosómicas estructurales y numéricas -Bajo Costo -Pesquisa de todo el genoma. -Requiere células en división. -Baja eficiencia en cariotipos complejos. FISH -Determinar la presencia número de copias y localización de secuencias de ADN. -Su coste no es demasiado elevado. -Es rápida y sencilla. -Se aplica a células en interfase y en división. -Solo es informativa de la secuencia que se desea investigar. Multi-FISH y SKY -Detecta rearreglos cromosómicos complejos que involucran más de un cromosoma. -Identifica cromosomas marcadores. -Pesquisa de todo el genoma. -Clarifica rearreglos cromosómicos complejos. -Es laboriosa y de alto costo. -Requiere células en división y de muy buena calidad. -No detecta anomalías intracromosómicas. -Detecta pérdidas y ganancias de secuencias de ADN. -Pesquisa de todo el genoma. -No necesita células en división. -Tanto el equipamiento como los reactivos son costosos. -Las anomalías que se detectan deben ser confirmadas por FISH. aCGH Ventajas Desventajas Tabla 3. Ventajas y desventajas de las técnicas citogenéticas. 6. RESUMEN Las anomalías estructurales son reordenamientos estructurales que se originan por una rotura cromosómica seguida de reconstitución en una combinación anormal y sus efectos son complejos de predecir. Las anomalías estructurales balanceadas o equilibradas son aquellas donde no existe pérdida o 23 ganancia de material genético y habitualmente no se acompañan de efecto fenotípico, pero pueden tener un riesgo incrementado de anomalía cromosómica en la descendencia, mientras que las anomalías estructurales desbalanceadas o desequilibradas son aquellas donde sí existe pérdida o ganancia de material genético y se acompañan de efecto fenotípico en menor o mayor medida ya que no conservan el complemento cromosómico íntegro. El diagnóstico citogenético prenatal se puede solicitar siguiendo distintos criterios, entre ellos, un cribado combinado de primer trimestre positivo, en padres portadores de alteraciones cromosómicas o en malformación fetal actual asociada a cromosomopatía. Las técnicas de citogenética molecular han permitido la detección e identificación precisa de un gran número de anomalías cromosómicas, que con la citogenética convencional pasaban desapercibidas, como las reorganizaciones cromosómicas complejas, las microdeleciones y las reorganizaciones crípticas. Es muy importante quedarnos con el concepto de que ambas técnicas citogenéticas, las convencionales y las moleculares, no son excluyentes entre sí, sino complementarias, y unas vienen a paliar las limitaciones de las otras. 24 BIBLIOGRAFÍA 1. ISCN (1995): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Mitelman F (ed); S. Karger, Basel. ISBN: 978-3-8055-6226-3. 2. Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance. A common European framework for quality assessment for constitutional and acquired cytogenetic investigations.Coordinators:Authors:Ros Hastings, Rod Howell, Franca Dagna Bricarelli, Ulf Kristoffersson, Simona Cavani . 3. Citogenética. Juan Ramón Lacadena. Ed. Complutense. 1ª Edición. Marzo 1996.ISBN: 8489364-58-X 4. Nelly TE. Clinical Genetics and genetics Counseling.Year Book Medical publishers. 2.nd ed. Chicago;1986. 5 Harper PS. Practical Genetic Counseling. Butterworth-Heinemann, 5.th ed. Oxford, 1998. 6. Repercusión clínica de las anomalías cromosómicas. Moreno García, M; Fernández Martínez, FJ, Barreiro Miranda, E. An Pediatr (Barc). 2004;61:236-41. - vol.61 núm 03. 7 Professional Guidelines for Clinical Cytogenetics: General Best Practice Guidelines (2007). 8. Standards for the Medical Laboratory. Version 2.01, (2009) Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd. 9. Wolstenholme J, Emslie JB, Connors S. Association of Clinical Cytogeneticists, chorionic villus sampling database 1987-2000. Prenatal diagnosis 2006 26(5) 420-7 10. Hsu LYF and Benn PA (1999). Revised Guidelines for the Diagnosis of Mosaicism in Amniocytes. Prenatal Diagnosis 19 1081-82 11. Levy B, Dunn TM, Kaffe S, Kardon N, Hirschhorn. Clinical applications of comparative genomic hybridiszation. Genetics in Medicine 1998; 1: 4-12. 12. Schwartz S. Molecular Cytogenetics: show me the colors. Genetics in Medicine 1999; 1: 178-80. 13. McNeil N, Ried Th (2000). Novel molecular cytogenetic techniques for identifying complex chromosomal rearrangements: technology and applications in molecular medicine. Exp Rev Mol Med : September 14th, pp 1-14. 14. Levsky JM, Singer RH (2003). Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J Cell Sci 116: 2833-2838. 15. Shaffer LG, Bejjani BA (2004). A cytogeneticist’s perspective on genomic microarrays. Hum Reprod Update 10: 221-226. 16. Nussbaum RL. Genética en Medicina. Thompson and Tompson.7ª ed. 2008. ISBN: 9788445818701. 17. Association for clinical cytogenetics Prenatal diagnosis best practice guidelines (2009) v1.00. 