Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Proteínas INK4 en el mantenimiento de la
integridad del genoma : participación de
p19INK4d en los mecanismos de reparación del
DNA en células neuronales
Ceruti, Julieta María
2007
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis
Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
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This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.
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Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
Proteínas INK4 en el mantenimiento de la
integridad del genoma.
Participación de p19INK4d en los mecanismos de
reparación del DNA en células neuronales.
Lic. Julieta María Ceruti
Director: Dr. Eduardo Tomás Cánepa
Laboratorio de Biología Molecular
Departamento de Química Biológica
Tesis presentada para optar al título de
Doctor de la Universidad de BuenosAires.
2007
Agradecimientos
A la Universidad de Buenos Aires y a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas.
A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.
Al Dr. Eduardo Cánepa, por haber dirigido este proyecto, intentando siempre transmitir sus
conocimientos con precisión y sobre todo con cariño. Por haber confiado en mí para
llevarlo a cabo, alentándome para continuar el camino de la investigación científica.
A la Dra. María E. Scassa, por el aporte intelectual, la colaboración constante durante este
trabajo y, especialmente por su amistad.
A mis compañeros y amigos del laboratorio: Abel Carcagno, Mariela Marazita, Pablo
Sirkin, Florencia Ogara y Willy Videla.
Deseo agradecer especialmente a la Dra. Silvia Moreno de Colonna; al Dr. Juan M. Fló; y
a la Dra. Adalí Pecci, por los buenos consejos, las discusiones enriquecedoras y, por
supuesto, por la colaboración recibida.
Al Dr. Alberto Kornblihtt, por ser ejemplo de excelencia, tanto en la docencia como en la
investigación, contagiando su entusiasmo por la biología molecular desde el inicio de la
carrera.
A todas aquellas personas del Departamento de Química Biológica y del Departamento de
Fisiología, Biología Molecular y Celular que nunca dudaron en darme una mano.
A toda mi familia, en especial a mis padres, Luis M. Ceruti y Graciela C. S. de Ceruti por
ser mis primeros formadores, dándome el ejemplo y al mismo tiempo, la libertad de elegir
y su apoyo incondicional.
A Néstor Romero y Graciela C. de Romero, por interesarse en mi trabajo con mucho
cariño.
A Hernán y a Ignacio,
mis dos soles.
Resumen
En neuronas, así como en otras células somáticas la progresión a través de la fase G1
del ciclo celular depende de la actividad de las enzimas CDK4 y CDK6, y luego, de
CDK2.
La familia INK4 incluye a cuatro polipéptidos, p16, p15, p18 y p19, los cuales se unen e
inhiben específicamente CDK4/CDK6. A pesar de ser estructuralmente redundantes e
igualmente potentes como inhibidores, cada uno se expresa diferencialmente durante el
desarrollo en ratón. Además, distintos inhibidores han sido implicados en la inducción de
la diferenciación terminal, la senescencia y la apoptosis. La gran diversidad en el patrón de
expresión, sugirió que estos inhibidores podrían tener funciones específicas de tipo celular
o de tejido. En el sistema nervioso central p19 es una de las INK4 mayoritaria. Es
expresada tempranamente durante el desarrollo en el cerebro y allí su expresión es
mantenida en la adultez. Aparte de sus roles fisiológicos, las proteínas INK4 se encuentran
comúnmente perdidas o inactivadas por mutaciones en diversos tipos de cáncer.
En este estudio, investigamos el rol de p19 en la respuesta celular frente al daño
del DNA con distintos agentes genotóxicos en células de neuroblastoma humano SHSY5Y y otros tipos celulares. Al contrario de las otras INK4, solamente la expresión de
p19 es periódica a lo largo del ciclo. En este trabajo demostramos que p19 es la única
INK4 cuya expresión es inducida por UV en células de neuroblastoma, que esta inducción
se da a nivel transcripcional y que requiere parcialmente la síntesis de proteínas. Además,
observamos la translocación de p19 desde el citoplasma al núcleo luego de la irradiación
con UV. La sobrexpresión de p19 claramente reduce la apoptosis inducida por el daño y
mejora la eficiencia de la reparación del DNA. Experimentos llevados a
cabo con
mutantes de CDK4, con mimosina o en células Saos-2, sugieren que estos efectos de p19
serían independientes de su rol como controlador del ciclo. Además, con ensayos
clonogénicos y de supervivencia celular, observamos que p19 influencia la sensibilidad
celular a largo plazo y confiere resistencia al estrés genotóxico.
Estos resultados descubren una nueva función de p19 como regulador del nivel de
apoptosis inducida por daño en el DNA, sugiriendo que p19 protegería a las células de
morir por apoptosis mediante el aumento en la eficiencia de reparación del DNA.
Postulamos que p19 pertenecería a una red proteica integrando la reparación del DNA, la
apoptosis y los checkpoints del ciclo celular para mantener la integridad genómica.
I
Abstract
In neurons, as in other somatic cells, progression through the G1 phase of the cell cycle
depends upon the activities of CDK4/6, and later, upon the activity of CDK2.
The INK4 family includes four polypeptides, p15, p16, p18 and p19 that specifically
bind to and inhibit CDK4/6. Although they are structurally redundant and equally potent as
inhibitors, members of the INK4 family are differentially expressed during mouse
development. Moreover, different inhibitors have been implicated in regulating terminal
differentiation, senescence or apoptosis. The striking diversity in the pattern of expression,
suggests that this family of cell cycle inhibitors might have cell-lineage or tissue- specific
functions. In the central nervous system, p19 is one of the major INK4 proteins. It is
expressed early during brain development and its expression is mantained into adulthood.
Apart from their physiological roles, the INK4 proteins are commonly lost or inactivated
by mutations in diverse types of cancer.
In the present study, we investigated the role of p19 in the response driven by human
neuroblastoma cells, against DNA injury caused by different genotoxic agents. In contrast
to the other INK4, p19 expression is periodic through the cell cycle. In this work, we
demonstrated that p19 is the only INK4 protein whose expression is induced by UV in
neuroblastoma cells, that this induction acts at the transcriptional level and partially
requires protein synthesis. Furthermore, we observed p19 translocation from cytoplasm to
nucleus after UV irradiation. Ectopic expression of p19 clearly reduces DNA damage
induced apoptosis and improves the cellular ability to repair DNA lesions. Experiments
performed with a CDK4 mutant, or with mimosine, or Saos-2 cells, suggest that p19 exerts
its effects independently of its role as a cell cycle checkpoint gene. Moreover, performing
clonogenic and viability assays we observed that p19 influences the long term cellular
sensibility and confers resistence to genotoxic stress.
These results uncover a new role for p19 as regulator of DNA damage induced
apoptosis and suggest that p19 might protect cells by allowing a more efficient DNA
repair. We postulate that p19 would belong to a protein network that integrates DNA
repair, apoptosis, and cell cycle checkpoints to surveil and maintain genome integrity.
II
Trabajos publicados
Los resultados presentados en este trabajo dieron origen a las siguientes publicaciones:
Induction of p19INK4d in response to ultraviolet light improves DNA repair and confers
resistance to apoptosis in neuroblastoma cells.
Oncogene (2005) 24, 4065–4080
Julieta M. Ceruti, María E. Scassa, Juan M. Fló, Cecilia L. Varone and Eduardo T. Cánepa.
Transcriptional regulation of p19INK4d by different DNA lessions.
Manuscrito en preparación.
Julieta M. Ceruti, María E. Scassa and Eduardo T. Cánepa.
III
Indice
Resumen …..…………………………………………………………………..….. I
Abstract ……..…………… ………………………………………........................II
Trabajos publicados…………….…………………………………...…………….III
Indice ………………………….……………………………………………….......IV
Introducción...............................................................................................................1
CAPITULO 1: El ciclo celular…….………………………………………..….…..2
Quinasas dependientes de ciclinas…..……………………………………………3
Reguladores de CDKs……………….……………………………………………4
Ciclinas……………………………….…………………………….……………..5
Ciclinas de tipo D ..………………….………………………………………….5
CKIs………………………….……………………………………………….…...6
Sustratos de CDK4/6 y CDK2…………….……………………………….….…..6
Regulación de G1 e inhibidores de CDKs….……………………………….….…8
Proteínas INK4…………………………….………………………………….…..9
Función de las proteínas INK4 en ratón…………………………………………11
Cooperación entre los inhibidores de las familias INK4 y Cip/Kip……..….…...13
CAPITULO 2: Mantenimiento de la integridad del genoma….….………………...14
Consecuencias del daño al DNA…………………………………………….…..14
Mecanismos de reparación del DNA……………………………………………17
NER………………………………………………………………………..……18
BER……………………………………………………………………………...19
HR y NHEJ………………………………………………………………………22
CAPITULO 3: Puntos de control en el ciclo celular: una respuesta al estrés……...25
Los checkpoints de G1 y G1/S………………………………………………….26
Las vías checkpoint de fase S………………………………………………..….27
El checkpoint de G2………………………………………………………….....28
CAPITULO 4: Integrando la información sobre el estatus del genoma……….…..30
Daño al DNA, arresto del ciclo celular, reparación del DNA y apoptosis……...30
IV
Indice
Objetivos……………………………………………………………………….…34
Hipótesis……………………………………………………………………….…35
Resultados …………………………………………………………………….…36
PRIMERA PARTE
Estudio de la expresión y la localización subcelular del inhibidor de CDKs
p19INK4d en condiciones basales y como respuesta al tratamiento con
agentes genotóxicos en células de neuroblastoma………………………….….…37
1-p19INK4d se expresa en forma periódica en el ciclo celular de
neuroblastoma………………………………………………………………….…38
2- p19INK4d es inducida por radiación UV en células de
neuroblastoma………………………………………………………………….…40
3- El efecto de UV sobre p19INK4d no está restringido a un solo
tipo celular. …………………………………………………………………….…41
4- p19 es la única INK4 inducida por UV en células de neuroblastoma……….…44
5- Los agentes genotóxicos cisplatino y péptido β-amiloide inducen
p19INK4d en células de neuroblastoma……………………………………….….46
6- La estabilidad del mRNA de p19INK4d no es afectada por agentes
genotóxicos…………………………………………………………………….….48
7- La estabilidad de la proteína p19INK4d no es modificada con la
radiación UV. ………………………………………………………………….….50
8- Los agentes genotóxicos UV y β-amiloide provocan un incremento
en la tasa de iniciación de la transcripción del gen de p19INK4d……………..….52
9- La inducción transcripcional de p19INK4d en respuesta al daño al
DNA requiere la síntesis de novo de proteínas……………………………….......54
10- p19INK4d transloca al núcleo cuando las células son irradiadas
con UV……………………………………………………………………….…...55
SEGUNDA PARTE
Estudio de la participación de p19INK4d en los mecanismos de reparación
del DNA luego de tratar células con distintos agentes genotóxicos…………………57
11- La sobrexpresión de p19INK4d protege a las células de
neuroblastoma de la muerte provocada por la radiación UV. ………………...….57
V
Indice
12- La muerte celular observada en SH-SY5Y luego de la
irradiación con UV es un evento apoptótico que puede
ser disminuído por p19INK4d……………………………………………….….59
13- La sobrexpresión de p19INK4d disminuye la apoptosis
causada por dos agentes genotóxicos distintos de UV en células
de neuroblastoma…………………………………………………………….….61
14- La sobrexpresión de p19INK4d mejora la capacidad de las
células de reparar un DNA plasmídico dañado con UV………………………..63
15- p19INK4d aumenta la eficiencia de reparación del DNA
genómico independientemente del agente genotóxico utilizado. ……………...65
16- El arresto del ciclo celular no es suficiente para observar
una reparación más eficiente del DNA. …………………………………….....68
17- p19INK4d disminuye la apoptosis y mejora la habilidad
de las células de neuroblastoma de reparar el DNA dañado
con UV independientemente de su interacción con CDK4…………………….70
18- p19 ejerce su efecto sobre reparación y apoptosis de un modo
independiente de retinoblastoma y de p53…………………………………....72
19- Relación causal entre el aumento en la reparación del DNA
y la disminución de la apoptosis en células tratadas con UV y
que sobrexpresan p19INK4d……………………………………………..……74
20- La presencia de moléculas de DNA dañadas con UV no es
suficiente para inducir p19INK4d……………………………………………..77
21- La sobrexpresión de p19INK4d confiere mayor resistencia a
distintos agentes genotóxicos………………………………………………..79
Discusión……………………………………………………………………….82
Materiales y Métodos………………………………………………………….91
1- Cultivo de líneas celulares……………………………………………..……92
2- Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo…………………..…93
3- Análisis de RNA por Northern blot……………………………………..…..93
4- Análisis de proteínas por Western Blot…………………………………..…97
5- Agentes genotóxicos……………………………………………………..….99
6- Análisis de la estabilidad proteica. Ensayo de Pulse- Chase con
VI
Indice
35
S- metionina. ……………………………………………………………..….99
7- Estudio de la tasa de iniciación de la transcripción. Ensayo de Run-on…....100
8- Inmunocitoquímica. Determinación de la localización subcelular de
p19INK4d……………………………………………………………………...102
9- Preparación de plásmidos ………………………………………………..…103
10- Clonado del cDNA de p19ink4d en el plásmido de expresión pSG5……..105
11- Transfección transitoria de células y selección…………………………....106
12- Actividad de la enzima caspasa-3………………………………………....106
13- Ensayo de fragmentación internucleosomal de DNA……………………..107
14- Síntesis de DNA no programada (UDS, Unscheduled DNA Synthesis).......107
15- Ensayo de reactivación en la célula huésped (HCR: host cell
reactivation assay) .………………………………………………….………...108
16- Incorporación de 3H-timidina……………………………………………....110
17- Generación de líneas celulares estables para p19INK4d…………………..110
18- Ensayo de MTT: estimación de viabilidad celular…………………………111
19- Ensayo clonogénico…………………………………………………….…..111
Referencias………………………………………………………………………...113
VII
INTRODUCCIÓN
Introducción
CAPÍTULO 1: El ciclo celular
El ciclo celular es el proceso universal mediante el cual las células se reproducen y que
sustenta el crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos (Paul Nurse, 2000). El
ciclo celular básico está dividido en cuatro fases (Figura 1). Durante dos de estas fases, las
células ejecutan los dos eventos más importantes de la división celular: la generación de
una copia confiable de su material genético (fase S o de síntesis) y la partición de todos los
componentes celulares entre dos células hijas idénticas (fase M o mitosis). Las otras dos
fases del ciclo (G1 y G2) representan intervalos (Gaps) durante los cuales las células se
preparan para completar con éxito las fases S
y
M,
respectivamente
(Malumbres
and
Barbacid, 2001; Norbury and Nurse, 1992).
Cuando las células completan la división
mitótica,
ya
sea
debido
a
señales
antimitogénicas específicas o a la ausencia de
señales mitogénicas adecuadas, abandonan el
ciclo e ingresan en un estado quiescente, de
Figura 1. Las etapas del ciclo celular.
“no-proliferación”, conocido como G0.
Las células en cultivo, pasan por un período de dependencia de mitógenos antes de
entrar en el ciclo y volverse independientes de ellos (Pardee, 1974). Sin embargo, la
remoción de mitógenos antes de este momento les permite retornar a G0. Esta transición,
el Punto de Restricción, R,
Remover
factores de
crecimiento
representa un punto de noretorno que compromete a
las células a llevar a cabo
una nueva ronda de división
celular. Hoy en día, R, es
comúnmente utilizado para
Mitógenos
G1 tem prana
Remoción de
factores de
crecimiento
G1
temprana
G1 tardía
G1
G1 tardía
tardía
dividir las fases G1 temprana
y G1 tardía (Malumbres and
Barbacid, 2001)(Figura 2).
Malum bres y Barbacid, Nat Rev Cancer, 2001
Figura 2. El punto de restricción
Existen controles o checkpoints que actúan para regular el establecimiento de todos
estos eventos y que compensan o solucionan los errores cometidos durante su ejecución.
2
Introducción
La base molecular de estos controles está altamente conservada, desde simples eucariotas
unicelulares como las levaduras hasta complejos metazoos, como nosotros mismos. La
precisión con la que los eventos del ciclo celular son llevados a cabo, asegura la
supervivencia de los organismos, mientras que la pérdida de esta precisión aumenta la
inestabilidad genómica, un factor importante en la formación del cáncer.
El ciclo celular mitótico es modificado hacia un ciclo meiótico durante la formación de
las gametas, llevando a la reducción del número de cromosomas, esencial para la
reproducción sexual, y al aumento en la variabilidad genética, que es la fuerza que dirige la
evolución (Nurse, 2000). Por lo tanto, el ciclo celular juega un rol central en la concreción
y el desarrollo de toda la vida, y asegura la continuidad de esta a través de las
generaciones.
Quinasas dependientes de ciclinas
Algunas de las moléculas que controlan los eventos tempranos del ciclo celular han sido
caracterizadas extensamente. Estas proteínas, integran el flujo de información proveniente
desde el exterior celular para dirigir la progresión en la fase G1 e iniciar la replicación del
DNA. Los actores centrales son las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs), un grupo de
serina treonina quinasas que forman complejos activos heterodiméricos luego de unirse a
las ciclinas, sus subunidades regulatorias (Morgan, 1997; Sherr, 2000).
Varias CDKs, principalmente CDK4, CDK6 y CDK2 cooperan para dirigir el pasaje de
las células a través de G1 y hacia la fase S. CDK4 y CDK6 están involucradas en la fase
G1 temprana, mientras que CDK2 es requerida para completar G1 e iniciar S. CDK4 y
CDK6 forman complejos activos con las ciclinas de tipo D (ciclina D1, D2 y D3).
Evolutivamente, estas quinasas están muy relacionadas y han resistido la diferenciación
funcional, excepto por los distintos patrones de activación (Jinno et al., 1999; Meyerson
and Harlow, 1994). CDK2 es activada secuencialmente por ciclinas de tipo E (ciclina E1 y
E2), durante la transición G1/S, y las ciclinas de tipo A (ciclina A1 y A2) durante la fase S.
Luego, en mitosis, la quinasa principal es CDK1, activada primero por ciclinas A y más
tarde por ciclinas de tipo B (B1 y B2) (Figura 3).
3
Introducción
Ciclina
Inactiva
Ciclina
Inactiva
CDK
Ciclina
CDK
Tyr
Tyr
Thr
Cambios conformacionales en
CDK luego de la unión de ciclina
CDK
Thr P
Ciclina H
CDK 7
Thr
CAK
P
Figura 3. Activación de una CDK, mediada por la unión de una ciclina y por la acción de CAK (CDK activating
kinase)
Reguladores de CDKs
Las células eucariotas en fase G1 expresan niveles relativamente bajos de actividad
CDK neta. Esta actividad aumenta progresivamente mientras las células avanzan en el
ciclo de división, tiene un pico y luego decae rápidamente durante mitosis (Morgan,
1997). El nivel reducido de actividad CDK durante la fase G1 es requerido para la
formación de los complejos de preiniciación en los orígenes de replicación del DNA
cromosómico (Massague, 2004). Luego, la entrada y la progresión a través de la fase S y la
entrada en mitosis puede proceder únicamente en la presencia de una actividad enzimática
más robusta (Sherr and Roberts, 2004). Por lo tanto, los reguladores de CDKs, al modular
su actividad, pueden controlar el destino del ciclo celular.
Los reguladores incluyen activadores, principalmente las ciclinas, e inhibidores,
conocidos como CKIs (CDK kinase inhibitors). Las CDKs también son reguladas por
fosforilación: deben ser fosforiladas en un residuo treonina (localizado en el Loop T), para
poseer actividad catalítica apropiada. Esto es llevado a cabo por el complejo CDK7-ciclina
H (también conocido como CAK; CDK activating kinase), una serina/ treonina quinasa
que también está involucrada en mecanismos de transcripción y reparación del DNA
(Malumbres and Barbacid, 2001). Al mismo tiempo, existen fosforilaciones inhibitorias en
residuos treonina y tirosina (en el caso de CDK1 son adyacentes), mediadas por quinasas
de especificidad dual (como Wee1 y MYT1). Esta inhibición es retirada cuando las
fosfatasas CDC25 (CDC25A, CDC25B o CDC25C) defosforilan estos residuos,
disparando la entrada en mitosis (Figura 4).
4
Introducción
Ciclina A/B
CDK
CDK
Ciclina A/B
Inactiva
Thr161
CDK
Thr14
Tyr15
CDK
Ciclina A/B
Activa
WEE1/MIK1/MYT1
Ciclina A/B
Inactiva
Figura 4. Ejemplo de regulación de la activación de CDK1. CDK1 es activada si se reúnen ciertas
condiciones: la unión de una ciclina, la fosforilación en Thr161 por CAK y la ausencia de fosforilación en
Thr14 y Tyr15. Estos últimos residuos son fosforilados por una kinasa cuyo nombre varía según las especies.
Ciclinas
Las ciclinas componen una familia de proteínas que sufren variaciones en su cantidad a
lo largo del ciclo y que comparten cierto grado de similitud en cuanto a su composición
aminoacídica. En efecto, las ciclinas son definidas por una región común denominada
cyclin box que permite la unión a las CDKs y su activación.
Ciclinas de tipo D
Las ciclinas de tipo D son integradores importantes de señales mitogénicas, ya que su
síntesis es una de las principales metas de la vía de RAS/RAF/MAPK (Malumbres and
Pellicer, 1998). La ciclina D1 es una molécula bastante inestable que es transportada desde
el núcleo al citoplasma donde es marcada (por la ligasa de ubiquitina, SCF) para ser
degradada mediante proteólisis.
La exportación nuclear es mediada por la enzima
glicógeno sintasa quinasa 3-β (GSK-3β), una quinasa que a su vez es inhibida por la vía de
RAS/PI3K/AKT (Alt et al., 2000; Diehl et al., 1998). Por lo tanto, la disponibilidad de
ciclina D1 es controlada por el balance entre las vías mitogénicas de RAS/RAF/MAPK
(síntesis de ciclina D1) y RAS/PI3K/AKT (estabilidad de ciclina D1), tanto como por la
5
Introducción
actividad de GSK-3β y de SCF (degradación de ciclina D1). Debido a que las tres ciclinas
de tipo D poseen alta homología de secuencia y son coexpresadas en varios tejidos, es
posible que tengan ciertos roles redundantes. La sobrexpresión de ciclina D1 facilita el
pasaje a través de la fase G1 y promueve la proliferación celular (Malumbres and
Barbacid, 2001).
CKIs
Existen dos familias de CKIs (Ortega et al., 2002; Sherr and Roberts, 1999). Los cuatro
miembros de la familia INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c y p19INK4d) ejercen su
actividad inhibitoria uniéndose a las quinasas CDK4 y CDK6 e impidiendo su asociación
con las ciclinas D (ver más adelante). Por otro lado, los complejos ciclina D-CDK4/6 se
unen a otra familia de inhibidores del ciclo celular, la familia Cip/Kip (p21Cip1, p27Kip1
y p57Kip2), cuyo rol principal es inhibir la actividad CDK2-ciclina E/A y CDK1-ciclina B
(Hengst and Reed, 1998; Nakayama and Nakayama, 1998). La formación de complejos
heterotriméricos CDK4/6-ciclina D-Cip/Kip contribuye en la progresión de G1
secuestrando estos inhibidores, impidiéndoles la unión a los complejos CDK2-ciclina E y
su inactivación (Sherr and Roberts, 1999). Más aún, se ha propuesto que la unión de los
inhibidores Cip/Kip podría ser necesaria para la actividad de CDK4/6-ciclina D ya que
fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) que carecen de p21Cip1 y p27Kip1 no poseen
actividad detectable de CDK4 (Cheng et al., 1999). Sin embargo, estos resultados no han
podido ser confirmados por otros investigadores (Bagui et al., 2000). Por lo tanto, no es
claro hasta qué punto el secuestro de inhibidores Cip/Kip por los complejos CDK4/6ciclina D contribuye a la progresión de G1 (Olashaw et al., 2004; Ortega et al., 2002; Pei
and Xiong, 2005). Los CKIs se inducen en respuesta a distintos procesos celulares (Sherr
and Roberts, 1999; Sherr, 2000).
Sustratos de CDK4/6 y CDK2
Los principales sustratos de CDK4/6 y CDK2 en la progresión de la fase G1 son los
miembros de la familia de proteínas de retinoblastoma (Rb, p107 y p130) (Adams, 2001).
Estas moléculas funcionan como sitios de anclaje para una serie de proteínas que deben ser
fuertemente reguladas durante el ciclo celular. Por ejemplo, la proteína Rb se une a los
6
Introducción
factores de transcripción de la familia E2F, asegurando que estos permanezcan inactivos
durante las fases M y G0. Además, los complejos Rb-E2F participan en un mecanismo de
represión activa sobre algunos promotores: este proceso involucra otras familias de
proteínas, como las deacetilasas de histonas (HDACs), complejos remodeladores de la
cromatina SWI/SNF y metiltransferasas de histonas como SUV39H1. La actividad de las
proteínas Rb es modulada mediante fosforilación secuencial por los complejos CDK4/6ciclina D y CDK2-ciclina E. Rb también puede ser regulada por acetilación, mediada por
histonas acetilasas asociadas a p300/CBP. Estas acetilasas están bajo el control del ciclo
celular e impiden la eficiente fosforilación de Rb por el complejo CDK2-ciclina E. Las
proteínas Rb hiperfosforiladas liberan las moléculas que se unen a sus isoformas
hipofosforiladas. Esta “liberación” les permite llevar a cabo sus roles específicos en el
ciclo celular (Malumbres y Barbacid, 2001) (Figura 5).
Inhibición de
la activación
Reclutamiento de p300,
acetilación de histona H3
Deacetilación de
Lys9 de histona H3
Represión
activa
Metilación de Lys9 de
histona H3
Reclutamiento de HP1
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (2002), 11
Figura 5. Mecanismos generales que controlan la actividad represora de E2F
7
Introducción
Regulación de G1 e inhibidores de CDKs
El nivel de ciclina E en embriones tempranos es elevado, para permitir que CDK2 inicie
la fase S tan pronto como concluya la fase M. En cambio, en la mayoría de los otros tipos
celulares, varios mecanismos colaboran en la existencia de la fase G1 manteniendo CDK2
inactiva hasta la llegada de señales mitogénicas.
Uno de estos mecanismos se basa en limitar el abastecimiento de ciclina E. La
expresión de ciclina E es dependiente de los factores E2F. En células quiescentes y en
aquellas que recién han salido de la fase M, los factores E2F están unidos a Rb y por lo
tanto la expresión de ciclina E está reprimida (o no activada) (Massagué, 2004).
Durante la fase G1 temprana, la célula integra información externa que deriva de
estímulos mitogénicos y de la disponibilidad de nutrientes. Así, se prepara para atravesar
las fases del ciclo celular. Una vez que se generan cantidades suficientes de ciclina D y de
los subsecuentes complejos ciclina D-CDK4/6, Rb (y otros miembros de la familia Rb,
dependiendo del tipo celular) se fosforila parcialmente, resultando en la activación de los
factores transcripción E2F. Rb también puede ser fosforilada por CDK2-ciclina E, creando
una retroalimentación positiva que precipita la entrada en la fase S una vez que suficientes
moléculas de CDK2 han sido activadas (Malumbres and Barbacid, 2001) (Figura 6).
Otro mecanismo que previene la entrada prematura en la fase S, y que liga la transición
G1/S a señales regulatorias, recae en proteínas inhibitorias que se unen a los complejos
ciclina- CDK y afectan su centro catalítico. Uno de estos inhibidores, p27Kip1, funciona
como un freno integral del ciclo celular. Otros, como p15INK4b, p16INK4a, p21Cip y
p57Kip2 son mediadores de señales citostáticas. p27 silencia el complejo ciclina E-CDK2
que pudiera estar presente en células quiescentes o en fase G1 temprana. Los estímulos
mitogénicos liberan a CDK2 de la inhibición impidiendo la transcripción, traducción,
estabilización o localización nuclear de p27, o inducen el secuestro de 27 por los
complejos ciclina D-CDK4/6. La activación de CDK2 es completada por la acción de CAK
(CDK- activating kinase) y la remoción de la fosforilación inhibitoria por la fosfatasa
CDC25. Una vez que el equilibrio se desplaza hacia la activación de CDK2, p27 es
fosforilada por la misma CDK2, un evento que la marca para ser poliubiquitinada y
degradada por el sistema del proteasoma (Massagué, 2004; Malumbres y Barbacid, 2001).
El descenso en la actividad de CDK2 durante la transición G1/S está controlada
8
Introducción
principalmente por la degradación de las ciclinas de tipo E, mediada por la enzima ligasa
de ubiquitina específica CDC4/AGO (Moberg et al., 2001); (Koepp et al., 2001).
p16INK4a
p15INK4b
p18INK4c
p19INK4d
p21Cip1
p27Kip1
p57Kip2
Cdk4/6
Cdk2
P
P P
P
P
pRb, p107, p130
P
P
pRb, p107, p130
pRb, p107, p130
E2F
E2F
Quiescencia
Diferenciación
E2F
Proliferación
Figura 6. Regulación de la transición G1/S por la vía CDK4/6-ciclina D/ INK4/ Rb. La progresión a través de la
fase G1 es controlada por el estado funcional de las proteínas de la familia Rb, pRb, p107 y p130. En G0 las proteínas Rb
no están fosforiladas, y se unen a los factores de transcripción E2F, impidiendo la transcripción dependiente de E2F. Uno
de los eventos tempranos de G1 es la activación de las quinasas CDK4/6 por las ciclinas D, y la consecuente fosforilación
de las proteínas Rb. Esto lleva a su parcial inactivación lo que permite la transcripción de los genes controlados por E2F,
como la ciclina E1 que a su vez activa la quinasa CDK2. La actividad de CDK4/6 es negativamente regulada por la familia
INK4 al impedir la unión de la ciclina D. La hiperfosforilación de las proteínas Rb por el complejos CDK2/ciclina E es
requerida para la correcta transición G1/S y la iniciación de S. Las flechas gruesas y oscuras representan utaciones
halladas frecuentemente en cáncer humano que resultan en la actividad aumentada (flecha ascendente) o disminuída
(flecha descendente) de estos reguladores de G1/S.
