Genética de la tembladera o scrapie ovino

Genética de la tembladera o scrapie ovino
David Parra, Javier Cañón
Laboratorio de Genética. Facultad de Veterinaria. UCM.
http://www.ucm.es/info/genetvet
El scrapie, prurito lumbar o tembladera es una enfermedad degenerativa,
transmisible, que afecta al sistema nervioso central de óvidos y cápridos, que
pertenece al grupo de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, y cuyo curso
es fatal para el animal que la padece.
Esta enfermedad fue ya descrita en 1732 y afecta a la especie ovina de la
mayoría de los paises, con la excepción de Australia y Nueva Zelanda. Se
caracteriza, al igual que las demás Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, por
la acumulación de una proteína (PrP o prión) que adquiere una conformación
anormal (PrPsc) en diferentes órganos del animal afectado (Prusiner et al., 1990).
Los síntomas clínicos típicos del scrapie en la oveja incluyen incoordinación motora,
prurito, excitabilidad, temblores, finalizando con parálisis y la muerte del animal
(Dickinson, 1976; Clark y Moar, 1992). En algunas ocasiones no cursa con estos
síntomas y sólo las lesiones histopatológicas evidencian la enfermedad (Onodera y
Hayashi, 1994). Aunque no ha sido caracterizado ningún agente infeccioso, hay
evidencias experimentales de la existencia de diferentes tipos de scrapie (Bruce y
Dickinson, 1987).
Uno de los elementos centrales de esta dolencia es la proteína PrP, una
glicoproteína de la superficie de la neurona que se comporta como un marcador
consistente de la enfermedad. A diferencia de la proteína salvaje (PrPC) cuya función
es desconocida, la proteína alterada (PrPSc) es un marcador específico de la
enfermedad, constituyendo la base de una de las hipótesis sobre la etiología que
asigna a la propia PrPSc como el agente infeccioso o prión catalizando la
transformación del PrPC endógeno a PrPSc, lo que impediría el normal
funcionamiento de la proteína desencadenando la enfermedad degenerativa
(Prusiner et al., 1990). Un modelo de herencia sencillo (Parry, 1984) se ajusta
bastante bien a la hipótesis del prión como causante de la enfermedad. Sin
embargo, el hecho de que pueda ser transmitida experimentalmente no encaja con
esta hipótesis de enfermedad genética. Una hipótesis alternativa (Hunter, 1998)
propone el control genético de la susceptibilidad permitiría solventar las
inconsistencias de la hipótesis de enfermedad genética. De esta forma, lo que se
plantea es que la proteína salvaje actuaría como un receptor con escasa afinidad
para el agente desencadenante del scrapie, mientras que la proteína mutada (PrPSc)
tendría una mayor afinidad por dicho agente, de tal manera que sólo los portadores
del genotipo mutado padecerían la enfermedad.
Hoy resulta evidente la existencia de un determinismo genético para la
resistencia o la susceptibilidad a la enfermedad en la especie ovina asociado a la
combinación de determinados amino-ácidos en las posiciones 136, 154 y 171 de la
proteína PrP. En la especie ovina, el gen prp codifica una proteína de 256
aminoácidos. En este gen se han descrito una serie de mutaciones (Figura 1), 7 de
ellas en la región codificante que originan cambio amino-acídico, y una en el extremo
3’ no traducido (3’-UTR) detectable mediante la enzima EcoR1 (Hunter et al., 1991).
Los polimorfismos ubicados en la región codificante y asociados con la
susceptibilidad a la enfermedad afectan al codón 136 (Clouscard et al., 1995; Ikeda
et al., 1995) y a los codones 154 y 171 (Clouscard et al., 1995; Ikeda et al., 1995;
Hunter et al., 1996).
En la especie ovina, a diferencia de la especie bovina, se ha encontrado
asociación entre determinados haplotipos del gen prp y la aparición de la
enfermedad. Así, por ejemplo, se asocia los haplotipos V136R154Q171, A136R154Q171y
A136R154H171, con la susceptibilidad a padecer la enfermedad, y los haplotipos
A136R154R171 y A136H154Q171 con la resistencia a padecer la enfermedad (ver en la
tabla 1 el significado de los diferentes símbolos).
Tabla 1.- Relación entre aminoácido y su símbolo
Aminoácido
Símbolo
Alanina
Histidina
Glutamina
Arginina
Valina
A
H
Q
R
V
Es evidente que, independientemente de la hipótesis correcta, conocer el
genotipo de los animales, y sobre todo de los reproductores, puede resultar una
información de gran interés, sobre todo si tenemos en cuenta que el comportamiento
de los genotipos en relación con la susceptibilidad al scrapie puede ser diferente en
las diferentes razas y también en función del origen del scrapie (Clouscard et el.,
1995; Ikeda et al., 1995). Así, por ejemplo, el genotipo AA136RR154QQ171 que
aparentemente confiere resistencia al scrapie en la raza Cheviot (Hunter et al., 1996)
está asociado a una elevada susceptibilidad en ovejas de la raza Suffolk (Westaway
et al., 1994) y otras razas francesas (Barillet et al., 2002).