25 ENLACES DE INTERÉS ACC (Asociación de Citogenética Clínica del Reino Unido): http://www.cytogenetics.org.uk/ AGT (Asociación de Tecnólogos en Genética de USA): http://www.agt-info.org/ ECA (Asociación Europea de Citogenetistas): http://www.e-c-a.eu/EN/ ECARUCA (Registro de Aberraciones Cromosómicas Desbalanceadas de la Asociación Europea de Citogenetistas) http://agserver01.azn.nl:8080/ecaruca/ecaruca.jsp Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología: http://atlasgeneticsoncology.org Fuentes en Citogenética Molecular, Universidad de Bari (Italia): http://www.biologia.uniba.it/rmc/ Grupo de Citogenética Molecular de Instituto Sanger: http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ Recursos para Citogenética Molecular: http://www.biologia.uniba.it/rmc/ Variación Cromosómica en el Hombre (Base de Datos): Catálogo de Variantes y Anomalías Cromosómicas: http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/index.html 26 EVALUACIÓN CASO CLÍNICO 1 Paciente de 39 años de edad con 17 semanas de gestación a quien se le realizó diagnóstico prenatal citogenético por cultivo de líquido amniótico, obteniéndose como resultado un feto de sexo femenino que presentaba una translocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas 13 y 18, cuya fórmula cromosómica era 46,XX,t(13,18), la cual estaba presente en todas y cada una de las las 30 metafases analizadas mediante bandeo GTG de 2 frascos de cultivo diferentes (fig. 1). Posteriormente se realizaron estudios cromosómicos de sangre periférica de ambos padres cuyos resultados fueron normales. Cromosoma 13 Cromosoma 18 Fig 1. Cariotipo parcial con t(13,18). Con la técnica de bandas GTG no se pudo observar que existiera pérdida de material cromosómico, por lo que, en principio, habría que pensar en una translocación recíproca balanceada. Pero esto no es posible asegurarlo, ya que puede haber ocurrido un desequilibrio de información génica de resultado imprevisible en el paciente (y su descendencia). La alteración en los cromosomas fetales se consideró "de novo", ya que dicha alteración no se detectó en el cariotipo de los padres. Se citó a los padres a la consulta de Consejo Genético, donde se les informó adecuadamente y estos optaron por la interrupción voluntaria del embarazo a la semana 21 de gestación. El análisis del feto tras la interrupción mostró una hembra fenotípicamente normal y en el resultado anatomopatológico no se informaron anomalías morfológicas. Al feto se le tomó una muestra de sangre por punción del corazón y una muestra de piel de la región glútea y muslos para estudios cromosómicos. Al analizarse 50 metafases provenientes de sangre fetal se halló un complemento cromosómico normal (46, XX) mientras que el cultivo de piel dió como resultado, en las 56 células analizadas, un cariotipo 46, XX t(13q;18q). Este hallazgo demostró que esta alteración cromosómica estaba presente sólo en algunos tejidos, encontrándonos ante un caso de mosaicismo estructural. 1 - Mosaicismo es la presencia en un individuo o en un tejido de al menos dos líneas celulares que difieren desde el punto de vista genético. No es cierto respecto al mosaicismo: a) Puede ser numérico b) Se pueden detectar dos o más fórmulas cromosómicas diferentes c) Se puede producir como consecuencia de la no disyunción de una división mitótica poscigótica temprana d) Las líneas celulares derivan de dos o más cigotos diferentes. En cuanto a las translocaciones: Se forman por intercambio recíproco de fragmentos rotos de cromosomas. En todas las translocaciones el número cromosómico total cambia La mayoría de los casos son reordenamientos balanceados que portan un fenotipo normal aunque existe un riesgo aumentado de producir gametos desequilibrados, y por tanto de descendencia desequilibrada. d) A y C son ciertas. 2a) b) c) 27 3 - En el síndrome del maullido de gato, síndrome producido por una deleción cromosómica, es falso que: a) En el periodo neonatal los pacientes presentan un llanto característico, similar al de un gato. b) Es debido a una deleción del brazo corto del cromosoma 4. c) Se presenta con microcefalia y retraso mental. d) Se suprime el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa. 4a) b) c) d) Tras el subcultivo de una muestra de líquido amniótico: Se incuban los subcultivos durante 72 h y después se valora el crecimiento. Si el índice mitótico es el adecuado se sacrifica (se añade la colchicina) el subcultivo a las 24 h. Se le añade la colchicina a las 12 h tras ser subcultivado. Ninguna es cierta. 5 - En cuanto a los métodos utilizados para la obtención de tejido fetal para el análisis cromosómico, es cierto: a) La amniocentesis se debe realizar en la semana 11-14 de gestación. b) Se prefiere la Obtención de Vellosidades Coriónicas a la amniocentesis por la menor tasa de pérdidas fetales. c) La técnica de elección es la foniculocentesis por proporcionar resultados más precoces d) Ninguna es cierta. 