Efecto del complemento sobre la velocidad de la reacción

CNEA 337
Efecto del Complemento
Sobre la Velocidad de la
Reacción Antígeno-Anticuerpo
E. Degiorgi
L. D. Borella
Comisión
Nacional
de Energía
Atómica
República Argentina
Buenos Aires, 1973
L. M. Scavini
E. E. Capalbo
INIS CLASSI FICATION AND K EYWORDS
C31
RADIOIMMUNOLOGY
ANTlGENS
ANTIBODIES
IMMUNE SERUMS
ALBUMINS
CATTLE
LABELLED COMPOUNDS
IODINE 125
FIL TERS
GUINEA PIGS
PRECIPITINS
COMPLEMENT
ANTlGEN.ANTIBODY REACTIONS
COMI510N NACiONAL DE ENERGIA ATOMICA
DEPENDIENTE DE LA
Pf~ESIDENCIA DE
LA NACION
EFECTO DEL COMPLEMENTO SOBRE LA VELOCIDAD DE LA
REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO
E. Degiorgi ", L.D. Borella", L.M. Scavini···
y É.E. Capalbo···
RESUMEN
Mediante la técnica de filtración con Millipore y un solo anticuerpo
(SAFNO se estudió si el complemento o alguno de sus componentes interviene
en la reacción antígeno-anticuPTDo (Ag-Ac) acelerándola.
Con ella se comprobó que: a) el precalentamiento a 56°C-durante 30 mi
nutos, de la fracción 7S de un suero anti-albÚffiina sérica bovina (ASB) pues
to en contacto con su antígeno específico marcado ASB (1-125), produce dife
rencias significativas en los valores de antígeno retenido específicamente~
diferencias que varían entre 2% y 45% para la fracción inactivada, mientras
que para la fracción sin inactivar varió entre 28% y 85% a los 30 minutos
y les 120 minutos respectivamente de la reacción Ag-Ac; b) el añadido de
suero normal de cobayo al 50% (como fuente de complemento) a la fracción
inactivada, acelera la cinética de la reacción, mientras que el efecto es
menor o nulo cuando aquél es previamente inactivado a 56°C durante 30 minu
tos. El efecto de ese factor, posiblemente complemento, en la velocidad de
la reacción medido con la técnica SAFM, no es universal en todas las comb inaciones molares Ag-Ac siendo más evidente en la ZOna de equivalencia o de
moderado exceso de antígeno.
•
Dirección actual: Servicio Nacional de Sanidad Animal (SEN ASA), Sección- Virología.
Buenos Aires.
•• Miembro de la Carrera del Investigador del CNICT. Dirección actual: Sto Jude Children's
Re se arch Hospital, Memphis, Tennessee, U.S.A•
••• CNEA, Departamento de Biología Nuclear Aplicada.
-4•
s
ti MMA'R Y
The effect of complement (C')on the antigen-antibody (Ag-Ac) reaction
was investigated using the single antibody and Millipore filtration teclmique (2). 1t was established that a) the pretreatment (30 minutes at 56°C)
of the 75 fraction of anti-bovine serum albumin (BSA) significantIy decrease ~he specifically retained labeled antigen (BSA 1-125) which vary from
2% to 45% for the experimental group (inactivated) and from 28% to 85% for
the control group )non-inactivated) both values observed at 30 and at 120
minutes during the Ag-Ac reaction, respectively; b) the addition of 50%
fresh nOTWEl guinea pig serum as source of complement accelerate the reaction, while there is little, probably due to (C'), on the Ag-Ac reaction
as measured by the Millipore filtration technique is not universal for all
molar Ag-Ac combinations being more evident in the equivalence or in the
moderate antigen excess zones.
INfRODUCC10N
Estudios preliminares sobre la reacción Antígeno-Anticuerpo efectuados mediante la técnica de filtración con Millipore (SAMF), indicaron que
esta reacción es acelerada por un factor terrr~lábil presente en el suer9,
posiblemente alguno o algunos de los factores del Complemento (e') (1).