136
154
171
112
137
141
EcoR1
Región codificante
3’UTR
Figura 1.- Posición de algunas de las mutaciones descritas en el gen prp
En prácticamente todos los países europeos, incluido España, se ha llevado a
cabo, o se está llevando, un genotipado sistemático de los tres codones mediante
diferentes técnicas: PCR-RFLP (Hunter et al., 1994; Yuzbasuyan-Gurkan et al.,
1999), PCR alelo-específica (Okayama et al., 1989) o Primer Extension (Syvänen,
1999) con el fin de disponer de información sobre la frecuencia de las diferentes
variantes génicas y de los diferentes genotipos.
Recientemente, el 14 de febrero se publicó en el DOUE (Diario Oficial de la
Unión Europea) una Decisión de la Comisión por la que se fijan los requisitos
mínimos para el establecimiento de programas de cría de ovinos resistentes a las
encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). De acuerdo con esta Decisión, el
primero de enero de 2004 tendrán que estar disponibles programas de mejora en
todas las razas ovinas encaminados a incrementar la resistencia a las EET, así
como un criterio para el reconocimiento del nivel de resistencia a estas EET.
La participación de los rebaños en los programas de mejora podrá ser
voluntaria, a criterio del país, hasta el primero de abril de 2005, siendo obligatoria a
partir de esa fecha. Los programas de mejora consistirán, básicamente, en el
incremento de la frecuencia de los individuos ARR/ARR, genotipo que se considera
el de mayor resistencia al scrapie, y la reducción de aquellas variantes genéticas
asociadas a la susceptibilidad que son fundamentalmente la VRQ y ARQ. De hecho
cualquier reproductor que presente la variante del gen VRQ no sólo no podrá ser
utilizado para la reproducción, sino que no podrá salir de la explotación salvo para
ser sacrificado.
Aunque parece evidente que la susceptibilidad/resistencia al scrapie se
mueve en una cierta escala entre los diferentes genotipos cuyos valores,
posiblemente con pocas variaciones, pueda ser diferente entre razas (ver tabla 2) el
objetivo que parece claramente imponerse es el de disponer de animales
homocigotos para el alelo ARR. De hecho, la reciente Decisión publicada considera
rebaños de nivel I los formados en su totalidad por animales de genotipo ARR/ARR y
los rebaños de nivel II serán aquellos en los que la progenie proviene de moruecos
de genotipo también homocigoto ARR/ARR, es decir, se garantiza que la progenie
será portadora de al menos un alelo ARR.
Tabla 2.- Consideraciones sobre la utilización como reproductores de los diferentes
genotipos en la Plan Nacional contra el Scrapie de Gran Bretaña1
Genotipo
ARR/ARR
ARR/AHQ
ARR/ARH
ARR/ARQ
ARQ/ARH
ARQ/AHQ
AHQ/AHQ
ARH/ARH
AHQ/ARH
ARQ/ARQ*
ARR/VRQ
AHQ/VRQ
ARH/VRQ
ARQ/VRQ
VRQ/VRQ
Susceptibilidad/Resistencia
Se considera el genotipo más resistente al
scrapie
Animales considerados genéticamente resistente
pero que deben manejarse con cuidado si
pretenden ser utilizados como reproductores
Animales con escasa resistencia al scrapie que
podrán ser utilizados como reproductores
libremente sólo hasta finales del año 2004.
Posteriormente, con la excepción de los
señalados con * se utilizarán para reproducción
por un período máximo de 3 años o hasta el final
de su vida.
Animales genéticamente susceptibles al scrapie
pero que podrían ocasionalmente ser utilizados
como reproductores en el contexto de un
programa de mejora aprobado2.
Animales muy susceptibles al scrapie que
deberán ser sacrificados o castrados
*
Este genotipo es cuidadosamente vigilado y curiosamente en España, hasta donde tenemos
información, es el que aparece en la mayoría de los animales afectados de scrapie
1
Es posible que algunas de estas consideraciones se vean modificadas después de la publicación de la
Decisión de la Comisión
2
En este caso se valora positivamente la posibilidad que tienen estos animales de transmitir el alelo
ARR que confiere resistencia al scrapie.