S. Ortega et al. Bioch et Bioph Acta 1602 (2002) 73-87
Proteínas INK4
En 1994, el gen supresor de tumores, designado MTS1 (multiple tumor supresor 1), fue
localizado en el cromosoma humano 9p21(Kamb et al., 1994a; Kamb et al., 1994b). Este
gen había sido previamente descripto como una proteína inhibidora del ciclo celular
(Serrano et al., 1993). Actualmente este gen es conocido como p16INK4a y sirve de
prototipo para la familia de inhibidores del ciclo INK4. El análisis detallado de la región
cromosómica 9p21 descubrió la presencia de otro supresor tumoral MTS2 (Kamb et al,
1994a), identificado independientemente como un miembro de la familia INK4,
p15INK4b. Dos miembros adicionales de esta familia génica, p18INK4c y p19INK4d,
fueron clonados mediante estrategias basadas en PCR o identificados con ensayos de
9
Introducción
doble-híbrido (Chan et al., 1995; Guan et al., 1994; Hirai et al., 1995). De aquí en más los
denominaremos p16, p15, p18 y p19.
Las proteínas INK4 tienen actividades muy similares in vitro. Cuando son expresadas
ectópicamente, arrestan las células en G1, pero únicamente en presencia de las proteínas
Rb funcionales (Bruce et al., 2000). Las bases estructurales para la inhibición de la
actividad quinasa de CDK4/6 por las proteínas INK4 están claramente establecidas. Las
cuatro INK4 comparten un motivo estructural, las repeticiones ankirina. Estas repeticiones
consisten en pares de α-hélices antiparalelas, conectadas por una serie de motivos horquilla
(Pavletich, 1999). Mientras que p16 y p15 tienen cuatro motivos ankirina, p18 y p19 tienen
cinco. Estos dominios estructurales están involucrados en la unión a la región no-catalítica
de CDK4 y CDK6, opuesta al sitio de unión de ciclina D. La unión de INK4 induce un
cambio alostérico en CDK4/6, rotando los dos lóbulos estructurales de la quinasa en 15°
alrededor del eje vertical. Esto altera el sitio
de unión de las ciclinas D y reduce su
Ciclina
afinidad por ATP (Pavletich, 1999), dos
mecanismos que reducen en gran medida la
actividad quinasa de CDK4/6 (Figura 7).
Cdk libre
Cdk-ciclina
Mas aún, al impedir la formación de los
complejos ciclina D-CDK4/6, las proteínas
INK4 también fuerzan la redistribución de
Ciclina
INK4
los inhibidores Cip/Kip hacia los complejos
ciclina E-CDK2, causando la regulación
negativa de esta quinasa (Reynisdottir et
al., 1995; Sherr and Roberts, 1999).
Además de compartir los motivos ankirina,
los genes correspondientes a las cuatro
Cdk-INK4
P-Cdk-ciclina
Inactiva
Activa
Figura 7. Regulación de la actividad de CDK4/6 por las
ciclinas D y los inhibidores INK4
INK4 poseen un intrón que interrumpe la secuencia codificante en la misma posición,
indicando que han evolucionado desde un ancestro común (Ruas and Peters, 1998).
A pesar de ser estructuralmente redundantes e igualmente potentes como inhibidores,
los miembros de la familia INK4 son expresados diferencialmente durante el desarrollo del
ratón (Cunningham and Roussel, 2001; Thullberg et al., 2000b). p18 y p19 son expresadas
principalmente en el embrión, mientras que p16 y p15 son detectadas únicamente luego del
nacimiento en la mayoría de los tejidos. En términos de funciones biológicas, distintos
inhibidores participan en la regulación y coordinación de los eventos del ciclo celular que
10
Introducción
siguen a la estimulación mitogénica, a la deprivación de mitógenos o a cambios en la
interacción célula-célula o célula-matriz (Harper and Elledge, 1996), y han sido también
implicados en la inducción de la diferenciación terminal y el envejecimiento celular o
senescencia (Zindy et al., 1999; Zindy et al., 1997a; Zindy et al., 1997b).
Los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la expresión de las
INK4 no están del todo definidos. Solamente la expresión de p19 es periódica a lo largo
del ciclo celular. La transcripción de p19 es inducida durante las fases S y G2. Luego, es
rápidamente degradada por un mecanismo dependiente de ubiquitina/proteasoma, de
manera tal que en G1, el nivel de p19 es bajo para facilitar el ensamble de los complejos
ciclina D-CDK4/6 (Thullberg et al., 2000a). El mayor nivel de expresión proteica de p19
ocurre en cerebro, testículos, bazo y timo. p19 está relativamente bien caracterizada en el
sistema nervioso central, donde es una de las proteínas INK4 mayoritarias. Es expresada
tempranamente durante el desarrollo en el cerebro y allí su expresión es mantenida en la
adultez (Zindy et al., 1997b). La expresión de p16 aumenta con la edad (Zindy et al.,
1997a) y en cultivo su expresión se incrementa por la acumulación de duplicaciones
celulares. En células humanas jóvenes, donde este inhibidor no se expresa, el promotor de
p16 está metilado en islas CpG; además, la metilación de novo de las islas CpG
correlaciona con la expresión reducida de p16 en tumores y en células inmortalizadas
(Foster et al., 1998; Wong et al., 1999).
La expresión de las INK4 también es inducida diferencialmente en respuesta a varias
vías inhibitorias del crecimiento. El stress oncogénico y la senescencia celular replicativa
inducen específicamente la expresión de p16 (Serrano et al., 1997). Además, p16 actúa
como mediador de la actividad inhibitoria del crecimiento de JunB en células de ratón
(Passegue and Wagner, 2000). Los estímulos oncogénicos también regulan positivamente
a p15. Su expresión aumenta en células epiteliales por la acción de TGF β (Hannon and
Beach, 1994), y su promotor responde a proteínas Smad (Ekholm and Reed, 2000).
Función de las proteínas INK4 en ratón
El rol específico de cada miembro de la familia INK4 está siendo definido
principalmente mediante la generación de cepas de ratones genéticamente modificadas,
deficientes en uno o varios miembros de esta familia génica (Tabla 1). Ratones que
expresan una versión inestable de p16 se desarrollan normalmente y sólo un pequeño
11
Introducción
porcentaje tienen linfomas de células-B luego de una latencia prolongada. Por otro lado,
ratones homocigoto para una mutación que
Tabla 1 *
Resumen de los principales fenotipos de ratones knock out para los genes Cdk4 o INK4
Gen blanco
Efecto funcional
Linfomas de células B, luego de latencia prolongada
Variedad de tumores con latencia prolongada
No hay expresión de p16 ni de p19ARF
Linfomas y sarcomas similares a aquellos observados en ratones
p19ARF-/- y p53-/Desórdenes linfoproliferativos y angiosarcomas
Tamaño corporal aumentado y sobrecrecimiento de algunos
órganos, desórdenes linfoproliferativos, quistes en riñón y
glándula mamaria, tumores de hipófisis.
No se expresa p15INK4b
No se expresa p18INK4c
No hay expresión de p19INK4d
Ausencia de p15INK4b y p18INK4c
Ratones normales y fértiles, a pesar de que los machos exhiben
atrofia testicular
Similar al de los animales Knock out individuales. También hay
quistes múltiples en testículos y páncreas
Ausencia de p18INK4c y p19INK4d
Infertilidad en machos
Ausencia de p18INK4c y p27Kip1
Sobrecrecimiento de varios órganos y latencia reducida de
tumores de hipófisis
Proliferación de neuronas diferenciadas en el sistema nervioso
central. Ratones mueren por defectos neurológicos en 3
semanas
Tamaño corporal reducido, esterilidad y diabetes depend. de
insulina debida al número reducido de células pancreáticas β.
Tamaño corporal aumentado. Hiperproliferación de células de
Leydig y pancreáticas β. Sarcomas y neoplasias endócrinas
Ausencia de p19INK4d y p27KIP1
No hay expresión de Cdk4
Expresión endógena de la mutante
Cdk4R24C
*
Fenotipo principal
Proteína p16INK4a truncada, inestable
No hay expresión de p16INK4a
Traducida de S. Ortega et al., Bioch et Bioph Acta 1602 (2002) 72
elimina el exón 1α de p16 desarrollan una variedad de tumores a una tasa más elevada
(25% de incidencia al año de edad) (Krimpenfort et al., 2001; Sharpless et al., 2001). Por
lo tanto, p16 parece tener una actividad supresora tumoral moderada en ratones. En
humanos, está ampliamente reportada la existencia de mutaciones puntuales que afectan
específicamente la expresión de p16 en tumores (Ruas and Peters, 1998).
El fenotipo de ratones nulos para p16 se asemeja al de animales mutantes para las otras
INK4. Las distintas cepas desarrollan variados tipos de tumores, con baja incidencia y no
presentan anormalidades significativas en el desarrollo. Ratones deficientes en proteínas
INK4 son propensos a tener desórdenes hematopoiéticos. La alteración frecuente de p15 en
tumores hematopoiéticos humanos y murinos , sugiere que la ausencia de esta proteína
podría predisponer a la transformación maligna en células hematopoiéticas. p18 actúa
12
Introducción
como supresor tumoral o regula la homeostasis celular dependiendo del tejido y tipo
celular (Franklin et al., 1998; Latres et al., 2000).
Ratones deficientes en
p19 no desarrollan tumores u otro tipo de desórdenes
proliferativos. Estos ratones poseen atrofia testicular, sin embargo son fértiles. Este
fenotipo está asociado con un aumento en la apoptosis de las células germinales, un
resultado que correlaciona directamente con la elevada expresión de p19 en este tejido
(Zindy et al., 2000). Los ratones doble mutantes (p18; p19) presentan una incidencia
tumoral similar a la de los animales deficientes en p18 parentales. Estos resultados en
conjunto indicarían que p19 no es un supresor tumoral propiamente dicho.
En MEFs, también existen evidencias que indican roles diferenciales para las INK4
individuales (Franklin et al., 1998; Latres et al., 2000; Zindy et al., 2001; Zindy et al.,
2000).
Cooperación entre los inhibidores de las familias INK4 y Cip/Kip
El cruzamiento entre ratones deficientes para los miembros individuales de las familias
INK4 y
Cip/Kip han revelado un nivel significativo de cooperatividad funcional
(Malumbres et al., 2000). Por ejemplo, p18 y p27 cooperan en la supresión tumoral en
células de hipófisis, inhibiendo la fosforilación de Rb mediada por CDK4 (o CDK6) y
CDK2. Ratones deficientes en p18 y p21 desarrollan hiperplasia neuroendócrina gástrica y
tumores de pulmón, fenotipos observados solamente en la cepa doble mutante. Estos
resultados indican que el rol de varios inhibidores INK4 y Cip/Kip, así como sus efectos
cooperativos están influenciados por el tipo celular (Pei and Xiong, 2005).
Finalmente, p19 y p27 cooperan en mantener las neuronas post-mitóticas en un estado
de diferenciación y quiescencia que es potencialmente reversible. La ausencia de ambos
inhibidores lleva a la proliferación ectópica de las neuronas post-mitóticas en todo el
cerebro, incluyendo las células del hipocampo (normalmente en dormición). Como
consecuencia, estos ratones doble mutante sufren bradiquinesia, anormalidades
propioceptivas y temblores, y mueren al poco tiempo del nacimiento (Zindy et al., 1999).
13
Introducción
CAPÍTULO 2: Mantenimiento de la integridad del genoma
La constitución fisicoquímica de nuestros genes no garantiza una estabilidad indefinida
o su adecuado funcionamiento. Cada día una célula debe enfrentar una asombrosa variedad
de lesiones en el DNA que tienen tres causas principales. La primera está integrada por los
agentes del medio ambiente, como la radiación UV, la radiación ionizante y ciertos agentes
químicos genotóxicos. La segunda, la constituyen productos del metabolismo celular
normal como las especies reactivas de oxígeno, derivadas de la respiración oxidativa y
productos de la peroxidación de lípidos (Cadet et al., 1997). A pesar de que tendemos a
preocuparnos más por las fuentes ambientales de daño al DNA, una célula humana debe
reparar más de 10.000 lesiones en el DNA por día para contrarrestar la acción de las
fuentes endógenas de daño. (Lindahl, 1993; Peterson and Cote, 2004). De hecho, se ha
propuesto que la mayor parte de la maquinaria de reparación ha evolucionado para
competir con este tipo de daño (Lindahl and Barnes, 2000; Lindahl and Wood, 1999). Por
último, algunas uniones químicas en el DNA tienden a desintegrarse espontáneamente bajo
condiciones fisiológicas. La hidrólisis de nucleótidos deja sitios abásicos, sin información.
La deaminación de citosina, adenina, guanina o 5-metilcitosina convierte estas bases en las
respectivas bases no codificantes uracilo, hipoxantina, xantina y timina. La falla en la
reparación de tales lesiones puede originar una tasa de mutación deletérea, inestabilidad
genómica, o la muerte celular. En eucariotas superiores, el daño que ocurre en genes que
intervienen en la reparación del DNA y/o en la regulación del ciclo celular puede conducir
a enfermedades tan amenazantes como el cáncer (Peterson and Cote, 2004). Jan
Hoeijmakers ha postulado que “el cáncer es una enfermedad de nuestros genes”. La figura
8a resume los tipos de daño al DNA más comunes y sus respectivas fuentes.
Consecuencias del daño al DNA
El resultado del daño al DNA es muy diverso y generalmente adverso (Figura 9b). Los
efectos agudos derivan de un metabolismo anormal del DNA, que dispara el arresto del
ciclo celular o la muerte celular. Los efectos a largo plazo resultan de mutaciones
irreversibles que contribuyen a la oncogénesis, el envejecimiento o las enfermedades
congénitas.
14
Introducción
Varias lesiones bloquean la transcripción, lo cual inactiva cada gen que contiene un
daño en la hebra que se transcribe (un efecto directamente relacionado con la longitud del
gen). Este hecho ha promovido el desarrollo de un sistema de reparación, acoplado a la
transcripción, denominado TCR (por “transcription coupled repair”), que desplaza la RNA
polimerasa atascada y asegura una reparación de alta prioridad. El estrés transcripcional,
que deriva del bloqueo persistente de la síntesis del RNA, constituye un gatillo eficiente
para llevar a cabo la apoptosis dependiente de p53, como un mecanismo anti-cáncer
primordial.
Consecuencias
Agente de daño
Rayos-X
Luz UV
Rayos X
Radicales oxígeno Hidrocarburos policíclicos
Drogas antitumorales
Alquilantes
aromáticos
(cis-Pt, MMC)
Reacciones espontáneas
(Transitorio)
arresto del ciclo
celular
Errores
en replicación
Inhibición de:
• Transcripción
• Replicación
• Segregación
cromosómica
Escisión de una
base (BER)
Escisión de un
nucleótido (NER)
Recombinación
(HR, NHEJ)
Mecanismo de reparación
Reparación de
mismatch
Mutaciones
Aberraciones
Cromosómicas
Apoptosis
(muerte celular)
Cáncer
Envejecimiento
Enfermedades
congénitas
Jan Hoeijmakers, NATURE Vol 411, 17 Mayo 2001
Figura 8. Daño al DNA, mecanismos de reparación y consecuencias. a, Agentes comunes de daño al DNA
(arriba); ejemplos de lesiones en el DNA inducidas por estos agentes (medio); y mecanismos de reparación
más relevantes para remover las lesiones (abajo). b, Efectos agudos del daño al DNA sobre la progresión del
ciclo celular, llevando a un arresto transitorio en G1, S, G2 y M (arriba), y sobre el metabolismo del DNA
(medio). Las consecuencias a largo plazo del daño en el DNA (abajo) incluyen cambios permanentes en la
secuencia del DNA (mutaciones puntuales que afectan un gen o aberraciones cromosómicas que pueden
involucrar múltiples genes) y sus efectos biológicos. Abreviaturas: cis-Pt y MMC, cisplatino y mitomicina C,
respectivamente (ambos agentes croslinqueantes del DNA); (6-4)PP y CPD, 6-4 fotoproducto y dímero
ciclobutano pirimidina, respectivamente (ambos inducidos por la luz UV); BER y NER, reparación por escisión
de la base y del nucleótido, respectivamente; HR, recombinación homóloga; EJ, unión del extremo.
15
Introducción
Las lesiones también interfieren con la replicación del DNA. Existe un grupo de
polimerasas, designadas ζ a κ que están dedicadas a superar el estrés replicativo inducido
por el daño. Estas polimerasas especiales reemplazan temporalmente a las polimerasas
replicativas / (pol / ) bloqueadas y probablemente a la polα (Figura 9, hebra superior).
Tienen propiedades de apareamiento de base más flexibles permitiéndoles la síntesis a
través de la lesión. Por lo tanto, esta solución viene acompañada de una tasa de error más
elevada. Aún así, las polimerasas “de translesión” protegen el genoma (Goodman and
Tippin, 2000; Kunkel and Bebenek, 2000). Existe otra vía, tal vez más importante, que
permite eludir las lesiones sin cometer errores. Este mecanismo se basa en la reiniciación
de la replicación del DNA río abajo de la lesión bloqueante. El espacio vacío resultante, es
rellenado mediante replicación por recombinación, utilizando la nueva hebra sintetizada
complementaria como molde e ignorando la original que contenía la lesión (Figura 9, hebra
inferior). La desventaja reside en que, al final de ambos procesos, el daño persiste y, de no
ser reparado, causará problemas similares en las rondas de replicación subsecuentes. Esto
tiene particular relevancia para el daño que no es eficientemente reconocido por ningún
proceso de reparación en mamíferos, tales como los dímeros de pirimidina ciclobutano
(CPDs).
El daño en ambas hebras (DSBs, por double-strand breaks), inducido por rayos X,
sustancias químicas o durante la replicación de un daño en una hebra (SSB, por single
strand break) y, presumiblemente durante la reparación de entrecruzamientos entre hebras,
es particularmente relevante para la maquinaria de recombinación. Las células B y T son
afectadas por los DSBs durante el rearreglo de los genes de las inmunoglobulinas o de los
receptores T, respectivamente. Además, los DSBs impiden la correcta segregación
cromosómica durante la división celular. Estas lesiones inducen varios tipos de
aberraciones
cromosómicas,
que
incluyen
aneuploidía,
deleciones
(pérdida
de
heterocigocidad) y translocaciones cromosómicas; eventos que están asociados al proceso
de carcinogénesis (Hoeijmakers, 2001; Peterson and Cote, 2004).
16
Introducción
Lesión que bloquea
replicación
Cambio de polimerasa
Síntesis translesión por DNA polimerasas
especializadas (propensa al error)
Reparación del gap en la hebra hija
dependiente de recombinación (libre de error)
Jan Hoeijmakers, NATURE Vol 411, 17 Mayo 2001
Cambio de molde
Figura 9. Mecanismos de “bypass” replicativo de lesiones en el DNA. Las lesiones en el DNA (indicadas con
una X) pueden ser ignoradas por el aparato replicativo de dos maneras diferentes: mediante el cambio de la
polimerasa de DNA (hebra superior) o mediante el cambio del DNA molde (hebra inferior). En ambos
procesos la lesión original permanece.
Mecanismos de reparación del ADN
Frente a la gran variedad de lesiones, durante la evolución se ha desarrollado una
amplia red de sistemas de reparación del DNA interconectados y sofisticados que en
conjunto cubren la mayoría, pero no todas, de las lesiones sufridas por la información
genética de una célula. Todas las vías de reparación están altamente conservadas. En
mamíferos, operan al menos cuatro vías principales de reparación, parcialmente
redundantes: reparación por escisión del nucleótido (NER, por nucleotide excision repair),
17
Introducción
reparación por escisión de la base (BER, por base excision repair), recombinación
homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ) (Lindahl and Wood, 1999).
El mecanismo NER debe lidiar básicamente con la gran clase de lesiones que interfieren
con el apareamiento de bases y que generalmente obstruyen la transcripción y la
replicación normal (Dip et al., 2004). Las pequeñas alteraciones químicas de las bases son
blanco del mecanismo BER. Estas lesiones pueden o no impedir la transcripción y la
replicación, pero frecuentemente no codifican una base correcta. Por lo tanto, BER es
particularmente importante para prevenir la mutagénesis. La mayor parte de las lesiones
que implican la reparación vía NER provienen de fuentes exógenas (excepto por algunas
lesiones oxidativas), mientras que la vía BER concierne mayormente a daños de origen
endógeno. Las lesiones de ambos tipos de reparación afectan solamente una hebra del
DNA (Figura 8a).
Los DSBs son más problemáticos, ya que ambas hebras son afectadas. Para reparar
adecuadamente tales daños, la célula debe reconocer cuales extremos se pertenecen
mutuamente, una difícil tarea dado el tamaño del genoma de los mamíferos. Dos vías, la
recombinación homóloga (HR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ), son capaces
de solucionar los problemas causados por los DSBs. La recombinación homóloga parece
dominar durante las fases S y G2, momento en que el DNA está replicado, proveyendo una
copia fiel de la secuencia que es la cromátida hermana, para alinear los daños. En
contraste, el sistema menos preciso NHEJ tiene mayor relevancia en la fase G1 del ciclo
celular, cuando no existe una copia del material genético (Takata et al., 1998).
Por último,
algunas proteínas revierten directamente ciertos daños, como la O6-
metilguanina metiltransferasa, que remueve el grupo metilo no nativo de la guanina y lo
transfiere a una cisteína interna. Al hacerlo, la proteína se inactiva irreversiblemente
(Lindahl, 2004; Lindahl and Wood, 1999). Este hecho ilustra cómo, en determinadas
circunstancias, una proteína entera puede ser sacrificada para reparar una única base
dañada.
NER
En términos de reconocimiento de lesión, NER es el más versátil de todos los sistemas
de reparación. Existen dos vías NER con especificidad de sustrato parcialmente distinta: la
reparación global del genoma (GGR, por global genome repair) examina todo el genoma
en busca de lesiones que distorsionan su estructura, y la reparación acoplada a la
18
Introducción
transcripción (TCR, por transcription coupled repair) se focaliza sobre el daño que
bloquea las polimerasas que están elongando el RNA (Batty and Wood, 2000; de Laat et
al., 1999; Mitchell et al., 2003; Tornaletti and Hanawalt, 1999). TCR es crítico para la
rápida recuperación de la síntess del RNA, y por lo tanto protege a la célula de la apoptosis
inducida por lesiones que bloquean la transcripción (Dip et al., 2004). La figura 10
presenta el mecanismo de acción de estas vías.
BER
La vía de reparación BER es responsable de la reparación de las bases oxidadas y
alquiladas, así como de los sitios abásicos generados por depurinación espontánea
(Lindahl, 2000). En general, las lesiones que son sustrato de BER incluyen aquellas que no
distorsionan el esqueleto de DNA suficientemente como para detener las horquillas de
replicación. En consecuencia, la inactivación de BER puede ser altamente mutagénica. La
lesión más prevalente y mutagénica que debe ser corregida por BER es la base oxidada, 8oxo guanina, que puede aparearse tanto con citosina o adenina. Si no es detectada, 8-oxoG
resulta en una transversión de G:C a T:A, que es la segunda mutación más común hallada
en cánceres humanos (Bruner et al., 2000). El mecanismo molecular ha sido resuelto hasta
la estructura terciaria de todos los componentes y está explicado en la figura 11
(Hoeijmakers, 2001; Peterson and Cote, 2004).
Poco tiempo atrás, se creía que el mecanismo simple de “parche corto” era la vía de
BER predominante, pero estudios recientes indican que una vía de reparación de “parche
largo” podría tener más prevalencia de lo que alguna vez se creyó (Sattler et al., 2003).
19
Introducción
NER genómico global
Lesiones NER
(p.e. daño por UV)
NER acoplado a transcripción
Lesión bloqueante de pol-II elongante
(p.e. daño oxidativo y UV)
Factores de
replicación
Figura 10. El complejo
específico de GGR XPChHR23B examina la presencia
de bases desapareadas en
lugar de lesiones per se. En
TCR, la habilidad de una lesión
para
bloquear
la
RNA
polimerasa es crítica (I). La
polimerasa atascada debe ser
desplazada para que la lesión
esté accesible a la reparación,
y esto requiere al, menos dos
factores específicos de TCR:
CSB y CSA. Los pasos
siguientes de GGR y TCR son
similares. Las helicasas XPB y
XPD del factor TFIIH abren
aproximadamente 30 pares de
bases del DNA alrededor del
daño (II). XPA probablemente
confirma la presencia del daño
detectando una estructura
anormal del esqueleto, y si no
la hay, aborta NER. La
proteína de unión a simple
hebra RPA estabiliza el
intermediario abierto uniéndose
a la hebra no dañada (III).
Distintos factores permiten
detectar el daño con alta
especificidad.
Las
endonucleasas XPG y ERCC1/
XPF, cortan respectivamente
en los bordes 3’ y 5’ de la
región abierta solamente en la
hebra que contiene la lesión
generando un oligonucleótido
de 24-32 bases (IV). Luego, la
maquinaria
de
replicación
completa
la
reparación
rellenando el espacio (V).
Estudios in vivo indican que la
maquinaria
NER
es
ensamblada paso a paso
desde
los
componentes
individuales en el lugar de una
lesión. Luego de un evento
único de reparación (que lleva
varios
minutos)
todo
el
complejo es desarmado.
Jan Hoeijmakers, NATURE Vol 411, 17 Mayo 2001
20
Introducción
Especies reactivas de oxígeno
Metilación, deaminación
Rayos X
(corte de simple hebra)
Jan Hoeijmakers, NATURE Vol 411, 17 Mayo 2001
Hidrólisis espontánea
(sitio abásico)
BER de “parche corto”
BER de “parche largo”
Figura 11. Un gran número de diferentes glicosilasas de DNA reconocen un número limitado de distintos sustratos BER.
Las glicosilasas exponen la base sospechosa fuera de la hélice mediante la compresión del esqueleto del DNA. Así,
acomodan la base en una cavidad interna de la proteína. Dentro de la misma, la base dañada es cortada del esqueleto de
azúcar-fosfato (paso I). El sitio abásico resultante puede también ocurrir espontáneamente por hidrólisis. La reacción BER
principal es iniciada mediante la incisión de la hebra en el sitio abásico por la APE1 endonucleasa (II). La polimerasa de
poli(ADP-ribosa) (PARP), y la polinucleótido quinasa (PNK), serían importantes cuando VER es iniciado a partir de un SSB
para proteger y cortar los extremos para permitir la síntesis reparativa. (III). En mamíferos, en la vía de reparación
denominada de “parche corto”, la DNA polβ lleva a cabo una reacción de reposición de un nucleótido (IV) y remueve el
azúcar 5’ terminal carente de base mediante su actividad liasa (V); esto continúa con el sellado del nick remanente por el
complejo XRCC1-ligasa 3 (VI). La proteína “scaffold” XRCC1 interactúa con la mayoría de los componentes BER y
podría ser un instrumento de intercambio proteico. La vía de reparación denominada de “parche largo” involucra a la DNA
polβ, pol / y al antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA) para la síntesis reparativa (2-10 bases) tanto como a la
FEN1 endonucleasa para remover el flap de DNA desplazado y a la ligasa de DNA 1 para el sellado (VII-IX). Esta reacción
BER opera en todo el genoma. Sin embargo, algunas lesiones BER bloquean la transcripción, y en este caso el problema
es resuelto con la vía TCR descripta anteriormente, incluyendo TFIIH, XPG (que también estimula algunas de las
glicosilasas) y el resto del aparato NER.
21
Introducción
HR y NHEJ
Los DSBs son originados por radiaciones ionizantes, radicales libres, sustancias
químicas y durante la replicación de un SSB. Luego de la detección de un DSB, se dispara
una compleja cascada de reacciones con el objeto de detener la maquinaria del ciclo celular
y reclutar factores de reparación (Khanna and Jackson, 2001; Zhou and Elledge, 2000).
Uno de los iniciadores tempranos es la proteína quinasa ataxia telangiectasia mutada
(ATM), enzima de la familia PIKK, la cual es defectiva en el sindrome que provoca
sensibilidad a los rayos X, ataxia telangiectasia, una patología que predispone al cáncer
(Khanna et al., 2001; Rotman and Shiloh, 1998). El arresto en G1 es mediado por p53.
Otro evento temprano que depende de ATM, y de otras PIKK como ATR (ataxia
telangiectasia related) y DNA-PKcs, es la fosforilación de la histona H2AX en el dominio
de DNA contiguo al DSB (Burma et al., 2001; Sedelnikova et al., 2003). Este hecho otorga
a la cromatina el estatus local requerido para las complejas reacciones de reparación o para
reclutar las proteínas de reparación.
Como ya se mencionó, dos vías principales han evolucionado para reparar los DSBs y
ambas están altamente conservadas en todos los eucariotas (Hoeijmakers, 2001; Paques
and Haber, 1999) (Figura 12). El mecanismo de NHEJ involucra la religación de dos
extremos de DNA, y debido a que esta reacción no es guiada por un DNA molde, es
propensa a cometer errores. HR es otra vía principal de reparación de DSB y tiene una
ventaja distintiva sobre otros mecanismos ya que actúa generalmente libre de errores. HR
requiere miembros del grupo epistático RAD52, definido por los genes RAD50, RAD51,
RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RAD59, MRE11, y XRS2, todos altamente
conservados, resaltando la importancia de estas proteínas para la supervivencia celular
(Hoeijmakers, 2001; Paques and Haber, 1999; Peterson and Cote, 2004). Estudios
genéticos y bioquímicos en levaduras indican que la reparación de DSBs por NHEJ
requiere del heterodímero de unión al extremo de DNA Ku70/Ku80, la ligasa de DNA IV,
y el complejo Mre11/Rad50/Xrs2 (Haber, 2000; Wilson, 2002). Aún no está bien
establecido un rol en NHEJ para el complejo análogo Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) en
eucariotas superiores, y en contraste a las levaduras, NHEJ en este caso involucra a la
DNA-PKcs (Lieber et al., 2003).
22
Introducción
(A)
(B)
Recombinación
homóloga (HR)
Unión de extremos
no-homólogos (NHEJ)
cromátidas
hermanas
Ku70
DNA-PKcs
Ku80
DNA-PKcs
Remoción mediada
por nucleasa
Ku80
Ku70
Invasión
de la hebra
DNA reparado imprecisamente
Shiloh, Y. NAT REV CANCER (2003) Vol 3, p156
Síntesis de DNA;
migración de la
ramificación
Ligación;
resolución
DNA reparado con precisión
Figura 12. Las dos vías de reparación de DSB. A) La unión de extremos no homólogos media la reparación
re-ligando directamente las hebras del DNA. Involucra el reconocimiento del DSB, el procesamiento de los
extremos dañados o no complementarios y la subsecuente ligación de éstos. El procesamiento puede llevar a
la pérdida o ganancia de nucleótidos, por lo tanto NHEJ es menos preciso que HR. B) La recombinación
homóloga es un mecanismo preciso, basado en la presencia de un fragmento de DNA homólogo que puede
ser utilizado como molde. Los extremos de DNA libres que se forman en el sitio del DSB son procesados,
posiblemente involucrando la acción del complejo Mre11/Rad50/Nbs1. Rad51, Rad52 y RPA se asocian con
las colitas de hebra simple. Este filamento nucleoproteico busca un DNA homólogo. Luego, se forma una
molécula de unión entre las hebras dañada y no dañada. La síntesis de DNA guiada por el molde provee una
copia de la hebra sana (Weterings E. et al, 2004).
Varios grupos han determinado los eventos moleculares que siguen a la formación de un
solo DSB (Sugawara et al., 2003; Symington, 2002; Wolner et al., 2003). Primero, los
extremos 5’ del DNA que flanquean la lesión son removidos por una exonucleasa
23
Introducción
desconocida dejando largas colas 3’ de DNA de simple hebra. La recombinasa Rad51 une
estos extremos expuestos formando un filamento nucleoproteico. In vitro e in vivo, Rad52,
Rad54 y el heterodímero Rad55/Rad57 (Wolner et al., 2003) promueven este paso
temprano. Luego, el filamento nucleoproteico busca un compañero de apareamiento
homólogo para formar un heterodúplex (Petukhova et al., 2000). La secuencia homóloga
donante está generalmente localizada en la cromátida hermana luego de la replicación del
DNA. Sin embargo, la maquinaria de HR tiene la capacidad de hallar la homología dentro
del genoma aún cuando la secuencia donante está en otro cromosoma. Una vez que las
cadenas se han apareado, la hebra de DNA entrante es extendida por polimerasas de DNA
y luego por migración de la hebra, llevando a la restauración de la información genética en
el sitio de la lesión (Peterson and Cote, 2004). Notablemente, si el donante de DNA
homólogo no está presente (p.e. si las células están en la fase G1), el DSB puede ser
reparado mediante NHEJ. De qué manera la célula toma esta decisión no está claro,
especialmente en vista de que los componentes de ambos HR y NHEJ parecen coocupar el
DNA adyacente a un sitio único de DSB (Wolner y Peterson, datos no pub.)
24
Introducción
CAPÍTULO 3: Puntos de control en el ciclo celular: una respuesta al
stress.
El término punto de control o “checkpoint” del ciclo celular se refiere a los mecanismos
regulatorios que no permiten la iniciación de una nueva fase del ciclo celular antes de que
la anterior se haya completado, o que temporalmente detienen la progresión del ciclo en
respuesta al estrés. El daño al DNA activa checkpoints específicos en las uniones de G1-S
y G2-M y en la fase S, cada uno basado en diferentes mecanismos (Kastan and Bartek,
2004; Shiloh, 2003).
Los puntos de control (de aquí en más denominados, checkpoints) del daño al DNA
fueron inicialmente definidos como vías regulatorias no esenciales que controlan el arresto
del ciclo celular en respuesta al daño al DNA, otorgando tiempo para su reparación.
Evidencias recientes indican que, además de controlar el arresto, estas vías regulan la
activación de los mecanismos de reparación, la composición de la cromatina telomérica, y
la movilización de proteínas de reparación hacia los sitios de daño. También, la activación
de programas transcripcionales, el largo de los telómeros, y la indución de la muerte por
apoptosis. Por lo tanto, un checkpoint comprende una subrutina integrada en la respuesta
mayor al daño al DNA que a su vez controla una respuesta multifacética. Además, algunos
genes checkpoint son esenciales para la supervivencia de la célula o el organismo,
implicando que estas vías no actúan sólo como vigilantes de un daño ocasional sino que
son componentes integrales de la fisiología celular (Shiloh, 2003; Zhou and Elledge,
2000).
Los checkpoints constituyen cascadas de transducción de señales. Ciertas moléculas
sensoras que se encuentran río arriba,
monitorean y detectan moléculas de
DNA
alteradas,
mientras
que
transductores centrales actúan en una
cascada de proteínas quinasas para
Tabla 2
Proteínas involucradas en checkpoints inducidos por daño al
DNA en levaduras y mamíferos
Función
S. cerevisiae
S. pombe
Mamíferos
Quinasas ATM/ATR
Proteínas de interacción
con ATR
Reconocimiento/
procesamiento de DSB
regular un gran número de efectores río
proteínas similares RFC
abajo (Tabla 2) (Viscardi et al., 2005).
Los componentes fundamentales de los
checkpoints que dependen de daño al
DNA son las quinasas de la familia
proteínas similares PCNA
Mediadoras
Quinasas efectoras
25
Introducción
PIKKs (por PI3K-like protein kinases), ATM (ataxia telangiectasia mutated) y ATR (ATM
and Rad3 related protein). ATR responde al daño inducido por UV, a los DSBs y a las
horquillas de replicación atascadas en células mamíferas, mientras que ATM parece estar
principalmente involucrada en la respuesta a los DSBs.
Los checkpoints de G1 y G1/S
La respuesta dominante al daño al DNA en células de mamífero que están en fase
G1 es la vía ATM (ATR)/CHK2(CHK1)-p53/MDM2-p21 (Figura 13), que es capaz de
inducir un arresto sostenido, y a veces permanente en fase G1. ATM/ATR fosforilan
directamente el factor de transcripción p53, que
también es blanco de CHK1 y CHK2. Además,
la ligasa de ubiquitina MDM2, que normalmente
Mediadores
DSB
se une a p53 asegurando su degradación,
también es fosforilada luego del daño por
ATM/ATR y por CHK2/CHK1. Esto contribuye
a la acumulación de p53 y al aumento de su
actividad como factor de transcripción. En
consecuencia, aumenta el nivel de p21Cip1
causando un arresto en G1. Este hecho, no sólo
impide el inicio de la síntesis de DNA, sino que
activa, supresora del crecimiento, causando un
bloqueo en G1 sostenido. Por lo tanto, el
Retrasada;
sostenida
(senescencia)
Kastan y Bartek, NATURE Vol 432 (2004),320
también preserva la vía Rb/E2F en su forma
Rápida;
transitoria
checkpoint de G1 tiene como blanco dos vías
supresoras tumorales, gobernadas por p53 y Rb.
Estos son los dos mecanismos más comúnmente
desregulados en cáncer humano (Kastan and
Bartek, 2004; Massague, 2004). La mayoría de
los tumores que poseen Rb salvaje están ligados
a la pérdida de la función de p53 debida a la
inactivación del gen o como resultado de un
efecto epigenético (Bartek et al., 2004; Wang et
Impacto en el ciclo celular
Figura 13. Esquema simplificado de los checkpoints
del ciclo celular inducidos en respuesta al daño al
DNA (aquí DSBs), con los supresores tumorales en
rojo, y los proto-oncogenes en verde. El control global
regulado por ATM/ATR y CHK2/CHK1 afecta otras
respuestas celulares además de la progresión del ciclo
celular, incluyendo reparación del DNA, transcripción,
ensamble de la cromatina y apoptosis.
al., 2004).
26
Introducción
Sin embargo, algunas células malignas expresan la proteína p53 salvaje. Esta
circunstancia nos indujo a pensar que estas células podrían carecer de un checkpoint en G1
totalmente competente en respuesta al daño en el DNA, a pesar de la presencia de p53. En
este contexto, es razonable pensar que otras moléculas, como las proteínas INK4, que
inhiben las actividades de CDK4/6 causando un arresto en G1, serían necesarias para
reforzar esta respuesta.
En G1 tardía, como respuesta a un estrés genotóxico y por las actividades aumentadas
de CHK1 y CHK2 se produce la degradación de CDC25A y en consecuencia la inhibición
de los complejos ciclina E(A)/CDK2 (Bartek and Lukas, 2003; Donzelli and Draetta,
2003). El checkpoint de CHK1/ CHK2-CDC25A es implementado rápidamente,
independientemente de p53, y retrasa la transición G1/S por un par de horas, a menos que
el mecanismo sostenido dependiente de p53 prolongue el arresto en G1.
Las vías checkpoint de fase S
El checkpoint de replicación: es iniciado cuando la horquilla de replicación queda
atascada en un DNA dañado (Figura 14a). Los componentes clave de esta maquinaria son
la proteína RPA, el complejo ATR-ATRIP, la proteína mediadora claspina, RAD17 y el
complejo (9-1-1). Este checkpoint tiene dos funciones: inhibir la iniciación de la
replicación de orígenes nuevos y proteger la integridad de las horquillas y permitir la
recuperación de la progresión del ciclo celular luego de la reparación del DNA.
El checkpoint de S-M: asegura que la célula no trate de dividirse antes de que el genoma
completo esté fielmente duplicado (Figura 14b). También depende de la replicación. La
falla de este checkpoint resulta en una mitosis catastrófica. El blanco clave de esta vía es el
complejo ciclina B-CDK1 y varios componentes son compartidos con el checkpoint de
replicación.
El checkpoint intra-fase-S: es activado por DSBs generados en los loci genómicos
externos a los replicones activos (Figura 14c). La característica fundamental que diferencia
este control de los otros dos es su independencia de las horquillas de replicación (Bartek et
al., 2004).
Notablemente, ninguno de estos checkpoints de S requiere p53, que es el blanco
principal del checkpoint de G1-S.
27
Introducción
a Checkpoint de replicación
Bartek, Lukas y Lukas, NatRev MolCellBio, Vol5, Oct 2004
b Checkpoint de S-M
c Checkpoint de fase S
Figura
14. 14.
Puntos
de control en lade
fasefase
S.
Figura
Checkpoints
S
El checkpoint de G2
Este control impide que las células inicien mitosis cuando sufren daño en el DNA
durante G2, o cuando pasan por G2 con algún daño no reparado inflingido durante las fases
previas S o G1. El blanco crítico es la actividad de ciclina B/CDK1, cuya activación luego
del stress es inhibida por ATM/ATR, CHK1/CHK2 y/o el secuestro subcelular, la
degradación o inhibición de la fosfatasa CDC25 (que normalmente activa CDK1 en G2/M)
mediada por la quinasa p38. El hecho de que tumores deficientes en otros checkpoints,
como aquellos con p53 mutante, tiendan a acumularse selectivamente en G2 luego del
daño, indica que mecanismos independientes de p53 son suficientes para sostener el arresto
en G2 (Kastan and Bartek, 2004; Nyberg et al., 2002).
28
Introducción
Daño
Nyberg et al., AnnRevGenDev, 2002, 36:617
procesamiento
Figura 15. El checkpoint de G2 en mamíferos funciona principalmente para bloquear Ciclina B/CDK1.
Las flechas grises indican funciones perdidas luego de la activación de la cascada de checkpoint.
29
Introducción
CAPITULO 4: Integrando la información sobre el estado del genoma.
Daño al DNA, arresto del ciclo celular, reparación del DNA y apoptosis.
Las células, para asegurar su supervivencia y la propagación de copias fieles del
genoma en las siguientes generaciones, responden al daño en el DNA con una respuesta
multifacética que coordina la progresión del ciclo celular con la reparación del DNA, el
remodelamiento de la cromatina, los programas transcripcionales o la muerte celular
(Hoeijmakers, 2001; Lukas et al., 2004; Sancar et al., 2004).
Durante la apoptosis o muerte celular programada, las proteasas conocidas como
caspasas ejecutan la ordenada destrucción de la célula (Danial and Korsmeyer, 2004). Las
caspasas pueden ser activadas por factores extracelulares, como FasL (ligando de Fas), el
que actúa por medio de los receptores de muerte en membrana. También pueden ser
activadas por señales intrínsecas de la célula que liberan citocromo c y la proteína
Smac/DIABLO de la mitocondria. En células de mamífero, la liberación de estos factores
es llevada a cabo por los miembros pro-apoptóticos de la familia génica Bcl2, incluyendo
Bad, Bax, Bim, Noxa, Puma y otros. Estos actúan en oposición a los miembros antiapoptóticos BclXL, Mcl-1 y Bcl2. El citocromo c dirige la formación del “apoptosoma”,
un complejo formado por las proteínas señalizadoras caspasa-9 y Apaf-1, mientras que
Smac/DIABLO bloquea las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs), una familia de
inhibidores de caspasas. En conjunto, estos efectos derivan en una robusta activación de las
caspasas (Lowe et al., 2004; Massague, 2004).
La relación entre la integridad genómica y la regulación de la muerte celular puede ser
manifestada en diferentes circunstancias. Por ejemplo, la inestabilidad genómica puede
llevar a la mutación, o nivel de expresión alterado, de reguladores de la apoptosis. Además,
bajo condiciones normales, las células eucariotas que experimentan un daño excesivo en el
DNA y que no puede ser reparado durante el arresto del ciclo celular controlado por un
checkpoint, inician la muerte celular a través de la vía apoptótica o ingresan en un estado
de senescencia (arresto permanente). Sin embargo, si por alguna razón la apoptosis es
inhibida, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosómica. Las células que son lo
suficientemente fuertes para sobrevivir, tendrían una ventaja de crecimiento, que en última
instancia podría llevar al cáncer (Zhivotovsky and Kroemer, 2004). La apoptosis deficiente
afecta el resultado terapéutico, dado que la mayoría de los agentes utilizados en el
tratamiento del cáncer activan vías apoptóticas para precipitar la muerte celular (Johnstone
30
Introducción
et al., 2002). La inestabilidad genética, incluyendo el cambio en el número de cromosomas
y las aberraciones cromosomales, es frecuente en el cáncer humano y se cree que es
requerida para generar los múltiples errores genéticos necesarios para la transformación
maligna (Rouse and Jackson, 2002). La inestabilidad genómica es un evento que
correlaciona con una reparación del DNA inadecuada, y se lo ha asociado con mutaciones
que la restringen, incluyendo BRCA1, BRCA2, Ku80, XRCC4, NBS1 y genes
involucrados en anemia Falconi (D'Andrea and Grompe, 2003; Rooney et al., 2003; Roth,
2002). Por último, es posible que una única proteína o proceso esté involucrada tanto en el
control de la apoptosis como de la estabilidad genómica (Zhivotovsky and Kroemer, 2004).
Luego del reconocimiento de un daño en el DNA mediante Rad17 y el complejo 9-1-1,
se activa Chk2, blanco de ATM/ATR, que fosforila p53, aumentando su estabilidad y
unión al DNA. Además, una mutante dominante negativa de Chk2, inhibe la apoptosis
mediada por p53 (Peters et al., 2002). Ratones deficientes en Chk2 tienen reducida
apoptosis inducida por radiación en neuronas, timocitos y esplenocitos (Takai et al., 2002).
La fosforilación de H2AX, otro target de ATM y ATR, es una consecuencia aguda del
daño al DNA y un indicador de apoptosis inducida por daño al DNA (Taneja et al., 2004).
El supresor tumoral p53 puede estimular la reparación del DNA o, más allá de un cierto
umbral de daño, iniciar apoptosis (Figura 16). P53 transactiva una serie de proteínas proapoptóticas de la familia Bcl2, en particular BAX, BID, PUMA y NOXA (Vousden and
Dependiente de p53
Independiente de p53
Zhivotovsky y Kroemer, NatRev MolCellBio (2004) Vol 5
Figura 16. Procesos dependientes e independientes de p53 que relacionan DSBs con la vía apoptótica.
31
Introducción
Lu, 2002) y reprime la proteína anti-apoptótica Bcl2. Finalmente, en respuesta a DSBs,
p53 puede estimular la liberación nuclear de la histona H1.2, que estimula la
permeabilización de la membrana mitocondrial (MMP) (Konishi et al., 2003). También
existen efectos directos de p53 sobre la mitocondria (Chipuk et al., 2004; Chipuk et al.,
2003; Leu et al., 2004; Marchenko et al., 2000; Mihara et al., 2003).
Por lo tanto, p53
dispara numerosas vías dependientes e independientes de la transcripción que relacionan el
daño al DNA y la apoptosis. Esto es importante si consideramos que la inactivación
genética o funcional de p53 puede llevar a la inestabilidad genómica.
Otros eventos, independientes de p53, unirían el daño al DNA y la regulación de la
apoptosis. Tal relación podría involucrar a p73, un factor de transcripción similar a p53
(Melino et al., 2004) y a Nurr77, un receptor esteroideo huérfano que puede translocar a la
mitocondria e interactuar con Bcl2, induciendo MMP (Lin et al., 2004). La activación
nuclear de la caspasa-2, mediada por el PIDDosoma en respuesta a estrés genotóxico,
puede disparar la apoptosis por vía mitocondrial (Tinel and Tschopp, 2004). Por otro lado,
existe una coordinación entre la reparación del DNA y el destino celular apoptótico,
controlada por la liberación de Ku70 (subunidad regulatoria de unión al DNA de la DNAPK) desde el núcleo al citoplasma (Norbury and Zhivotovsky, 2004).
Podemos decir entonces, que existen
mecanismos comunes de detección del
daño
y
transducción
de
la
señal
compartidos por las vías que controlan la
reparación del DNA, el ciclo celular y la
detección del daño
apoptosis (Figura 17).
A pesar de que la gran mayoría de
transducción de la señal
proteínas involucradas en la red que
conforma la respuesta al daño al DNA
REPARACIÓN DEL DNA
son conocidas, como se describe más
falla
ARRESTO DEL CICLO
falla
APOPTOSIS
falla
arriba, aún quedan espacios vacíos, que
esperan ser completados, en la reacción
integral organizada por la célula. Por
células dañadas,
proliferantes y
viables
ejemplo, la identidad de los sensores que
monitorean el genoma por cualquier
Figura 17. Decisiones de vida o muerte luego del daño al DNA.
anormalidad y que ayudan a generar las
señales no es conocida en su totalidad (Zhou and Elledge, 2000). Debido a que la
32
Introducción
cromatina debe estar relajada para que lesión sea eficientemente detectada y reparada, los
factores de accesibilidad deberían interactuar con el genoma, especialmente en regiones no
transcribibles, para tener contacto con el daño. A pesar de que se han propuesto varios
complejos con esta función, la identidad de los factores de accesibilidad putativos
permanece sin descubrirse.
Finalmente, se han descripto varias evidencias que involucran proteínas en la reparación
del DNA así como en señalizar las vías que llevan a la apoptosis; sin embargo, se requieren
análisis genéticos y bioquímicos adicionales para completar el estudio. La identificación de
nuevas proteínas o mecanismos relacionados con estos procesos ayudará a responder
algunos de los interrogantes mencionados. Cada uno de estos eventos, potencialmente,
tiene crucial importancia en el desarrollo de tumores y en la respuesta de las células
cancerosas a las terapias basadas en la inducción de daño al DNA.
33
Introducción
Objetivos
Los cuatro miembros de la familia INK4 poseen una estructura similar y son igualmente
potentes como inhibidores de CDK4/6. Sin embargo, y a pesar de esta redundancia, son
diferencialmente expresados en el desarrollo del ratón, y en términos de funciones
biológicas, cada uno participa en la regulación de distintos eventos que siguen a la
estimulación mitogénica, a la deprivación de mitógenos o a cambios en la interacción
célula-célula o célula-matriz, y han sido también implicados en la inducción de la
diferenciación terminal y el envejecimiento celular o senescencia. Además, las INK4 están
ausentes o inactivadas por mutaciones en diversos tipos de cáncer, representando
supresores tumorales o candidatos a serlo. Por otra parte, la gran diversidad en su patrón de
expresión, sugiere que esta familia de inhibidores del ciclo celular podría tener funciones
específicas de tejido o de tipo celular.
La luz UV, la radiación ionizante y sustancias químicas genotóxicas provocan lesiones
en el DNA, que, si no se reparan, pueden llevar a mutaciones que aumentan el riesgo del
establecimiento de un tumor.
Luego de un daño en el DNA, se activa un checkpoint en G1, que depende de p53, y es
por eso que muchos tumores están ligados a la pérdida de esta proteína. Sin embargo,
algunas células malignas expresan p53 wt (p.e. SH-SY5Y). Tal vez, estas células carezcan
de un checkpoint en G1 competente, en respuesta al daño. En este contexto, las proteínas
INK4, podrían ser necesarias para reforzar esta respuesta.
El presente trabajo tuvo dos objetivos principales:
1- Analizar el rol potencial de p19INK4d en la respuesta celular frente al daño del DNA
con agentes genotóxicos, en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y y otros tipos
celulares.
X Analizar la expresión de p19 en ese contexto.
X Estudiar la localización subcelular de p19 luego de la irradiación con UV.
34
Introducción
2- De existir modificaciones en el estatus de p19 en un contexto celular de injuria al DNA,
investigar si las mismas, forman parte de algún mecanismo fisiológico involucrado en el
mantenimiento de la estabilidad genética.
X Analizar el efecto que tiene p19 en el nivel de apoptosis celular inducido por
distintos agentes de daño genómico.
X Estudiar la habilidad de p19 de mejorar la capacidad de las células de reparar el
DNA dañado con UV y con otros agentes genotóxicos.
X Estudiar la relación entre su función como inhibidor del ciclo, el nivel de apoptosis
y la reparación del DNA.
X Investigar si p19 ejerce algún efecto a largo plazo sobre la supervivencia de células
tratadas con agentes genotóxicos.
Hipótesis
Actualmente se sabe que, varias procesos celulares, tales como el crecimiento celular, la
diferenciación, la senescencia, y varios puntos de control o checkpoints, deben
interaccionar con las vías que regulan la progresión a través de la fase G1 del ciclo celular.
Además, como hemos mencionado, la célula responde al daño en el DNA con una
respuesta multifacética que coordina la progresión del ciclo celular con la reparación del
DNA, el remodelamiento de la cromatina, los programas transcripcionales o la muerte
celular. Y todo ello, para lograr un control preciso de la estabilidad genómica.
Nosotros postulamos que p19INK4d, además de cumplir su rol como inhibidor del ciclo
celular, estaría involucrada en el mantenimiento de la integridad del DNA. Esta proteína
tendría algún papel en la reparación del DNA dañado con diversos agentes genotóxicos,
haciéndola más eficiente, y disminuyendo el nivel de apoptosis inducida por el daño. De
esta manera, jugaría un rol integrador entre la apoptosis, la reparación y el ciclo celular.
35
RESULTADOS
Resultados
Primera Parte
Estudio de la expresión y la localización subcelular del inhibidor de
CDKs p19INK4d en condiciones basales y como respuesta al tratamiento
con agentes genotóxicos en células de neuroblastoma.
La compleja diversidad en el patrón de expresión de las INK4 sugiere que esta familia
de inhibidores del ciclo celular podría tener funciones específicas de tejido o de línea
celular (Roussel, 1999). Dado el rol emergente de estas proteínas en procesos tanto
fisiológicos como patológicos, sus similitudes bioquímicas y la homología evolutiva de las
cuatro INK4, es de considerable importancia estudiar y discernir entre las funciones
redundantes e individuales de cada una de ellas. En los últimos años, miembros de esta
familia han sido involucrados en diversos procesos tales como control del ciclo celular,
diferenciación, oncogénesis y senescencia. En conocimiento de estos antecedentes,
decidimos estudiar la participación de p19INK4d en los mecanismos relacionados con el
mantenimiento de la integridad del genoma. Nuestro primer objetivo consistió en analizar
la expresión y localización de p19INK4d (indistintamente denominada p19) en la respuesta
celular al daño del DNA con agentes genotóxicos.
37
Resultados
1- p19INK4d se expresa en forma periódica en el ciclo celular de neuroblastoma.
El neuroblastoma es uno de los tumores más frecuentes de la infancia. Deriva de la
cresta neural, la cual da origen a múltiples linajes celulares con fenotipo neuronal o
melanocítico (Sadee et al., 1987). A diferencia de otros tipos de tumores, la mayor parte de
los neuroblastomas humanos no presentan mutaciones en el gen de p53 (Hosoi et al.,
1994). Por lo tanto, estas líneas celulares son un modelo adecuado para investigar la
función y regulación de proteínas en un contexto de p53 salvaje. En primer lugar
analizamos la expresión basal de p19 y su regulación en el ciclo celular. Para ello, células
SH-SY5Y derivadas de neuroblastoma humano fueron arrestadas en la fase G1 temprana
del ciclo cultivándolas en medio sin suero durante 36 horas. Luego, fueron inducidas a
reingresar en el ciclo sincrónicamente mediante la adición de suero. El mRNA de p19 no
se detectó en células quiescentes (tiempo 0), ni en células ingresando en la fase G1. Sin
embargo, cuando las células se aproximaban a la transición G1/S, comenzó la síntesis del
mRNA de p19 abruptamente y aumentó mientras la célula progresaba en la fase S. Luego,
disminuyó nuevamente por el resto del ciclo. La cinética de expresión del mRNA de p19 es
distinta de la de ciclina D1, que es inducida en fase G1 temprana y oscila mientras las
células continúan proliferando. La expresión del gen gliceraldehído-3 fosfato
deshidrogenasa, utilizado como control de siembra, mostró mínimas oscilaciones durante
todo el ciclo celular (Figura 1a). A pesar de que las células comenzaron a perder sincronía
en el segundo ciclo, el mRNA de p19 aumentó nuevamente al final de G1 y en S (ver 48
h). En paralelo cuantificamos la proporción de células en cada fase del ciclo mediante
citometría de flujo (FACS) y medimos la incorporación de 3H-timidina. Con estos datos
calculamos la duración del ciclo celular de SH-SY5Y, que resultó ser de aproximadamente
44 horas. La máxima proporción de células en división fue observada entre 34 y 38 h
(Figuras 2a y 2b). Consistentemente con la cinética del mRNA, la síntesis de proteína p19
aumentó cerca de la transición G1/S, disminuyó mientras la célula se dividía y aumentó
nuevamente en fase G1 tardía y S del siguiente ciclo (Figura 1b). La abundancia relativa
de p19, está resumida en el gráfico de la figura 1c.
Por lo tanto, la síntesis de p19 (mRNA y proteína) en células de neuroblastoma es
periódica, con inducción en las fases G1 media y S del ciclo celular. Estos resultados son
coincidentes con lo reportado en otros tipos celulares (Guan et al., 1996; Hirai et al., 1995).
38
Resultados
a
Horas
0 6 12 18 24
30 3 6 42 48 54 60 72
p19
Ciclina D1
G3PDH
b
Horas
0
6
12 18 24 30 36
42 48
54 60 72
p19
Nivel relativo de p19
c
160
mRNA
Proteina
120
80
40
0
0
6
12 1 8 24 30 36 4 2 48 54 60 72
Horas
Figura 1. Expresión de p19 durante el ciclo celular de neuroblastoma. Células SH-SY5Y fueron
arrestadas en fase G1 temprana por deprivación de suero durante 36 h y luego estimuladas con suero a
entrar al ciclo sincrónicamente. a) Northern blot del RNA total (20 µg) extraído de las células en los tiempos
32
indicados. Las sondas marcadas con P se indican en el margen izquierdo. b) Immunoprecipitación y
Western blot con anticuerpo policlonal anti-p19. c) Nivel de mRNA y de proteína p19 cuantificado con un
analizador Bio-Imaging Analyzer.
39
Resultados
d
G1
S
G2/M
G1
Horas
Incorporación de 3H-timidina
(dpm/ mg de proteína)
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 72
G1
90 87 80 49 5 4 1 58 91 93 56 13
S
7 8 16 41 69 71 9 12 8 5 34 67
G2/M 1 2 4 8 24 23 77 8 1 1 8 18
125
100
75
50
25
0
0
12
24
36
Horas
48
60
72
Figura 2. Las fases y la duración del ciclo celular fueron determinadas mediante citometría de flujo e
incorporación de 3H-timidina. En la tabla se indica la cantidad de células en porcentaje.
2- p19INK4d es inducida por radiación UV en células de neuroblastoma.
A continuación, confrontamos nuestra hipótesis de que la proteína p19 estaría involucrada
en la respuesta celular disparada por el daño al DNA. En primer lugar, estudiamos la
expresión de p19 luego de irradiar células de neuroblastoma humano SH-SY5Y con luz
UV, un conocido agente genotóxico. Encontramos que existía una clara inducción
transitoria luego de 24 horas desde la irradiación y que esta inducción era dependiente de
la dosis de UV (Figuras 3a y 4). Para todos los ensayos siguientes elegimos la dosis de 8
mJ/cm2 de UV. Para verificar si este aumento en el nivel de proteína era atribuible a una
regulación a nivel de la transcripción medimos el nivel de mRNA a distintos tiempos luego
de la irradiación y observamos que el mRNA de p19 estaba significativamente aumentado
24 horas luego del tratamiento (Figura 5). Estos resultados sugieren que la expresión de
p19INK4d es inducida por luz UV principalmente en un paso pretraduccional. Como
control del tratamiento, estudiamos el nivel de la proteína p53, que aumentó con la
irradiación UV y el de CDK4 que permaneció inalterado (Figura 3b).
40
Resultados
Simultáneamente realizamos un análisis por FACS en células SH-SY5Y con el objeto
de evaluar su posición en el ciclo celular luego del tratamiento con luz UV. Observamos
que cerca del 65% estaban arrestadas en G1 48 horas luego de la irradiación, en contraste
con el 50% de células no tratadas con contenido de DNA correspondiente a fase G1. La
respuesta al agente genotóxico causó un verdadero arresto del ciclo celular ya que la
proporción de células en fase S disminuyó de 33% en células no irradiadas a 9% luego del
tratamiento. Además, 48 horas luego de la irradiación, el número de células, la actividad
metabólica y la incorporación de timidina disminuyeron significativamente comparándolas
con las células control (datos no mostrados). Por otro lado, la población celular en la fase
Sub G1 se incrementó de 3,5% a 13,6%, 48 luego de la irradiación, indicándonos un
aumento de la muerte celular (Figura 6).
3- El efecto de UV sobre p19INK4d no está restringido a un sólo tipo celular.
Con el objeto de determinar si la inducción de p19 mediada por UV es un evento
general y no una observación específica de este tipo celular, decidimos estudiar la
expresión de p19 en respuesta a la luz UV en varias líneas celulares de distinto origen.
Hallamos que el mRNA de p19 también era inducido en otra línea de neuroblastoma
humano, como IMR32, para la que realizamos una curva de tiempo luego de irradiar las
células y observamos alta acumulación del mensajero a las 24 horas (Figura 7). Así mismo,
estudiamos la expresión de p19 en células de neuroblastoma de ratón Neu-2a, en
fibroblastos de hamster BHK21 y en células HeLa, derivadas de adenocarcinoma de
cérvix. En estos ensayos, además, transfectamos una muestra con un vector de expresión
para p19 (pSG5p19) como control de sobrexpresión y que será utilizado en ensayos
posteriores. En los tres tipos celulares p19 se indujo considerablemente en respuesta a la
irradiación con luz UV. Es llamativa, la inducción de p19 en células HeLa, donde
normalmente esta silenciada o inhibida (Figura 8).
Podemos decir, entonces, que la inducción de p19 luego de la irradiación UV es una
respuesta celular general y que no está ligada a un tipo celular específico.
41
Resultados
a
Basal
Horas
0
24
UV
48
72
0
24
48
72
p19
CB
b
Basal
Horas
0
24
UV
48
72
0
24
48
72
CDK4
p53
β -actina
Figura 3. Inducción de la expresión de la proteína p19INK4d luego de irradiación UV.
Células SH-SY5Y fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 de UVC y cosechadas en los tiempos indicados luego de la
irradiación. a) Igual cantidad de proteína (100 µg) de los lisados celulares fue sujeta a immunoprecipitación y
Western Blot con un anticuerpo policlonal anti-p19. El contenido proteico de cada muestra fue verificado por
tinción con Coomasie Blue (CB). En la foto se muestra una banda representativa. b) Las proteínas p53 y
CDK4 fueron detectadas mediante Western blot utilizando 20 µg de proteínas totales de células SH-SY5Y
con anticuerpos policlonales anti-p53 y anti-CDK4 respectivamente. La figura muestra el resultado de uno de
tres experimentos independientes.
UVC (mJ/cm2)
0
1
2
4
8
12
p19
CB
Figura 4. El aumento de p19 es dependiente de la dosis de UV. Células SH-SY5Y fueron irradiadas con
las dosis de UV indicadas y cosechadas 24 h luego de la irradiación. Igual cantidad de proteína (100 µg) de
los lisados celulares fue sujeta a immunoprecipitación y Western Blot con un anticuerpo policlonal anti-p19.
El contenido proteico decada muestra fue verificado por tinción con Coomasie Blue (CB). En la foto se
muestra una banda representativa. La figura muestra el resultado de uno de tres experimentos
independientes.
42
Resultados
Basal
Horas
0
24
48
UV
72
0
24
48
72
p19
β-tubulina
Distribución
celular
u tio n ((%)
% )
c e ll
c y c le d is tr ib
Figura 5. El mRNA de p19 aumenta luego de la irradiación con UV. Células SH-SY5Y fueron irradiadas
con 8mJ/cm2 de UV y cosechadas en los tiempos indicados luego de la irradiación. 20 µg de RNA total fue
sujeto a northern blot utilizando una sonda específica para p19 humana marcada con 32P. La membrana fue
rehibridizada para b-tubulina como control de siembra. La figura muestra el resultado de uno de tres
experimentos independientes.
70
60
50
40
30
20
10
0
SubG1
G1
S
G2/M
cont 00 hh
none
1,5
43,5
32,7
12,7
cont 48
h
none
48h
3,5
50,6
29,7
11,2
UV 0 h
1,3
47
33
13,6
UV 48 h
13,6
65,2
9,3
7,1
Figura 6. Arresto en fase G1 en células de neuroblastoma luego de tratarlas con UV. Células SH-SY5Y
fueron irradiadas con 8mJ/cm2 de UV. Cuarenta y ocho horas luego de la irradiación, las células fueron
sometidas al análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo. La figura muestra el resultado de un
experimento de tres realizados en forma independiente.
43
Resultados
Horas
CONTROL
0 24 48
0
UV
24 48
p19
IMR-32
β-tubulina
Figura 7. Inducción de la expresión de p19 en células IMR-32. Células IMR-32 fueron irradiadas o no con
8mJ/cm2 de UVC y cosechadas en los tiempos indicados luego de la irradiación. Veinte µg de RNA total fue
sujeto a Northern blot utilizando una sonda específica para p19 humana. La membrana fue rehibridizada para
β-tubulina como control de siembra. La figura muestra el resultado de un experimento de dos realizados en
forma independiente.
4- p19 es la única INK4 inducida por UV en células de neuroblastoma.
A continuación pusimos énfasis en dilucidar si la luz UV tenía el mismo efecto sobre
los otros miembros de la familia INK4. Irradiamos células SH-SY5Y con 8 mJ/cm2 de UV,
tomamos alícuotas a distintos tiempos y aislamos el RNA de las mismas para analizar la
expresión de varios CKIs mediante northern blot. Como era esperable p21Cip1 se indujo
considerablemente luego del tratamiento; sin embargo, la expresión de la otras INK4, p15,
p16 o p18 no fue afectada por la luz UV (Figura 9). Realizamos este ensayo en células
BHK21, obteniendo el mismo resultado. Estos experimentos sugieren que p19 es el único
miembro de la familia de proteínas INK4 cuya expresión es inducida por irradiación con
luz UV. Es importante destacar que esta inducción se produce en respuesta a dosis de UV
que causan un daño efectivo en el DNA, tal como se desprende de las observaciones
referidas al aumento de p53 (Figura 3) y de p21.
44
Resultados
0h
C
UV
24h
UV
+p19
C
UV
p19
Neu2a
β-tubulina
0h
C
UV
24h
UV C
+p19
UV
UV
+p19
p19
BHK21
β-tubulina
0h
C
UV
24h
UV C
+p19
UV
UV
+p19
p19
HeLa
β-tubulina
Figura 8. La expresión de p19 es inducida por UV en distintos tipos celulares. Células Neu2a, BHK21 y
HeLa fueron irradiadas o no con 8mJ/cm2 de UV y luego de 24 horas fueron cosechadas. Veinte µg de RNA
total fue sujeto a Northern blot utilizando una sonda específica para p19 humana. Por lo menos una muestra
en cada ensayo fue transfectada con el vector de expresión pSG5p19 48 horas antes de la irradiación, como
control de sobrexpresión. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como control de carga. La figura
muestra el resultado de un experimento de dos realizados en forma independiente.
45
Resultados
Horas
0
24
Basal
48
72
0
24
UV
48
72
p16
p15
p18
p21
β-tubulina
Figura 9. Análisis de la expresión de INK4 y Cip/Kip luego de irradiación UV. Células SH-SY5Y fueron
irradiadas con 8 mJ/cm2 de UVC y cosechadas en los tiempos indicados luego de la irradiación. Se realizó
análisis de Northern blot con RNA total (20 µg). Las sondas marcadas con 32-P se indican en el margen izquierdo.
Se muestra una autorradiografía representativa de dos experimentos independientes con resultados similares.
5- Los agentes genotóxicos cisplatino y péptido β-amiloide inducen p19INK4d en
células de neuroblastoma.
Ya que p19 se induce en respuesta al daño con UV, quisimos comprobar si también
respondía a otros tratamientos que dañan el DNA. El cisplatino (cis-diaminodicloroplatino
II), un agente quimioterapeútico ampliamente utilizado, produce aductos de DNA no
codificantes de manera similar a la luz UV (Quiñones et al, 2002). El péptido β-amiloide,
es un componente proteico de las placas seniles extracelulares presentes en pacientes con
enfermedad de Alzheimer, y se cree que es neurotóxico. El mecanismo de la toxicidad aún
es poco claro, pero se sabe que el estrés oxidativo y la inflamación están implicados como
mediadores de la misma, y que estas lesiones, a su vez, dañan componentes celulares que
incluyen proteínas, lípidos de membrana y el DNA (Suram, et al., 2006). Por lo tanto, una
lesión originada por cisplatino, activa principalmente el mecanismo de reparación NER,
mientras que los daños derivados de la acumulación del péptido β-amiloide provocan la
activación de las vías de reparación BER y/o HR.
Para estudiar la respuesta de p19 frente a estos agentes genotóxicos, tratamos células SHSY5Y con cisplatino 20 µM o péptido β-amiloide 20 µM y tomamos muestras a distintos
46
Resultados
tiempos para analizar el RNA total por Northern blot. Observamos que la expresión de p19
se incrementó en función del tiempo con ambos tratamientos presentando máxima
acumulación del RNA a las 12 horas (Figura 11a). A continuación, tratamos a las células
con dosis crecientes de los agentes genotóxicos. La expresión de p19 resultó ser
dependiente de la dosis para ambos dañadores. El efecto del cisplatino se observó con una
dosis mínima de 10 µM y el del péptido con una de 2 µM. En ambos casos el RNA de βtubulina se mantuvo inalterado (Figura 11b).
Concluímos entonces que, diversos agentes genotóxicos que causan distintos tipos de
daño
sobre el DNA y que activan distintos mecanismos de reparación, conducen
igualmente a la inducción de la expresión del gen de p19.
a
β-amiloide (20µM)
Cisplatino (20µM)
0
Horas
6
12
24 36 48
0
6
12
24 36 48
p19
β-tub
b
β-amiloide
Cisplatino
Dosis (µM)
0
5
10
20
50 100
0
2
5
10
20 50
p19
β-tub
Figura 11. Los agentes genotóxicos cisplatino y péptido β-amiloide inducen p19INK4d en células de
neuroblastoma. a) Células SH-SY5Y fueron tratadas con cisplatino 20 µM o con péptido β- amiloide 20 µM y
cosechadas en los tiempos indicados luego del tratamiento. Veinte µg de RNA total fue sujeto a Northern blot
utilizando una sonda específica para p19 humana. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como
control de siembra. b) Células SH-SY5Y fueron tratadas con las dosis indicadas de cisplatino o péptido βamiloide durante 12 horas. El RNA total fue sometido a Northern blot de la misma forma que en a). La figura
muestra el resultado de un experimento de dos realizados en forma independiente.
47
Resultados
6- La estabilidad del mRNA de p19INK4d no es afectada por agentes genotóxicos.
El incremento del nivel de mRNA de p19 en respuesta al tratamiento de las células con
agentes genotóxicos puede ser causado por diversos motivos. Uno de ellos podría ser que
el agente de daño produzca un aumento en la estabilidad de este mRNA.
Con el objeto de dilucidar si el aumento del mRNA de p19 se debía a un incremento en
la estabilidad de la molécula, realizamos un ensayo agregando el inhibidor de la
transcripción actinomicina D 1 µM en el mismo momento de tratar a las células con UV o
con el péptido β-amiloide en células BHK21 o SH-SY5Y respectivamente. Tomamos
muestras a distintos tiempos y analizamos la cantidad de RNA de p19 remanente y de esta
manera calculamos la vida media del mensajero en células control y dañadas con ambos
tipos de genotóxicos. Observamos que la estabilidad del mensajero de p19 se mantiene
aproximadamente constante luego de los distintos tratamientos ya que la vida media es de
190 minutos para las células control, de 185 minutos para las células tratadas con UV
(Figura 12) y de 200 minutos para las tratadas con β-amiloide (Figura 13), diferencias que
no son suficientes para justificar la
acumulación del mensajero observada con los
tratamientos.
En el ensayo anterior existe una limitación, que es el hecho de agregar actinomicina D
simultáneamente con el tratamiento de UV. Si la luz UV necesitara la transcripción
temprana de alguna molécula para aumentar la estabilidad de p19, esto no sería posible ya
que toda la transcripción se encontraría inhibida. Por tal motivo, considerando que el
efecto de UV sobre el mensajero de p19 podría requerir la transcripción de una o varias
moléculas intermediarias, realizamos un nuevo ensayo en el que irradiamos las células y
dejamos transcurrir 3 horas antes del agregado de actinomicina D. Obtuvimos resultados
similares a los del ensayo anterior, o sea, que no se observó variación en la estabilidad del
mRNA de p19 con luz UV (Figura 14).
En conclusión, estos resultados sugieren fuertemente que los agentes genotóxicos
ensayados no modifican la estabilidad del mensajero de p19.
Por lo tanto, podemos suponer que los agentes genotóxicos estarían provocando un
incremento en la tasa de transcripción de este gen. Para poner a prueba esta hipótesis, más
adelante estudiaremos el inicio de la transcripción mediante un ensayo de run- on (ver item
8).
48
Resultados
CONTROL
0
Horas
1
UV
2
4
8
0
1
2
4
p19
β-tub
Actinomicina D
% p19 mRNA
125
control
UV
100
75
UV
8
Figura 12. La estabilidad del
mRNA de p19 no es modificada
por UV. Células BHK21 fueron
irradiadas o no, con 8mJ/cm2 de
UVC simultáneamente con el
tratamiento con actinomicina D 1
µM y cosechadas en los tiempos
indicados luego de la irradiación.
Veinte µg de RNA total fue sujeto a
Northern blot utilizando una sonda
específica para p19 humana. La
membrana fue rehibridizada para
β-tubulina
como
control
de
siembra. La figura muestra el
resultado de un experimento de
dos
realizados
en
forma
independiente.
50
25
0
0
2
4
6
Horas
β- amiloide (10 µM)
CONTROL
Horas
0
2
4
8
12
0
2
4
8 12
p19
β-tub
125
Actinomicina D
control
% p19 mRNA
100
bA
75
Figura 13. La estabilidad del
mRNA de p19 no es modificada
por el tratamiento con βamiloide. Células SH-SY5Y fueron
tratadas o no, con péptido βamiloide 10µM simultáneamente
con el tratamiento con actinomicina
D 1 µM y cosechadas en los
tiempos indicados. Veinte µg de
RNA total fue sujeto a Northern blot
utilizando una sonda específica
para p19 humana. La membrana
fue rehibridizada para β-tubulina
como control de siembra. La figura
muestra el resultado de un
experimento de dos realizados en
forma independiente.
β-A
50
25
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Horas
49
Resultados
UV
CONTROL
Horas
0
1
2
4
8
0
1
2
4
8
p19
β-tub
Figura 14. La estabilidad del mRNA de p19 no es modificada por UV. Células BHK21 fueron irradiadas o
no, con 8mJ/cm2 de UVC luego de tratarlas con actinomicina D 1 µM durante 3 horas y cosechadas en los
tiempos indicados luego de la irradiación. Veinte µg de RNA total fue sujeto a Northern blot utilizando una
sonda específica para p19 humana. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como control de siembra.
La figura muestra el resultado de un experimento de dos realizados en forma independiente.
7- La estabilidad de la proteína p19INK4d no es modificada con la radiación UV.
Se ha reportado que la oscilación periódica de p19 durante el ciclo celular es
determinada en gran medida por la degradación, utilizando el mecanismo del proteasoma
luego de su ubiquitinación (Thullberg et al., 2000). Este hecho permitiría que la
abundancia de la proteína siga los cambios en la expresión de su mensajero.
En vista de los resultados que indican que, además del RNA mensajero, la proteína p19
también está aumentada en células irradiadas con UV, a continuación consideramos la
posibilidad de que este aumento sea producto de un incremento en la estabilidad de p19
causada por la luz UV. Para ello realizamos experimentos de pulse-chase. Células BHK21
fueron incubadas con 50 µCi de 35S-metionina y luego de 2 horas de pulso, fueron lavadas,
irradiadas con 8 mJ/cm2 de UV y se les agregó medio con metionina fría extrayendo
alícuotas a distintos tiempos. Como podemos observar en la figura 15, la estabilidad de la
proteína p19 no fue modificada significativamente en células irradiadas respecto de las
células control. En células sin tratar la vida media es de 130 minutos y en las células
tratadas con UV la vida media es de 112 minutos.
50
Resultados
Estos resultados indican que la estabilidad de la proteína p19 no es aumentada por la
radiación UV, apoyando la idea de que el aumento en el nivel de proteína debe estar dado
por la inducción del gen y el aumento de la síntesis proteica.
UV
CONTROL
Horas
0
1
2
4
6
0
1
2
4
6
p19
125
CONTROL t1/2: 130 min
% p19INK4d
100
UV
t1/2: 112 min
4
6
75
50
25
0
0
2
Horas
Figura 15. La estabilidad de la proteína p19INK4d no es modificada por UV. Células BHK21 fueron
incubadas 15 minutos en medio libre de metionina y luego 2 horas en medio con metionina marcada con 35S
(50 µCi/ muestra). Se removió el medio, se lavaron las células y se irradiaron o no, con 8 mJ/cm2 de UV. Se
readicionó medio fresco con metionina y se tomaron alícuotas a distintos tiempos para someterlas a
inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-p19.
51
Resultados
8- Los agentes genotóxicos UV y β-amiloide provocan un incremento en la tasa de
iniciación de la transcripción del gen de p19INK4d.
Como concluímos en el punto 6, habiendo descartado un efecto estabilizador de los
agentes genotóxicos como causa de la acumulación del mRNA de p19, decidimos estudiar
el efecto de estos agentes sobre la iniciación de la transcripción. Para ello llevamos a cabo
ensayos de run-on.
En nuestro estudio comparamos la iniciación de la transcripción de varios genes,
incluyendo el de p19, en células control y en células irradiadas con UV o tratadas con el
péptido β- amiloide. Para este ensayo utilizamos las líneas de fibroblastos BHK21
(hamster) o WI38 (humana) respectivamente. Las células fueron sembradas y una vez
adheridas a las placas, irradiadas con 8mJ/cm2 de UV o tratadas con el péptido β- amiloide
10 µM e incubadas en estufa por 24 o12 horas respectivamente. Luego de extraer los
núcleos y hacer la marcación radioactiva del RNA que se estaba sintetizando en ese
momento, analizamos la expresión de cada gen. Observamos que la transcripción de p19
aumentó aproximadamente 3 veces en las células tratadas con los agentes genotóxicos con
respecto a las células control (Figuras 16 y 17). Los genes elegidos para ser utilizados
como controles del método, tienen funciones conocidas en el ciclo celular, en la reparación
del DNA o bien en apoptosis. Los mismos tuvieron una respuesta similar a la reportada
luego del daño. La transcripción de p21 fue inducida 4 veces con UV y la de GADD45 2,5
veces con β-amiloide, mientras que la expresión de CDK4 y de p16 se vió inalterada con
ambos tratamientos (Al-Mohanna et al., 2004; Jabbur et al., 2000; Santiard-Baron et al.,
1999). Ciclina D1 y Bcl-X presentaron una significativa disminución en su expresión luego
del daño con UV o con β-amiloide respectivamente (Hiyama and Reeves, 1999; Lutzen et
al., 2004).
Por lo tanto, el conjunto de resultados obtenidos hasta el momento indicarían que el
aumento en el nivel de proteína y mRNA de p19 en respuesta a agentes genotóxicos como
UV o péptido β-amiloide está regulado a nivel transcripcional, más precisamente sobre la
iniciación.
52
Resultados
CONTROL
UV
UV/ CONTROL
p19
3,1
p21
4,8
CDK4
0,9
ciclina D1
0,4
β-tubulina
0,9
*
Figura 16. La luz UV incrementa la transcripción de p19INK4d. Células BHK21 fueron irradiadas con 8
2
mJ/cm de UV 24 horas antes de ser cosechadas. Los núcleos fueron extraídos con buffer de lisis y luego
32
fueron incubados en buffer de marcación conteniendo 50 µCi Pγ.rUTP durante 20 minutos a 30°C para
marcar los nuevos RNAs sintetizados. El RNA total fue extraído y 20 µg de plásmidos conteniendo el cDNA
de p19, p21, CDK4, ciclina D1 y β-tubulina fueron desnaturalizados y fijados en una membrana de nylon. El
RNA total marcado fue utilizado como sonda. La radioactividad fue cuantificada en un analizador FUJIFILM
BASII 1800 Phosphorimager Analizer.
CONTROL
β-amiloide
β-amiloide
CONTROL
p19
2,5
p16
1,2
Gadd45
2,5
Bcl- x
0,4
β-tubulina
*
1
Figura 17. El péptido β-amiloide incrementa la transcripción de p19INK4d. Células SH-SY5Y fueron
tratadas con péptido β-amiloide 10 µM durante las 12 horas previas a la cosecha. Los núcleos fueron extraídos
con buffer de lisis y luego fueron incubados en buffer de marcación conteniendo 50 µCi 32Pγ.rUTP durante 20
minutos a 30°C para marcar los nuevos RNAs sintetizados. El RNA total fue extraído y 20 µg de plásmidos
conteniendo el cDNA de p19, p16, Gadd45, Bcl-X y β-tubulina fueron desnaturalizados y fijados en una
membrana de nylon. El RNA total marcado fue utilizado como sonda. La radioactividad fue cuantificada en un
analizador FUJIFILM BASII 1800 Phosphorimager Analizer.
53
Resultados
9- La inducción transcripcional de p19INK4d en respuesta al daño al DNA requiere
la síntesis de novo de proteínas.
A continuación nos preguntamos si la inducción génica del inhibidor de CDK4/6
observada luego del tratamiento con UV, requería en alguna medida de la síntesis de novo
de proteínas. Para encontrar la respuesta, analizamos la expresión del mRNA de p19 a lo
largo del tiempo, luego de tratar con UV células que habían sido previamente incubadas (o
no) con cicloheximida (CHX) 10µM durante 3 horas. Este compuesto interfiere con la
actividad peptidil-transferasa de la subunidad 60S del ribosoma y por lo tanto inhibe la
síntesis de proteínas.
El resultado, mostrado en la figura 18 pone de manifiesto que la cantidad de RNA
sintetizado luego del daño, es menor en las células tratadas con CHX que en las células
dañadas pero no tratadas con CHX, y sugiere que, al menos parcialmente, es necesaria la
síntesis de proteínas para obtener la inducción máxima frente al daño con UV. Además,
pudimos comprobar que la CHX no afecta la transcripción basal de p19, ni por su efecto
inhibitorio de la síntesis proteica, ni como agente de daño al DNA.
basal
Horas
0 6 12 24
+ CH
0 6 12 24
UV
0 6
12 24
UV + CH
0 6 12 24
p19
β- tub
Figura 18. La inducción de p19INK4d en respuesta al daño al DNA requiere la síntesis de novo de
proteínas. Células BHK21 fueron irradiadas o no, con 8mJ/cm2 de UVC luego de tratarlas o no, con
cicloheximida 10 µM durante 3 horas y cosechadas en los tiempos indicados luego de la irradiación. Veinte
µg de RNA total fue sujeto a Northern blot utilizando una sonda específica para p19 humana. La membrana
fue rehibridizada para β-tubulina como control de siembra. La figura muestra el resultado de un experimento
de dos realizados en forma independiente.
54
Resultados
10- p19INK4d transloca al núcleo cuando las células son irradiadas con UV.
Se ha reportado que la localización de p19INK4d en varios tipos celulares es
predominantemente citoplasmática (Guan et al., 1996). Con el objetivo de confirmar este
hecho en células de neuroblastoma SH-SY5Y, realizamos ensayos de inmunocitoquímica.
En primer lugar determinamos la distribución subcelular de p19 en células ciclantes de
neuroblastoma
utilizando un anticuerpo primario anti-p19 y un anticuerpo secundario
acoplado a fluoresceína (FITC). Los preparados
fueron teñidos con Höescht para
identificar los núcleos (Figura 19). En condición basal observamos que sólo el 43% de las
células control expresan p19, consistentemente con su expresión periódica en el ciclo
celular. La proteína p19 se encuentra principalmente en el citoplasma (93% de las células
positivas). A continuación analizamos la distribución subcelular de la proteína luego de
exponer a las células a un agente de daño como la luz UV. Observamos que luego de
irradiarlas con 8 mJ/cm2 de UV p19 comienza a acumularse en el núcleo alcanzando un
máximo a las 48 horas (54%). Además de la translocación, determinamos que existe un
incremento en el número de células que expresan p19 (75%) 48 horas luego del
tratamiento.
Luego de 72 horas, el número de células que expresan esta proteína
disminuye y p19 posee una distribución subcelular que se asemeja a la situación basal
(Figura 19 y Tabla 1).
Tabla 1. Localización subcelular de p19 en células SH-SY5Y
tratadas con luz UV
% de células a
Tiempo luego
de UV (hs)
0
24
36
48
72
p19 positivas
p19 positivas
Total
Citoplasma
Núcleo
43 (136)
68 (54)
60 (195)
75 (138)
55 (50)
93 (126)
89 (48)
66 (128)
42 (58)
90 (45)
7 (10)
11 (6)
34 (67)
54 (80)
10 (5)
p19 negativas
57 (182)
32 (26)
40 (132)
25 (45)
45 (40)
Los datos provienen de un experimento, representativo de dos experimentos
independientes . a Los datos entre paréntesis refieren al número de células.
55
Resultados
P19-FITC
Höestch
UV 0 h
UV 24 h
UV 36 h
UV 48 h
UV 72 h
Figura 19. Localización subcelular de p19 luego de irradiación UV. Células SH-SY5Y fueron irradiadas
2
con 8 mJ/cm de UV y fijadas a distintos tiempos luego de la irradiación. La inmunocitoquímica fue realizada
con un anticuerpo primario anti-p19 hecho en conejo y un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo
conjugado a fluoresceína (FITC).
56
Resultados
Segunda Parte
Estudio de la participación de p19INK4d en los mecanismos de reparación del DNA
luego de tratar células con distintos agentes genotóxicos.
Hasta aquí hemos demostrado que p19 está involucrada en la respuesta ejecutada por las
células de neuroblastoma humano frente al tratamiento con diversos agentes genotóxicos
tales como UV, cisplatino y el péptido β-amiloide. Existe un aumento en la expresión del
gen de p19 que se traduce en un incremento de los niveles proteicos y en su translocación
al núcleo. Este efecto parece manifestarse en distintos tipos celulares.
En esta segunda parte investigamos si estas modificaciones en el estatus de p19 en un
contexto celular de injuria al DNA forman parte de un mecanismo fisiológico involucrado
en el mantenimiento de la estabilidad genética.
11- La sobrexpresión de p19INK4d protege a las células de neuroblastoma de la
muerte provocada por la radiación UV.
Se sabe que p19 arresta las células en la fase G1 del ciclo celular, mediante la
interacción con CDK4 e impidiendo la formación del complejo Ciclina D/CDK4. Por otro
lado, la luz ultravioleta activa el checkpoint de G1, ya que, como respuesta al daño en el
DNA, el nivel de p53 aumenta, resultando en la activación transcripcional de p21Cip1, la
cual puede mediar dicho arresto (Dash and El-Deiry, 2004). Nuestro siguiente objetivo fue
caracterizar el efecto que tiene el nivel intracelular de p19 y el tratamiento con UV en el
ciclo celular de las células de neuroblastoma. Para llevar a cabo dicho análisis, estudiamos
las fases del ciclo mediante citometría de flujo. Utilizamos células SH-SY5Y transfectadas
con el vector pSG5 (vacío) como control, células transfectadas con el vector de expresión
que contiene el cDNA de p19 sentido (pSG5p19) y células tratadas con UV. Además, las
cotransfectamos con el vector pBABE puro, para poder seleccionar las células
transfectadas con el antibiótico puromicina. Observamos que, luego de 48 horas, tanto p19
como la luz UV produjeron un aumento del porcentaje de la población celular en fase G1,
comparado con las células control (de 50% a 70 %). Al mismo tiempo, la irradiación con
UV provocó la acumulación de células en fase SubG1, indicando un incremento de la
muerte celular (de 2% a 18,4%) (Figura 20 a).
57
Resultados
a
control
p19
subG1
0h
1.4
subG1
48 h
2.12
b
Horas
0
24
48
96
control
p19
UV
UV + p19
UV + p19AS
Figura 20. p19INK4d disminuye la población de células de neuroblastoma en SubG1 luego de la
irradiación UV. Células SH-SY5Y fueron cotransfectadas con 2µg del vector de expresión que contiene el
cDNA sentido (p19) o antisentido (p19AS) o el vector vacío junto con 0,5 µg del vector puroBABE.
Veinticuatro horas luego de la transfección las células fueron tratadas por otras 60 horas con puromicina. Las
células resistentes fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 de UV. a) Inmediatamente y 48 horas luego de la
irradiación con UV, las células fueron cosechadas y sujetas al análisis del ciclo celular mediante citometría de
flujo. En cada gráfico se indica el porcentaje de células en la fase SubG1. b) Las células fueron cosechadas
en los tiempos indicados luego de la irradiación e iguales cantidades de proteínas de lisados celulares fueron
sometidas a inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-p19 policlonal. Los complejos inmunes fueron
corridos en un SDS-PAGE 10%, transferidos a una membrana de nitrocelulosa y analizados en Western blot
con el mismo anticuerpo.
