Cuenta de mohos y levaduras en alimentos

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
OBJETIVOS
• Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de
mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al
consumo humano.
• Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar
contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111SSA1-1994.
• Comprender el fundamento de todas las etapas del método de detección y
cuantificación de mohos y levaduras en alimentos.
GENERALIDADES
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,
pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en
equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la
elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la
descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el
crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles
de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la
irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos
fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus
derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias,
etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos
como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar
problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia
al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no
favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar
malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.
El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos
multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer
fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado.
Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La
identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas y
microscópicas.
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Hifas y micelio. El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos
ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas
pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas o
en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles o
hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos:
septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no
septados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin tabiques
transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del cilindro y se
les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados
órganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o “anclajes” de los
géneros Rhizopus o Absidia, la célula basal del género Aspergillus y la ramificación
dicotómica, o en forma de Y, del género Geotrichum.
Órganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por
medio de esporas asexuales. Algunos mohos también producen esporas sexuales. A
tales hongos se les denomina “perfectos”, los cuales se dividen en Oomycetes y
Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son
septados, en contraposición a los mohos “imperfectos”, Fungi Imperfecti, los cuales sólo
poseen esporas asexuales.
Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son
pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación. Se diseminan fácilmente por la
atmósfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos
principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3)
esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas fértiles
denominadas conidióforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro
de ningún receptáculo, en contraposición a las esporangiosporas, las cuales se
encuentran dentro de un esporangio o receptáculo, situado en el extremo de una hifa
fértil, el esporangióforo. Las artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El
extremo engrosado del esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas
en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios
comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una célula
especializada, el esterigma o fiálide situada en el extremo del conidióforo.
Propiedades fisiológicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las
bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible.
Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en
algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los
mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a
temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor
de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son
aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los
alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo
de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son
capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos.
Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción
industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.
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Algunos géneros de mohos importantes en alimentos.
Mucor. Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la fabricación
de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la maduración de
quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales.
Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy común e interviene en la
alteración de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc.
Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen
en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad
para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la producción industrial
de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricación
de ciertos alimentos orientales y en la obtención de enzimas.
Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos
tóxicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las
denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la
ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina
producida principalmente por A. versicolor; el ácido ciclopiazónico producidas por A.
flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y ácido penicílico también son producidas por
especies de Aspergillus, las tóxinas tremorgénicas son producidas por A. terreus
(territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina).
Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se
producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren
a los colores de flurescencia por sus nombres en inglés ( azul y verde, respectivamente)
observados bajo longitudes de onda en la región UV, y los subíndices 1 y 2 se refieren a
sus patrones de separación cromatográficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por
la hidroxilación de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el
carcinógeno de hígado más potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina
A y la citrinina afectan la función renal. Las toxinas tremorgénicas afectan el sistema
nervioso central.
Penicillium. Es otro género de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los
alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P
italicum producen la podredumbre de frutas cítricas. Las especies P. camemberti, P.
roqueforti se utilizan en la maduración de quesos.
Se han reportado más de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas.
Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la función del
hepática o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por
Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, ácido ciclopiazónico, citreoviridina,
penitremo A, toxina PR y roquefortina y el ácido secalónico. De éstas la ocratoxina A es
sin duda la más importante, es un carcinógeno renal y es producida por P. citrinum, P.
viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o
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trigo, o a través de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es
posteriormente consumida por humanos.
Se recomienda consultar la bibliografía para conocer otros géneros de mohos con
importancia en los alimentos.
Levaduras y hongos levaduriformes.
El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son
filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por
gemación o por fisión.
Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales.
Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos,
vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos
fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteración del
sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las
carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación
microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme,
cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se reproducen asexualmente por
gemación multicelular o por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen por
fisión.
En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las
colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única
forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son
húmedas y algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas
tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad
metabólica es a la vez de ambos tipos.
La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No
obstante, crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen
elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es
decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayoría de las levaduras necesitan mayor
humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la Aw mínima de crecimiento
oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de
los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y una temperatura
máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de
tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los
azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las
oxidativas, pueden oxidar los ácidos orgánicos y el alcohol.
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Algunos géneros de importancia en alimentos son:
Schizosaccharomyces. Levaduras de este género se han encontrado en frutas
tropicales, en la melaza y en la miel.
Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias
alimentarias, como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza,
fermentación de los vinos, en la producción de alcohol, glicerol e invertasa.
Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la
obtención de productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa.
Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su capacidad
para crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar (osmófilas), intervienen
en la alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en la fermentación de la salsa
de soya y de algunos vinos.
Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película. P.
membranafaciens produce una película en la superficie de las cervezas y vinos.
Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en
la superficie de los quesos y de los embutidos.
Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de
frutas.
Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la
lactosa, alterando productos lácteos. Otras especies alteran la leche condensada
azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos ácidos.
Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular para
incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La
especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lácteos. C.
lipolytica produce alteración de la mantequilla y margarina.
Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la
fermentación de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de los
vinos franceses.
Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrándose en
las fábricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada.
Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas
en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color
rosado en el sauerkraut.