En Francia, desde 1999, se ha puesto en marcha un programa experimental
con 15 rebaños de ovejas de aptitud lechera en los que la incidencia de scrapie era
elevada y que tuvo como objetivo analizar la evolución de la incidencia de la
enfermedad al utilizar sistemáticamente moruecos de genotipo ARR/ARR. Los
resultados para uno de los rebaños incluidos en el seguimiento aparecen en la tabla
3 y puede observarse una drástica reducción de la frecuencia de animales
clínicamente enfermos. Esta gran reducción parece explicarse, en gran medida,
porque las placentas de las hembras resultaron negativas incluso cuando la oveja
era positiva al scrapie si sus corderos eran heterocigotos u homocigotos resistentes.
Tabla 3.- Resultados de la utilización sistemática de moruecos ARR/ARR sobre la
incidencia y el riesgo relativo al scrapie
1
Año de nacimiento
Nº de ovejas
% ovejas nacidas de
moruecos ARR/ARR
Incidencia de
scrapie
Riesgo relativo
1997
1998
1999
2000
98
92
92
73
3,1 %
5,4 %
100,0 %
100,0 %
27
20
0
0
1,000
0,975
0,856
0,184
1
Se refiere al cociente entre la proporción de afectados en el año 1997 dividido por la proporción de afectados en
los otros años. Así, por ejemplo, el riesgo o probabilidad de padecer scrapie es 5,4 veces menor si se ha nacido
en el año 2000 que si lo ha hecho en el año 1997.
En el Laboratorio de Genética de la Facultad de Veterinaria de Madrid hemos
analizado (ver protocolo de análisis en cuadro1) durante los últimos 2 años un
número aproximado de 300 animales de diferentes razas ovinas autóctonas, incluida
la raza Assaf aún no oficialmente reconocida pero con programas de mejora
bastante desarrollados. Los resultados de las frecuencias obtenidas se presentan en
la tabla 4 y se representan gráficamente en la figura adjunta.
Tabla 4.- Frecuencias de las variantes alélicas y genotípicas
Variante del gen
ARR
Frecuencias medias 0,2443
Genotipo Frecuencia
ARR/ARR
0,049
ARR/AHQ
0,000
ARR/ARH
0,000
ARR/ARQ
0,392
ARQ/ARH
0,078
ARQ/AHQ
0,013
AHQ/AHQ
0,000
ARH/ARH
0,000
AHQ/ARH
0,000
ARQ/ARQ
0,463
AHQ/VRQ
0,003
ARH/VRQ
0,000
ARQ/VRQ
0,003
VRQ/VRQ
0,000
ARR/VRQ
0,000
ARQ
ARH
AHQ
VRQ
0,7055
0,0388
0,0081
0,0032
0% 4%
24%
1%
71%
ARH
ARR
AHQ
ARQ
VRQ
Algunos comentarios en relación con estos resultados pueden ser de interés.
La frecuencia de animales homocigotos para el alelo ARR, los únicos que se
proponen como reproductores aceptables en los rebaños del nivel más elevado, es
inferior al 5 %. Evidentemente una medida que pretendiera utilizar sólo este 5 % de
reproductores podría dar lugar a una drástica reducción de las ganancias genéticas
esperadas para los caracteres de interés económico si no se actúa con buen criterio,
y esto aunque éstas características no tuvieran ninguna asociación con los
diferentes alelos del gen prp.
Cuadro 1.- Protocolo de análisis
El ADN se extrajo a partir de sangre y de semen siguiendo protocolos estándar. La
amplificación de 639 pb de ADN genómico correspondiente al gen prp se realizó en
un volumen de 25 µL con la siguiente composición: 5 µl de la lisis alcalina, 0,5
unidades de Taq polimerasa (Biotools), 10 pmol de cada cebador: SCRAPOV-for:
(GTGAAAAGCCACATAGGCAGTTGG)
y
SCRAPOV-rev:
(GCTCCACCACTCGCTCCATTATCTTG), 1,5 mM de MgCl2, Buffer 1x y 200 µM de
dNTPs. Después de purificar el producto amplificado por precipitación con etanol (con
el objetivo de eliminar los restos de oligonucleótidos y dNTPs no incorporados) se
llevó a cabo una minisecuenciación para la que se emplearon oligonucleótidos
específicos diseñados a partir de la secuencia de PrP ovina AJ223072 (Goldmann et
al., 1990), con distintas longitudes para evitar el solapamiento entre productos finales
(ver Tabla). Esta reacción en múltiplex se llevó a cabo en un volumen final de 10 µL,
con la siguiente composición: 5 µL de kit SNaPshot (Applied Biosystem), 1 µL de
PCR purificada (0.4 pmol total) y 1 µL de cada cebador a 5 µM. Previo a su carga en
el secuenciador automático ABI PRISM 3100 se purificó mediante precipitación con
etanol. El análisis de los fragmentos se llevó a cabo mediante el software Genescan
3.7.1®. El tamaño relativo de los fragmentos se determinó por comparación con el
estandar interno de tamaño GeneScan 120-LIZ (Applied Biosystems). En la figura 3
pueden observarse la lectura de dos genotipos correspondientes a dos imágenes
obtenidas mediante este método de análisis.