Un daño en el DNA podría, de algún modo, activar los componentes de la maquinaria
celular que participan en la activación de vías apoptóticas. Estudios previos sugieren que la
muerte neuronal causada por agentes genotóxicos requiere la participación de CDKs
involucradas en la transición de G1 a S (Park et al., 1998). A continuación, para estudiar el
rol de p19, un CKI, en la muerte celular inducida por UV, realizamos un análisis mediante
citometría de flujo y determinamos el porcentaje de muerte celular provocada por UV en
células que expresan p19 en niveles elevados o disminuidos. Para llevar a cabo esto,
58
Resultados
transfectamos dos poblaciones de células. Una de ellas con un vector de expresión que
contiene el cDNA de p19 sentido (pSG5p19), otra con un vector que contiene el cDNA de
p19 antisentido (pSG5p19AS). Luego, tratamos o no las células seleccionadas con 8
mJ/cm2 de UV y las incubamos por distintos tiempos (0-96 h). Examinamos si el aumento
o la disminución en la expresión de p19 afectaba la muerte celular luego de la irradiación
con UV. Las células que expresaban alto nivel de p19 mostraron resistencia a la irradiación
con UV, ya que luego de 48 horas, solamente el 9,7% de estas células se encontraba en
fase SubG1. Estos resultados indican que la muerte celular inducida por UV en las células
que sobrexpresan p19 es dos veces menor que las células transfectadas con el plásmido
vacío. Por otro lado, la población en SubG1 fue significativamente mayor (33,6%) luego
de la irradiación en las células de neuroblastoma con niveles de p19 indetectables (Figura
19a). Verificamos la transfección y expresión de los plásmidos en las células
seleccionadas, mediante western blot. El nivel de p19 fue notablemente mayor cuando
transfectamos el vector pSG5p19, mientras que fuimos incapaces de detectar la proteína en
las células que contenían el pSG5p19AS, aún cuando éstas fueron irradiadas con UV
(Figura 20b).
12- La muerte celular observada en SH-SY5Y luego de la irradiación con UV es un
evento apoptótico que puede ser disminuído por p19INK4d.
Con el objeto de confirmar la variación en la muerte celular inducida por UV en relación
con los niveles de p19 observada por citometría de flujo y si esta muerte correspondía a un
proceso apoptótico, determinamos la actividad de caspasa-3 en células control o expuestas
a UV, y transfectadas con pSG5p19 o pSG5p19AS. La activación de caspasas juega un
papel importante en las fases ejecutoras de la apoptosis ya que las caspasas efectoras
activadas, como la caspasa-3, llevan a cabo el programa de muerte celular mediante la
degradación de proteínas vitales. En nuestro sistema, la inducción de la actividad de
caspasa-3, demostró que las células de neuroblastoma sufren apoptosis luego de ser
irradiadas con UV (Figura 21a, 24h). La magnitud de esta inducción fue mayor en las
células con el nivel de p19 disminuido (células con p19AS). Por el contrario, observamos
una significativa reducción de esta actividad en las células que estaban sobrexpresando
p19. En la figura 21b se observa la expresión de los plásmidos transfectados sobre el nivel
de mRNA endógeno.
59
Resultados
Estos resultados, en conjunto, indican que luego de la exposición a UV las células de
neuroblastoma experimentan apoptosis inducida por el daño al DNA (DDIA) y ponen de
manifiesto una función protectora de p19 frente a este tipo de muerte celular.
a
Actividad caspasa- 3 (%)
1000
Control
p19
p19AS
UV
UV+p19
UV+p19AS
750
500
250
0
8
Tiempo (horas)
p1
9
ct
or
ve
S
9A
p1
9
p1
or
ct
ve
AS
UV
CONTROL
9
b
24
p1
4
p19
β-tubulina
Figura 21. p19INK4d regula la actividad de caspasa-3 inducida por la luz UV. Células SH-SY5Y fueron
cotransfectadas con 2 µg del vector de expresión que contiene el cDNA sentido (p19) o antisentido (p19AS) o
con el vector vacío junto con 0,5 µg del vector puroBABE. Veinticuatro horas luego de la transfección las
células fueron tratadas por otras 60 horas con puromicina. Las células resistentes fueron irradiadas con 8
mJ/cm2 de UV. a) A diferentes tiempos luego de la irradiación, la actividad de caspasa-3 fue testeada en los
lisados celulares. El resultado está expresado como porcentaje de la actividad de caspasa-3 con respecto a
la actividad basal de los lisados transfectados con el vector vacío y sin tratamiento con UV, medido a 4 horas,
y al que se le dio un valor de 100. Las barras representan la media + d.e. de tres experimentos
independientes llevados a cabo por duplicado. El test de Student fue utilizado para comparar muestras
transfectadas con p19 o p19 AS y tratadas con UV, con muestras tratadas con UV pero transfectadas con el
vector vacío (*P<0,05). b) RNA total fue extraído de las células irradiadas o no, inmediatamente luego de la
irradiación y 20 µg fueron sometidos a Northern blot utilizando una sonda específica para p19 humana
marcada con 32P-ATP. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como control de siembra.
60
Resultados
13- La sobrexpresión de p19INK4d disminuye la apoptosis causada por dos agentes
genotóxicos distintos de UV en células de neuroblastoma.
A continuación, quisimos analizar si la protección ejercida por p19 frente a la apoptosis
inducida por UV, se observaba también cuando las células eran tratadas con otros agentes
genotóxicos.
Para ello, realizamos el ensayo de caspasa-3 de manera similar al anterior pero luego de
tratar a las células con 20 µM de cisplatino o 10 µM de péptido β-amiloide durante 24
horas (chequear). (Figura 22). Como era de esperar, observamos que con ambos
tratamientos las células de neuroblastoma presentaron un incremento en la actividad de
caspasa-3, indicando la presencia de células apoptóticas. Sin embargo, aquellas células que
habían sido transfectadas con p19 estaban significativamente protegidas contra este tipo de
muerte celular inducida por cualquiera de los genotóxicos mencionados. Las células con el
nivel de p19 disminuido y tratadas con β-amiloide tuvieron mayor inducción de la
actividad de caspasa-3, sin embargo, estas células tratadas con cisplatino no presentaron
diferencias significativas con respecto a las células sin transfectar. Esta observación
particular, podría estar relacionada con la concentración de cisplatino utilizada. Es
probable que con una dosis mayor, tal que en las células control la actividad de caspasa-3
sea superior (pero no máxima), podamos poner en evidencia el efecto de bajar el nivel de
p19 y observar un incremento en la actividad de caspasa-3 con respecto al control.
Estos resultados, refuerzan la idea de que p19 jugaría un rol fundamental en proteger a
las células de la apoptosis inducida por un daño en el DNA independientemente del agente
genotóxico utilizado.
61
Resultados
a
1000
0 horas
Actividad Caspasa-3 (%)
24 horas
800
600
*
400
*
200
b
β-amiloide
cis-platino
C
C
p19
p19
AS
β
βA A
+
βA p
+p 19
19
AS
co
nt
ro
l
ci
s
ci
s
ci +p
s+ 19
p1
9A
S
co
nt
ro
l
ci
s
ci
s+
ci
s+ p19
p1
9A
S
βA
βA
βA +p
+p 19
19
AS
0
C
p19
p19
AS
p19
β-tubulina
Figura 22. p19 regula la actividad de caspasa-3 inducida por los agentes genotóxicos cisplatino y péptido βamiloide. Células SH-SY5Y fueron cotransfectadas con 2 µg del vector de expresión que contiene el cDNA de p19
sentido (p19) o antisentido (p19AS) o el vector vacío junto con 0,5 µg del vector puroBABE. Veinticuatro horas luego de la
transfección las células fueron tratadas por otras 60 horas con puromcina. Las células resistentes fueron tratadas con
cisplatino (cis) 10 µM o péptido β-amiloide (βA) 10 µM . a) La actividad de caspasa-3 fue testeada en los lisados celulares
inmediatamnete y 24 horas más tarde. El resultado está expresado como porcentaje de la actividad de caspasa-3 con
respecto a la actividad basal de los lisados transfectados con el vector vacío y sin tratamiento, medido a la hora 0, y al que
se le asignó el valor de 100. Las barras representan la media + d.e. de tres experimentos independientes llevados a cabo
por duplicado. El test de Student fue utilizado para comparar muestras transfectadas con p19 o p19 AS y tratadas con el
agente de daño, con muestras tratadas pero transfectadas con el vector vacío (*P<0,05). b) RNA total fue extraído de las
células irradiadas o no inmediatamente luego de la irradiación y 20 µg fueron sometidos a Northern blot utilizando una
sonda específica para p19 humana. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como control de siembra.
62
Resultados
14- La sobrexpresión de p19INK4d mejora la capacidad de las células de reparar un
DNA plasmídico dañado con UV.
Uno de los mecanismos principales que posee la célula para responder a los efectos
citotóxicos de la radiación UV, es la activación de las vías de reparación del DNA (Guan et
al., 1996). Por lo tanto, nuestro siguiente objetivo consistió en estudiar si la relación
inversa que observamos entre sobrexpresión de p19 y disminución de apoptosis causada
por UV tiene alguna relación con la reparación del DNA. Para ello utilizamos el ensayo
“host cell reactivation” (HCR) por el cual se estima la capacidad que tienen las células de
reparar un DNA dañado agregado exógenamente. Transfectamos células BHK21 con el
plásmido pCMVCAT que contiene el gen reportero CAT bajo la regulación de un
promotor fuerte y constitutivo. Este plásmido había sido previamente irradiado con
distintas energías de UV (0-256 mJ/cm2 UV). A distintos tiempos luego de la transfección
determinamos la expresión del gen reportero CAT. La cuantificación de la expresión de
CAT con el plásmido dañado en relación con el plásmido control es una medida de la
reparación de este DNA en la célula receptora. En primer lugar, confirmamos que el
tratamiento con UV había dañado efectivamente el DNA ya que la expresión de CAT
cuantificada 36 horas luego de la transfección, disminuye a medida que la irradiación con
UV aumenta (Figura 23a). A continuación realizamos una curva de tiempo postransfección
utilizando el DNA dañado con 64 mJ/cm2 de UV. El daño es evidente ya que la actividad
de CAT a las 24 horas es mucho menor con el plásmido previamente irradiado (280
unidades) que con el que no fue tratado (1355 unidades). Por otro lado, la reparación
también se evidencia, ya que la actividad de CAT en función del tiempo aumenta más
rápidamente en las células con plásmido dañado que en las control. Esto se puede ver 48
horas postransfección (Figura 23b y 23c). Estos resultados indican que, como era de
esperar, las células utilizadas en nuestro sistema tienen la capacidad de reparar el DNA
dañado por UV.
Para investigar si la sobrexpresión de p19 modifica la reparación del DNA de acuerdo al
ensayo de HCR, cotransfectamos los fibroblastos con el gen reportero CAT dañado o no
con UV y con el plásmido de expresión para p19 o p19 antisentido. Cuarenta y ocho 48
horas postransfección determinamos la expresión de CAT. Vimos que la recuperación de la
expresión de CAT fue mayor en las células con sobrexpresión de p19. Sin embargo la
sobrexpresión de p19AS no modificó significativamente la actividad CAT. Estos
63
Resultados
resultados indican que p19 mejoraría la capacidad de las células de reparar fotolesiones en
un DNA dañado con UV (Figura 24).
a
Actividad CAT
(unid. arbitrarias)
7500
5000
2500
0
0
8
16
32
64
128
256
Dosis UV (mJ/cm2)
Actividad CAT
(unid. arbitrarias)
b
3000
control
UV
2000
1000
0
24
36
48
72
Tiempo de expresión (h)
Actividad CAT (%)
c
400
control
UV
300
200
100
Figura 23. Reparación
de
un
plásmido
dañado con UV en
células BHK21. Ensayo
HCR. Células BHK21
fueron
transfectadas
con 2 µg del plásmido
pCMVCAT previamente
irradiado o no, con
distintas energías de
UV (0-256 mJ/cm2 UV).
a) La expresión de CAT
fue
cuantificada
36
horas luego de la
transfección
y
relativizada
con
la
βexpresión
de
galactosidasa.
La
misma disminuye a
medida
que
la
irradiación
con
UV
aumenta confirmando la
eficacia del tratamiento.
b) Las células fueron
transfectadas con el
DNA dañado con 64
mJ/cm2 de UV y la
actividad de CAT fue
determinada a distintos
tiempos luego de la
transfección
y
relativizada
con
la
expresión de β-gal.
c) El resultado de b)
expresado
como
porcentaje
de
la
actividad
CAT
en
relación a la actividad
de la muestra de 24
horas que fue tomada
como 100. Las figuras
muestran la media +
d.e.
de los valores
obtenidos
en
dos
ensayos independientes
realizados
por
duplicado.
0
0
24
48
72
Tiempo de incubación (h)
64
Resultados
control
UV
Actividad CAT (unid. arbitrarias)
1500
*
1000
500
0
control
p19
AS p19
Figura 24. p19INK4d mejora la reparación de un plásmido dañado con UV . Células BHK21 fueron
transfectadas con 2 µg del plásmido pCMVCAT previamente irradiado o no, con 64 mJ/cm 2 de UV y
cotransfectadas con pSG5p19 o pSG5p19AS o vector. La expresión de CAT fue cuantificada 36 horas luego
de la transfección y relativizada con la expresión de β-gal. Las figuras muestran la media + d.e. de los
valores obtenidos en dos ensayos independientes realizados por duplicado.
15-
p19INK4d
aumenta
la
eficiencia
de
reparación
del
DNA
genómico
independientemente del agente genotóxico utilizado.
Con el objeto de profundizar el estudio sobre el efecto que tiene p19 sobre la reparación
del DNA, utilizamos el ensayo de UDS, el cual refleja la habilidad celular para reparar su
propio DNA. Brevemente, seleccionamos células de neuroblastoma previamente
transfectadas con el vector pSG5 o pSG5p19 o pSG5p19AS y las incubamos en medio
libre de arginina y bajo suero (1%) durante 60 hs. De esta manera las arrestamos en G0/G1
y minimizamos la síntesis de DNA semiconservativa. Luego, irradiamos los cultivos con 8
mJ/cm2 de UV y medimos la incorporación de 3H- timidina a distintos tiempos. Ya que en
estas condiciones la replicación está inhibida, toda la incorporación de 3H-timidina
observada se debe a la reparación del DNA. Hallamos que las células que sobrexpresaban
p19 incorporaron 50% más 3H-timidina que las células con nivel basal de p19 (Figura 25a).
Por el contrario, la reparación fue dramáticamente reducida en las células deficientes en
65
Resultados
p19. Esta reducción en la síntesis de DNA no programada, no sólo indica que el aumento
en la reparación proviene específicamente de la sobrexpresión de p19, sino también que la
proteína p19 endógena es necesaria para llevar a cabo una respuesta completa contra el
daño en el DNA.
dpm/ µg de proteína
Control
UV
UV+p19
UV+p19AS
Tiempo (horas)
UV
or
ct
ve
or
9
p1
AS
p1
9A
S
ct
ve
9
p1
p19
β-tubulina
Figura 25. p19 aumenta la capacidad de las células SH-SY5Y de reparar el DNA genómico dañado con
UV. Células SH-SY5Y fueron cotransfectadas con 2µg del vector de expresión que contiene el cDNA sentido
(p19) o antisentido (p19AS) o el vector vacío junto con 0,5 µg del vector puroBABE. Veinticuatro horas luego
de la transfección el medio fue sustituído por medio libre de arginina conteniendo suero fetal bovino 1% y las
células fueron incubadas con puromicina por otras 60 h. Las células resistentes fueron irradiadas con 8
mJ/cm2 UV . a) Luego de la irradiación las células fueron incubadas con10 mCi [3H] timidina durante distintos
tiempos y luego se cuantificó la incorporación de timidina en los lisados celulares. Las barras representan la
media +/- e.s. de tres experimentos diferentes llevados a cabo por triplicado. El test de Student fue utilizado
para comparar muestras transfectadas con p19 o p19 AS y tratadas con UV, con muestras tratadas con UV
pero transfectadas con el vector vacío (*P<0,05). b) RNA total fue extraído de las células irradiadas o no, 8
horas luego de la irradiación y 20 µg fueron sometidos a Northern blot utilizando una sonda marcada con 32P
específica para p19 humana. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como control de siembra.
66
Resultados
Paralelamente realizamos el mismo ensayo utilizando cisplatino (20 µM) y β-amiloide
(10 µM) como agentes de daño y determinamos UDS 12 horas postratamiento. Las células
transfectadas con p19 incorporaron significativamente mayor cantidad de 3H- timidina que
las células transfectadas con vector vacío para ambos tratamientos, indicando que existe
una reparación del DNA más eficiente. Bajo estas circunstancias, la expresión de p19
antisentido no afectó la respuesta celular basal frente a estos daños (Figura 26a).
Suponemos que el daño con cisplatino y β-amiloide no fue excesivo como para que la
ausencia de p19 represente una desventaja para la célula.
Estas evidencias, en conjunto, confirman la hipótesis de que p19 es una proteína que
participa de manera directa o indirecta en la reparación del DNA, independientemente del
agente genotóxico, mejorando la eficiencia de la respuesta celular frente al daño.
a
dpm/µg de proteína
500
400
**
**
0 horas
12 horas
300
200
100
b
β-amiloide
cis-platino
C
C
p19
p19
AS
l
ci
s
ci
s
ci +p
s+ 19
p1
9A
S
βA
βA
βA +p1
+p 9
19
AS
tro
co
n
co
nt
ro
l
ci
s
ci
s
ci +p
s+ 19
p1
9A
S
βA
βA
βA +p
+p 19
19
AS
0
C
p19
p19
AS
p19
β-tubulina
Figura 26. p19 aumenta la capacidad de las células SH-SY5Y de reparar el DNA genómico dañado con cisplatino o
con péptido beta-amiloide. En a y b, la metodología es similar a la empleada en la figura 25 excepto porque las células
resistentes luego de la transfección fueron tratadas con cisplatino 20 µM (cis) o péptido β-amiloide 10 µM (βA) por 12
horas. Las barras representan la media + e.s. de tres experimentos diferentes llevados a cabo por triplicado. El test de
Student fue utilizado para comparar muestras transfectadas con p19 o p19AS y tratadas con alguno de los agentes
genotóxicos, con muestras dañadas pero transfectadas con el vector vacío (*P<0,05).
67
Resultados
16- El arresto del ciclo celular no es suficiente para observar una reparación más
eficiente del DNA.
La respuesta primaria de la célula luego de la agresión por un genotóxico, consiste en el
arresto del ciclo de proliferación, mediante la activación de los “checkpoints”. Esto permite
a la célula ejecutar los programas de reparación del DNA dañado. Una hipótesis adecuada
para explicar nuestras observaciones acerca de la mayor eficiencia de la reparación causada
por p19, consiste en que su sobrexpresión, al igual que la de cualquier INK4, produce un
arresto en el ciclo celular, dando de este modo más tiempo para la reparación del DNA. De
acuerdo a esta hipótesis, el tratamiento de las células dañadas con una droga que arresta el
ciclo en fase G1 o la sobrexpresión de otra INK4, debería aumentar la reparación del DNA
en forma similar a la causada por p19.
Para contrastar esta hipótesis, determinamos la reparación del DNA, mediante el ensayo
de HCR, en células dañadas con UV y con sobrexpresión de p16INK4a, otra INK4 con
igual potencial de inhibición de CDK4/6, o tratadas con mimosina, una molécula que causa
arresto en G1/S a través de la disminución del pool intracelular de deoxirribonucleótidos
(Krude, 2000). Previamente, medimos incorporación de 3H-timidina para corroborar si
efectivamente, estos tratamientos provocan un arresto similar al de p19 (Figura 27).
Observamos que tanto p19 como p16 o mimosina produjeron una disminución de la
incorporación de 3H-timidina similar entre sí, y además, un arresto parecido al causado por
UV.
Sin embargo, y en oposición a lo observado con p19, ni la sobrexpresión de p16 ni el
tratamiento con mimosina modificaron significativamente la reparación del DNA
plasmídico determinado por el ensayo de HCR (Figura 28).
Estos resultados sugieren que el efecto reparador de p19 no estaría relacionado con su
capacidad de arrestar el ciclo en G1.
68
Resultados
dpm/ µg de proteína
200
150
100
50
0
control
p19
p16
mimosina
UV
Actividad CAT (unid. arbitrarias)
Figura 27. Mimosina y p16 provocan un arresto celular similar al producido por p19 y por UV. Células
BHK21 fueron transfectadas con 2µg del vector de expresión pBABEp16 ó pSG5p19 ó tratadas con mimosina
X µM ó con 8 mJ/cm2 de UV. Cuarenta y ocho horas luego de la transfeccón y 12 horas luego del
tratamiento con mimosina y con UV el medio fue reemplazado por uno conteniendo 1µCi/ml de 3H-timidina y
la incorporación en el DNA fue medida 12 horas más tarde. Las barras representan la media + e.s. de dos
experimentos llevados a cabo por triplicado.
3000
*
2000
1000
0
control
p16
control
p19
mimo
p16
Vector dañado
Figura 28. El arresto del ciclo celular no es suficiente para observar una reparación más eficiente del
DNA. Células BHK21 fueron transfectadas con 2 µg del plásmido pCMVCAT previamente irradiado o no, con
64 mJ/cm2 de UV y cotransfectadas con 2µg del pSG5p19 o pBABEp16 o tratadas con mimosina durante 12
horas. La expresión de CAT fue cuantificada 36 horas luego de la transfección. Las barras representan la
media +/- e.s. de dos experimentos llevados a cabo por triplicado. El test de Student fue utilizado para
comparar muestras cotransfectadas con p19 ó p16 ó tratadas con mimosina (mimo) y pCMVCAT dañado con
UV, con muestras transfectadas solamente con pCMVCAT dañado (*P<0,05).
69
Resultados
17- p19INK4d disminuye la apoptosis y mejora la habilidad de las células de
neuroblastoma de reparar el DNA dañado con UV independientemente de su
interacción con CDK4.
La proteína p19, como las otras INK4, detiene la progresión del ciclo mediante la unión
a CDK4 o CDK6 e inhibiendo la acción de la ciclina D (Roussel, 1999). Para verificar si la
interacción con CDK4 es necesaria para llevar a cabo los efectos observados sobre
apoptosis y reparación de DNA, realizamos ensayos de transfección coexpresando CDK4
salvaje o una versión mutada CDK4R24C, junto con p19. La quinasa CDK4R24C, tiene
una mutación puntual que reemplaza el aminoácido arginina 24 por cisteína en el primer
exón codificante y que determina que esta variante tenga actividad quinasa normal pero
que no una las proteínas INK4. Por lo tanto, no es inhibida por ellas (Sotillo et al., 2001).
Pensamos que si p19 ejerciera su rol sobre reparación y apoptosis asociada con CDK4, la
sobrexpresión combinada de p19 y CDK4 salvaje debería aumentar estos efectos, mientras
que la sobrexpresión de una mutante CDK4, deficiente en la unión a INK4, debería
atenuarlos. Por el contrario, si p19 ejerciera su efecto de manera independiente de CDK4,
el aumento en la reparación del DNA y la disminución de la apoptosis observadas con la
sobrexpresión de p19 deberían estar atenuados en presencia de CDK4 y no modificarse en
presencia de CDK4R24C. Los resultados están graficados en la figura 29. La
sobrexpresión de CDK4 salvaje potenció la inducción de caspasa-3 mediada por UV. Esta
potenciación fue aún mayor en células que sobrexpresaban la mutante CDK4R24C. Luego
analizamos la expresión combinada de p19 y CDK4 en células irradiadas con UV.
Llamativamente, la inducción de la actividad de caspasa-3 en respuesta a la radiación UV
en células que sobrexpresan p19 fue totalmente diferente dependiendo del contexto de
CDK4. La coexpresión de p19 en células sobrexpresando CDK4 salvaje no modificó la
actividad de caspasa-3 según lo evaluado por la relación (UV+ CDK4wt+ p19)/( UV+
CDK4wt) = 0,96. Por el contrario, en un contexto de sobrexpresión de CDK4R24C p19
causó una importante reducción en la actividad de caspasa-3 inducida por UV (UV+
CDK4R24C+ p19)/( UV+ CDK4R24C) = 0,38 (Figura 29a).
Así mismo, decidimos estudiar el efecto de CDK4 salvaje o mutante R24C sobre la
habilidad de reparación del DNA de las células SHSY-5Y irradiadas con UV y con el nivel
de p19 endógeno o sobrexpresado. Llevamos a cabo ensayos de UDS en células crecidas
en paralelo a las utilizadas para medir actividad caspasa. Como podemos ver en la figura
29b, la habilidad de p19 de aumentar la reparación del DNA genómico, se vio disminuida
70
Resultados
en las células que sobrexpresaban la quinasa CDK4 salvaje (UV+ CDK4 wt+ p19)/( UV+
CDK4 wt)
a
) 1400
%
(
1200
y
ti
v
it 1000
c
a 800
3
e 600
s
a
p 400
s
a
c 200
Actividad caspasa-3 (%)
basal
UV
0
b
*
l
ro
ntne
cono
4
4
ol
4
4C
4CC
4C
tre
24C
D4Kwt R2 24C onon
D4Kwt
4 CD4Kw1t9
R42C
R
CK
C
2
2
2
c
4
4
4
n
Kp 9 4
K
R 9
K 4R
KR R
CD CDD
DK +pp119
K
CD DCKDD4K4
CD ++p1 D
CK
+
C
CC
C
- UV
b
300
+ UV
*
basal
UV
dpm/ µg de proteína
in 250
e
t
o
r 200
p
g
m150
/
m
p 100
d
50
l
4t
4t
C
ol
4 t
ro
4C C
4C
24 4C ontrone
4C
22
nt ne DK4w
D4Kw R2 24 DK4w9
RR
CK
co no CDK K4R4R2
c n
C
4
1
K
4
R
9
p 1 K 4 19 19
K
4
D
D
K
+
C
C CD DK
C +p CDDK+p+p
CDCD
C
C
- UV
c
+ UV
C
C 9
C
24
24 p1 24
R
R
R
+
or K4 K4
or K4 K4 K4 K4 p19
ct
ct
D D
D D D D +
e
e
C C
v
C C C
v
C
UV
CDK4
p19
β-tubulin
β-tubulina
-
+
Figura 29. p19 ejerce su efecto
independientemente
de
su
interacción con CDK4. Células
SH-SY5Y fueron transfectadas
con 2 µg de pSG5p19 y
cotransfectadas o no, con 2 µg
del vector de expresión de CDK4
wt ó mutante CDK4(R24C) junto
con 0.5 µg de puroBABE. a) Las
células resistentes a puromicina
fueron irradiadas con 8 mJ/cm 2
de UV. La actividad de caspasa-3
se determinó en los lisados
celulares inmediatamente y 24
horas luego de la irradiación. Los
resultados están expresados
como porcentaje de actividad de
caspasa-3 con respecto a la
actividad
basal
de
lisados
celulares sin transfectar y sin
tratar con UV que fue seteado en
100. Las barras representan la
media
+/e.s.
de
tres
experimentos llevados a cabo por
duplicado. El test de Student fue
utilizado para comparar muestras
transfectadas con una versión de
CDK4 y p19, con muestras
transfectadas con la respectiva
CDK4 sola (P< 0,05). b) Luego
de la transfección las células se
incubaron por otras 60 horas en
medio libre de arginina, con
suero
fetal
bovino 1%
y
puromicina.
Las
células
resistentes fueron irradiadas con
8 mJ/cm 2 de UV e incubadas
con 10 µCi [3H] timidina
durante 12 horas y luego se
cuantificó la incorporación de
timidina
en
los
lisados
celulares.
Las
barras
representan la media +/- e.s.
de
tres
experimentos
diferentes llevados a cabo por
duplicado. El test de Student
fue utilizado para comparar
muestras transfectadas con
una versión de CDK4 y p19, con
muestras transfectadas con la
respectiva CDK4 sola (P< 0,05).
c) Veinte µg de
RNA total
extraído de células tratadas
como en a) fue sujeto a Northern
blot con una sonda marcada con
32P específica para p19 humana
y rehibridizado para CDK4 y βtubulina. La figura muestra una
autorradiografía
representativa
de
tres
experimentos
independientes con resultados
similares.
71
Resultados
= 0,78. Sin embargo, la síntesis de DNA asociada al daño con UV aumentó dos veces al
coexpresar p19 en las células que sobrexpresaban la mutante CDK4R24C, incapaz de unir
este CKI (UV+ CDK4R24C+ p19/UV+ CDK4R24C =2.08). La correcta expresión de los
vectores transfectados fue verificada mediante northern blot (Figura 29c).
Estos resultados indican que CDK4 salvaje, pero no la mutante CDK4R24C, impide que
p19 mejore la reparación inducida por UV y reduzca la apoptosis, y sugieren que p19
ejerce los mencionados efectos de manera independiente de CDK4.
18- p19 ejerce su efecto sobre reparación y apoptosis de un modo independiente de
retinoblastoma y de p53.
Con el objeto de verificar la hipótesis anterior, llevamos a cabo experimentos en la línea
celular Saos-2, deficiente en la proteína retinoblastoma (Rb) (Fogh and Tempre, 1975).
Varios autores han confirmado que la sobrexpresión de proteínas INK4 arresta el ciclo
celular en fase G1 dependiendo de la integridad de Rb (Guan et al., 1996; Lukas et al.,
1996; Sherr and Roberts, 1999). Por lo tanto, en esta línea celular derivada de
osteosarcoma humano, la sobrexpresión de cualquier INK4, incluyendo a p19, no causaría
un arresto en G1 tal como lo hace en células con Rb salvaje (p.e. SH-SY5Y). La idea, al
realizar este experimento, fue tratar de dilucidar si p19 era capaz de mejorar la reparación
del DNA dañado con UV y disminuir la apoptosis en células carentes de Rb, como las
Saos-2. En caso afirmativo, esto indicaría una disociación entre estas funciones nuevas de
p19 y aquellas ya descriptas relacionadas con la inhibición de CDK4/6. Los resultados de
estos ensayos muestran que la actividad de caspasa-3 fue reducida en células Saos- 2
sobrexpresando p19, mientras que se observó un incremento significativo en las células
transfectadas con p19 antisentido (Figura 30a). Además, la habilidad de reparar el DNA
dañado con UV de las células Saos-2 fue notablemente mejorada por la sobrexpresión de
p19, mientras que esta capacidad de reparación fue parcialmente impedida en células
deficientes en p19 (Figura 30b).
Los resultados mencionados demuestran que, luego del daño en el DNA, p19 tiene un
efecto muy similar en ambas líneas celulares, SH-SY5Y (Rb positivas) y Saos-2
(deficientes en Rb).
A continuación, evaluamos el efecto de p19 sobre la proliferación celular tanto en SHSY5Y como en Saos-2. Los ensayos de incorporación de 3H-timidina mostraron que, al
igual que lo observado previamente, la proliferación celular en SH-SY5Y fue
72
Resultados
significativamente disminuída al sobrexpresar p19 (Figura 30d). Por el contrario, p19 fue
incapaz de causar el arresto en fase G1 cuando fue sobrexpresada en células Saos-2 (Figura
30c). Sin embargo, la entrada en fase S tanto en células Saos-2, como en SH-SY5Y fue
bloqueada al incubarlas con mimosina.
La línea celular Saos-2 también es deficiente en la proteína supresora tumoral p53. Por
lo tanto, estos resultados nos hacen suponer que la acción de p19, también sería
independiente de p53. Son necesarios más experimentos para confirmar este indicio, y para
responder una gran cantidad de preguntas que se presentan con estos nuevos hallazgos. En
el presente trabajo no vamos a profundizar en el estudio de la relación de p19 y p53.
a
*
Actividad caspasa-3 (%)
UV
UV+p19
1000
UV+ASp19
*
500
dpm/mg de proteína
b
control
none
control
1500
150
UV
100
UV+p19
0
50
0
24
12
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
control
none
UV
p19
mimosine
200
100
*
*
*
0
dpm/mg de proteína
d
300
dpm/mg de proteína
c
*
UV+AS p19
0
0
*
control
none
200
*
control
none
UV
p19
mimosine
150
*
100
50
0
0
8
16
Tiempo (horas)
24
0
8
16
24
Tiempo (horas)
Figura 30. Efecto de p19 en células Saos-2, deficientes en Rb y p53. a) Células Saos-2 fueron cotransfectadas con 2 µg del
vector de expresión que contiene el cDNA sentido (pSG5p19) o antisentido (pSG5p19AS) o el vector vacío con 0,5 µg del
vector puroBABE. Las células resistentes a puromicina fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 de UV. Inmediatamente y 24 horas
luego de la
irradiación, la actividad de caspasa-3 fue testeada en los lisados celulares. b) Células Saos-2 fueron
cotransfectadas con el vector de expresión que contiene el cDNA sentido (p19) o antisentido (p19AS) o el vector vacío con el
vector puroBABE. Lisados celulares fueron sometidos al ensayo de UDS como está descripto en la figura 25. En a y b, las
barras representan la media +/- e.s. de tres experimentos independientes llevados a cabo por duplicado. El test de Student fue
utilizado para comparar muestras transfectadas con p19 o p19 AS y tratadas con UV, con muestras tratadas con UV pero
transfectadas con el vector vacío (*P<0,05). c) Células Saos-2 ó d) SH-SY5Y fueron transfectadas con 0,5 µg de pBABEpuro y
con 2 µg del vector pSG5p19 según está indicado y seleccionadas con puromicina 36 horas y en este instante fueron tratadas
con mimosina 500 mM e incubadas por otras 24 horas en presencia de puromicina. Las células resistentes fueron irradiadas
con 8 mJ/cm2. Los cultivos fueron incubados con 1 µCi [3H] timidina y la incorporación del nucleótido fue medida a diferentes
tiempos. Las barras representan la media +/- e.s. de tres experimentos. El test de student fue utilizado para comparar las
muestras transfectadas con las basales en el punto de tiempo correspondiente (*P<0.05).
73
Resultados
En conjunto estos resultados demuestran que, el mecanismo mediante el cual p19
mejora la reparación del DNA y disminuye la apoptosis disparada por UV, es
independiente de su rol como regulador del ciclo celular.
19- Relación causal entre el aumento en la reparación del DNA y la disminución de la
apoptosis en células tratadas con UV y que sobrexpresan p19INK4d.
El siguiente objetivo fue analizar si existe alguna relación entre los efectos de p19 sobre
reparación de DNA y apoptosis. Para ello llevamos a cabo ensayos de UDS y de caspasa-3
en células de neuroblastoma tratadas con UV, en presencia de F11782, un inhibidor del
mecanismo de reparación NER (Barret et al., 2002). Este inhibidor bloquea la actividad
endonucleasa de los complejos ERCC1/XPF o ERCC1/XPG. Los resultados obtenidos del
ensayo UDS mostraron nuevamente, que en células SH-SY5Y sobrexpresando p19, la
reparación del DNA luego del tratamiento con UV estaba aumentada. Además, el
tratamiento con F11782 fue efectivo para inhibir el mecanismo NER ya que la síntesis de
DNA asociada al daño fue indistinguible de la síntesis en las células no irradiadas (Figura
31a). Luego determinamos la actividad de caspasa-3 en células SH-SY5Y en presencia o
ausencia de F11782. Las células irradiadas con UV e incubadas en ausencia del inhibidor
de NER mostraron una elevada actividad de caspasa-3 que fue disminuida parcialmente
con la sobrexpresión de p19. Notablemente, la inducción de caspasa-3 por UV fue mayor
en presencia de F11782, y en este caso, p19 fue incapaz de atenuarla (Figura 31b).
A continuación, repetimos estos ensayos reemplazando el inhibidor de NER por un
inhibidor general de caspasas, el zVAD-fmk a una concentración de 20 µM. En este caso,
las células transfectadas con las distintas construcciones fueron tratadas durante 1 hora con
el inhibidor de caspasas antes de ser irradiadas con UV. Los resultados de UDS
demuestran que la reparación no estuvo afectada a pesar de la presencia del inhibidor de
apoptosis y confirman que las células transfectadas con p19 son más eficientes para
responder frente al daño con UV (Figura 32a). Por otro lado, comprobamos que la
actividad de caspasa-3 fue prácticamente anulada bajo el efecto del inhibidor zVAD-fmk,
con un nivel similar al basal (Figura 32b).
Por lo tanto, el conjunto de los resultados señala a la reparación del DNA como el
blanco de acción principal de p19, y sugieren que la disminución de la apoptosis sería una
consecuencia de esa reparación.
74
Resultados
a
160
dpm/ µg de proteína
140
*
Control
UV
UV + p19
120
100
80
F11782
60
F11782
40
20
0
0 horas
12 horas
b
Actividad caspasa-3 (%)
1200
1000
Control
UV
UV + p19
F11782
800
600
400
F11782
*
200
0
0 horas
24 horas
Figura 31. Relación entre el aumento en la reparación del DNA y la disminución de la apoptosis en
células irradiadas con UV y que soobrexpresan p19. Células SH-SY5Y fueron cotransfectadas con 2 µg del
vector de expresión que contiene el cDNA de p19 o el vector vacío con 0,5 µg del vector puroBABE. a) Veinticuatro horas
luego de la transfección el medio fue sustituído por medio libre de arginina conteniendo suero fetal bovino 1% y las células
fueron incubadas con puromicina por otras 60 h. Las células resistentes fueron tratadas con el inhibidor de NER F11782
50 µM durante 30 minutos y fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 UV . Las células fueron incubadas con 10 µCi [3H] timidina e
inmediatamente y 12 horas más tarde se cuantificó la incorporación de timidina en los lisados celulares (UDS). b)
Veinticuatro horas luego de la transfección el medio fue reemplazado por medio fresco y las células fueron incubadas con
puromicina por otras 60 h. Las células resistentes fueron tratadas con el inhibidor de NER F11782 50 µM durante 30
minutos y luego fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 UV. La actividad de caspasa-3 fue testeada en los lisados celulares
inmediatamente y 24 horas más tarde. El resultado está expresado como porcentaje de la actividad de caspasa-3 con
respecto a la actividad basal de los lisados transfectados con el vector vacío y sin tratamiento con UV, medido a la hora o,
y que fue seteado en 100. Las barras representan la media +/- e.s. de tres experimentos diferentes llevados a cabo por
duplicado. El test de Student fue utilizado para comparar muestras transfectadas con p19 y tratadas con UV, con muestras
tratadas con UV pero transfectadas con el vector vacío (*P<0,05).
75
Resultados
a
350
dpm/ µg de proteína
Control
300
Inh VI
UV
UV + p19
250
200
150
100
Inh VI
50
0
0 horas
12 horas
b
Actividad caspasa-3 (%)
1000
800
Control
UV
UV + p19
600
400
200
Inh VI
Inh VI
0
0 horas
24 horas
Figura 32. Relación entre el aumento en la reparación del DNA y la disminución de la apoptosis en células
irradiadas con UV y que sobrexpresan p19. Células SH-SY5Y fueron cotransfectadas con 2 µg del vector de expresión
que contiene el cDNA de p19 o el vector vacío con 0,5 µg del vector puroBABE. a) Veinticuatro horas luego de la
transfección el medio fue sustituído por medio libre de arginina conteniendo suero fetal bovino 1% y las células fueron
incubadas con puromicina por otras 60 h. Las células resistentes fueron tratadas con el inhibidor pancaspásico 20 µM
durante 30 minutos y fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 UV . Las células fueron incubadas con 10 µCi [3H] timidina e
inmediatamente y 12 horas más tarde se cuantificó la incorporación de timidina en los lisados celulares (UDS). b)
Veinticuatro horas luego de la transfección el medio fue reemplazado por medio fresco y las células fueron incubadas con
puromicina por otras 60 h. Las células resistentes fueron tratadas con el inhibidor pancaspásico 20 µM durante 30 minutos
y luego fueron irradiadas con 8 mJ/cm2 UV. La actividad de caspasa-3 fue testeada en los lisados celulares
inmediatamente y 24 horas más tarde. El resultado está expresado como porcentaje de la actividad de caspasa-3 con
respecto a la actividad basal de los lisados transfectados con el vector vacío y sin tratamiento con UV, medido a la hora o,
y al que se le dio el valor de 100. Las barras representan la media +/- e.s. de tres experimentos diferentes llevados a cabo
por duplicado. El test de Student fue utilizado para comparar muestras transfectadas con p19 y tratadas con UV, con
muestras tratadas con UV pero transfectadas con el vector vacío (*P<0,05).
76
Resultados
20- La presencia de moléculas de DNA dañadas con UV no es suficiente para inducir
p19INK4d.
Se sabe, por ejemplo que p21, inhibidor de CDKs de la familia Cip/Kip y regulado
predominantemente por p53 frente al estrés celular, se induce a nivel transcripcional luego
de la irradiación con UV, IR o hipoxia (O'Reilly, 2005). A pesar de que ATM y ATR son
requeridas para activar p53 luego de IR, solamente se requiere de ATR para activar p53
luego del daño con UV (Siliciano et al., 1997; Tibbetts et al., 1999). Además, el mRNA de
p21 está aumentado en presencia de oligonucleótidos conteniendo dímeros de timidina
(Goukassian et al., 1999). O sea, que el daño propiamente dicho es una señal suficiente
para inducir este gen.
En base a estos antecedentes nos propusimos estudiar si la sola presencia de moléculas
de DNA dañadas es una señal suficiente para causar la inducción de p19. Para ello,
realizamos un ensayo de northern blot, luego de incubar y transfectar las células con un
oligonucleótido previamente irradiado con 64 mJ/cm2 de luz UV. Este fragmento posee en
su secuencia dos bases T consecutivas, lo que asegura que luego de la irradiación se
formarán dímeros de timidina, fotolesiones que deben ser reconocidas por el NER y por las
proteínas sensoras que incian los checkpoints. Paralelamente, otras muestras fueron
transfectadas con un plásmido dañado con 64 mJ/cm2 de luz UV o irradiadas directamente
con 8 mJ/cm2 de UV. Los resultados indican que las células incubadas con el
oligonucleótido irradiado, o transfectadas con el plásmido dañado, o bien irradiadas
directamente presentan una notable inducción del mRNA de p21. Sin embargo, p19
solamente se indujo transcripcionalmente luego de que las células habían sido irradiadas
(Figura 33). Además, es evidente que la cinética de inducción de p21 es más rápida,
observándose la acumulación del mensajero desde las 8 horas luego de los tratamientos; en
cambio el aumento de p19 es más lento siendo evidente desde las 16 horas.
Este resultado tiene dos posibles explicaciones: la primera, es que p19 requiera más de
una señal para inducirse luego del daño con UV, por ejemplo otras señales extracelulares
y/o activación de cascadas de transducción además de las lesiones propiamente dichas
sobre las moléculas de DNA. La segunda, es que la cantidad de moléculas dañadas, ya sean
de oligonucleótido o de plásmido, que hayan entrado en las células no sean suficientes para
disparar la respuesta de inducción. Si esto es así, el umbral de daño para la inducción de
p19 sería mayor que el de p21, y podría tratarse de un segundo mecanismo que se active
cuando el daño es excesivo y como reaseguro de la reparación del DNA. La dosis de UV
77
Resultados
aplicada a las células es bastante elevada, y en este caso p19 se induce, lo que estaría en
concordancia con la última suposición (Figura 33). Por otro lado, como observamos en
experimentos anteriores, p19 se induce luego del tratamiento con cisplatino, agente que se
intercala y daña directamente el DNA. Este hecho es llamativo, reforzando la segunda
hipótesis de que p19 podría inducirse por la sola presencia de lesiones en el DNA. Son
necesarios más experimentos para poder responder este interrogante, sin embargo, los
mismos exceden la extensión de este trabajo.
control
Horas
0
8
16
ON dTT
24
0
0
8
16
24
16
24
plásmido
UV (8 mJ/cm2)
Horas
8
ON dTT + UV
0
8
16
0
8
16
24
plásmido + UV
24
0
8
16
24
Figura 33. El daño en el DNA no es suficiente para inducir transcripcionalmente a p19. Células BHK21
fueron irradiadas o no, con 8mJ/cm2 de UVC luego de tratarlas con actinomicina D 1 µM durante 3 horas y
cosechadas en los tiempos indicados luego de la irradiación. Veinte µg de RNA total fue sujeto a Northern
blot utilizando una sonda específica para p19 humana. La membrana fue rehibridizada para β-tubulina como
control de siembra. La figura muestra el resultado de un experimento de dos realizados en forma
independiente.
78
Resultados
21- La sobrexpresión de p19INK4d confiere mayor resistencia a distintos agentes
genotóxicos.
Por último, deseamos verificar si la expresión aumentada o disminuída de p19 tiene
alguna significancia biológica o juega un rol funcional en la respuesta celular al
tratamiento con genotóxicos. En primer lugar, examinamos la supervivencia celular en
clones de células BHK21 establemente transfectadas con el vector pMTCBp19
(BHK21p19), o pMTCBp19AS (BHK21p19AS), que contienen el cDNA de p19 o la
versión invertida del mismo, respectivamente, bajo el promotor inducible por zinc de la
enzima metalotioneína, o el vector vacío (BHK21v). Estos clones celulares fueron
obtenidos en nuestro laboratorio. Debido a que la sobrexpresión de p19 arresta las células
en fase G1, para evitar este efecto antiproliferativo de p19, indujimos el promotor de
metalotioneína, únicamente 6 horas antes y durante las 24 horas posteriores al tratamiento
con distintos agentes genotóxicos. Luego estimamos la supervivencia celular mediante el
ensayo de reducción de MTT en los siguientes 5 días.
a
Figura 34. p19INK4d incrementa la supervivencia de
las células con daño genómico.La viabilidad celular fue
determinada con el ensayo de MTT. Clones celulares
BHK21 transfectados en forma estable con p19 sentido
(p19) o p19 antisentido (p19AS) bajo el promotor de
metalotioneína (MT), o con el vector vacío fueron tratados
en (a) con ZnCl2 por 30 horas o en (b) tratados con ZnCl2
durante 30 horas y péptido β-amiloide 10µM o cisplatino
20µM por 12 horas e incubados en medio completo
durante 6 días . El medio fue reemplazado por medio
conteniendo MTT (3- [4,5- dimethylthiazol-2-yl]- 2,5
diphenyltetrazolium bromide, 1 mg/ml) y las células fueron
incubadas durante 4 horas a 37ºC. Luego, el medio fue
reemplazado por 500 µl de isopropanol. La absorbancia en
el solvente fue determinada a 440 nm. Cada punto
representa la media + d.s. de 2 experimentos diferentes
llevados a cabo por sextuplicado. El análisis estadístico se
realizó con el test de Student (*P<0,05).
Actividad metabólica (Abs 440nm)
900
800
700
600
500
400
200
wt
wt + Zn+
p19 + Zn+
100
p19AS + Zn+
300
0
0
1
2
3
4
5
6
7
días
2000
cisplatino
Actividad metabólica (Abs440nm)
Actividad metabólica (Abs440nm)
b
*
1600
1200
800
400
0
0
1
2
3
4
5
6
7
p19
*
1600
1200
800
400
0
0
días
WT
β-amiloide
2000
1
2
3
días
4
5
6
7
p19AS
79
Resultados
El ensayo control sin agentes genotóxicos muestra que el ZnSO4 no tiene efecto sobre
la proliferación celular (Figura 34 a). En los clones estables, observamos diferencias
significativas en la habilidad de las células BHK21p19 o BHK21p19AS, con respecto a
las células control para reducir MTT; esto correlaciona con la diferencia inicial en el nivel
de p19. En la figura 34 b, vemos que luego de 6 días las células BHK21p19 tienen un
crecimiento celular mayor (37 % y 39%) luego de los tratamientos con cisplatino (20 µM)
o β-amiloide (10µM), respectivamente, comparado con la línea clonal BHK21v. Por el
contrario, las células BHK21p19AS fueron más sensibles frente a sendos daños
genotóxicos (45% y 42%) que el clon con vector vacío. Este efecto protector de p19 se
torna aún más relevante si consideramos que inicialmente las tres líneas celulares poseían
distintos potenciales proliferativos (Figura 34 b).
En segundo lugar y con el objetivo de analizar el efecto a largo plazo y la relevancia
fisiológica de p19 en la supervivencia celular, realizamos ensayos clonogénicos. No
observamos diferencias sinificativas en las células tratadas solamente con ZnSO4
indicando que todas las líneas poseen una capacidad similar para formar colonias a pesar
de la variación en la tasa de proliferación incial (Figura 35). Como era esperable, tanto el
tratamiento con cisplatino como con β-amiloide tienen alta citotoxicidad en todas las líneas
celulares ensayadas. Sin embargo, las curvas de dosis-respuesta son diferentes
dependiendo del nivel de p19 expresado para cada tipo celular. Hallamos que el 31% de
las colonias de BHK21v sobrevivieron con 20 µM de cisplatino, mientras que el 50% de
las colonias BHK21p19 permanecieron vivas con la misma dosis. En este ensayo no
hallamos diferencias significativas entre BHK21v y BHK21p19AS. Las células tratadas
con β-amiloide demostraron estar más protegidas cuando sobrexpresaban p19, ya que el
51% de BHK21p19 formó colonias, mientras que sólo el 29% de las BHK21v y el 14% de
las BHK21p19AS lo hizo (para 20 µM). En este caso también hay diferencias
significativas para BHK21p19AS con respecto a las células con el vector vacío (Figura
35). Estos resultados concuerdan con los obtenidos previamente en el laboratorio para el
tratamiento con UV (Scassa et al., 2007).
Podemos decir entonces, que p19 influencia la sensibilidad celular frente a distintos
agentes de daño y confiere una notable resistencia al estrés genotóxico.
80
Resultados
120
wt
p19
Colonias viables (%)
100
p19AS
80
60
40
20
0
0 µM
mM
µM
55µM
10µM
mM
10
µM
20 µM
mM
µM
20
40 mM
µM
[cis -platino]
120
Colonias viables (%)
wt
p19
100
p19AS
80
60
40
20
0
0 µM
55 µM
mM
10
µM
10 mM
20
20 µM
mM
50 mM
µM
50
[β- amiloide]
Figura 35. p19INK4d promueve la supervivencia celular frente al daño con los agentes genotóxicos
cisplatino y péptido β-amiloide. Ensayo clonogénico. Células BHK21 provenientes de clones transfectados
en forma estable con p19 sentido (p19) o p19 antisentido (p19AS) bajo el promotor de metalotioneína (MT),
fueron sembradas a razón de 1500 células /placa de 10 cm de diámetro. Luego de inducir el promotor de MT
durante 6 horas con 75 mM ZnCl2, las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de cisplatino
o péptido β-amiloide durante 12 horas e incubadas en medio completo durante 6 días. Luego se procedió a
cuantificar los clones supervivientes. Las colonias que contenían más de 50 células fueron consideradas
como derivadas de células clonogénicamente activas.
81
DISCUSIÓN
Discusión
La inestabilidad genética, causa primordial de la tumorigénesis, es alimentada por
daños en el DNA y por los errores cometidos durante la replicación del mismo. La
maquinaria del ciclo celular detecta de alguna manera la lesión genómica y arresta la célula
en checkpoints específicos de G1, S, G2 y M para permitir la reparación de las lesiones
antes de que sean convertidas en mutaciones permanentes (Hoeijmakers, 2001; Sandal,
2002). Cuando el daño es muy significativo, una célula puede optar por el último modo de
rescate iniciando el programa apoptótico a expensas de la pérdida de una célula (Hahn and
Weinberg, 2002; Martin et al., 2003). En los últimos años se ha delineado la hipótesis de
que frente al daño en el DNA, la célula organiza una respuesta integrada, no solamente
mediante los mecanismos clásicos de reparación, sino involucrando también mecanismos
de replicación, transcripción, dinámica de la estructura de la cromatina, progresión del
ciclo celular y apoptosis. En el contexto de esta nueva visión del control de la estabilidad
genómica, nosotros proponemos que, además de su rol en la inhibición del ciclo celular,
p19 está involucrada en el mantenimiento de la integridad del DNA.
El presente trabajo tuvo dos objetivos principales. El primero fue analizar el rol
potencial de p19 en la respuesta celular al daño en el DNA. El segundo, estudiar la
habilidad de p19 de mejorar la capacidad de las células de reparar el DNA dañado con UV
y con otros agentes genotóxicos. Para llevar acabo estos objetivos, utilizamos la línea
celular de neuroblastoma SH-SY5Y, que expresa p19. Tal como fue reportado por otros
autores para otros tipos celulares (Hirai et al, 1995; Guan et al, 1996), el mRNA y la
proteína p19 presentan una expresión periódica durante el ciclo celular de SH-SY5Y. Esta
característica de p19 parece ser distintiva de las otras proteínas INK4. Su expresión es baja
en G0/G1 y tiene un pico al final de G1 y en fase S. La periodicidad de la proteína p19
durante el ciclo celular está regulada en parte por el mecanismo de degradación
dependiente de ubiquitina/proteasoma permitiendo que la abundancia de la proteína siga
los cambios en la expresión del mensajero (Thullberg et al., 2000). Sin embargo, los
mecanismos que determinan la expresión cíclica del gen de p19 aún permanecen
desconocidos.
Nosotros hallamos que la exposición de células de neuroblastoma a la irradiación UV
induce cambios en el estado celular de p19 incluyendo activación transcripcional y
translocación nuclear. Luego de 24 horas desde la irradiación, los niveles del mRNA y de
la proteína p19 aumentaron significativamente. Esta regulación positiva de p19 parece ser
un fenómeno general ya que fue observado en todas las líneas celulares estudiadas,
incluyendo células HeLa, que en estado basal no expresan niveles detectables de p19 (Hirai
83
Discusión
et al, 1995). Este aumento no podría deberse solamente al incremento de células en fase G1
que se observa luego de la irradiación, ya que existe una inducción del mRNA de p19 que
es de 4 a 5 veces con respecto al nivel basal.
Otros autores han reportado que, en respuesta a la irradiación UV, el nivel de p16
aumenta en células de cáncer de cérvix HeLa y en células de melanoma A2058 (Milligan
et al., 1998). Sin embargo, nosotros no detectamos cambios mediados por UV en la
expresión de las otras INK4. Una explicación molecular posible para este comportamiento
diferente podría recaer en la especificidad de tejido de la expresión de las INK4 (Zindy et
al., 1997a). Más aún, se sabe que su transcripción responde diferencialmente a diversos
estímulos. La inducción de p15INK4b en respuesta a TGFβ, la regulación positiva de
p16INK4a que sigue a ciertos estímulos oncogénicos, o la expresión aumentada de
p18INK4c asociada con la acción antiproliferante de interleuquina-6, son otros ejemplos de
esta regulación de la transcripción diferencial (Serrano, 1997; Ruas y Peters, 1998). En este
aspecto, la expresión de p19 comenzó a ser estudiada recientemente y está reportada la
regulación mediante el factor de transcripción Sp1 y mediante inhibidores de deacetilasas
de histonas (Matsuzaki et al., 2002; Yokota et al., 2004a; Yokota et al., 2004b). El análisis
in silico de la región 5´ regulatoria proximal del gen de p19 reveló un sitio de unión de alta
homología para el factor de tanscripción NF-κB. Además, observamos que fibroblastos
transfectados con RelA tienen el nivel del mRNA de p19 elevado (datos no publicados).
NF-κB es un gen de respuesta temprana inmediata involucrado en la modulación de la
respuesta celular, incluyendo la apoptosis siguiente a diversos daños ambientales (Fan et
al., 2002; Wu et al., 2004). Estímulos activadores comunes, como lipopolisacáridos,
hipoxia, o UV inducen la translocación al núcleo luego de su activación y podría explicar
la inducción de p19 mediada por UV. Análisis in silico adicionales, revelaron la presencia
de sitios con alta homología para la unión de E2F. Además, fibroblastos humanos que
sobrexpresan transitoriamente E2F1 muestran un aumento en el mRNA de p19 (datos no
publicados). Se ha demostrado que la proteína E2F1 es inducida por varios agentes que
dañan el DNA incluyendo UV y drogas quimioterápicas. Esta inducción es rápida y
dependiente de la actividad quinasa ATM/ATR que específicamente fosforila E2F1
promoviendo la estabilidad de la proteína (Lin et al., 2001; Stevens and La Thangue,
2004). Esta acumulación de E2F1 podría ser crítica para la inducción de p19 en respuesta a
UV.
Hemos observado que la inducción de p19 es una respuesta amplia frente al daño en el
DNA, ya que también se produce luego del tratamiento con otros agentes genotóxicos,
84
Discusión
como cisplatino y péptido β-amiloide. El daño causado por cada uno de estos agentes es
reparado por distintos mecanismos; NER repara principalmente el daño generado por
cisplatino y UV, mientras que BER y HR reparan las lesiones derivadas de la presencia de
β-amiloide. Estos hechos nos permiten postular una atractiva hipótesis acerca del papel
central que podría desempeñar p19 actuando como nexo entre varias vías de reparación
activadas frente a distintos tipos de daño. Esta hipótesis es actualmente evaluada en nuestro
laboratorio.
Mediante ensayos de northern con actinomicina D, marcación metabólica de la proteína
con
35
S-metionina y run-on determinamos que, luego de tratar las células con UV o
péptido β-amiloide, la estabilidad del mRNA de p19 no es afectada, ni tampoco la de la
proteína. Sin embargo, la tasa de inicio de la transcripción aumenta considerablemente
luego de ambos tratamientos, y esta sería la causa de la acumulación de p19 observada.
La distribución subcelular de p19 en SH-SY5Y fue examinada mediante microscopía de
inmunofluorescencia indirecta. Estudios previos en otras líneas celulares (Guan et al.,
1996; Hirai et al., 1995), y los resultados presentados aquí, demuestran que p19 posee
localización citoplasmática. Nosotros determinamos que luego de la irradiación con luz
UV, p19 es translocada al núcleo con un máximo entre 36 y 48 horas. La importación de
proteínas al núcleo no es un proceso constitutivo, parece estar modulado por estímulos
externos, el ciclo celular, y el desarrollo. Una variedad de agentes genotóxicos afectan
varios aspectos de la fisiología celular, y la respuesta al estrés celular incluye la
translocación desde el citoplasma al núcleo de los factores responsables de la misma. Sin
embargo, la manera en que estos factores son translocados y cómo las vías de tanslocación
son reguladas en células con daño no está aclarada (Miyamoto et al., 2004).
El análisis de la secuencia de p19 en las bases de datos muestra que p19 no contiene la
señal de localización nuclear (NLS) estándar monopartita o bipartita encontrada en la
mayoría de las proteínas nucleares (Dingwall and Laskey, 1991). Aún sin tener una NLS
estándar conocida en su secuencia, no podemos descartar completamente la existencia de
una NLS no estándar.
Un mecanismo esencial de regulación de la localización subcelular involucra la
fosforilación directa de la proteína transportada (Lim et al., 2003; Mattaj and Englmeier,
1998). En este aspecto, p19 es la única INK4 capaz de ser fosforilada in vivo en dos
residuos serina conservados (Thullberg et al., 2000). Tales eventos de fosforilación en
residuos filogenéticamente conservados, surgen como un potencial y atractivo mecanismo
para controlar el transporte nuclear de la proteína p19.
85
Discusión
Los resultados obtenidos nos indujeron a considerar que p19 podría formar parte de un
mecanismo de señalización frente a estrés en mamíferos, iniciado en respuesta a agentes
que dañan el DNA. Por lo tanto, postulamos que p19 jugaría un rol importante en el
mantenimiento de la integridad del DNA. El presente trabajo provee fuertes evidencias de
que la apoptosis inducida por daño en el DNA (DDIA, por su sigla en inglés) en células de
neuroblastoma y en otras líneas celulares, está regulada negativamente por p19. Mediante
el análisis por citometría de flujo, demostramos que células SH-SY5Y que sobrexpresan
p19 son más resistentes a la apoptosis que sigue al tratamiento con luz UV, que aquellas
células que expresan el cDNA antisentido de p19 y por lo tanto poseen niveles
indetectables de p19. Estos resultados fueron avalados por aquellos obtenidos en los
ensayos de actividad de caspasa-3. Además, resultados similares fueron obtenidos con
cisplatino y péptido β-amiloide en ensayos de caspasa-3.