Con el propósito de aclarar este hecho se realizaron expe~iencias
utilizando la técnica de filtración por Millipore (Fig. 1), mediante las
cuales se estudió:
l°) La influencia del calentamiento a 56°C durante 30 minutos sobre
la velocidad de la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac).
~
2°) El papel del complemento en la misma.
MATERIALES Y METOVOS
1. Obtenc.i.6It del. an.ilcwvl.pO
El antisuero se obtuvo de ratones BALB inmunizados con albúmina sérica bovin.a (ASB) .mezclada con adyuvante de Freund completo.
Se precipitaron las globulinas de ese suero y se purificaron por cro
matografía en columna, usando Sephadex G-200.
Se separaron tres picos proteicos. De ellos, el segundo, conteniendo las inmoglobulinas 7S (IgG e 19A) y algunos de los componentes d~l com
plemento con un contenido en proteína de aproximadamente 0,2 mg por ml. Se concentró al quinto de Su volumen utilizando carbowax (polietilenglicol).
2. Sofuc.i.altu ILe.glLtadolriUl
Se usó sal disódica del ác~d<;> etilendiamino tetracético (EITIA -Na
con buffer de veronal pH: 7,4 adICIonado de suero nonnal de conejo al 2)
10% (1).
- 53. An:Ugeno
Se uSó albúmina sérica bovina doblemente cristalizada (ASE) Pentex.
Se la marcó con 1-125 en la División Moléculas Marcadas de esta Comisión
Nacional de Energía Atomica con una actividad específica de 63 ~ci/mg. cuan
do esta solución se trató con ácido tricloroacético al 10%, el 95% de laac
tividad se encontró en el precipitado.
4•
Comp.f.eme.n.to
Se usó como fuente de complemento, suero normal de cobayo.
Se usé la técnica de Borella L. (2) que consiste en determinar cuanti
tativamente el antígeno marcado de un complejo Ag-Ac mediante filtración
de alícuotas de diluciones del antisuero con concentraciones constantes de
Antígeno-I-131 a través de filtros Millipore.
La actividad detectada en el filtro corresponde a la concentración
del anticuerpo en el suero.
RESULTAVOS
En una primera experiencia, a O,S mi de una porción del pico 7S diluí
do 1:16 en solución reguladora EDTA-Veronal 0,0125 M conteniendo suero nor-=mal de conejo al 10% se añadió 0,5 mI del mismo buffer y 1 mi de una solución de ASE (1-125) al 0,1%, conteniendo por lo tanto 1 ~g de ASE; se agitó
e incubó a 37°C.
Otra porción se inactivó a 56uC durante 30 minutos con el objeto de
estudiar la influencia del calentamiento del antisuero, fracción 75, sobre
la velocidad de la reacción, siendo las condiciones de trabajo las mismas
descriptas anteriorrr~nte.
Después de la incubación, se agitaron nuevamente las mezclas y se
volcaron los 2 mI contenidos en cada tubo en un aparato de filtración indi
vidual conteniendo un filtro Millipore, graduándose la velocidad de filtración de tal manera que ésta se realizó en 15-20 minutos (fig. 1).
En cada determinación se incluyeron tubos controles adicionales, conteniendo en algunos casos, solamente antígeno marcado y en otros antisuero,
cada uno de ellos añadido de 1 mi de solución reguladora EDTA-Veronal 0,0125
M con 10% de suero nomn.l de conej o. Para la determinación de la radiactivi dad luego de la filtración, se recogió el líquido que pasa a través del filtro en un tubo de polietileno y el filtro Millipore conteniendo el complejo
Ag-Ac en otro tubo, efectuando el contaje correspondiente por separado en
un espectrómetro de centelleo.
Como podemos observar en la figura 2, el estudio cinético de la r~ac
c ión Ag-Ac, haciendo mediciones del antígeno retenido específicamente, a los 10, 20, 30, 60, 120 Y 240 minutos, sigue una línea recta hasta los 20
minutos con un valor de retención de un 2%, para continuar con el mismo va
lar a los 30 minutos para el ''pool'' de suero inactivado pero alcanzando el
28% con el suero sin inactivar. A los 60 minutos el" suero inactivado fijaun 20%, mientras que el sin activar fija un 68%. A los 120 minutos con el
-6suero inactivado, el antígeno retenido específicamente es de un 45\ mientras
con el suero sin inaetivar alcanza a un 85\. A los 240 minutos los valores son de 80% y 97% para el suero sin inactivar e inactivado respect ivamep
te.
