Mitocondria

Proteoma mitocondrial de
Saccharomyces cerevisiae
PNAS, 23: 13207-13212 (2003)
Mitocondria
•
Orgánulos celulares presentes en casi todas las células
eucariotas.
•
La mitocondria desempeña un papel principal en múltiples
funciones celulares:
• Bioenergética
• Apoptosis
• Metabolismo de ácidos grasos, lípidos, hierro
•
Muchas enfermedades se atribuyen a defectos mitocondriales.
•
El conocimiento de las funciones fisiológicas de la mitocondria
es limitado, y muchas enfermedades mitocondriales no pueden
ser analizadas a nivel molecular.
Mitocondria
IM - membrana interna
IMS- espacio intermembrana
OM- membrana externa
Saccharomyces cerevisiae
•
Hongo ascomiceto unicelular que se utiliza ampliamente en la
elaboración de vino, cerveza, pan y otros alimentos.
•
Muchos genes humanos implicados en enfermedades tienen
homólogos en levaduras.
•
Excelente accesibilidad de las levaduras al análisis genético y
bioquímico.
•
Principal organismo modelo para la identificación y
caracterización de funciones proteicas y rutas celulares en
eucariotas.
•
Primer genoma eucariota completamente secuenciado: 12 Mb,
organizado en 16 cromosomas.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
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Tettelin H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):81-4
Dujon B et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):98-102
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Objetivo
Identificación de proteínas mitocondriales
de S. cerevisiae
El análisis del proteoma mitocondrial proporcionará una
importante base de datos para:
• Análisis de funciones asociadas a la mitocondria
• Análisis de nuevas funciones mitocondriales
• Caracterización de enfermedades mitocondriales
Purificación de mitocondrias
•
Aislamiento de mitocondrias a partir de lisados celulares de
S. cerevisiae mediante:
•
Centrifugación diferencial
•
Dos gradientes de sacarosa consecutivos
•
Utilización de cuatro métodos de separación de proteínas en
paralelo, para minimizar el problema de que una fracción
significativa de proteínas pueda escapar a la detección:
•
1D-PAGE
•
2D-PAGE
•
Digestión con 4 proteasas seguida de
cromatografía líquida multidimensional
(MDLC, multidimensional liquid cromatography)
•
Generación de fracciones asociadas a mitocondrias
mediante tratamiento con sales o tripsina.
Separación de proteínas y análisis MS
•
Mitocondrias purificadas:
a. 2D-PAGE y MALDI-TOF-MS o n-LC-MS/MS (nano liquid
chromatography-MS/MS).
b. Cromatografía líquida multidimensional y ESI-MS.
c. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS.
•
Fracciones asociadas a mitocondrias generadas mediante
tratamiento con sales o tripsina:
a. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS.
b. 1D-HPLC y n-LC-MS/MS.
•
En total, se obtuvieron de más de 20 millones de espectros de
masas que se analizaron posteriormente en las bases de datos.
Separación de proteínas y análisis MS
Separación de proteínas y análisis MS
•
Busqueda automática en la base de datos completa de S. cerevisiae
utilizando el algoritmo SEQUEST.
•
Identificación de un total de 750 proteínas mitocondriales diferentes
en S. cerevisiae (aprox. 90% del total): indica la implicación de la
mitocondria en múltiples procesos celulares.
•
Análisis con el programa MitoProt: predicción de una presecuencia
mitocondrial clásica en 320 proteínas (43%).
•
Análisis con el programa TMHMM: predicción de al menos un
segmento α-hélice transmembrana en 255 proteínas (34%).
Separación de proteínas y análisis MS
Separación de proteínas y análisis MS
•
Mediante 2D-PAGE se identificaron 209 spots, que permitieron la
identificación de 109 proteínas diferentes: 13 proteínas tenían
función desconocida.
•
De las 750 proteinas mitocondriales identificadas:
•
436 proteínas (58%) mitocondriales conocidas
•
208 proteínas de función desconocida
•
106 proteínas previamente descritas como localizadas en
otros compartimentos celulares.
•
Se ha descrito una localización doble (mitocondria y otro
compartimento celular) para al menos 30 proteínas mitocondriales
conocidas.
Cobertura del proteoma
•
Identificación de todas las subunidades conocidas del complejo
piruvato deshidrogenasa.
•
Identificación de los complejos de la membrana interna de la
maquinaria de fosforilación oxidativa.
•
El estudio no está sesgado hacia proteínas de membrana.
•
Tampoco está sesgado hacia proteínas pequeñas o grandes:
distribución de los MWs de las proteínas identificadas.
•
Las proteínas mitocondriales identificadas representan aprox. el
92% de las proteinas mitocondriales conocidas de S. cerevisiae en
la base de datos MITOP.
Cobertura del proteoma
•
Difícil identificar el 100% de las proteínas de un organulo celular
mediante un análisis proteómico.
•
Algunas proteínas sólo se expresan en condiciones de crecimiento
particulares, por lo que no existe una única condición de
crecimiento en la que se expresen todas la proteínas
simultaneamente.
•
Además, algunas proteínas escapan a la detección mediante los
métodos de separación e identificación disponibles.
•
La identificación de proteínas mitocondriales en S. cerevisiae
mediante la combinación de múltiples aproximaciones está
próxima a la saturación.
Cobertura del proteoma
•
Más de 650 proteínas mitocondriales identificadas con los
primeros 5 millones de espectros.
•
La mayor parte de las proteínas restantes identificadas en los
siguientes 10 millones de espectros.
Clasificación funcional
•
En base a las funciones conocidas o predichas de las proteinas
mitocondriales, diferentes clases funcionales:
•
Sólo un 14% de las proteínas actuan directamente en el
metabolismo energético:
•
Maquinaria de fosforilación oxidativa
•
Ciclo del ácido tricarboxílico
•
Piruvato deshidrogenasa
•
Un 25% de las proteínas implicadas en el mantenimiento y
la expresión del genoma mitocondrial.
•
El 25% de la proteínas identificadas tiene una función
desconocida.
Clasificación funcional
Perspectivas
• La base de datos del proteoma mitocondrial de S. cerevisiae
representa una fuente global para estudios de:
• Caracterización de nuevas funciones
mitocondriales.
• Caracterización de nuevas funciones asociadas a
la mitocondria.
• Rutas de señalización.
• Sistemas proteolíticos.
• Identificación molecular de las bases de las
enfermedades mitocondriales.