Aplicación de ingeniería genética en levaduras de vino

“La ingeniería genética de
levaduras como herramienta
para el desarrollo
Biotecnológico del vino”
Ivan Ciklic, Laura Mercado y Mariana Combina
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Mendoza
Resumen de la presentación
Historica
1) Importancia de Saccharomyces cerevisiae
Biotecnología
Organismo Modelo
2) Definición y aclaración de conceptos biotecnológicos
3) Principales areas de aplicación de la ingeniería genética de
levaduras de vino
Estrategias previas
4) Ejemplificación:
5) Conclusiones
Reducción del nivel de
alcohol en vinos
Nuestro proyecto
en INTA
Importancia de Saccharomyces cerevisiae
Biotecnología Tradicional
Uso extensivo en la industria debido a su larga historia en la producción
De bebidas alcoholicas y en panaderías
Biotecnología Moderna
Mejoramiento génetico de levaduras para uso industrial. Producción de
enzimas, hormonas y compuestos quimicos en Farmaceutica
Importancia de Saccharomyces cerevisiae
Organismo modelo
✱ Eucariota unicelular con todas las características típicas (e.g.
organelas, regulación del ciclo celular, envejecimiento, apoptosis)
✱ Microorganismo con tiempos breves de generaión (1,5 h), alta
densidad (108 cel/ml) y eleveda proporción superficie/volumen
✱ Génetica Mendeliana (ciclo de vida sexual, análisis de tetradas)
✱ Gran eficiencia de recombinación homologa
✱ Primer organismo eucariota en contar con la secuencia completa del
genoma (1996)
✱Colección de cepas delecionadas para cada uno de los 6000 genes
Definición y aclaración de algunos
conceptos importantes
Biotecnología
Cualquier aplicación tecnologica que utilice sistemas biológicos,
organismos vivientes o derivados de ellos para fabricar o
modificar productos o procesos para un uso específico
Organismo modificado geneticamente (GMO)
Un GMO es un organismo cuya composición genética ha sido
alterada mediante la aplicación de técnicas de ingenieria génetica.
Estas alteraciones generalmente implican la incorporación de un
nuevo gen/genes o el reemplazo de un gen/genes prexistente por
uno diferente
Transgénico
Es un caso particular de GMO en el cual el gen/genes incorporado
proviene de una especie distinta de la del organismo receptor
Aceptación de productos derivados de
GMOs en la industria de alimentos
Aceptación de GMOs
Ventajas para
el consumidor
- Productos más saludables
- Menor impacto en el ambiente
“Iniciativa
intragénica”
Percepción de riesgo
aceptación USA
- Credibilidad en los
entes reguladores
- Desconfianza en las
ONGs conservadoras
- Variabilidad intraespecie
- Transgénico de especie familiar
Europa aceptación
- Desconfianza en
entes reguladores
- Gran influencia de
ONGs conservadoras
Areas de aplicación de ingeniería
genética de levaduras de vino
Mejoramiento de la performance
durante la fermentación
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Areas de aplicación de ingeniería
genética de levaduras de vino
Mejoramiento de la eficiencia
de procesamiento
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Aplicación de ingeniería genética en
levaduras de vino
Mejoramiento del control biológico
de microorganismos contaminantes
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Aplicación de ingeniería genética en
levaduras de vino
Mejoramiento del sabor y otras
características sensoriales
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Aplicación de ingeniería genética en
levaduras de vino
Mejoramiento de las propiedades
saludables del vino
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Problema abordado y principales
estrategias para solucionarlo
Problema
“Vinos con alta concentración de
alcohol, indeseable para el
Mercado de exportación“
Causas
_ Uvas cosechadas con madurez
azucarina muy avanzada
_ Veranos cálidos con un aumento
en la incidencia solar
Principales estrategias biológicas
1) Desarrollo de una levadura genéticamente modificada (GMO) con
un redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol
2) Redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol sin
utilizar técnicas de ingeniería genética (sin GMOs)
Adaptado de D. Kutina et al., 2010
Metabolismo anaerobico de glucosa en
S. cerevisiae y disponibilidad de NADH/NAD+
Sobre-expresión de la glicerol fosfato
dehidrogenasa GPD1/2
Adaptado de D. Kutina et al., 2010
- Reducción de hasta
45 % etanol y aumento
de hasta 700 %
en glicerol
-Alta producción de
acido acético
Adaptado de D. Kutina et al., 2010
Deleción de Piruvato descarboxilasas
PDC1, PDC2, PDC5 y PDC6
Hipotesis de trabajo
PDC2
Mutagénesis
pdc2
Selección
PDC2 = factor de
transcripción que
regula positivamente
la expresión de las
piruvato decarboxilasas
PDC1 y PDC5
Reducción de regulación
positiva de PDC1 y PDC5
Reducción nivel de expresión
de PDC1 y PDC5
Redución en la producción
de etanol
PDC1 y PDC5 = Dos
isoformas de la piruvato
decarboxilasa que
cataliza la conversión
de piruvato en
acetaldehído
Mutagénesis de PDC2 y reducción de la
producción de etanol
Nevoigt y Stahl 1996
Deleción Δpdc2
Proyecto Actual
Mutagenesis de PDC2
Reducción actividad
de Pdc - 80%
1°Selección: mutantes pdc2
con actividad Pdc reducida
Reducción etanol
- 30%
2°Selección: mutantes pdc2
con etanol reducido
Fermentación a escala piloto
con mutantes seleccionados
Proyecto actual vs. estrategias anteriores
para reducir niveles de etanol
Proyecto actual
Mutagénesis de PDC2 y selección
de variantes mutantes apropiadas
Estrategia y autores
Ventajas asociadas
-Variabilidad genética intraespecie. -Mutación
integrada establemente en el genoma.
-Efectos moderados sobre el metabolismo.
Desventajas asociadas
Deleción del gen PDC2
(Nevoigt y Stahl 1996)
-Causa un severo efecto en el metabolismo del
Etanol con reducciones de hasta un 30 %.
-Los mutantes no pueden crecer en glucosa
Sobreexpresión de genes
GPD1/2 de la vía de glicerol
(Remize et al., 1999; Lopes Barros
et al., 2000; Eglinton et al.,2002)
-Aumento en la producción de acidoacético,
a consecuencia del desequilibrio redox.
-Problemas asociados con plásmidos de
multicopia: número variable de copias p/célula,
es necesario mantener una presión selectiva
Sobreexpresión del gen de la
La glucosa oxidasa de A. Niger
(Malherbe et al., 2003)
-Problemas asociados al uso de plásmidos de
multicopia.
-Producto transgénico, poca aceptación por la industria y consumidores
Estrategias alternativas sin alteración directa de
un componente de la via metabolica de glucosa
NADH oxidasa
- Fermentación incompleta
- Reducción hasta 7 % etanol
- Bajas tasas de consumo de azucar y alta
producción de acetaldehído, acetona y acetoina
Transportadores
de glicerol
- Elevada producción de glicerol
- 30 % reducción en la producción de biomasa
Glucosa oxidasa
- Reducción en etanol de hasta 2 % v/v
- Requiere oxigeno para funcionar
Transportadores
de hexosas
- Fermentación incompleta
- Reducción hasta 7 % etanol
- Bajas tasas de consumo de azucar y alta
producción de acetaldehído, acetona y acetoina
Estrategias biológicas sin uso de
GMOs
✱ Sondeo de variantes naturales con baja producción de etanol
-Poco probable de hayar ya que la levadura esta altamente
adaptada para producir etanol por selección natural
✱ Generación de híbridos interespecíficos
-Hasta el momento no se ha encontrado ningún hibrido ya sea
artificial o natural que produzca menos etanol
✱ Evolución adaptativa
-Es muy difícil generar condiciones de presión selectiva que
favorezcan un redireccionamiento del metabolismo de etanol
Conclusiones
✱ La biotecnología de levaduras es una herramienta poderosa para
obtener mejoras en el proceso de elaboración del vino, especialmente
en la etapa de fermentación
✱ Como ejemplo hemos visto que en el problema de la reducción de
los niveles de alcohol, distintas estrategias de GMOs han logrado
reducir en menor o mayor proporción la producción de etanol
asociado casi siempre a un aumento en la producción de glicerol
✱ Las principales limitaciones de las estrategias con GMOs derivan en
muchos casos de factores intrínsecos como un aumento de productos
indeseados como el ácido acético, o de factores externos como la baja
aceptación particularmente de los productos transgénicos
✱ El proyecto que desarrollamos en el INTA potencialmente posee
varias ventajas sobre trabajos anteriores ya que se busca un
alteración moderada del metabolismo y se obtendría una cepa nativa
GMO pero que no es transgénica lo cual aumenta la aceptación