Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del

Aportaciones del laboratorio en el
diagnóstico y el tratamiento del
paciente intoxicado.
Dpto. Toxicología y Legislación Sanitaria, Fac. Medicina
Universidad Complutense de Madrid
Dra. Ana María López Parra
Esquema
•
Introducción.
•
Muestras.
•
Envasado, conservación y almacenamiento.
•
Análisis químico-toxicológico.
•
Métodos de extracción.
•
Detección e identificación del tóxico:
técnicas espectrofotométricas
técnicas cromatográficas
técnicas inmunoquímicas
Introducción
La investigación toxicológica es
el conjunto de procesos
analíticos que tienen por objeto
el aislamiento, identificación y
determinación cuantitativa de
los tóxicos, tanto en el vivo
como en el cadáver, con el fin
de permitir el diagnóstico de la
intoxicación.
Muestras
•
•
•
•
•
•
Contenido gástrico
Sangre
Orina
Pelo
Saliva
Meconio
Muestras
Contenido gástrico
-Vómito, aspirado gástrico y lavados estomacales.
-En el caso de los lavados estomacales, primer
lavado.
-Un volumen de aproximadamente 20 ml.
-Puede ser necesario procedimientos de
homogenización, filtración y/o centrifugación.
-No representa grado de intoxicación.
Muestras
Sangre
-Es una de las muestras más útiles para la identificación y
especialmente para el análisis cuantitativo.
-La sangre total y el plasma son las muestras más
representativas.
-Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como
anticoagulante.
-Si se sospecha de intoxicación con etanol, utilizar fluoruro
sódico como conservante. Y la extracción deberá
efectuarse desinfectando la zona con cloruro mercúrico.
Muestras
Orina
-Ensayos preliminares en el screening de tóxicos.
-Para drogas de abuso.
-La concentración de un tóxico puede llegar a ser
100 veces mayor que en la sangre.
-Se debe de tomar antes del tratamiento.
-Como mínimo 50 ml.
Muestras
Pelo
-Tóxicos minerales
-Detección de drogas de abuso.
-Refleja el estado promedio de los elementos
minerales del organismo durante su crecimiento.
Muestras
Saliva.
-Correlación de los análisis
séricos con drogas de abuso y
psicofármacos.
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Meconio.
-Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y
células que se han desprendido de la piel y del tracto
intestinal.
-Identificación de drogas durante la gestación.
Muestras
Hígado
-Niveles de tóxicos superiores
a los de la sangre.
-Especialmente útil cuando no
se puede disponer de sangre.
-Evitar contaminación por bilis.
-Evitar añadir conservantes.
Envasado y conservación
• Tapones PTFE
(polytetrafluoroethylene)
• Conservantes:
– Azida sódica (0,1%, p/v)
– Fluoruro sódico (1%, p/v)
• Anticoagulante:
- Heparina
- EDTA
- Oxalato potásico (0,5%, p/v).
Almacenamiento
Factores que intervienen:
Luz
Temperatura
Hidrólisis
Oxidación
Descomposición
biológica
Análisis
químico-toxicológico
• 1. Separación o extracción del tóxico de la
muestra.
• 2. Detección e identificación del tóxico.
• 3. Cuantificación.
Métodos de extracción
Finalidad:
Aislamiento y purificación del tóxico
Concentración del tóxico en el extracto obtenido
Parte de la muestra se reserva íntegra
Desde el punto de vista analítico los tóxicos se
dividen en:
–
–
–
–
Tóxicos volátiles
Tóxicos gaseosos
Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles
Tóxicos inorgánicos o minerales
Métodos de extracción de
tóxicos volátiles
• Aquellos que se volatilizan por debajo de los
100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor
de agua cuando ésta destila (alcohol etílico,
alcohol metílico, benceno, fenoles, ...).
Métodos de extracción de
tóxicos volátiles
Las técnicas son:
-Destilación simple.
-Destilación fraccionada.
-Destilación directa al vacío.
-Destilación por arrastre en corriente de vapor.
-Microdifusión.
-Técnica de “espacio de cabeza” ("head space" ).
