diferenciación de especies de perdiz mediante caracterización de

DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE PERDIZ MEDIANTE
CARACTERIZACIÓN DE SNPS
SNPS CHARACTERIZATION TO DISTINGUISH PARTRIDGE SPECIES
García, C.B. y M.V. Arruga*
Laboratorio de Citogenética y Genética Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza.
Miguel Servet, 177. 50013. Zaragoza. España. *Autor correspondencia: [email protected]
PALABRAS
CLAVE ADICIONALES
Perdiz roja. Perdiz chukar. RFLP. RT-PCR.
ADDITIONAL KEYWORDS
Red-legged partridge. Chukar partridge. RFLP.
RT-PCR.
RESUMEN
Se han buscado metodologías capaces de
diferenciar genéticamente la perdiz roja (Alectoris
rufa) de otras especies de perdiz que hibridan
con ella (principalmente perdiz chukar, A. chukar)
y pueden por tanto poner en peligro la subsistencia de la perdiz roja. Los procedimientos empleados en el presente trabajo se basan en la detección de polimorfismos de una única base
nucleotídica (SNPs). Cuando el nucleótido diferente para las distintas especies forma parte del
sitio de restricción se detecta mediante el empleo
de enzimas de restricción (RFLP). Otra alternativa es la discriminación alélica con PCR a tiempo
real (RT-PCR) mediante el empleo de sondas
marcadas con fluorocromos diferentes para el
alelo de cada especie. Ambas metodologías han
demostrado su eficacia en la diferenciación de
especies e incluso en la identificación de híbridos
tanto en ejemplares silvestres como en aquellos
criados en cautividad.
SUMMARY
Genetic methodologies to distinguish
between red-legged partridge (Alectoris rufa)
and other partridge species that hybridise with it
(mainly chukar partridge or A. chukar) have been
developed to protect the survival of the species.
The procedures used in this work are for the
detection of single nucleotide polymorphisms
(SNPs). RFLP methodology is used when the
polymorphism is in a restriction site of a specific
restriction enzyme. Real-time PCR (RT-PCR)
allows the allelic discrimination using fluorescent
probes with different markers for the allele of
each species. Both methodologies are efficient
to distinguish both species and to identify hybrids
between them in wild animals and captive reared
partridges.
INTRODUCCIÓN
La perdiz roja (A. rufa) es un ave
del Orden Galliformes, Familia Phaisanidae, que habita principalmente en la
Península Ibérica, Sur de Francia y
algunos puntos del Norte de Italia y Sur
de Inglaterra (Randi et al., 1992). Además de la importancia cinegética y
económica, forma parte de la cultura y
tradición de nuestro país y es parte
integrante de numerosos ecosistemas.
Arch. Zootec. 56 (Sup. 1): 403-408. 2007.
GARCÍA Y ARRUGA
El número de perdices en su medio
natural ha ido disminuyendo por diferentes causas y la producción en cautividad se ha convertido en referente
fundamental para el mantenimiento de
la especie.
Un grave problema existente es la
hibridación con otras especies de perdiz (principalmente perdiz chukar o A.
chukar). Legalmente (Ley 4/1989, de
27 de Marzo, de conservación de los
espacios naturales y de la flora y fauna
silvestre) sólo se permite la suelta o
repoblación con ejemplares de perdiz
roja (A. rufa) y poder identificar a los
ejemplares híbridos es de interés para
los criadores de la especie para evitar
las repoblaciones y sueltas con dichos
individuos. La imposibilidad de detección de híbridos por su apariencia externa ha hecho imprescindible el desarrollo de pruebas genéticas con tal
finalidad.
En el laboratorio de Citogenética y
Genética Molecular de la Facultad de
Veterinaria de Zaragoza se buscan
desde hace ya varias décadas marcadores genéticos que permitan diferenciar la perdiz roja de otras especies de
perdices, así como los híbridos entre
ellas. Ya se han desarrollado diversas
metodologías capaces de alcanzar dicho objetivo (Arruga et al., 1996, 1998;
Saz et al., 1998; García y Arruga,
2002, 2003, 2004, 2005, 2006a, 2006b)
pero se continúa con el estudio de
estas especies incorporando las nuevas metodologías que van surgiendo y
permiten una identificación de híbridos
de forma actual y rápida.
Se ha elegido la búsqueda de SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms)
como técnica de estudio debido a su
abundancia en el genoma ya que estos
Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 404.
marcadores son heredados más establemente que otros como las secuencias repetidas (Landegren et al., 1998;
Brookes, 1999).
Para la identificación de estos
polimorfismos de un único nucleótido
se parte de información de secuenciación de otras especies aviares, principalmente de pollo, que además de ser
la especie aviar más estudiada genéticamente, se ha comprobado que tiene
una alta homología cromosómica con
la perdiz roja (Kasai et al., 2003). Para
la posterior detección de los SNPs
identificados se emplean dos procedimientos: RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) y RT-PCR
(Real-Time PCR).