La apoptosis es la consecuencia de un programa de muerte celular determinado
genéticamente, que puede ser iniciado por diversos estímulos como la falta de factores de
crecimiento, señales a través de receptores apoptóticos, o señales de estrés celular. La
inducción de la apoptosis por agentes que dañan el DNA juega un rol central en la
eliminación de células alteradas genéticamente, contribuyendo a la inhibición del
desarrollo de un tumor (Johnstone et al., 2002; Norbury and Zhivotovsky, 2004). La
pérdida de la apoptosis, por otro lado, juega un rol principal en la tumorigénesis (Igney and
Krammer, 2002). Ha sido reportado recientemente que otra INK4, el supresor tumoral p16,
tiene un efecto protector similar frente a la apoptosis inducida por UV en células de
osteosarcoma. Los autores sugieren que p16 controla la apoptosis regulando negativamente
el nivel de la proteína proapoptótica Bax (Al-Mohanna et al., 2004).
Una hipótesis atractiva para explicar el efecto antiapoptótico de p19 involucra al
gen temprano Nurr77, el cual codifica para un receptor nuclear huérfano, que es
rápidamente inducido por varios estímulos de estrés, incluyendo el daño en el DNA.
Inicialmente, fue sugerido que la unión al DNA y la transactivación por Nurr77 podrían ser
requeridas para su efecto proapoptótico. Datos más recientes muestran que, si bien es una
proteína nuclear, Nurr77 es translocada al citosol en respuesta a genotóxicos donde está
implicada en la liberación del citocromo c mitcondrial (Norbury and Zhivotovsky, 2004;
Wilson et al., 2003). Se ha reportado que p19 puede interaccionar con Nurr77 en
hibridomas de células T (Chan et al., 1995; Ruas and Peters, 1998). Por lo tanto, la
inducción de p19 mediada por UV podría disminuir la apoptosis secuestrando Nurr77 y
bloqueando su efecto proapoptótico.
86
Discusión
Por otro lado, se ha observado que, tanto proteínas dominantes negativas de CDK4
y CDK6, como los CKIs p16 y p27 protegen neuronas corticales de apoptosis inducida por
el daño en el DNA, sugiriendo que las correspondientes CDKs endógenas estarían elevadas
en las neuronas apoptóticas debido a la expresión inducida de la ciclina D1 (Park et al.,
1998). En este caso p19 podría interactuar con CDK4 y 6 y bloquear su incrementada
actividad, contrarrestando las señales apoptóticas. Sin embargo, la inducción de la ciclina
D1 luego del daño al DNA parece no ser una respuesta totalmente generalizada ya que
otros autores han reportado un nivel de ciclina D1 disminuido en varias líneas celulares
que habían sido expuestas a una variedad de genotóxicos, incluyendo la luz UV (Shapiro et
al., 1998).
Finalmente, p19 podría ejercer su efecto directamente en la reparación del DNA,
aumentando la eficiencia de los mecanismos implicados en la remoción de los daños, y en
consecuencia, disminuir el número de células en las que se dispara la apoptosis.
Nuestros resultados apoyan fuertemente la última hipótesis, ya que la sobrexpresión
de p19 en células de neuroblastoma mejora la reparación del daño en el DNA inducido por
diversos agentes genotóxicos, y además, células transitoriamente carentes de p19 fueron
deficientes a la hora de contrarrestar el daño. Como hemos mencionado, NER es el
mecanismo de reparación del DNA responsable de la remoción de los aductos de DNA
producidos por la luz UV, cisplatino y por ciertos carcinógenos ambientales (Friedberg,
2001; Sancar et al., 2004). NER comprende dos vías: reparación acoplada a transcripción
(TCR), generalmente la más rápida de las dos y la cual remueve el daño en regiones
transcribibles del genoma; y la reparación genómica global (GGR), la cual elimina el daño
en el resto de la cromatina (Rubbi and Milner, 2003).
Nosotros medimos la capacidad de reparación del DNA de las células de
neuroblastoma, mediante el ensayo de UDS. Al respecto, los resultados sugieren que p19
actuaría sobre todo el DNA dañado, ya que la detección con UDS es apropiada para
cuantificar la síntesis por reparación luego del paso de escisión en todo el genoma de un
mamífero, más que en un locus específico.
Los experimentos llevados a cabo con el inhibidor de NER F11782 proveen
sustento adicional para considerar la reparación del DNA como el blanco de acción
principal del efecto de p19. F11782 es un nuevo inhibidor dual de las topoisomerasas I y II
que fue identificado como un potente inhibidor de NER, principalmente en el paso de
incisión, más que en el paso de síntesis reparativa (Barret et al., 2002). En tales
experimentos, la inhibición de NER causó un gran incremento en la apoptosis inducida por
87
Discusión
UV, aún en las células que sobrexpresan p19. Estos resultados son consistentes con un
modelo que proponga que p19 protege a las células de neuroblastoma de sufrir muerte
apoptótica como respuesta al daño con UV, permitiendo una reparación más eficiente del
daño en el DNA.
Estudios recientes realizados en ratones knock-out para p19, demostraron que la
falta de p19 incrementa la sensibilidad celular a la muerte apoptótica o autofágica y
sugieren un posible rol de la inducción de p19 en la quimioprevención (Tavera-Mendoza et
al., 2006a; Tavera-Mendoza et al., 2006b). Considerando su función como inhibidor del
ciclo celular, en conjunto, nuestros resultados sugieren que p19 podría por sí mismo, tener
un papel en la reparación del DNA, en los checkpoints del ciclo celular, o en la integración
de la apoptosis y la reparación.
Entonces, de qué manera p19 mejora la reparación del DNA luego del daño con
genotóxicos? Una explicación simple de estos hallazgos sería que, luego del daño, una
cantidad elevada de p19 se une a CDK4 y CDK6 arrestando las células en G1, lo cual a su
vez permitiría la reparación de la lesión de una forma más eficiente. Con respecto a esto,
p16 ha sido implicada en un checkpoint de arresto en G1 en respuesta al daño en el DNA
(Shapiro et al., 1998). Sin embargo, nuestros datos indican que este no es el mismo caso.
Los experimentos que utilizan CDK4 salvaje y mutante R24C demuestran que el
incremento en la reparación en las células que sobrexpresan p19 fue observado en
presencia de una CDK4 constitutivamente activa que no une p19. Por lo tanto, estos
resultados suponen un rol de p19 independiente de CDK4, no relacionado con su función
antiproliferativa. Los resultados obtenidos en células Saos-2, deficientes en Rb, otorgan un
aval adicional a esta interpretación. En estas células, así como en SH-SY5Y, la
sobrexpresión de p19 fue capaz de mejorar la reparación del DNA y disminuir la apoptosis.
Sin embargo, en células Saos-2 a diferencia de SH-SY5Y , p19 fue incapaz de detener la
proliferación celular. Estos datos sustentan la idea de que el rol de p19 como regulador del
ciclo celular está disociado de su función reparadora del DNA.
En humanos, dos sistemas son esenciales para mantener la integridad del genoma,
la reparación del DNA y la apoptosis. Células que son deficientes en reparar el DNA
tienden a acumular un exceso de daño. Células deficientes en apoptosis tienden a
sobrevivir con exceso de daño en el DNA, que no puede ser reparado en su totalidad,
causando mutaciones que llevan a la carcinogénesis.
Aparentemente, las proteínas clave que contribuyen a la supervivencia celular
actuando sobre la reparación del DNA se tornan ejecutoras en la fase de excesivo daño en
88
Discusión
el DNA. El mantenimiento de un mecanismo que permita a la célula alternar entre la
reparación y la apoptosis, como es apropiado en el caso de daño excesivo, parece tener
central importancia evitando la progresión hacia el cáncer. El mecanismo apoptótico basal
evita la expansión clonal de células en las cuales la acumulación del daño no reparado
llevaría a la mutación y a la carcinogénesis.
Por lo tanto, debe existir un compromiso entre la ventana de tiempo para permitir
una reparación apropiada y para disparar los mecanismos de muerte celular para evitar un
aumento en la carga de mutaciones que causan inestabilidad genómica (Bernstein et al.,
2002; Lengauer et al., 1998). Esto es particularmente cierto en neuronas postmitóticas del
sistema nervioso central, donde la muerte celular causa una pérdida irreemplazable.
Además, la muerte neuronal puede ocurrir anormalmente, en tiempo, causa o magnitud.
Esto tiene, obviamente particular importancia cuando concierne el sistema nervioso
humano,
donde
se
observa
una
muerte
celular
extensiva
en
enfermedades
neurodegenerativas o luego de una apoplejía o trauma cerebral (Connor and Dragunow,
1998; Yuan and Yankner, 2000).
En este escenario, la acción de proteínas que permitan una respuesta más robusta
frente al daño en el DNA, y en consecuencia impidan una apoptosis excesiva es altamente
deseable. La habilidad de p19 para mantener la integridad genómica se ajustaría a esta
premisa. El hecho de que el sistema nervioso central es un tejido donde p19 tiene una
expresión relativamente importante y que existe alto nivel de p19 en neuronas en
desarrollo y en neuronas postmitóticas adultas correlaciona directamente con esto.
Con ensayos clonogénicos y de supervivencia celular, observamos que p19
influencia la sensibilidad celular a largo plazo y confiere resistencia al estrés genotóxico.
En resumen, demostramos que como respuesta a la irradiación con UV y al
tratamiento con otros agentes genotóxicos, la expresión del gen de p19 es aumentada en
células de neuroblastoma y translocada al núcleo. El nivel de p19 elevado mejora la
reparación del DNA. Estos eventos van acompañados por la disminución de la apoptosis
inducida por genotóxicos, y en conjunto estos efectos promueven la supervivencia celular.
El trabajo describe un nuevo rol para p19, como colaborador de los mecanismos
implicados en el mantenimiento de la estabilidad genómica de una forma que es
independiente de su habilidad de inhibir CDK4 y 6. Proponemos que p19 pertenecería a
una red proteica que integraría la reparación del DNA, la apoptosis y los checkpoints para
mantener la integridad genómica. Si esto es así, la carencia de p19 funcional tendría claras
implicancias en el desarrollo de tumores, ya que una capacidad celular reducida de reparar
89
Discusión
el DNA podría resultar en una carga de mutaciones elevada que, en circunstancias
apropiadas, llevarían a la transformación neoplásica. Actualmente, estamos llevando a
cabo estudios para determinar el rol preciso de p19 en la reparación del DNA y los
mecanismos que regulan su expresión génica.
90
MATERIALES Y
MÉTODOS
Materiales y métodos
1- Cultivo de líneas celulares.
Medios de cultivo. La línea celular derivada de neuroblastoma humano SH-SY5Y
fue cultivada en botellas T 25 y T 75 (TRP) y mantenida en medio D-MEM (Dulbecco´s
modified Eagle medium) 45%, Ham F12 45% (GIBCO) conteniendo 10% de suero fetal
bovino (SFB), L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1
mM, bicarbonato de sodio 1,5 g/L, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml, a 37 ºC
y en atmósfera de aire con 5% de CO2. La línea celular fibroblástica BHK- 21 proveniente
de riñón de hamster (Mesocricetus auratus) y la línea derivada de osteosarcoma humano
Saos-2 fueron cultivadas en placas de 100 mm y mantenidas en medio D-MEM (GIBCO)
suplementado con 10% de SFB, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos
no esenciales 0,1 mM, bicarbonato de sodio 1,5 g/L, penicilina 100 U/ml, estreptomicina
100 µg/ml, a 37 ºC y en atmósfera de aire con 5% de CO2.
Tripsinización. Una vez que las células formaron una monocapa, el medio de cultivo
fue aspirado y descartado, las células se lavaron una vez con PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de
KCl, 1,44 g de Na2HPO4, y 0,24 g de KH2PO4 en 1 litro de agua bidestilada, pH 7,4) para
remover los inhibidores de tripsina presentes en el suero y luego se agregó a cada placa o
botella 1,5 ml de solución de tripsina 0,25%, EDTA 0,53 mM (GIBCO). Se incubaron a
temperatura ambiente (o a 37 °C) hasta observar en el microscopio que las células se
despegaron. Luego fueron resuspendidas en medio fresco, se determinó el número y la
viabilidad celular como se indica más abajo y se plaqueó a una densidad de 2,0 x 104
células/ cm2 en botellas T 25 o T 75 o en placas de 100 mm de diámetro.
Las células SH- SY5Y crecen como una mezcla de células adherentes y flotantes
formando “clusters” de células neuroblásticas con múltiples procesos celulares, finos y
cortos (neuritas). Las células pueden agregarse formando “clumps” y flotar. Por lo tanto,
en el momento de tripsinizar esta línea, es necesario remover el medio con las células
flotantes y recuperarlas por centrifugación para luego combinarlas con las células
tripsinizadas.
Determinación del número de células y su viabilidad. Para la determinación del
número de células y su viabilidad se empleó el método de exclusión del azul tripán. Se
colocaron 50 µl de la suspensión celular en 30 µl de medio y 20 µl de la solución de azul
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Materiales y métodos
tripán 4 % (azul tripán 400 mg, NaCl 810 mg, K2HPO4 60 mg y metil-p-hidroxibenzoato
50 mg a pH 7,4, en PBS). Se colocó una gota de esta mezcla en una cámara de Neubauer y
se efectuó el recuento celular (N) al microscopio óptico en los cuatro cuadrantes de la
cámara entre los 5 y los 10 minutos luego del agregado del colorante. El número de células
totales por ml y el porcentaje de viabilidad se calculó aplicando las siguientes fórmulas:
Células/ ml = (N/ 4) x 1.000 x 2 x 10
% de viabilidad = células no teñidas x 100
células totales
Arresto del ciclo celular. Células de neuroblastoma SH-SY5Y creciendo
exponencialmente fueron arrestadas en la fase G1 temprana mediante la incubación en
medio con 0,5 % de suero durante 36 horas y fueron inducidas a retomar el ciclo celular en
forma sincrónica mediante el agregado de 10 % de suero al medio de cultivo.
2- Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo.
Preparación de los extractos. Aproximadamente 1 x 106 células fueron cosechadas
con 1 ml de PBS conteniendo 10% SFB. Luego, se centrifugaron a 1000 rpm durante 5
minutos. El pellet celular se resuspendió suavemente en 100 µl de PBS, se pasó a otro tubo
conteniendo 1 ml de metanol y se dejó a 4ºC toda la noche. Las células fijadas se lavaron 2
veces con PBS, se les agregó 200 µl de RNAsa A 0,2 mg/ml en PBS y se incubaron 30
minutos a 37ºC. Luego se resuspendieron en 200 µl de PBS conteniendo ioduro de
propidio 50 µg/ml. El contenido de DNA celular fue analizado en un citómetro de flujo
FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Los datos
fueron analizados con el programa WinMDI 2.8.
3- Análisis de RNA por Northern blot.
Obtención de RNA total. El RNA total fue obtenido según el método descripto
previamente (Chomczynski and Sacchi, 1987), levemente modificado. Partiendo de 2 x 106
células en placas de 6 cm de diámetro, se lavaron 1 vez con PBS frío, se agregaron 700 µl
de solución desnaturalizante D (isotiocianato de guanidina 4M, citrato de sodio 25 mM pH
93
Materiales y métodos
7, N-laurilsarcosina 5 %, β-mercaptoetanol 0,1 M), se homogeneizaron con micropipeta y
se trasvasaron a un tubo eppendorf. Todo el trabajo se realizó sobre hielo. Se agregaron
luego 50 µl de acetato de sodio 2 M pH 4.5, 400 µl de fenol saturado en Tris pH 8.0 y 90
µl de cloroformo-alcohol isoamílico (49:1). La suspensión fue agitada vigorosamente
durante 10 segundos con un vórtex y centrifugada durante 20 minutos a 10.000 rpm a 4 ºC.
La fase superior acuosa, que contiene el RNA se trasvasó a otro tubo y el mismo fue
precipitado agregando un volumen de isopropanol y dejándolo durante 1 hora a -20 ºC. Se
centrifugó luego a 10.000 rpm durante 20 minutos a 4 ºC, se descartó el sobrenadante y el
pellet fue resuspendido en 150 µl de solución D. El RNA fue reprecipitado con 150 µl de
isopropanol centrifugándolo 20 minutos a 10.000 rpm. Se lavó 2 veces con etanol 75 % y
se resuspendió en 22 µl de agua estéril libre de RNasas.
La concentración del RNA se calculó midiendo la absorbancia a 260 nm (1 OD260 =
40 µg de RNA) aceptando como criterio de pureza un cociente A260/A280 mayor que 1,7
(Sambrook et al, 1989).
Electroforesis de RNA. La separación electroforética del RNA total se realizó según
una adaptación del método descripto por (McMaster and Carmichael, 1977). Las muestras
de RNA (20 µg) se desnaturalizaron a 50 ºC durante 60 minutos en una mezcla
conteniendo glioxal 1,2 M, DMSO 7,5 M, fosfato de sodio 10 mM pH 7. Luego, las
muestras fueron tratadas con el buffer de siembra (glicerol 50 %, fosfato de sodio 10 mM
pH 7, azul de bromofenol 0,25 % y xilene cianol FF 0,25 %) y sembradas en gel de
agarosa 1 % en buffer fosfato 10 mM. La corrida electroforética se llevó a cabo durante 23 horas a 100 mV en buffer fosfato de sodio 10 mM.
Transferencia de RNA a membrana. Una vez finalizada la electroforesis, el gel fue
sometido a transferencia pasiva a una membrana de nylon (Hybond-N+ Amersham) según
lo descripto por Sambrook y col (1989). Dicha membrana fue humedecida previamente
durante 45 minutos en SSC 20X (NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M pH 7). La transferencia
se realizó por capilaridad ascendente en una solución de SSC 20X durante 16 horas. Luego
el filtro de nylon se secó entre papeles Whatman 3 MM durante 30 minutos a temperatura
ambiente y se colocó en estufa a 80 ºC durante 1 hora para que el RNA se fije
irreversiblemente al nylon.
94
Materiales y métodos
Marcación de sondas.
p19.
Con la finalidad de detectar el mRNA de p19INK4d se sintetizó un
oligonucleótido de 24 bases complementario a las bases +3 a +26 del mRNA de p19INK4d
humano (Newton Bishop et al., 1999) cuya secuencia es: 5'-GGC GCG AAC CTC CTC
CAG CAG CAT -3'.
El oligonucleótido fue marcado radioactivamente en su extremo 5' con la enzima T4
polinucleótido quinasa. Se preparó la mezcla de reacción conteniendo 5 pmoles de
oligonucleótido, el buffer de reacción, 5 U de T4 polinucleótido quinasa (Invitrogen), 100
µCi de [γ-32P]ATP (6.000 Ci/mmol), en un volumen total de 30 µl. Esta preparación se
incubó 1 hora a 37 º C. La sonda marcada fue purificada, para eliminar el nucleótido
radioactivo no incorporado, mediante dos precipitaciones sucesivas con 1/10 del volumen
de acetato de amonio 7,5 M pH 5,5 y 2 volúmenes de etanol absoluto durante 30 minutos a
-20 ºC. Se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 minutos. El precipitado fue lavado con
etanol 70% y resuspendido en 100 µl de buffer TE (Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM). Una
alícuota de la sonda se colocó en un vial con líquido centellante a base de tolueno y se
contó la radioactividad en un contador de centelleo líquido. Las sondas poseían una
actividad específica aproximada de 4-6 x 103 cpm/fmol.
β-tubulina. Los resultados de los ensayos de Northern blot fueron normalizados con
los valores de los niveles de mRNA de β-tubulina detectados en paralelo. Se eligió el gen
de la β-tubulina por ser un gen de expresión constitutiva, no afectado por las fases del ciclo
celular. Para detectar el mRNA de β-tubulina se empleó como molde el cDNA de β-
tubulina de pollo escindido del plásmido pBR322β-tubulina (cedido por el Dr. J. Messina;
Universidad de South Florida, Florida, EEUU) por digestión con la enzima Hind ΙΙΙ. El
cDNA se marcó radioactivamente por la técnica de hibridización con hexaoligonucleótidos
de secuencia al azar (“random primers”). Se mezclaron 40 ng del DNA molde,
previamente desnaturalizado 5 minutos a 95ºC, buffer de reacción correspondiente, 2 U del
fragmento Klenow de la DNA polimerasa Ι de E.coli, 0,25 DO de la mezcla de
hexaoligonucleótidos de secuencia al azar, dATP, dTTP, dGTP a una concentración 500
µM cada uno y [α-32P]dCTP 10 µCi/µl, (3.000 Ci/mmol). La mezcla de reacción fue
incubada a 25 ºC deteniéndose luego de 1 hora con “stop buffer” (Tris 50 mM pH 8,
EDTA 5 mM, NaCl 50 mM y SDS 0,5 %). La sonda fue precipitada con 1/10 del volumen
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Materiales y métodos
de acetato de amonio 7,5 M pH 5,5 y 2 volúmenes de etanol absoluto durante 1 hora a -20
ºC. Se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 minutos, se lavó el precipitado con etanol 70 %
y se resuspendió en 100 µl de buffer TE (Tris 10 mM y EDTA 1mM). Una alícuota de la
sonda se colocó en un vial con líquido centellante a base de tolueno y se contó la
radioactividad en un contador de centelleo líquido. Las sondas así obtenidas poseían una
actividad específica aproximada de 5-7 x 10 3 cpm/fmol.
Para detectar el mRNA de p16ink4a, p15ink4b, p18ink4c, p21CIP1, Ciclina D1, CDK4 y
G3PDH, se utilizaron como sondas, los cDNA correspondientes marcados con [α32
P]dCTP con el método de “random primers” de manera similar a la descripta para β-
tubulina.
Hibridización. Las membranas de nylon conteniendo el RNA fijado por calor fueron
prehibridizadas en una solución bloqueante. Para detectar el mRNA de p19 la
prehibridización se llevó a cabo en una solución conteniendo SSC 6X, SDS 0,1 %,
Denhardt 2X (polivinilpirrolidona 0,04 %, Ficoll 0,04 %, seroalbúmina bovina 0,04 %) y
DNA de esperma de salmón 100 µg/ml durante 2 horas a 68 ºC en horno de hibridización
con rotación. Posteriormente, la sonda para p19 fue agregada a la solución y la
hibridización se completó a 68 ºC por 16 horas más. Finalizado este procedimiento, las
membranas fueron lavadas 3 veces a temperatura ambiente con SSC 1X y SDS 1% durante
2 minutos y tres veces a 68 ºC con SSC 0,2X y SDS 0,1 % durante 2 minutos.
Para detectar los mRNA de β-tubulina, p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, p21CIP1, Ciclina
D1, CDK4 y G3PDH, la prehibridización se llevó a cabo en una solución bloqueante (SSC
6X, SDS 1%, Denhardt 2X, y DNA de esperma de salmón 100 µg/ml) durante 2 horas a 68
ºC en horno de hibridización con rotación. Posteriormente se agregaron las sondas
correspondientes y se completó la hibridización a 68 ºC por 16 horas más. Finalizado este
procedimiento, las membranas fueron sometidas a dos lavados a temperatura ambiente con
SSC 2X y SDS 0,1 % durante 15 minutos y dos lavados a 68ºC con SSC 0,2X y SDS 0,1
% durante 15 minutos.
Autorradiografía y cuantificación. Las membranas lavadas se secaron entre papel
Whatmman 3MM por 30 minutos, se envolvieron con nylon impermeable y se expusieron
en un casette con pantalla radiográfica intensificadora (FUJIFILM) a temperatura ambiente
entre 24 y 72 horas. Luego de escanear las pantallas en un analizador de imágenes Bio-
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Materiales y métodos
Imaging Analyzer Fujifilm BAS-1800II, las imágenes resultantes se cuantificaron con el
programa ImageQuant, Amersham Biosciences.
4- Análisis de proteínas por Western Blot.
Preparación del lisado celular total. Aproximadamente 2- 3 X 106 células, se lavaron
una vez con PBS frío, se pasaron a un eppendorf con 1 ml de PBS, se centrifugaron y se
descartó el sobrenadante. El lisado celular total fue preparado con 100 µl de buffer de
precipitación de complejos inmunes RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1%
Nonidet P-40, 0,5% deoxicolato de sodio, 0,1% SDS) conteniendo inhibidores de proteasas
frescos (100 µg/ml PMSF, 60 µg/ml aprotinina y 1 mM ortovanadato de sodio). Luego de
homogeneizar las células con el tip, se dejaron en hielo 30 minutos. Se centrifugaron a
10.000 rpm por 10 minutos para remover los restos celulares y se guardó una alícuota del
sobrenadante para cuantificar proteínas por el método de Bradford.
Inmunoprecipitación de p19. Debido a que la cantidad absoluta de p19INK4d en la
célula es baja decidimos inmunoprecipitar la proteína presente en cada muestra para
concentrarla y disminuir el fondo inespecífico del lisado celular. A 100 µg de proteínas del
lisado se las sometió a inmunoprecipitación con 1 µg de un anticuerpo policlonal hecho en
conejo anti-p19 humana (Santa Cruz sc-1063), incubando la mezcla durante 1 hora a 4 ºC.
Luego se agregaron 20 µl de una solución de bolitas de agarosa acopladas a proteína A/G
(Santa Cruz sc-2003) y se dejó toda la noche a 4 ºC, con rotación. Los complejos inmunes
se recuperaron por centrifugación a 1000 rpm por 5 minutos a 4ºC y se descartó el
sobrenadante. El precipitado se lavó 4 veces con PBS y luego se resuspendió en 25 µl de
buffer de siembra 1X (50mM Tris- HCl pH 6.8, 100mM betamercaptoetanol, 2% SDS,
0,1% azul de bromofenol, 10% glicerol).
p53, CDK4 y β-actina. Para analizar las proteínas p53, CDK4 y β-actina se utilizaron 20
µg de proteínas del lisado celular total (ver preparación más arriba) al que se le agregó un
volumen igual de buffer de siembra 2X.
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA). En todos los casos las muestras fueron
analizadas en un gel de PAA en condiciones desnaturalizantes (Laemmli, 1970).
97
Materiales y métodos
Utilizamos el sistema vertical de Bio-Rad. El gel separador (inferior) se preparó al 12%
(1,6 ml de agua destilada estéril, 2 ml de solución de acrilamida/ bisacrilamida al 30%, 1,3
ml de Tris 1,5 M pH 8,8, 50 µl de SDS 10%, 50 µl de persulfato de amonio 10% y 2 µl de
TEMED) y el gel concentrador (superior) se preparó al 5% (1,4 ml de agua destilada
estéril, 0,33 ml de solución de acrilamida/ bisacrilamida al 30%, 0,25 ml de Tris 1 M ph
6,8, 20 µl de SDS 10%, 20 µl de persulfato de amonio 10% y 2 µl de TEMED). Las
muestras, con el buffer de siembra se hirvieron 3 minutos y se removió la proteína A/G por
centrifugación a 10.000 rpm por 20 segundos antes de sembrarlas en el gel. En un pocillo
se sembraron 5 µl del marcador de peso molecular (NEB, P7708S). Luego se realizó la
electroforesis, a 150 V, en buffer Tris-Glicina-SDS 1X (Tris base 25mM, glicina 250 mM
pH 8,3, SDS 0,1%) hasta que el azul de bromofenol alcanzó el final del gel separador.
Transferencia a membrana. Una vez concluída la separación electroforética, las
proteínas fueron transferidas a un soporte sólido, en este caso un filtro de nitrocelulosa
(Burnette, 1981). Una de las caras del gel fue apoyada sobre un trozo de nitrocelulosa del
mismo tamaño y ambos fueron colocados entre papeles Whatman 3MM previamente
humedecidos en buffer de transferencia 1X ( Tris-glicina 1X, SDS 0,01%, metanol 20%) y
estos a su vez colocados entre dos esponjas de poro grande y dentro de un soporte plástico.
Toda la construcción fue sumergida en el tanque electroforético, con buffer de
transferencia 1X, con el filtro de nitrocelulosa del lado anódico. La transferencia se llevó a
cabo a 200V, durante 90 minutos.
Detección de proteínas. Luego de la transferencia, se colocó la membrana de
nitrocelulosa en una solución de bloqueo (5% leche descremada en polvo, 0,02% Tween
20 en PBS) entre 4-16 horas a temperatura ambiente para reducir los sitios potenciales de
unión de proteínas irrelevantes. Luego se incubó la membrana con el anticuerpo primario
diluído en solución de bloqueo durante 3 horas a temperatura ambiente con agitación
suave. La membrana se lavó 3 veces con 0,02% Tween 20 en PBS, durante 5 minutos.
Luego se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con la enzima
peroxidasa de rabanito (HRP) diluído en solución de bloqueo durante 90 minutos a
temperatura ambiente. La membrana se lavó igual que antes y se agregó un lavado con
PBS. Para visualizar las proteínas de interés se utilizó el kit de detección ECL (Amersham
Pharmacia Biotech), basado en la producción de quimioluminisencia como consecuencia
98
Materiales y métodos
de la digestión de un sustrato de la enzima HRP. La señal fue detectada en un analizador de
imágenes Bio-Imaging Analyser Fujifilm LAS-1000. Como control de carga del gel se
utilizó tanto la detección de la proteína de expresión constitutiva β-actina así como la
técnica de tinción de un gel de proteínas corrido en paralelo con el colorante Coomasie
Blue.
Anticuerpos primarios: polyclonal rabbit anti-p19, sc-1063, dil (1: 500); polyclonal
rabbit anti-p53, Novocastra NCL-p53-CM1 dil (1: 100); polyclonal rabbit anti-CDK4, sc260 dil (1: 400), rabbit anti- β-actina H-196, sc-7210 dil (1: 500).
Anticuerpos secundarios: goat anti- rabbit conjugado con HRP, sc-2004, dil (1: 5000).
5- Agentes genotóxicos.