En esta experiencia se demuestra que en la fracción 7S del antisuero
existe un factor termolábil cuya inactivación por calor, durante 30 minutos
a 56°C, produce una disminuci6n del antígeno retenido específicamente.
q~e
En vista de los resultados anteriores, se trató de investigar si este
factor correspondía al complemento (C') o a alguno de los factores del mismo y para ello se decidió utilizar como fuente de C' suero normal de cobayo al 50%.
En esta experiencia alícuotas del pico 7S de la cromatografía en Sephadex se inactivaron a 56°C durante 30 minutos, luego de lo cual se hicieron dilU4iones 1:20, 1:40, 1:80 de manera de tener 3 sistemas: uno en exceso de anticuerpo, otro en equivalencia y otro en exceso de antígeno.
Se tomaron 0,5 mI de cada una de las diluciones que se colocaron. en
dos series a y b de tubos. Se agregó 0,2 mi de suero normal de cobayo al
50% sin inactivar, a cada tubo de la serie a y 0,2 mI de suero normal de
cobayo inactivado a 56°C durante 30 minutos-; a cada uno de la serie ~.
'A ambas series se añadió 1 mi de ASB (1-125) al 0,1\ en solución reguladora EDTA-Veronal con suero normal de conejo al 10\ como diluyente. Los
tubos se agitaron y se dejaron S, 15, 30 Y 60 minutos a 37°C.
Los resultados están indicados en la Hg. 3, en la que podemos observar que con la dilución 1:20, zona de exceso de anticuerpo, haya los 15 mi
nutos una cantidad de antígeno retenido específicamente, del 65\ para el suero de cobayo sin inactivar'frente a un valor del 52\ para el suero de co
bayo inactivado. A los 30 minutos, los valores son del 90\ y 85\ para el suero sin inactivar e inactivado respectivamente. A los 60 minutos los valores alcanzan el 98\ para ambos sueros.
Con la dilución 1:40, a los 15 minutos los valores son iguales para
ambos (5%). A los 30 minutos este valor es de 12\ para el suero normal y
de un 8% para el suero inactivado. A l0s 60 minutos son de IDl 50\ Y IDl 30\
respectivamente.
Con la dHuci6n 1:80 o sea en la zona de gran exceso de antígeno no
hay prácticamente retención específica hasta los 60 minutos.
Otra experiencia similar se llevó a cabo poniendo diluciones de la
fracción 75 del antisuero en presencia del antígeno marcado, incubándose
a 37°C y luego a 4°C durante 1 hora, 24 horas ó 48 horas, filtrándose luego
en las condiciones expuestas.
Como se ve en la figura 4, para la dilución 1:20 el valor de antígeno retenido es constante y alcanza un valor del 100\. Para la dilución
1:40 aIcanza a las 24 horas un valor del 85\ igual para el suero inactivado como para el suero sin activar. A las 48 horas alcanzan ambos un valor
constante de 98%. Para la dilución 1:80 les valores tanto para el suero
inac tdvadc como para el sin inactivar alcanzan a las 24 horas IDl valor del
15% y para las 48 horas, un 98%.
~
7-
CONCLUSIONES
Cuando se estudió la reacción entre el suero de conejo anti ASB y la
ASB-I-13l por el método de filtración en ~úllipore y un solo anticuerpo, se
observó que el precalentamiento del antisuero a 56°C, 30 minutos, disminuye
el porcentaje de retención específica en función del tiempo, de un 2% a un
45%. Se estudió el efecto que tenía el suero nomal de cobayo inactivado y
sin inactivar, sobre el antisuero inactivado, cuando se hacía reaccionar con
el antígeno marcado. Se observó que con el suero sin inactivar, se acelera
la cinética de la reacción, mientras que con el inactivado, el efecto es me
nor o nulo.