28 CASO CLÍNICO 2 Paciente masculino de 7 años de edad, sin antecedentes patológicos ni de consanguinidad. A los 3 meses de edad se le diagnostica estenosis de la rama pulmonar bilateral. Posteriormente estrabismo, retraso mental y del desarrollo psicomotor e hipercalcemia. Al examen físico, punta nasal elevada, labio inferior grueso e hipotonía generalizada. Por el fenotipo se sospecha de Síndrome de Williams, que es una patología multisistémica causada por la deleción del brazo largo del cromosoma 7, que abarca de 1,5 a 1,8 millones de pares de bases. La identificación de esta deleción se logra en un 95% de los casos mediante estudio por hibridación in situ fluorescente (FISH). Al paciente, se le realiza cariotipo, cuya fórmula cromosómica fue 46,XY correspondiente a un paciente de sexo masculino cromosómicamente normal. Posteriormente se realiza FISH para la región crítica del síndrome de Williams situada en 7q, siendo normal. Ante este resultado, se realizó una revisión bibliográfica, de modo que se confirmaron los criterios clínicos necesarios para mantener el diagnóstico, por lo que, teniendo en cuenta la alta sospecha clínica de éste síndrome, se realizó estudio por Hibridación Genómica Comparada, detectándose mediante esta técnica una deleción de 1,6 Mb en el cromosoma 7, del(7)(q11.23), confírmándose con esto el diagnóstico de Síndrome de Williams. 1 - La capacidad para detectar y caracterizar anomalías cromosómicas mediante FISH ha aumentado y mejorado en los últimos años por el rápido incremento y perfeccionamiento de sondas cromosómicas específicas. Respecto a estas sondas cromosómicas, no es cierto: a) Las sondas LSI son sondas de secuencia única que se unen a las zonas centroméricas de los cromosomas b) Las sondas centroméricas se usan para identificar cromosomas como el 18 o la X. c) Las sondas subteloméricas reconocen zonas que contienen gran cantidad de genes. d) Las sondas WCP sirven para detectar translocaciones difícilles de identificar por citogenética convencional. 2 - Con la CGH se puede realizar una búsqueda de anomalías a lo largo de todo el genoma sin necesidad de disponer de información previa acerca de la anomalía. Además, es cierto: a) Consiste en la hibridación in situ simultánea de dos ADN en igualdad de proporciones, el ADN genómico de la muestra de un paciente con un ADN humano normal. b) Es muy importante garantizar el éxito en el cultivo de la muestra, así como la disponibilidad y la calidad de las metafases obtenidas, hecho por el cual, puede utilizarse incluso en tejidos no viables. c) Una de las grandes ventajas de la CGH es que puede detectar pérdida o ganancia de material cromosómico, así como anomalías cromosómicas balanceadas como las inversiones paracéntricas. d) Todas son ciertas. 3 - La técnica CGH array, es similar a la CGH, pero la hibridación se realiza en una matriz inmovilizada llamados arrays. Respecto a ella, es falso: a) Tiene una resolución muchísimo mayor que la de un cariotipo de alta resolución por bandeo G. b) La mayoría de las plataformas de arrays se diseñan para detectar aneuploidías, síndromes de microdeleción y microduplicación así como rearreglos subteloméricos desbalanceados. c) También se le ha llamado cariotipo molecular. d) Son necesarios cromosomas metafásicos para su realización. 29 4 - Las técnicas de citogenética molecular han permitido la detección e identificación precisa de un gran número de anomalías cromosómicas. En cuanto a éstas: a) La técnica CGH viene a ser la “panacea” de las técnicas citogenéticas. Con ella se puede detectar cualquier tipo de anomalía cromosómica. b) Con la técnica Multi-FISH se pueden detectar rearreglos intercromosómicos complejos como una translocación c) Con la técnica Multi-FISH se puede detectar una inversión paracentromérica del cromosoma 3. d) Con la técnica SKY se puede detectar una inversión pericentromérica del cromosoma 8. 5 - En el caso de las anomalías cromosómicas estructurales, como es el caso de la deleción de este niño: a) Cualquier tipo de deleción, debido a que existe pérdida de material cromosómico, es detectable mediante la práctica de un cariotipo mediante bandeo G en la muestra del paciente. b) Siempre hay que recurrir a técnicas de citogenética molecular para detectarlas. c) Puede haber casos de deleciones crípticas intersticiales que se informen como un cariotipo normal. d) Como consecuencia de una deleción, siempre hay pérdida de material cromosómico que se traduce en monosomías, que al ser parciales, no presentan efecto fenotípico adverso. 30 NOTAS 31 NOTAS 32 NOTAS 33 ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE FARMACÉUTICOS ANALISTAS c/ Modesto Lafuente, 3 - entreplanta C y D 28010 Madrid Tel.: 91 593 84 90 - Fax: 91 593 01 34 Correo electrónico: Secretaría: [email protected] Tutoría y envío de resultados: [email protected] Web: www.aefa.es COMISIÓN DE FORMACIÓN CONTINUADA Coordinación y tutoría: Miriam Martínez Villanueva ISBN: 978-84-616-7915-7 Depósito Legal: M-36610-2013 Imprime: AYREGRAF Colabora:
