Introducción a la biología molecular

Curso: Bioseguridad y Biotecnología Moderna
Introducción a la biología molecular
Raul Blas
Facultad de agronomia
Dpto. Fitotecnia
[email protected]
La tecnología
es un proceso y un conjunto de conocimientos tanto como
una colección de artefactos (Carlson, 2010)
Biología es tecnología.
La biología es la tecnología más antigua. A lo largo de la
historia de la vida en la Tierra, los organismos han hecho uso
de unos a otros en formas sofisticadas (Carlson, 2010).
Interacción entre organismos constituye una economía natural
global que mueve los recursos naturales a escalas desde
molecular a macroscópica
Los seres humanos siempre han dependido explícitamente de
esta economía biológica para proveerse de alimentos, oxigeno, y
otros servicios.
Hasta hace poco, nuestra economía industrial se basó
principalmente en tecnologías no biológicas; la revolución
industrial fue construida principalmente sobre el fuego,
minerales y química.
Ahora, nuestra economía parece estar cambiando rápidamente,
y basados en la incorporación de nuevos organismos cuyos
genomas han sido modificados a través de la aplicación del
esfuerzo y el ingenio humano.
formas de uso
de la biología
como tecnología
agricultura
mejoramiento genético
e.g. La biorremediación utilizado para limpiar los contaminantes
(generados por otras tecnologías humana) a través de la selección de las
plantas y los animales que se alimentan de materiales que se consideran
en general como residuos o desperdicios.
1828: Friedrich Wohler , produjo cristales
de Urea
Nacio la quimica organica sintetica
1843-45: Hermann Kolbe, sintetizó acido acético a partir
de sus elementos inorgánicos
http://syntheticbiology.org/ (MIT)
Biología Sintética (BS) es
 el diseño y construcción de nuevas partes biológicas,
dispositivos y sistemas.
 el rediseño de sistemas biológicos naturales, ya existentes,
para aplicaciones útiles.
 BS se basa en trabajos recientes en la biología de sistemas
que consiste en la modelación de sistemas biológicos, pero
va más allá de la construcción y la estandarización de partes
biológicas, que se unen para formar sistemas más
complejos.
 BS se basa en el desarrollo de las matemáticas,
computación, bioquímica, etc.
La genética Molecular
La “molecularización” de la genética en los años 1950 cambió el
estudio de las herencias en general.
Molecularización se refiere:
a la caracterización de los procesos biológicos a la escala de las
proteinas, y ácidos nucleicos (ARN, y ADN);
en la identificación de las modalidades de bloqueo de los
procesos biológicos elementales por las alteraciones de las
macromoléculas.
El desarrollo de cristalografía de rayos X, y resonancia
magnética molecular, en las décadas antes de 1950
abrió la venta al mundo molecular.
Experimento de Frederick Griffith, 1928
El principio de la
transformacion era
DNA
Que es el DNA?
Componentes fundamentales de los acidos
nucleicos:
Componente acido: Fosfatos
Componente neutro: Azucares
Componente basico: Bases nitrogenadas
Adenina, Guanina, Citosina y Timina
Estructura del ADN
Nucleotidos unidos por enlaces fosfodiester
Cromosomas
núcleo
Célula
DNA doble
hebra
Pares de
bases
Antiparalelismo
de las dos hebras
Tamano de genomas y numero
de genes en vegetales
Espèce
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Prunus persica (L.) Batsch
Oryza sativa L.
Eucalyptus grandis W. Hill ex- Maiden
Brassica rapa L.
Quercus robur L.
Lycopersicon sculentum Mill.
Solanum tuberosum L.
Zea mays L.
Lactuca sativa L.
Pisum sativum L.
Hordeum vulgare L.
Triticum aestivum L.
Tulipa fosteriana L.
Moyenne
Taille physique de
Génome (Mb)
150
300
450
600
650
900
980
1.540
2.500
2.730
5.000
5.200
16.000
30.000
~5.000
Nombre
chromosomes (n)
5
8
12
11
10
12
12
12
10
9
7
7
21
12
-
Source : INRA (2003) ; Borém et al. (2003) ; Delseny, et al. (2004) ;
Gibson & Muse (2004), pb = paire de bases, 1Mb = 106 pb
Nombre
gènes
25.500
40.000
25.000
50.000
50.000-75.000
40.100
Tipos de secuencias del genoma nuclear
Tipo de
secuencias
Número de copias
por genoma
Que son?
Secuencias
únicas
1 copia o unos
pocos
Famila multigenica
Genes que codifican proteinas
Secuencias
medianamen
te repetidas
1000 a 100000
copias
Genes que codifican para ARNr,
ARNt, eventualmente de genes
de protéinas
Secuencias
altamente
repetidas
100000 a 1000000
No son genes,
Rol poco conocido
Genomas en los organismos
genoma es el conjunto de todas las secuencias de DNA de un individuo o de una
especie.
Que es un gen?
Un gen es el conjunto de secuencias de
DNA
que
incluye:
Secuencias
estructurales (intrones, exones) y
Secuencias reguladoras, necesarias
para codificar un producto genico, sea
este un RNA maduro de cualquier tipo o
una proteina funcional.
RNA
Gen
Proteina
Transmisión de la información genética
Región reguladora
Secuencias reguladoras
Región estructural
Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3 Intron3 Exon4
Transcripción
Donde?
Cuando?
Que cantidad?
Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3 Intron3 Exon4
Pre-mRNA
Maduración de mRNA
Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 AAAAA
Traducción
Proteína
Corte y empalme de exones
…30% de
genes
Código genético
 El codigo genetico es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la
informacion contenida en el mRNA (transcrito del DNA) para la sintesis de las
proteinas
 Es la correlacion entre dos lenguajes informativos:
la secuencia de nucleotidos en el mRNA (el lenguaje con 4 letras de los
acidos nucleicos)
La secuencia de aminoacidos en el polipeptido (lenguaje con 20 letras de las
proteinas)
 Concretamente, el codigo genetico establece la correspondencia entre los 64
posibles tripletes de bases del mRNA y los 20 aa de las proteinas.
Modelos de representacion
Se han elaborado diversos modelos (tablas, esquemas, etc) para
representar de forma clara y sencilla la correlacion existente entre codones
del mRNA y aa del polipeptido traducido
En todos los modelos, la secuencia del triplete se refiere al codon del
mRNA
Formato en tabla
Video mRNA-aa
Interaccion de los factores de transcripcion con la polimerasa
La flexibilidad del DNA permite la aproximacion fisica de los tres tipos de secuencias
promotoras a pesar de su lejania en la secuencia lineal de DNA. De esta forma los
factores de transcripcion unidos a las regiones basal, proximales, y distales pueden
contactar entre si y con la RNA polimerasa II, por lo que participan en forma conjunta
en el control del inicio de la transcripcion.
Genes constitutivos; aquellos que se expresan de una forma constante, a la misma
velocidad en todo momento de la vida celular (~ genes domesticos o
caseros(housekeeping genes)
Genes inducibles; estan reguladas en tiempo y espacio (~genes regulables o de expresion
diferencial), los TFs que regulan estos genes no estan presentes en la celula de forma
continua, sino que se sintetizan o se activan en momentos especificos o en tejidos
particulares.
Herramientas básicas de biología Molecular
Enzimas de restricción
Ligación
PCR
Electroforesis
Hibridación
Southern Blot
Enzimes de restriccion
Secuencias Palindromicas
Sequence is symmetrical
about the center point
Point of cleavage
3’
5’
G A A T T C
C T T A A G
3’
5’
Point of cleavage
Restriction enzymes
Corte de DNA con EcoRI
Mecanismos de Ligación
ATP
Mecanismo de ligacion
Electroforesis
Sonda (probe)
es un fragmento de DNA de longitud variable (~ 100-1000 bases
longitud)
Es usado para detectar muestras de DNA o RNA (la presencia de
secuencia de nucleotidos que son complementarios a la secuencia
de la sonda)
La sonda de hibridizacion es marcado radiactivamente
(communmente con 32P) o con marcdores inmunologicos como
digoxigenin.