Se sabe que el agregado de EDrA compleja a los iones Ca++ y Mg++ nec~
sarios para efectuar las etapas 2 y 4 de las reacciones de hemálisis con los componentes del complemento C"lq, C'lr, C'ls y C'2. Por lo tanto, en
estas experiencias, estos factores fueron excluídos por el agregado de EDrA.
De acuerdo a las características de termo'lab i Lidad se excluyen los componen
tes C3, C4, C6 y C7. De esta manera resulta que alguno de los restantes com
ponentes C5, CS y C9, sería el factor acelerante de la reacción Ag-Ac.
-8-
A
Anti-ASB
/
<, ~ !J
s«
.o~ ~:~
ASB (1-125)
Filtro Millipore
Placa Fi Itrante
Vacío
Com piejo Ag-Ac
B
Vacío
+ - - ASB (1-125)
.l ....
Figura 1
Esquema representativo de la técnica SAMF
(Single Antibody Millipore Filtratíon)
para la determinación cuantitativa del antígeno marcado.
En A se colocan el antisuero y el antígeno marcado (ASB 1-125) en
una placa fiitrante en la cual se ha colocado un filtro Millipore con
una porosidad promedio de 0,45 micron. En B se demuestra que el
complejo Ag-Ac debido a su mayor tamaño no pasa el filtro Millipore
y sí lo hace el antígeno libre que no ha reaccionado con el anticuerpo.
·9·
lOO
80
60
20
O~"-='--r---.....----_----~----~
30
60
120
180
240
TIEMPO (min)
Figura 2
Efecto del calentamiento del antisuero sobre la velocidad de la
reacción Ag-Ac - Antígeno: ASB 0-125) 1 ug/ml. Antisuero: Fracción
7S de un suero anti-ASB diluída al 1: 16. Sin in activar: ~;
Inactivada (30 minutos a 56 oC): !J.-A.
lOO
75
...eL
Illzlml ASB .1125
Fracción 7S ant. ASa (ratón)
-1:20
----1:40
••••1: lllI
50
uJ
....
CD
a:::
>/!
25
O
5
iD
40
50
Tiempo (min)
Figura 3
Efecto del suero normal de cobayo (SNC) sobre la velocidad de la
reacción Ag-Ac. Antígeno: ASB (1.-125) '1 ug/ml.
Anticuerpo: fracción 7S de un suero anti-ASB diluida al 1:20-;
al 1:40-.-.-.-.-; y al 1:80 •••••.•.• SNC: in activado: !J.---!J.;
sin in activar 0-0
· 10 lOO·························
_
~
@
--- --- .-l/lg!ml ASB * 1''''
Fracción 7S ant. ASa (ratón)
···1:20
...1: 40
--1:80
o
25
!'Y.
10
20
30
40
No inactivado
Inactivado
50
60
Tiempo (horas)
Figura 4
Efecto del suerononnal de cobayo (SNC) sobre la velocidad de la
reacción Ag-Ac, Antígeno: ASB (1-125) 1 ug/ml,
Anticuerpo: fracción 75 de un suero anti-A5B diluída al 1: 20-;
al 1:40-.-.-.- y al 1:80.........•. -SNC inactivado !'Y.-!'Y.;
sin inactivar 0--0
- 11 BIBLIOGRAFlA
1. KABAT, E.A., Ml\YER, M.M.. Experimental Irrmunochemistry Cap. 4, Thomas
A.. Springfíeld(196l).
Z. BORELLA, L.D.• Quantítatíve Detenninatíon of Antíbody - BOUJ'l.d Labeled
Antígens by Fíltratíon through Cellulose PGrous Membranes. ftnal. Bíoche~. 24; 259-269, (1968).
FE DE ERRATA
En la página 4, primer párrafo, donde dice: "rion, while there is littl e,
probably due to";
Debe decir: "tion, while there is Hule or no effect ir the guinea pig
serum i s inactivated, Thi s accelerating effect, probably due to C'? on the
Ag-Ab reaction as measured by the Millipore filtration" •••