MATERIAL Y MÉTODOS
Se extrae DNA de 468 perdices
rojas silvestres, 22820 criadas en granja (pertenecientes a 26 granjas distribuidas en toda la Península y las islas
Baleares), 142 perdices chukar de distintas procedencias (España, Argentina, Chipre, Cerdeña y Grecia) y de 4
ejemplares híbridos de perdiz roja y
perdiz chukar obtenidos por cruzamiento directo.
Los 15 SNPs utilizados han sido
previamente identificados por secuenciación directa y en su caracterización
se han empleado dos metodologías: La
PCR-RFLP y la RT-PCR. La PCRRFLP es una técnica cuyas primeras
referencias datan de publicaciones en
1979 y 1980 (Kiko et al., 1979; Reilly
y Thomas, 1980). El SNP forma parte
de la secuencia de reconocimiento de
una enzima de restricción y se puede
usar ésta para detectarlo. Tras la am-
CARACTERIZACIÓN DE SNPS EN PERDICES
plificación por PCR del fragmento analizado, se digiere el producto con la
enzima de restricción específica. Si se
produce la digestión o no, se puede
M
C H
R C
H
1000 pb
500 pb
inferir la existencia o no de dicho nucleótido diferente en ambas especies.
En el caso de RT-PCR se realiza
una discriminación alélica mediante un
termociclador a tiempo real usando
sondas Taqman ® marcadas con
fluorocromos diferentes para cada alelo
(Johnson et al., 2004; Llambí et al.,
2006). Con las secuencias de las perdices, se han diseñado cebadores convencionales específicos del gen que
hibriden en ambas especies y sondas
marcadas con fluorocromos diferentes para A. rufa y A. chukar.
400 pb
300 pb
Figura 1. Imagen de un gel de agarosa a
una concentración de 1,5% en la que se
observa el producto de PCR y posterior
digestión con enzima de restricción. Las
calles C, R y H corresponden a perdices
chukar, rojas e híbridas respectivamente.
Se ha señalado con una flecha la banda
diagnóstica que permite diferenciar las
perdices chukar e híbridas de las perdices
rojas. (Image o f a 1.5% concentrated agarose
gel in which PCR products of gene A amplification
and digestion with restriction enzyme are
observed. Lanes marked as C, R and H corresponded to lanes where digested PCR products of
chukar partridges, red-legged partridges and
detected hybrids respectively. Diagnostic band
that allows to differentiate chukar and hybrid
partridges from the red ones is shown with an
arrow and corresponds to the digestion band of
the PCR product with the restriction enzyme).
RESULTADOS
Mediante PCR-RFLP el alelo de
perdiz chukar es el reconocido por la
enzima de digestión por tanto, sólo
ocurrirá el corte en perdices chukar
puras o en híbridos de perdiz roja con
esta otra especie (figura 1).
Durante la realización de la reacción de RT-PCR con las sondas
TaqMan® marcadas fluorescentemente,
FAM para perdiz roja y VIC para
perdiz chukar, se observa el aumento
de fluorescencias para cada una de las
muestras en los sucesivos ciclos. Si
únicamente aumenta la fluorescencia
de FAM el ejemplar es una perdiz roja
pura y si aumenta la de VIC es una
perdiz chukar. Si aumentan ambas
fluorescencias la muestra corresponde a una perdiz híbrida (figura 2).
Se han detectado ejemplares
híbridos tanto en los ejemplares silvestres distribuidos por diferentes puntos
de España como en las granjas analizadas. Los porcentajes de hibridación
han resultado diferentes según la localización de origen de las muestras,
Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 405.
GARCÍA Y ARRUGA
ducto de PCR, la identificación alélica
manual y la falsa identificación alélica por
una digestión enzimática incompleta.
Entre las principales aplicaciones
de las metodologías descritas destacan la comprobación de existencia de
ejemplares híbridos en las poblaciones
silvestres y en las criadas en granjas,
así como la identificación de los ejemplares híbridos para que los productores puedan eliminarlos de sus granjas
como reproductores y finalmente la
posibilidad de averiguar el porcentaje
de hibridación en la granja. En las
diferentes granjas estudiadas se han
encontrado porcentajes de hibridación
muy distintos, por lo tanto conviene
encontrando una gran variabilidad en
los mismos.
DISCUSIÓN
Ambas metodologías (RFLP y RTPCR) han demostrado ser pruebas
efectivas para la identificación de ejemplares híbridos y complementan la información obtenida con otros marcadores (Arruga et al., 1996, 1998; Saz
et al., 1998; García y Arruga, 2002,
2003, 2004, 2005, 2006a, 2006b).