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FUNDAMENTO
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de
cultivo selectivo específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de
utilizar como nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de estos
compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La
sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al
inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la acidificación
permite la eliminación de la mayoría de las bacterias. Finalmente, las condiciones de
aerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 ± 1 ºC da como resultado el
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
• 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solución
amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estéril a.
• 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos
de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estériles con tapón de algodón a.
• 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa .
• 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta a.
NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza únicamente el agar papa dextrosa para la detección y
cuantificación de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificación de las levaduras, la utilización del agar extracto de malta acidificado ya
que es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo
microbiano.
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
• Solución colorante de lactofenol azul de algodón b.
• Colorantes para tinción de Gram b.
• Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 % a.
MATERIAL Y EQUIPO
• Vaso de licuadora estéril o bolsa para Stomachera.
• Motor para licuadora o Stomachera.
• Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a.
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•
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•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón a.
Pipetas Pasteur estériles a, b
Propipetaa, b
Cajas de Petri estériles (una se utiliza para pesar la muestra) a.
Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas,
tenedores, etc. a
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25±1°C a.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica mantenida a
45±1°C a.
Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b.
Microscopio óptico b.
Asa bacteriológica y asa micológicab.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador b.
NOTAS
a
b
Material necesario para el inicio de la práctica.
Material necesario para los 3, 4 y/o 5 días después de iniciada la práctica.
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DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solución diluyente
1.0 mL
Homogenizar
con 90 .0 mL de
solución
Pesar 10 g de
muestra en
condiciones
de asepsia
10-1
10-2
1.0 mL
10-3
10-4
Depositar por duplicado 1.0 mL de
cada dilución en cajas de Petri
estériles
Adicionar de 15 a 20 mL de agar
papa dextrosa y/ó agar extracto
de malta acidificados con 0.3
mL ácido tartárico 10 %
enfriado a 45°C en cada placa
Homogeneizar la
muestra con el agar
mediante
movimientos
rotatorios
1.0 mL
Incubar las cajas en
posición invertida
Contar aquellas placas que tengan
entre 10 a 150 colonias de hongos
y/o levaduras y reportar por
separado como UFC/g o mL de
muestra, indicando tiempo de
incubación
3,4 ó 5 días
/
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PROCEDIMIENTO
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz
Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de
fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora
estéril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0
seg en el caso de la licuadora a velocidad mínima, ó 30.0 seg en el
Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilución primaria.
3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo
de ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de
pH 7.2, agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean
necesarias. Se debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.
NOTA
Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o
de un fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de
UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneización de
la muestra (a mayor tiempo de homogeneización mayor será la ruptura de las
hifas y por lo tanto se aumentarían las UFC / mL), por lo que se debe poner
especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneización citados en
esta metodología son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para
este grupo microbiano.
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las
diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estéril.
5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de
agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y
mantenerlos a ±45°C.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0
mL de agar, 1.4 mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en
membrana, o bien esterilizar la solución a 121°C±1°C durante 15 minutos.
Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y
mantenido a ±45°C se le deberá adicionar 0.3 mL del ácido, o colocarlas en
la caja de Petri teniendo precaución de que no toque la muestra antes de
agregar el medio de cultivo.
7. Después de la acidificación, utilizar un tubo de medio acidificado como
testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un
potenciómetro.
8. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa
dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y
mantenidos a ±45°C. El tiempo transcurrido entre la preparación de las
diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de
exceder de 20.0 min.
9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a
izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido
contrario y seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo
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cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir
que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una
superficie horizontal fría.
10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en
una caja de Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa
acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Después de la incubación
estas cajas no deberán presentar desarrollo de colonias.
11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25±1°C.
12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación.
Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y
150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de
mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar la
cuantificación de 4 días de incubación o incluso las de 3 días. En este caso,
se informa el período de incubación en los resultados de los análisis.
13. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul
de algodón, para un examen microscópico y una posible identificación de
los mohos que se hayan desarrollado.
14. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las
levaduras obtenidas.
15. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días
de incubación (a 26 ± 1ºC o a temperatura ambiente).
16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las
adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución.
17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o
mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a
25±1°C durante 5 días.
18. Describir las características macroscópicas y microscópicas observadas, de
los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.
19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es
difícil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos
a los 4 días de incubación y aún a los 3 días. En este caso se debe informar
el periodo de incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a
continuación se expresan:
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este análisis, se deben
seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias
(representatividad estadística). Posteriormente, contar las colonias presentes y
calcular el número de hongos y levaduras por separado. De esta manera se
puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro
dependiendo del estado físico de la muestra analizada. Esto se logra
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multiplicando el número de UFC encontradas en una caja representativa, por el
inverso de la dilución correspondiente a esa caja.
En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos
y/o levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la
dilución correspondiente.
En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el
resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g ó bien menos de 10 UFC/mL
(Sensibilidad del Método)
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de
incubación en el que se realizó la cuantificación.
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el
resultado de la cuantificación de hongos y de levaduras.
Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes
tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis. Si es
posible reportar el o los géneros probables.
BIBLIOGRAFÍA.
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