Destilación simple
Muestra
problema
Tóxico
volátil
extraído
Destilación fraccionada
Separación según puntos
de ebullición
Microdifusión
Análisis
Muestra
Acetaldehído
3 ml de sangre
5 ml de tejido
3 ml de sangre
5 ml de tejido
1 ml de sangre
Acetona
Monóxido de
carbono
Cianuro
Etanol
Formaldehído
Hidrocarburos
halogenados
Isopropanol
Camara
de
Conway
Metanol
Fenoles
Sulfuro
2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
0,8 ml de sangre
4 ml de tejido
3 ml de sangre
5 ml de tejido
1-4 ml de sangre
1-4 ml de tejido
2 ml de sangre
5 ml de tejido
2 ml de sangre
5 ml de tejido
2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
Agente
liberador
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
1 ml de SO4H2 al
10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
1 ml de CO3K2 al
10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
1 ml de CO3K2
1 ml de CO3K2
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
3-4 gotas de
SO4H2 al 10%
Compartimento
interior
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
2 ml de cloruro
de paladio
3,3 ml de NaOH
0,1N
2 ml de
dicromato
potásico
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
1 ml de tolueno
3,3 ml de SO4H2
al 10%
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3,3 ml de NaOH
0,1N
3,3 ml de NaOH
0,1N
Tiempo de
difusión
3 horas
3 horas
1 hora
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
3 horas
Técnica de espacio de cabeza
1.
2.
3.
La muestra se deposita en un vial
cerrado con tapón perforable, en el
que se deja una cámara de aire.
Se calienta a 60ºC durante 30 min.
Se extrae con una jeringa para
gases una muestra de la parte
superior del frasco para inyectarla en
un cromatógrafo de gases.
Métodos de extracción de
tóxicos gaseosos
• Se denominan tóxicos gaseosos a todas
aquellas sustancias que a temperatura ambiente
se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo:
CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.
Métodos de extracción de
tóxicos gaseosos
• Las técnicas son:
-La extracción de gases en sangre se basa en leyes
físicas, según las cuales su solubilidad disminuye
elevando la temperatura o disminuyendo la presión.
-Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos
volátiles.
-Cromatografía de gases
Técnicas cromatográficas
Volatilización
Cromatografía
de gases (GC)
Técnica de separación.
Se basa en la diferente velocidad con que se
mueven los solutos a través de un medio poroso
arrastrados por un disolvente en movimiento.
Cromatografía de gases
*Line Base
*Pico Cromatográfico
*Base del Pico
*Área del Pico
*Altura del Pico
*Anchura del Pico
*Anchura del Pico a la mitad de la altura
Cromatografía de gases
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• Personal especializado.
• Técnica muy sensible, fiable y rentable para
determinaciones cualitativas (casi la totalidad de
los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad
1-5 µg/ml.) .
• Posibilidad de derivación (obtener un
compuesto intermedio a partir de una sustancia
no volátil) hace su aplicación prácticamente
universal.
Métodos de microextracción
en fase sólida
Métodos de extracción de
tóxicos orgánicos fijos
Sustancias orgánicas y no volátiles.
Se incluyen:
*Tóxicos de origen vegetal (glucósidos,
aceites esenciales, alcaloides, etc)
*Productos de síntesis (medicamentos).
Métodos de extracción de
tóxicos orgánicos fijos
Las técnicas son:
-Con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto.
- Con disolventes apolar: los más frecuentes son: éter etílico,
cloroformo y diclorometano. Puede ser:
*Directa: sólo aplicable a muestras biológicas limpias
como la orina
*Previa purificación de la muestra (eliminación de
proteínas).
Fraccionamiento del extracto antes de su análisis:
Debido a la gran variedad de tóxicos orgánicos conocidos es
necesario un fraccionamiento del extracto.
Métodos de extracción de
tóxicos orgánicos fijos
Clasificación de tóxicos orgánicos en:
1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por
ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes
orgánicos en medio ácido.
2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico
(alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.)
3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido
o básico.
Métodos de extracción de
tóxicos orgánicos fijos
Las técnicas son:
-Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que
tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de
los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo
negativo y el resto al polo positivo.
-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas
son absorbidas por la resina y luego son eluidos con
solventes apropiados.
Métodos de extracción de
tóxicos orgánicos fijos
Extracción en fase sólida
Métodos de extracción de
tóxicos minerales o
inorgánicos
Estos tóxicos se encuentran en el organismo
firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos,
siendo requisito la destrucción de la materia
orgánica para poder realizar su análisis.