La realización de RT-PCR supera
muchos problemas asociados con RFLP
como que evita la manipulación de pro-
Homocigoto
alelo roja
Heterocigoto
Homocigoto alelo chukar
Figura 2. Discriminación alélica de las muestras de perdiz por el aumento de fluorescencia
durante la realización de RT-PCR.. (Allelic discrimination of partridge samples with different
increases of fluorescences during RT-PCR reaction).
Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 406.
CARACTERIZACIÓN DE SNPS EN PERDICES
estudiar cada caso en concreto.
Se puede evitar la desaparición de
la perdiz roja en pureza, que todavía
está en nuestras granjas y en el campo,
asegurando que las sueltas o repoblaciones se realicen con animales de
origen conocido y certificado genéti-
camente como ausente de hibridación.
Para los productores de perdiz roja,
eliminar los individuos híbridos de entre sus reproductores, les aporta un
valor añadido a sus productos de venta
además de ayudarles a cumplir con la
legislación vigente.
BIBLIOGRAFÍA
Arruga, M.V., M.T. Tejedor, M.R. Villaroel, A.
Heriz, E. Ferreira and F.J. Abenia. 1996.
Genetic studies of Alectoris rufa and A.
graeca in Spain. Arch. Zootec., 45: 339-344.
Arruga, M.V., M.T. Tejedor, J. Saz, L.V. Monteagudo y M. Villarroel. 1998. Avances en la
determinación de la pureza genética de la
perdiz roja. II Jornadas técnicas PROGALTER.
Expoaviga, 98: 9-14.
Brookes, A.J. 1999. The essence of SNPs. Gene,
234: 177-186.
García, C.B. y M.V. Arruga. 2002. Contribución
al conocimiento de la base genética de la
perdiz roja española. V Congreso de la Sociedad Española para los Recursos Genéticos
Animales y III Congreso Ibérico sobre Recursos Genéticos Animales. ISSN: BAG 16660390.
García, C.B. y M.V. Arruga. 2003. Estudios
genéticos en perdiz roja española (Alectoris
rufa L.). ITEA, 24: Tomo II: 543-545.
García, C. B. y M. V. Arruga. 2004. Aplicación del
estudio de DNA al conocimiento de la estructura genética de la perdiz roja (Alectoris rufa,
L.). Veterinaria, 39: 61-64.
García, C.B. and M.V. Arruga. 2005. Advances
in DNA analysis by RAPD methodology in a
little studied genetically avian species
(Alectoris rufa, L.). Poultry Avian Biol. Rev.,
16: 81-86.
García, C. B. and M. V. Arruga. 2006a. Application
of RAPD methodology to preserve the purity
of wild red-legged partridges (Alectoris rufa,
L.). Wildlife Biol. Practice, 2: 13-16.
García, C.B. and M.V. Arruga. 2006b. Comparative genetic analysis between red-legged
partridges (Alectoris rufa) and chukar
partridges (A. chukar): identification of single-nucleotide polymorphisms. Anim. Res.,
55: 335-342.
Johnson, V.J., B. Yucesoy and M.I. Luster.
2004. Genotyping of single nucleotide
polymorphisms in cytokine genes using realtime PCR allelic discrimination technology.
Cytokine, 27: 135-141.
Kasai, F., C.B. García, M.V. Arruga and M.
Ferguson-Smith. 2003. Chromosome
homology between chicken (Gallus gallus
domesticus) and the red-legged partridge
(Alectoris rufa); evidence of the occurrence
of a neocentromere during evolution.
Cytogenet. Genome Res., 102: 326-330.
Kiko, H., E. Niggermann and W. Ruger. 1979.
Physical mapping of the restriction fragments
obtained from bacteriophage T4 dc-DNA with
the restriction endonucleases SmaI, KpnI
and BglII. Mol. Gen. Genet., 172: 3003-3012.
Landegren, U., M. Nilsson and P-Y. Kwok. 1998.
Reading bits of genetic information: methods
for single-nucleotide polymorphism analysis.
Genome Res., 8: 769-776.
Llambí, S., C.B. García y M.V. Arruga. 2006. Una
nueva era para el diagnóstico genético en
salud y producción animal. Albéitar, 93: 3234.
Randi, E, P.U. Alkon and A. Meriggi. 1992. A new
model of Alectoris evolution based on
biochemical analysis. Gibier Faune Sauvage,
Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 407.
GARCÍA Y ARRUGA
9: 661-666.
Reilly, J.G. and C.A. Thomas Jr. 1980. Lenght
polymorphisms, restriction site variation, and
maternal inheritance of mitochondrial DNA of
Drosophila melanogaster. Plasmid, 3: 109-
Archivos de zootecnia vol. 56, Sup. 1, p. 408.
115.
Saz, J., M.V. Arruga, M.T. Tejedor, M. Villarroel
and D. Savva. 1998. Genetic differentiation
in Alectoris rufa and A. graeca from Spain.
Hungarian J. Anim. Product., 48: 86-89.