La sonda marcada es denaturada (por calentamiento) en simples
hebras de DNA y hibridizada al DNA objetivo (target DNA)
(Southern blotting) or RNA (northern blotting)
Se immobiliza sobre la membrana.
Secuencias de DNA complementrias a la sonda son detectadas
por la visualizacion de la sonda a traves de la autoradiografia.
Hibridación
Sonda DNA
Sonda Marcada
CGCAGATCTAATATAT
CGCAGATCTAATATAT
Hibridacion
CGCAGATCTAATATAT
CCTTCCGGAATTAGCGTCTAGATTATATACCAGAATAGGCTA
DNA Blanco
Gel despues de
electroforesis
Detectado con sondas
hibridadas
Southern Blot
Es el procedimiento por el cual se transfiere el DNA que
ha sido digerido y corrido en un gel de agarosa (0,8%),
hacia una matriz sólida tal como es una membrana de
nylon.
El total de DNA que se digerió se corre en un gel de
agarosa (0,8%).
El ADN se encuentra en forma de fragmentos de doble
cadena que son muy cortos (100 pb) y otros muy
grandes (15000 pb), por lo que el gel es sometido a
determinadas soluciones para que los fragmentos puedan
ser transferidos hacia la matriz sólida en forma de
cadenas simples. (NaOH)
NaOH 0.4M
10.000 ans de
processus de
domestication et
Genomica
d’agriculture
Proteomica
4. Era –”omica”
Metabolomica
Capacidad de analisis de genoma completo
Sintesis de genes?
Regulación/expresión
génica
RNAi, snRNA, miRNA
tRNA
DNA
rRNA
Transferencia
Ribosomas
mRNA
Genoma
Transcriptoma
Proteína
Proteoma
Fenotipo
metabolitos
Metaboloma
Informacion
Biologica
Genome
mRNAs 1
Proteome 1
Genome
Genome
mRNAs 3
mRNAs 2
Proteome 3
Proteome 2
Perspectivas-conclusiones
Animales y plantas se convierten en objetivo
(blanco) como biorreactores naturales para
producir nuevos productos, los que nunca fueron
creados por mutagenesis, cruzamientos o
seleccion
Esta nueva tecnologia facilita(rá) el desarrollo
radical de nuevas terapias medicas,y sistemas de
diagnostico.
Contribucion de la biotecnologia molecular:
Proporciona la posibilidad de diagnostico mas fino de las enfermedades y
prevencion o cura de un amplio rango de enfermedades infecciosas y geneticas.
Incremento del rendimiento de los cultivos (resistencia a stres biotico y abiotico)
Desarrollo de micro-organismos que producen quimicos, antibioticos, polimeros,
aminoacidos, enzimas y varios aditivos de los alimentos.
Desarrolla ganado y otros animales con determinada atributos geneticamente
superiores.
Facilita la remocion de los contaminantes y material basura del ambiente
(bioremediacion)
Reacciones (-) de la sociedad sobre biotecnologia
Dos aspectos de la biotecnologia pueden haber contribuido a la
incertidumbre :
La velocidad con que fueron adoptadas en algunos sectores economicos y
llegada asombrosa en el mercado
Inicio de la
Tecnologia Invencion produccion
Lapicero
1888
1938
Television
1907
1936
Transgenicos
1983
1994
Tiempo transcurrido
para comercializacion
(anos)
50
29
11
El periodo corto de tiempo probablemente no es suficiente para aprender
y acostumbrarse a productos transgenicos
Evolucion en la
Produccion de
alimentos
10.000 años de
procesos de
domesticacion y de
agricultura
1
Tomate silvestre
Tomate cultivada
Capacidad de analisis de genomas
2
Hibridacion y seleccion
4. Genómica
Ingenieria
Genetica
Sintesis de genes
3
OGM
Conclusiones
Para la ingeniería de sistemas biológicos, necesitaremos
aprender considerablemente mas sobre la forma como las
piezas biológicas trabajan juntas.
 Desafíos surgirán que no son obvias de la observación de
todos los sistemas funcionales, pre-existentes.
Con el tiempo, vamos a comprender y abordar los desafíos, el
uso de la biología va a cambiar drásticamente en el proceso.