Tabla.- Oligonucleótidos diseñados para el análisis del gen PrP ovino.
Cebador
Prp136
Prp154
Prp171.2
Prp171.3
Secuencia(1)
GTGGCTACATGCTGGGAAGTG
TATACATTTTGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATC
TATATCCAAGTGTACTACAGACCAGTGGATC
GCTACAGACCAGTGGATCA
Resultado(2)
negro (C:A) / rojo (T:V)
azul (G:R)/ verde (A:H)
azul (G:R)/ verde (A:H o Q)
azul (G:H) / rojo (T:Q)
1)
Todas las secuencias tienen una orientación 5’-3’
El resultado indica en primer término el color de la señal, y entre paréntesis, el nucleótido
detectado (en cursiva) y correspondencia amino-acídica (en negrita).
2)
Debemos tener en cuenta que la intensidad de selección en un programa de
selección depende del número de animales que se elijen en relación al número de
animales disponibles. Si sólo tenemos disponibles el 5 % de la población para elegir
los padres de la generación siguiente es como si de pronto el porcentaje de animales
en control se redujera al 5 %. Al contrario, imaginemos que tenemos 100 moruecos
en evaluación y que necesitamos elegir a los 5 mejores para ser utilizados
posteriormente mediante inseminación artificial. Si suponemos una distribución
uniforme de los genotipos resistentes entre la clasificación por mérito genético de los
100 moruecos, los 5 machos con genotipo ARR/ARR estarían situados a lo largo de
todo el rango de variación de esos 100 moruecos, por lo que la media del valor
genético de estos 5 moruecos sería prácticamente igual a la media de los 100
moruecos, es decir, la intensidad de selección sería nula y nulo el progreso genético
que se lograría.
Figura 3.- Imágenes proporcionadas por un ABI PRISM 3100 de dos genotipos,
AA136RH154HQ171 en la parte superior y AA136RR154RQ171 en la inferior
Una posible alternativa estaría en utilizar animales heterocigotos portadores
de alelos ARR, que aparacen en un porcentaje próximo al 45 %, y seguir de esta
forma progresando en el incremento de la frecuencia de los alelos ARR que, como
hemos comentado más arriba, confiere una significativa resistencia a los corderos
nacidos incluso cuando la madre fuera positiva al scrapie.
Tal vez el resultado más preocupante de los que presentamos pueda ser esa
elevada frecuencia de animales homocigotos para el considerado alelo salvaje ARQ
(46 %), que ha sido el genotipo de casi todos los animales a los que se ha
diagnosticado el scrapie. La frecuencia media de este alelo es de casi el 71 % y en
todas las razas analizadas el valor es siempre muy elevado, entre el 60 y el 82 %.
Por el contrario, la variante genética VRQ es muy poco frecuente en todas las
poblaciones analizadas en nuestro laboratorio, incluso en la mayoría de las razas
francesas la frecuencia de este alelo es inferior al 10 %.
Tenemos la sensación que desde Bruselas se han precipitado decisiones que,
aunque podrían tener una justificación en algunos paises, no estamos convencidos
de que el coste de un programa de estas características tenga la prioridad que
necesariamente tendrá que imponer nuestra administración. Necesitaremos algún
tiempo para conocer con suficiente precisión cual es la frecuencia de la enfermedad,
con que genotipos se asocia en las diferentes razas, y si la selección basada en
estos genotipos es, como debiera, para resistencia a la enfermedad o para retrasar
la aparición de la misma.
Existe otra faceta de gran impacto sobre la estrategia de gestión de estos
genotipos que es la que se refiere a los aspectos de sanidad, de hecho, desde el 1
de abril de 2002 la UE extendió el análisis de la encefalopatía espogiforme bovina a
ovinos y caprinos a través de encuestas. ¿Existe algún riesgo por el consumo de
animales susceptibles al scrapie?. El hábito de consumo de animales muy jóvenes
(< 2 meses) parece reducir, si existiera, el riesgo, aunque en algunos países
recomiendan la eliminación del sistema nervioso central y aparato digestivo de los
animales portadores de algún alelo VRQ. En cualquier caso, parece probable una
tendencia hacia la necesidad de genotipar cualquier animal, ya sea porque va a ser
utilizado como reproductor, ya sea porque va destinado a consumo. Evidentemente,
aunque después de pocos años el gen será prácticamente monomórfico y la
necesidad de llevar a cabo estos análisis será marginal, hasta que lleguemos a esa
situación serán necesarios grandes esfuerzos para el manejo de tan elevado número
de muestras en las que es necesario practicar un análisis, el genotipado, que todavía
requiere un importante grado de especialización.