Métodos de extracción de tóxicos
minerales o inorgánicos
1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción
de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico.
a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando
ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc.
b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación).
c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes
orgánicos.
Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos
métodos, para obtener una muestra más apropiada.
Métodos de extracción de tóxicos
minerales o inorgánicos
Existen métodos que no precisan la destrucción de la
materia orgánica como:
*Diálisis.
*Ultrafiltración.
*Electrodiálisis.
*Desproteinización.
2. Marcha posterior de extracción
Detección e identificación
del tóxico
Dos etapas:
1. Rastreo o detección rápida:
-Técnicas de inmunoensayo
-Cromatografía en capa fina
2. Técnicas de confirmación:
-Técnicas espectrofotométricas.
-Técnicas cromatográficas.
Técnicas inmunoensayo
Fundamento:
Reacciones antígeno-anticuerpo.
Se aplica especialmente para drogas de abuso y
psicofármacos.
Tóxico libre
+ AC
Tóxico libre-AC
Tóxico marcado
Tóxico marcado
Técnicas inmunoensayo
1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo.
2. Enzimoinmunoensayo: enzima.
-ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas
-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas
3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo.
4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas
(KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar
agregados de micropartículas.
Técnicas inmunoensayo
•Su aplicación es cualitativa y cuantitativa (con patrones de
concentración).
•Técnicas rápidas, y sensibles.
•Posibilidad de reacciones cruzadas.
Técnicas cromatográficas
Cromatografía en capa fina (CCF)
Fase movil
Cloroformo/acetona
80:20
Isopropanol/cloroformo
Cloroformo/acetona
90:10
Fase estacionaria
Silica gel G activada a 120ºC/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Silica gel G activada a 120ºC/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Silica gel G activada a 120ºC/30 min
Desarrollo: 30-45 min
Aplicaciones
Todos los tipos
Barbitúricos
Anticonvulsionantes
Sedantes no
babitúricos
Detección e identificación
del tóxico
2. Técnicas de confirmación:
-Técnicas espectrofotométricas.
-Técnicas cromatográficas.
Técnicas espectrofotométricas
Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los
átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda
utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios
energéticos en su estructura (en los átomos transiciones
electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos)
Técnicas
Espectrofotometría UV visible
Espectrofluorimetría
Espectrofotometría infrarroja
Espectrofotometría de absorción atómica
Espectrometría de masas
Aplicaciones
Compuestos
Orgánicos
Orgánicos
Orgánicos
Metales
Orgánicos
Análisis
Cuali/cuantitativo
Cuali/cuantitativo
Cualitativo
Cuali/cuantitativo
Cualitativo
Espectrofotometría de absorción
atómica (EAA)
E*
Luz
incidente
E
Fluorescencia
emitida
Espectrofotometría de
absorción atómica
Lámpara de
cátodo hueco
Sistema
atomizador
Sistema
monocromador
Sistema
detector
La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada,
se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo
absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.
Espectrofotometría de absorción
atómica
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• En la interpretación de resultados considerar:
contaminación en la toma y mantenimiento de
las muestras, etc.
• Personal especializado.
• Técnica muy sensible, fiable y rentable. Su
sensibilidad permite identificar y cuantificar
metales en niveles de traza.
Espectrofotometría de emsión
atómica (EEA)
E*
Luz emitida
E
Volatilización
Ionización
2.Aceleración
iones
Espectrofotometría
de masas (EM)
3. Separación
4. Detección
Técnica cualitativa y cuantitativa.
Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.
Espectrofotometría de masas
Técnica cualitativa y cuantitativa.
Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura
molecular.
Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas
Espectrofotometría de masas
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• Personal especializado.
• Acoplamiento a GC (o HPLC): método
más efectivo para la identificación de
tóxicos y sus metabolitos.
• ICP-MASAS
ICP-Masas
ICP: Plasma de
acoplamiento inducido
Técnicas cromatográficas
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
Técnicas cromatográficas
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• Personal especializado.
• No destruye la muestra, lo que permite la detección por
distintos sistemas en serie.
• Requiere mínima preparación y pequeñas cantidades.
• Mayor precisión que GC. En general se aplica a
compuestos de alto peso molecular y polar mientras que
GLC se aplica a gases permanentes y sustancias
volátiles.
• Mejor resolución y menor tiempo de análisis.
Gracias por su atención