COPEG

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PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DEL
ANTIGENO PARA MUESTRAS VESICULARES
1.0
OBJETIVO:
Describir los procedimientos necesarios para la Extracción del Antigeno para
Muestras Vesiculares.
2.0
ALCANCE:
El alcance de este procedimiento incluye la especificación de los materiales a
utilizar, además de los procedimientos para el Medio Esencial Mínimo Tagle con
Solución de Earle’s y la Solución Alta de Antibióticos (SAA).
3.0
PROCEDIMIENTO:
Paso
3.1
Descripción
Materiales y Equipo
abcdef-
3.2
Responsable
Mortero y pilón estéril
Tijeras y pinzas estéril
Platos Petri estéril
Arena estéril
Tubos de centrífuga estériles (15 ml)
Bandeja con 1000 ml de ácido acético al 3% o
solución yodada al 2%.
g- Centrífuga refrigerada
h- Cámara de bioseguridad
i- Balanza
j- pH metro
k- Medio de extracción
Preparación del Medio de Extracción ( Medio E-MEM
Solución Alta de Antibiótico).
Medio Esencial Mínimo Eagle con Solución de Earle’s:
Personal de
LADIVES
a- Disolver el contenido de un paquete del medio
liofilizado en la cantidad de agua destilada que se
indica en el sobre.
b- Disolver completamente y medir el pH~ 7.3
c- Filtrar tres veces a través de papel whatman..
d- Filtrar en millipore de 0.2 un dentro de la cámara de
bioseguridad.
e- Guardar en botellas estériles de 250 ml.
Código:
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PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DEL
ANTIGENO PARA MUESTRAS VESICULARES
Paso
3.3
Descripción
Responsable
Solución Alta de Antibióticos (SAA).
Antibiótico
Cantidad
Necesaria
Concentr. Stock
de Antibiótico
Stock
Necesario
(ml)
Concentr.
Final por ml
Penicilina
2 000 000 unit
500 000 unit/ml
4
20 000 unit
Gentamicin
3 000 mcg
50 mg/ml
6
3 000 mcg
Amfotericin
B
25 000 mcg
2 500 mcg/ml
10
250 mcg
Kanamicina
5 ml
100 mcg
Personal de
LADIVES
a- Esterilice por filtración y congele a – 20° C en
alícuotas.
b- Mezcle los cuatro antibióticos (25 ml. en total) con
975 ml. del medio E-MEM.
c- Mida el pH ~ 7.3 +/- 0.2. Ajuste con NaOH estéril.
d- Refrigere a 4° C.
3.4
Procesamiento de las Muestras
a- Se introduce la caja que se trae del campo al área de
seguridad, la cual debe abrirse dentro de la cámara
de bioseguridad. Dentro de la caja deben venir las
muestras con sus respectivas hojas de campo,
indicando: procedencia, número de muestras
provenientes del brote, localización geográfica, etc.
b- A cada muestra con su respectiva hoja se le asignará
un número de entrada, precedido de la letra “L” que
indica LADIVES, luego el número y posterior el año
en que nos encontramos. Si de un mismo brote
vienen varias muestras se les dará un sub-número.
Ejemplo Si vienen 2 muestras del mismo brote, el
número de entrada que se le dará será L-50-99 (1)
y L-50-99 (2).
c- Se identifican los tubos centrífuga y los platos Petri
con el respectivo número de cada muestra.
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Paso
Descripción
d- Se coloca en la balanza el plato de Petri estéril
previamente identificado y se pesa 1 gramo del
epitelio. ( Si sobra epitelio este debe guardarse en
un vial con un poco de medio de extracción y
congelarse a –70° C)
e- Previamente pesado el epitelio se enjuaga con un
poco de medio para eliminar detritos. Luego se
coloca en un mortero estéril con ayuda de las pinzas
y se pica con las tijeras lo más fino que se pueda, se
le agrega un poco de arena estéril y se macera
completamente con el pilón.
f- Se mide 9 ml. del medio de extracción y se le
adiciona a el macerado, se mezcla bien con ayuda
del pilón y se deposita en el tubo de centrífuga de 15
ml, que se debe tapar completamente.
g- Se centrifuga a 3.000 r.p.m por 10 minutos a 4° C.
h- Luego de centrifugado se separa 1 ml. del
sobrenadante para la inoculación en células VERO y
Riñón de Cordero, el resto se utiliza en la prueba de
ELISA ( 3.0 ml.) y/o Fijación del Complemento (2ml).
Si sobra sobrenadante se guarda a –70° C.
3.5
Código:
Responsable
Personal de
LADIVES
NOTAS:
a- Los fluidos vesiculares se utilizan directamente para
las inoculaciones y pruebas de diagnóstico.
b- Para los cultivo celulares, estos deben congelarse y
descongelarse tres veces, luego se colocan en tubos
cónicos debidamente rotulados, se centrifugan a
3.000 r.p.m por 10 minutos a 4° C y se utiliza el
sobrenadante para las pruebas de diagnóstico.
c- Si el epitelio pesa menos de un gramo, se debe hacer
la dilución manteniendo la proporción 1:10. Ejemplo
Si se pesa 0.5 g del epitelio se le debe adicionar 4.5
ml del medio de extracción.
d- Si el epitelio pesa 0.4 gr. o menos se debe mantener
la proporción 1:10 para la dilución y se procederá a
inocularlo en células VERO y Riñón de Cordero
inmediatamente y se reportará que la muestra se
encuentra en estudio.
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4.0 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
5.0 HISTORIAL DE MODIFICACIONES
FECHA
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