PRACTICA No 5 EXTRACCION DNA PLASMIDICO

UNIVERSIDAD DE SANTANDER
Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales
GUIA DE LABORATORIO
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA CON SDS
Nombre del Profesor :
Nombre del Curso
Código del curso:
Horas de trabajo con el docente
Horas de trabajo independiente
Horas totales (desarrollo de la práctica)
YADIRA YLEANA PINTO
Laboratorio de Biología Molecular
1horas
2 horas
3 horas
1. Introducción
Los plasmidos son moléculas de DNA extracromosomal los cuales están presentes en algunas células bacterianas,
levaduras y hongos. Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han
encontrado plàsmidos lineales. La replicación de los plasmidos es independiente de la replicación del cromosoma del
huésped ya que los plasmidos poseen su propio origen de replicación. El número de copias de un plasmido en la
célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regulación. Los plàsmidos no
son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una ventaja competitiva a las células
que los poseen, dado a que los plasmidos poseen genes que le confieren características selectivas a su huésped tales
como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, factores de
virulencia y producción de toxinas entre otros.
Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de
usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA
que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta
de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de
vector recombinante.
Existen unos requerimientos básicos que un plásmido debe poseer para que sea un buen vector al aplicar su uso en la
biología molecular. Debe poseer un origen de replicación, un gen para un marcador de selección (ya sea resistencia a
algún antibiótico) y un lugar de clonaje múltiple (MCS). El MCS es una región donde pueden digerir varias enzimas de
restricción pero solamente una vez.
Existen diversos métodos para el aislamiento de plasmidos. Las técnicas de Minipreps o mini preparaciones de
plasmidos, permiten la recuperación de plasmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las
células con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando
que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuración superenrrollada del plasmido
se mantiene estable.
La lisis alcalina es el método mayormente utilizado para el aislamiento de plasmidos circulares proveniente de células
bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos
básicos.
a. Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación.
b. Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared celular del
huésped.
c. Resuspender las células en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.
d. Lisar las células con NaOH y SDS.
e. Unión de las hebras de DNA y remoción de contaminación mediante el acetato de potasio.
f. Precipitación del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio,
Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).
g. Enjuague del material genético con EtOH al 70%.
h. Resuspender el material genético.
ALCANCE
Con este protocolo se obtiene DNA plasmídico a partir de cultivos bacterianos a pequeña escala (1.4 ml), mediante
tratamiento con lisis alcalina y SDS. La obtención de DNA plasmídico a pequeña escala es esencial para el análisis de
colonias recombinantes.
1
GENERALIDADES
•
Para obtener DNA plasmídico este debe ser replicado en una célula anfitriona. Con frecuencia se utilizan cepas
de E. coli por las facilidades que ofrecen para su manipulación y por ser un organismo muy estudiado.
•
El cultivo bacteriano debe provenir de una sola colonia, la cual debe ser cultivada en 5 ml de medio líquido.
Utilizando el agente selectivo adecuado (antibiótico).
•
Los cultivos deben ser incubados toda la noche a 37°C con agitación a 150 rpm.
Principio del método
Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA
plasmídico (pequeños círculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosómico (fragmentado). La
alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis celular, la
desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven
menos afectados por su pequeño tamaño y estructura superenrollada. La neutralización del medio en presencia de
una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca que se cierre covalentemente el DNA plasmídico y la
precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potásica del dodecil
sulfato) y la del DNA cromosómico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de
proteínas y DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y
conserva mayoritariamente su estructura nativa
2. Competencias
2.1 Competencia general
Obtener DNA plasmídico de células bacterianas mediante el método de lisis celular por lisis alcalina
2.2 Competencias específicas
Describir los tipos de plasmidos su importancia, función y usos en la ingeniería genética.
Identificar las acciones de los componentes del protocolo de extracción
3. Lista de Equipos
Balanza
Cámara de extracción
Cámara de flujo laminar para la inoculación de bacterias
Centrifuga refrigerada para tubos eppendorf
pH-metro
Shaker
Vortex
3.1. Lista de materiales y reactivos
- Cultivo bacteriano que contenga el plasmido
Reactivos
Soluciòn I: Glucosa/Tris/EDTA (GTE)
50mM glucosa
25mM TrisHCl pH 8.0
10mM EDTA
Añada 4mg/ml lisozima antes de utilizar si ES una bacteria gram positiva.
Soluciòn II: NaOH/SDS
0.2N NaOH
1% (w/v) SDS
Prepare esta soluciòn antes de ser utilizada
Soluciòn III: Acetato de Potasio 5M
29.5 ml acido acético glacial
KOH en grano hasta pH de 4.8
H2O hasta 100ml
Guardar a temperatura ambiente, no esterilizar.
RNasa
10mM TrisCL pH 7.5
15 mM NaCL
Caliente a 80ºC por 10 min. Permita que la solución se enfrie a temperatura ambiente y guarde en alícuotas a -20ºC.
Diluya a 10µg/ml.
Materiales
Falcon 15 ml, Gradillas, Hielo, Micropipetas de 1000 ul, 200 ul y 10ul, Nevera de icopor, Puntas para micropipetas
blancas (10ul), amarillas (200 ul) y azules (1000 ul), Tubos eppendord de 1.5 ul
Elementos de protección
2
Bata de laboratorio
Guantes de látex
Cámara de extracción
El estudiante debe traer al laboratorio: Guantes, bata,
4. Contexto TEORICO
Contestar las siguientes preguntas antes de entrar a la práctica.
1. Que es un plásmido y que funciones cumplen en Biología Molecular
2. Se puede decir que un DNA plasmídico es igual a un DNA genómico bacteriano? Explique
3. Cuales son las 3 diferentes conformaciones que pueden adquirir los plásmidos
4. En que consiste la Denaturación alcalina para la extracción de DNA plasmídico?
5. Cual es la función en un protocolo de extracción de ADN plasmídico de :
a. Buffer de lisis que con tiene un detergente
b. Buffer de Neutralización que contiene un componente acido
c. Buffer de Resuspensión
d. Identifique cada uno de los anteriores Buffer en nuestro protocolo
6. Que función cumple la RNAsa A en el protocolo?
7. Para que se adiciona ampicilina en el medio de cultivo de las Bacterias?
8. Fuera del método de extracción por Denaturación alcalina que otros métodos existen para extracción de ADN
plasmídico?
4. Procedimiento
Puntos de control
•
Antes de comenzar el procedimiento se debe verificar el crecimiento bacterial para lo cual debe observarse el
medio turbio.
•
Al adicionar la solución de lisis 2 debe observarse una nata blanca lo cual indica el rompimiento celular y
después de centrifugar se debe obtener un sobrenadante transparente.
•
Luego de realizar la precipitación se debe observar la presencia de un pellet después de la centrifugación.
•
Al secar el pellet éste debe tornarse transparente.
Desarrollo del método
Día Nº1:
•
Inocular la bacteria deseada (contiene plasmido) en caldo (LB, YT o Terrific Broth) por 24 horas a 37°C en
agitación. Recordar que si el plasmido tiene algún gen de selección, como por ejemplo resistencia a algún
antibiótico, se debe adicionar en el medio que va a ser inoculada la bacteria.
Dìa Nº2:
•
Transferir 1,5 ml de la bacteria en un eppendorf de 1,5 estéril y centrifugar a 13,000 rpm (revoluciones por min)
durante 2 minutos para formar un pellet de bacterias.
•
Descartar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 100µl de la solución I(fría), darle vortex e incubar por 5
minutos a temperatura ambiente. Recordar que la solución I debe estar en hielo.
•
Añadir 200 µl de la solución II a cada tubo , tapar y mezclar bien por inversión. Incubar en hielo por 5 minutos.
•
Añadir 150µl de la solución III(fría), tapar el tubo, mezclar por inversión (puede darle vortex) . Incubar en hielo
por 5 minutos.
•
Nuevamente vortex varios segundos y centrifugar por 5 minutos a 13,000 rpm.
•
Transferir el sobrenadante a un eppendorf estéril. Añadir dos volúmenes de alcohol absoluto (etanol 100%).
Mezclar invirtiendo el eppendorf y dejar incubando por 5 minutos a temperatura ambiente.
•
Centrifugar por 5 minutos a 13,000 rpm y descartar el sobrenadante cuidadosamente.
•
Lavar el sedimento añadiendo 1 ml de alcohol al 70% (etanol) y mezclar invirtiendo varias veces
•
Centrifugar por 3 minutos a 13,000 rpm y descartar el sobrenadante cuidadosamente.
•
Dejar secar el etanol que no vayan a quedar restos en las paredes del tubo (5-10) min.
•
Resuspender el sedimento en 50µl de buffer TE y añadir 1µl de RNasa A.
•
Guardar a -20ºC.
3
5. Resultados y discusión
1.
SOLUCIÓN DE LISIS I
Anote los cambios observados mientras adiciona la Solución I en el tubo epperdorf
DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO
2.
EXPLICACIÓN DE LOS CAMBIOS OBSERVADOS
SOLUCIÓN DE LISIS II
Anote los cambios observados mientras adiciona la Solución II en el tubo epperdorf
DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO
EXPLICACIÓN DE LOS CAMBIOS OBSERVADOS
3. SOLUCIÓN DE LISIS III
Anote los cambios observados mientras adiciona la Solución III en el tubo epperdorf
DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO
EXPLICACIÓN DE LOS CAMBIOS OBSERVADOS
El chequeo o visualización del DNA plasmídico luego de la extracción se observara a través de un gel de electroforesis al 1% en el cual se debe
observar una o varias bandas de alto peso molecular dependiendo de la configuración que tenga el plásmido
Interpretacion del Gel
Elabore un esquema del gel sembrado e interprete los resultados obtenidos
6. Conclusiones
7. Evaluación/Autoevaluación
CUESTIONARIO
1. ¿Qué finalidad tiene la neutralización en el método de “lisis alcalina”?
2. ¿Por qué la alcalinización en presencia de SDS afecta menos a los plásmidos que al DNA cromosómico?
3. ¿Migra con idéntica velocidad un plásmido con estructura nativa superenrollada que un plásmido con
roturas?
4. Que diferencias existen entre un protocolo de extracción de DNA plasmídico bacteriano y uno genómico
bacteriano?
5. Cuál es la importancia de los plásmidos en la Ingeniería genética?
8. Observaciones
9. Bibliografía- Webibliografía
rd
Sambrook, J. and D. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 edition. Cold Spring Harbor, NY. Pp
5.8, 5.76.
Current Protocols and Molecular Biology. John Wiley and Sons, inc. 1999. Suplemento 45.
Brown, T. A. (2006). Gene cloning and DNA analysis : an introduction. Oxford, UK ; Malden, MA, Blackwell
Pub.Impreso.
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