Irradiación ultravioleta. Células en crecimiento exponencial fueron tripsinizadas y
sembradas en placas de 35 mm a 60% de confluencia. Veinticuatro más tarde, se removió
el medio y las células fueron irradiadas en placas abiertas con 8mJ/cm2 de luz UVC, de
254 nm (rango 240-280) a temperatura ambiente con una lámpara Philips TUV15WG15T8
calibrada para otorgar 0,25 mJ/cm2.seg. Luego de la exposición, el medio fue readicionado
y las células incubadas en estufa a 37 °C con 5% CO2 durante los tiempos indicados en
cada caso. Células control fueron tratadas idénticamente excepto por la exposición a la luz
UV.
Cis-platino y péptido β- amiloide . Células en crecimiento exponencial fueron
tripsinizadas y sembradas en placas de 35 mm a 60% de confluencia en medio completo
con 10% SFB. Veinticuatro horas más tarde el medio fue reemplazado por medio fresco
conteniendo cisplatino 20 µM final o péptido β- amiloide 20 µM y las células fueron
incubadas en estufa a 37 °C con 5% CO2 durante los tiempos indicados en cada caso antes
de realizar las distintas determinaciones. Células control fueron tratadas idénticamente sin
agregar al medio fresco los dañadores
6- Análisis de la estabilidad proteica. Ensayo de Pulse- Chase con 35S- metionina.
Marcación metabólica con
35
S- metionina.
Células BHK21 fueron sembradas en
placas de 60 mm a 70% de confluencia con medio completo suplementado con 10% de
SFB. Una vez que las mismas estaban adheridas, se aspiró el medio y las células se lavaron
99
Materiales y métodos
1 vez con PBS y 2 veces con medio completo libre de metionina. Se agregaron 3 ml de
medio libre de metionina y se incubaron 15 minutos en estufa para eliminar el contenido de
metionina intracelular. Luego se removió el medio y se agregaron 2 ml de medio libre de
metionina con 50 µCi/ml de 35S- metionina (35S L- metionina 1200 Ci/ mmol, Amersham
Pharmacia). Se incubaron 2 horas en estufa a 37 °C y a continuación se removió el medio
radioactivo y se lavaron con 5 ml de medio completo conteniendo metionina fría. Los
cultivos fueron o no sometidos a irradiación con 8 mJ/cm2 de luz UV y se les agregó 4 ml
de medio completo (con metionina fría). Se incubaron en estufa y se tomaron muestras a
distintos tiempos luego de la irradiación con UV.
Inmunoprecipitación. Las células se lavaron 2 veces con PBS frío. Se centrifugaron
a 1000 x g por 3 minutos y el pellet celular fue resuspendido en 200 µl de buffer RIPA frío.
Se incubó 30 minutos a 4 °C y luego se centrifugó a 10.000 x g por 10 minutos a 4 °C. El
sobrenadante fue transferido a otro tubo y el volumen se completó a 250 µl con agua. Se
agregaron 3 µl (1 µg) del anticuerpo primario obtenido en conejo anti-p19 (Santa Cruz sc1063) y se incubó 90 minutos a 4 °C. Luego se agregaron 20 µl de Proteina A/G Plusagarosa y se incubó toda la noche a 4 °C . Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm por 5
minutos en frío, el pellet se lavó 4 veces con PBS y se resuspendió en 30 µl de buffer de
siembra 1X (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM betamercaptoetanol, 2% SDS, 0,1% azul de
bromofenol, 10% glicerol).
Electroforesis. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se sembraron en u n
gel de poliacrilamida 12% desnaturalizante y se corrieron a 105 V durante 5 horas (SDSPAGE). El gel se secó y se expuso durante 5 días en un casette con pantalla radiográfica
intensificadora (FUJIFILM) a temperatura ambiente. Luego de escanear la pantalla en un
analizador de imágenes (Bio-Imaging Analyzer Fujifilm BAS-1800II), las imágenes
obtenidas se cuantificaron con el programa ImageQuant, Amersham Biosciences.
7- Estudio de la tasa de iniciación de la transcripción. Ensayo de “Run- on”.
Para cada tratamiento sembramos 56 x106 células BHK21 o WI38 en placas de 10 cm a
razón de 8 x 106 células/ placa. Al día siguiente el medio de cultivo fue reemplazado por
medio fresco conteniendo o no el péptido β- amiloide 10 µM, o, antes del agregado del
100
Materiales y métodos
medio las células se irradiaron con 8mJ/cm2 de UV e incubamos en estufa a 37°C por 12
horas.
Aislamiento de núcleos. Luego del tratamiento, descartamos el medio de cultivo,
lavamos las células dos veces con PBS frío y las cosechamos en dos tubos eppendorf (dos
tubos por cada tratamiento) con 1 ml de PBS frío. Luego las centrifugamos durante 5
minutos a 1.500 rpm y resuspendimos ambos pellets celulares en un tubo con 1 ml de
buffer de lisis ( 10mM Tris- HCl pH 8,4, 1,5 mM MgCl2, 0,14 M NaCl). Agregamos 4 µl
de Nonidet P40 5% y dejamos reposar 10 minutos en hielo. Verificamos la ruptura celular ,
por observación de una alícuota al microscopio con azul tripán. Continuamos agregando
alícuotas de 2 µl de Nonidet P40 hasta que la ruptura fuera mayor al 80%. Luego
centrifugamos las muestras a 1.300 rpm por un minuto para recuperar los núcleos y
descartamos el sobrenadante. Lavamos 2 veces con 1 ml de buffer de lavado frío ( 20 mM
Tris-HCl pH 8.0, 140mM KCl, 10 mM MgCl2, 1mM MnCl2, 20% glicerol,14mM βmercaptoetanol).
Radiomarcación del RNA nuclear. Descartamos todo el sobrenadante del lavado y
resuspendimos los núcleos en 50 µl de buffer de marcado (es el buffer de lisis con el
agregado de 1 mM ATP, GTP y CTP, 10 mM fosfocreatina, 100 µg/ml fosfocreatina
quinasa, 0,34 µM [α-32 P] UTP (New England Nuclear, cat. BLU507H). Incubamos la
mezcla de reacción 20 minutos a 30 °C con agitación y luego la centrifugamos a 800 x g
durante 5 minutos. Descartamos el sobrenadante.
Obtención del RNA. Resuspendimos los núcleos en 150 µl de HSB frío (10 mM TrisHCl pH 7,4, 50 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,5 M NaCl) y agregamos 3 µl de solución de
DNAsa (2 mg de DNAsa en 1 ml de 0,0025 N HCl, 50% glicerol). Pipeteamos varias veces
para reducir la viscosidad y agregamos 300 µl de buffer de detención (50 mM Tris- HCl
pH 7,5 20 mM EDTA pH 8.0, 0,8 % SDS). Agregamos proteinasa K (solución 20 mg/ml
en Tris-HCl 50 mM pH 8.0, 1,5 mM acetato de calcio) a concentración final 100 µg/ml (45
µg) e incubamos 30 minutos a 42 °C. Luego, agregamos 450 µl de fenol/agua, incubamos
15 minutos a 65 °C vortexeando cada 5 minutos, agregamos 450 µl de cloroformo/alcohol
isoamilico (CHISAM), mezclamos con vórtex y centrifugamos a 2000 x g por 5 minutos,
descartando la fase orgánica. La extracción se repitió con 450 µl de CHISAM.
Centrifugamos y transferimos la fase acuosa a un nuevo tubo eppendorf. Adicionamos 45
101
Materiales y métodos
µl de LiCl 5 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. Mezclamos, centrifugamos 10 minutos
a 12.000 x g y resuspendimos el pellet en 0,4 ml de agua destilada. Hicimos una segunda
precipitación con 40 µl de LiCl 5 M y 2,5 volúmenes de etanol. Resuspendimos el pellet de
RNA en 100 µl de agua y con una alícuota de 2 µl medimos la actividad de la preparación
en un contador de centelleo líquido.
Preparación de sondas de cDNAs. Para cada tratamiento se requieren 10 µg de los
plásmidos linealizados que contengan los cDNA de los genes a estudiar para ser utilizados
como sondas frías.
Los plásmidos fueron linealizados y luego purificados mediante precipitación con dos
volúmenes de etanol y un décimo del volumen de acetato de amonio 3M, resuspendimos
cada vector en 20 µl de solución desnaturalizante ( NaCl 2 M, NaOH 0,1 M) y los
hervimos por 2 minutos. Les agregamos 180 µl de SSC 6X. A continuación cortamos un
trozo de una membrana de nylon (Hybond +, Amersham) del mismo tamaño que el
dispositivo para realizar un slot blot. La humedecimos en agua y luego en SSC 6X por 10
minutos. Colocamos la misma en el dispositivo y aplicamos vacío. Añadimos los cDNAs
desnaturalizados y luego lavamos con 200 µl de SSC 6X. Secamos la membrana al aire y
luego la cocinamos durante 1 hora a 80 °C.
Hibridización. Incubamos la membrana que contiene las sondas fijadas en solución
de prehibridización (6X SSC, 5X Denhardt´s, 0,5% w/v SDS, 1 µg/ml PolyA, 100 µg/ml
DNA esperma de salmón) durante 6 horas a 68 °C. Agregamos la muestra de RNA
marcado con [α-32 P] UTP e incubamos las membranas 72 horas más. Luego la membrana
fue sometida a dos lavados a temperatura ambiente con SSC 2X y SDS 0,1% durante 15
minutos y dos lavados a 68 ºC con SSC 0,2X y SDS 0,1% durante 15 minutos y se expuso
en un casette con pantalla radiográfica intensificadora (FUJIFILM) a temperatura ambiente
72 horas. Luego de escanear las pantallas en un analizador de imágenes Bio- Imaging
Analyzer Fujifilm BAS- 1800II, las imágenes resultantes se cuantificaron con el programa
ImageQuant, Amersham Biosciences.
8- Inmunocitoquímica. Determinación de la localización subcelular de p19ink4d.
Células SHSY-5Y creciendo exponencialmente fueron sembradas sobre un cubreobjetos
de vidrio a 40% de confluencia y dejadas en reposo 24 horas para permitir la adherencia al
102
Materiales y métodos
mismo antes de irradiarlas con 8 mJ/cm2 UVC. En los tiempos indicados las células fueron
lavadas con PBS y fijadas con paraformaldehído 4% en PBS durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Luego de lavar dos veces con PBS las células fueron
permeabilizadas con 0,1% Triton X-100 en PBS por 10 minutos, lavadas e incubadas por
30 minutos con 3% seroalbúmina bovina (BSA), 10% FCS en PBS. Luego las células
fueron lavadas una vez e incubadas con anticuerpo policlonal anti-p19 (Santa Cruz, sc1063) diluído 1:200 en buffer del anticuerpo (3% BSA en PBS) durante 2 horas a
temperatura ambiente. Las células fueron lavadas dos veces con PBS y una vez con
solución de lavado (50 mM Tris-HCL, pH 7,2; 100 mM NaCl, 0,2% Tween 20) antes de
incubarlas durante 1 hora con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, obtenido en
cabra conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Santa Cruz) diluído 1:200 en el
buffer del anticuerpo a temperatura ambiente y en oscuridad. Luego de lavar dos veces con
PBS y dos veces con solución de lavado, los núcleos fueron teñidos con Höescht 33258 (3
µg/ml final en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad y finalmente
las células fueron montadas con Mowiol 4-88 (Calbiochem). Los preparados fueron
observados con un microscopio invertido IX70 Olympus Fluoview y las imágenes
adquiridas con una cámara digital Zeiss AxioCam, operada bajo el programa AxioVision
3.1.
9- Preparación de plásmidos
Obtención de bacterias competentes. Las bacterias competentes se prepararon según
una variante del método de Cohen (Cohen et al., 1972), descripta por Sambrook y Russell
(Sambrook et al., 2001). Brevemente, se inocularon 2 ml de medio LB líquido (extracto de
levadura 5 g, peptona 10 g, NaCl 5 g, agua c.s.p 1 litro) con bacterias Escherichia coli,
cepa DH5α e incubaron con agitación constante a 37 °C, durante toda la noche. Luego se
diluyó el cultivo a 50 ml con medio LB y se incubó a 37 °C con agitación, hasta que
alcanzó la fase exponencial de crecimiento (DO600= 0,35-0,4). Se enfrió el cultivo en hielo
y se centrifugó a 5.000 x g durante 5 minutos. El pellet de bacterias fue resuspendido en 10
ml de CaCl2 60 mM frío y se mantuvo en hielo durante 30 minutos. Se centrifugó a 5.000 x
g y el pellet celular se resuspendió en una solución de CaCl2 60 mM, glicerol 15%. Las
bacterias competentes se alicuotaron y almacenaron a -70 °C.
103
Materiales y métodos
Transformación de bacterias competentes. Una pequeña cantidad de DNA plasmídico
(50-100 ng) se incubó con 50-100 µl de bacterias en hielo durante 45 minutos. A
continuación las bacterias fueron sometidas a un shock térmico a 42 °C durante 2 minutos,
seguido de un enfriamiento rápido en baño de agua con hielo. Luego se agregó LB hasta
completar un volumen de 1 ml y se incubó durante 45 minutos a 37 °C. Las bacterias se
centrifugaron y se resuspendieron en 50 µl de sobrenadante. Se sembraron en placas de
Petri con LB agar 1,5% con ampicilina (100 µg/ml). Se incubaron 16 horas en estufa a 37
°C.
Preparación de plásmidos en baja escala (miniprep). Se empleó el método de lisis
alcalina (Birnboim and Doly, 1979). Las bacterias transformadas con el plásmido de
interés fueron inoculadas en 2 ml de medio LB líquido con ampicilina (100 µg/ml) y se
incubaron toda la noche a 37 °C. Luego de centrifugarlas, se resuspendieron en 150 µl de
Solución I (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM). Se les agregó 200 µl
de Solución II (NaOH 0,2 M, SDS 1%) para lisarlas y desnaturalizar el DNA. Se neutralizó
con 150 µl de Solución III (acetato de potasio 3 M, pH 5,2) y se centrifugó 5 minutos a
10.000 x g para precipitar el DNA genómico. El DNA plasmídico presente en la fase
acuosa se precipitó al disminuir la polaridad del medio por el agregado de dos volúmenes
de etanol absoluto. Luego de 20 minutos a -20 °C se centrifugó a 10.000 x g durante 10
minutos y el pellet se lavó con etanol 75 %. Luego se resuspendió en 20 µl de agua
destilada o buffer TE.
Preparación de plásmidos en gran escala (maxiprep). Los plásmidos
fueron
preparados utilizando el kit de maxipreparación plasmídica Wizard Plus (Promega). Las
bacterias transformadas con el plásmido a aislar fueron inoculadas en 500 ml de medio LB
con ampicilina (100 µg/ml) e incubadas durante 16 horas. Una vez obtenido el pellet
bacteriano, se prosiguió con la extracción plasmídica según las instrucciones del
fabricante. Se obtuvieron preparaciones de concentración 0,7- 1 µg/ml.
Análisis de las preparaciones plasmídicas. Con el objeto de determinar la
concentración y calidad de las preparaciones , las mismas fueron sometidas a electroforesis
en gel agarosa 0,8- 1% en buffer TAE (Tris- acético 0,4 M, EDTA 1 mM) conteniendo 0,5
µg/ml de bromuro de etidio. Las muestras fueron sembradas con buffer de siembra 6X
(azul de bromofenol 0,25%, glicerol 30%), sometidas a electroforesis a voltaje constante
104
Materiales y métodos
(5 V/cm) y visualizadas por transiluminación con luz UV. Paralelamente, las preparaciones
plasmídicas fueron cuantificadas espectrofotométricamente:
DO260= 1 equivale 50 µg/ml de DNA.
DO260/280 > 1,5 indica pureza aceptable (Sambrook et al., 1989).
10- Clonado del cDNA de p19ink4d en el plásmido de expresión pSG5.
La secuencia codificante completa de p19 humana fue amplificada por PCR a partir de
una biblioteca de cDNA de cerebro humana cedida generosamente por el Dr. Enzo Lalli
(Estrasburgo, Francia) utilizando los oligonucleótidos (primers) apropiados diseñados con
sitios de corte para las enzimas EcoRI y BamHI. El primer forward: 5’GGGAATTCATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC-3’, corresponde a los primeros 21
nucleótidos
del
cDNA
de
p19
GGGATCCTCACAGCGGGGCCACCATGTG-3’
y
el
primer
corresponde
a
reverse:
los
últimos
5’–
21
nucleótidos de la región codificante de p19. El plásmido de expresión pSG5p19 (p19
sentido) fue obtenido clonando el fragmento de PCR EcoRI – BamHI en el vector pSG5 en
dichos sitios. El plásmido de expresión
pSG5p19AS que contiene el cDNA de p19
antisentido (orientación 3`-5`) fue obtenido con el mismo procedimiento utilizando 5’–
GGG GATCCATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC-3’ como primer forward y 5’–
GGGAAT TCACAGCGGGGCCACCATGTG-3’ como primer reverse. La fidelidad de
los plásmidos generados fue analizada por secuenciación del DNA.
p19INK4d
Figura 1. Vector de presión eucariota pSG5. El cDNA de p19INK4d fue clonado entre los sitios
únicos EcoR I y BamH I.
105
Materiales y métodos
11- Transfección transitoria de células y selección.
Las transfecciones se llevaron a cabo con el reactivo Lipofectamine 2000 reagent
(Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. En general, 1 x 106 células
sembradas en pocillos de 3 cm fueron cotransfectadas con 2 µg de pSG5p19, pSG5p19AS
o vector pSG5 vacío, junto con 0,5 µg de plásmido puroBABE que confiere resistencia al
antibiótico puromicina. Cuando se indica, las células fueron transfectadas con 2 µg de
pSG5p19 y 2 µg de vector de expresión para CDK4 wt o una mutante CDK4R24C
(generosamente cedidos por Patrick O`Connor, Bethesda). Veinticuatro horas luego de la
transfección se agregó al medio, el antibiótico puromicina (Sigma) 2,5 µg/ml y luego de 60
horas de selección, las células resistentes (transfectadas) fueron utilizadas en los distintos
ensayos.
12- Actividad de la enzima caspasa-3.
Para determinar el nivel de apoptosis en las células luego del tratamiento con luz UV, uno
de los ensayos utilizados es la medición de la actividad de la enzima caspasa-3. El ensayo
fue realizado como está descripto previamente, con algunas modificaciones (Chen et al.,
2005). Las células fueron cultivadas en pocillos de 3 cm a razón de 1 x 106 células/pocillo
y fueron irradiadas o no, con 8 mJ/cm2 de luz UVC, o tratadas con distintos agentes
genotóxicos por 24 hs. Luego, fueron cosechadas y lavadas 1 vez con PBS y resuspendidas
en 325 µl de buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10 mM EGTA, 10
µM digitonina, 500 µM PMSF, 10 µg/ml bisbenzamida, 10 µg/ml pepstatina, y 10 µg/ml
aprotinina) en los tiempos indicados, incubadas 30 minutos a 37 ºC y centrifugadas a
12.000 rpm por 20 minutos. La actividad de caspasa-3 fue determinada con 150 µl del
lisado celular utilizando 100 µM del sustrato sintético Ac- DEVD-pNA (Sigma) en buffer
de reacción (100 mM HEPES pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol y 20% v/v
glicerol) en un volumen final de 300 µl incubando la mezcla a 37 ºC por 4 horas. La
aparición de color amarillo, indicativo de la actividad de caspasa-3 fue cuantificada en
espectrofotómetro a 405 nm. La actividad de caspasa-3 fue estimada como A405nm/µg
proteína x hora.
106
Materiales y métodos
13- Ensayo de fragmentación internucleosomal de DNA.
Las células fueron cultivadas en placas de 6 cm de diámetro a razón de 2 x 106
células/placa e irradiadas o no, con 8 mJ/cm2 de luz UVC. Luego, fueron cosechadas en los
tiempos indicados y lavadas 1 vez con PBS frío, centrifugadas a 5000 rpm por 2 minutos y
resuspendidas en 100 µl de buffer de lisis (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 20 mM EDTA pH 8,0,
0,5% v/v Triton X-100). Las muestras fueron inmediatamente centrifugadas a 3000 rpm
por 5 minutos y el sobrenadante fue trasvasado a otro tubo eppendorf. Al pellet se le
agregaron 100 µl de buffer de lisis. Ambas muestras fueron incubadas con RNAsa A (5
µg/µl), 1% SDS por dos horas a 56 ºC. Luego, se incubaron toda la noche con proteinasa K
(4 µg/µl) a 37 ºC, se realizó la precipitación del DNA con 75 µl de 10 M acetato de
amonio y 450 µl de etanol y las muestras se lavaron 1 vez con etanol 70%. Una alícuota de
las muestras fue sembrada en un gel de agarosa 1,5% y el DNA fue visualizado por tinción
con bromuro de etidio.
14- Síntesis de DNA no programada (UDS, Unscheduled DNA Synthesis).
Las células fueron sembradas en pocillos de 3 cm a razón de 1 x 106 células/pocillo con
medio completo y se dejaron en reposo hasta que llegaron a 80-90% de confluencia. Luego
fueron lavadas dos veces con PBS y el medio fue reemplazado por medio con 1% suero y
libre de arginina (medio UDS). Luego de 24 horas se cambió el medio por medio UDS
fresco por otras 36 hs. Bajo estas condiciones, determinamos que la síntesis de DNA
semiconservativa es inhibida completamente. Las células fueron lavadas con PBS,
irradiadas o no con 8 mJ/cm2 de luz UV e incubadas nuevamente con medio UDS fresco y
10 µCi/ml 3H-timidina. En los tiempos indicados, se determinó la incorporación de 3H-
timidina. Las células fueron lavadas 3 veces con PBS frío, cosechadas y centrifugadas a
3000 rpm por 5 minutos. Luego fueron lisadas con 500 µl de 5% TCA por 30 minutos y
centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos. El pellet fue lavado dos veces con agua fría y
resuspendido en 50 µl de 1 M NaOH. La radioactividad incorporada fue cuantificada en un
contador de centelleo. La reparación del DNA fue estimada como dpm/µg de proteína.
107
Materiales y métodos
15- Ensayo de reactivación en la célula huésped (HCR: host cell reactivation assay) .
La capacidad de una célula para reparar su DNA puede ser evaluada a través del método
denominado Host Cell Reactivation. Esta técnica consiste en transfectar en una célula un
plásmido que contiene el cDNA de un gen reportero bajo la regulación de un promotor
fuerte, y que ha sido dañado con luz UV o con agentes químicos. La capacidad de la célula
para reparar este DNA plasmídico se cuantifica mediante la expresión del gen reportero.
De este modo, este ensayo permite medir la reactivación de la expresión del plásmido y
relacionarla directamente con la capacidad de reparación de la célula huésped del DNA
dañado. En nuestro trabajo se utilizó el plásmido pCMVCAT que contiene el promotor
fuerte del citomegalovirus y el gen de la enzima cloramfenicol- acetiltransferasa (CAT)
como reportero. Para este ensayo se utilizaron células BHK21.
Irradiación de plásmido. A efectos de evaluar la capacidad de reparación de las células
BHK21 en condiciones basales, se realizó un experimento de transfección de plásmidos
irradiados con UV, en un rango de energía entre 0 y 640 mJ/cm2. Se colocó el plásmido a
irradiar en placas de Petri de 6 cm colocadas sobre hielo, a una concentración de 100
µg/ml.
Transfección de células en cultivo. El día previo a la transfección, células BHK21 fueron
tripsinizadas y sembradas en cajas de seis pocillos de 3 cm de diámetro a una densidad de
5 x 105 células por pocillo en 2,5 ml de medio completo. Al día siguiente, y cuatro horas
antes de la transfección, el medio fue reemplazado por medio fresco. El DNA plasmídico
fue introducido en las células mediante el método de precipitación con fosfato de
calcio(Chen and Okayama, 1988). Por cada pocillo a transfectar se preparó un tubo
conteniendo 150 µl de HeBS 2X (Hepes 1% pH 7, NaCl 1,6%) y 3 µl de buffer fosfato
(NaHPO4 0,06 M, NaH2PO4 0,07 M). Por otro lado, se prepararon las distintas soluciones
de plásmidos en 20 µl de CaCl2 2 M y H2O c.s.p. 147 ml. Además del plásmido irradiado
se cotransfectó un vector conteniendo el cDNA de la enzima β-galactosidasa como control
de transfección. La cantidad final de DNA fue ajustada en todos los casos a 20 µg por
pocillo, la que fue completada con cantidad necesaria de DNA “carrier” (DNA genómico
de esperma de salmón). Las distintas preparaciones plasmídicas se agregaron lentamente a
la solución de fosfato de sodio, mientras ésta se agitaba en forma continua con vórtex. Se
dejó reposar 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del precipitado
108
Materiales y métodos
y se agregaron a cada pocillo 250 µl de la correspondiente preparación de DNAs. Se dejó
recuperar a las células en medio completo aproximadamente por 20 horas. Al cabo de este
período, las células fueron lavadas con PBS y cultivadas con 2,5 ml de medio completo por
los tiempos indicados. Luego se realizaron las distintas determinaciones.
Preparación de extractos celulares. Las células fueron lavadas 3 veces con 2 ml de PBS
frío. Se agregó luego 1 ml de TEN frío (Tris 20 mM, NaCl 100 mM y EDTA 1 mM) para
favorecer el despegado de las células. La monocapa celular fue levantada mediante el
empleo de un “rastrillo de células” y cosechada en tubos eppendorf. Las células fueron
centrifugadas a 1.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue eliminado por
aspiración y el pellet celular resuspendido en 200 µl de buffer Tris 250 mM pH 7,5
conteniendo glicerol 15%. Las células fueron lisadas sometiéndolas a 3 ciclos
consecutivos, de 5 minutos cada uno, de congelamiento y descongelamiento en baño de
etanol/hielo seco y baño de agua a 37 °C respectivamente, agitando vigorosamente cada
vez. Finalmente, los tubos se centrifugaron a 1.000 x g 10 minutos a 4 °C para eliminar los
restos celulares. El sobrenadante proteico se dividió en dos alícuotas para la posterior
determinación de las actividades de β-galactosidasa y cloramfenicol acetiltransferasa.
Determinación de la actividad β-galactosidasa. La actividad de la enzima βgalactosidasa se determinó mediante un ensayo colorimétrico cuantificando el sustrato
cromogénico liberado por hidrólisis enzimática. La reacción se llevó a cabo en una mezcla
conteniendo 50-65 µl del extracto, 1 ml de buffer PM2 (Na2 HPO4 60 mM, NaH2PO4 40
mM, KCl 10 mM y MgSO4 1 mM), 0,25 ml de una solución del sustrato ortonitrofenil-β-
galactopiranósido (ONPG) 4 mg/ml en PM2 y 0,7 µl de β-mercaptoetanol que se incubó a
37 °C hasta la aparición de color amarillo, aproximadamente luego de 3-4 horas. Se
registró el tiempo de reacción y se midió la absorbancia a 420 nm. La actividad específica
de la enzima β-galactosidasa fue calculada según: (A420nm muestra – A420nm control)/ul
extracto x hora.
Determinación de la actividad de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). La actividad
de la enzima CAT fue determinada según el método descripto por Seed y Sheen (Seed and
Sheen, 1988). El extracto celular fue previamente calentado a 65 °C durante 5 minutos, con
el propósito de inactivar las acetilasas endógenas. Se enfrió inmediatamente en hielo y se
centrifugó 15 minutos a 1.500 x g a 4 °C para eliminar las proteínas desnaturalizadas. El
109
Materiales y métodos
ensayo fue realizado con 50 µl de sobrenadante en una mezcla de reacción conteniendo
Tris 100 mM pH 8, butiril-CoA 0,25 mg/ml y 200 nCi de 3H-cloramfenicol (60 Ci/mmol,
0,01 mCi/ml) e incubando a 37 °C entre 90-120 minutos. A continuación se agregaron 200
µl de xileno y luego de agitar vigorosamente, los incubados fueron centrifugados a 10.000
x g durante 15 minutos. Se separó la fase orgánica, la que fue sometida a una extracción
reversa mediante el agregado de 200 µl de H2O. Luego de agitar y centrifugar bajo las
mismas condiciones, la fase orgánica resultante, conteniendo los derivados butirilados de
3
H-cloramfenicol, fue colocada en viales con líquido centelleante a base de tolueno (PPO
0,4%, dimetil POPOP 0,05% en tolueno) y se cuantificó la radioactividad en un contador
de centelleo líquido. La actividad específica de CAT se determinó como (dpm pCMVCAT – dpm control pBLCAT6)/ul x minuto). Las unidades CAT fueron normalizadas
contra las unidades β-galactosidasa, para ajustar los resultados de acuerdo con la eficiencia
de transfección en cada caso.
16- Incorporación de 3H-timidina.
Las células se sembraron en pocillos de 3 cm a razón de 2 x 105 células pocillo con medio
completo, suplementado con 10% de suero fetal bovino. Inmediatamente luego del
tratamiento correspondiente, las células fueron incubadas con 1 µCi/ml 3H-timidina (81 Ci/
mmol; Amersham Biosciences) durante 6 horas a 37 °C, lavadas 3 veces con PBS frío,
cosechadas y centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. Luego fueron lisadas con 500 µl de
5% TCA por 30 minutos y centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos. El pellet fue lavado
dos veces con agua fría y resuspendido en 50 µl de 1 M NaOH durante 1 hora. La
radioactividad incorporada fue cuantificada en un contador de centelleo. La reparación del
DNA fue estimada como dpm/µg de proteína.
17- Generación de líneas celulares estables para p19INK4d.
Las transfecciones se llevaron a cabo con el reactivo Lipofectamine 2000 reagent
(Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante como está descripto en el punto 12.
Células BHK21, plaqueadas en pocillos de 3 cm para llegar a 90% de confluencia en el
momento de la transfección fueron transfectadas con 2 µg de plásmido de expresión
pMTCB (vacío), ó pMTCBp19 ó pMTCBp19AS que expresan la proteína p19INK4d
110
Materiales y métodos
salvaje y la secuencia antisentido respectivamente, río abajo del promotor del gen de la
metalotioneína, inducible con zinc. Además, el vector pMTCB confiere a las células
resistencia al antibiótico geneticina (G418). Cuarenta y ocho horas luego de la
transfección, las células fueron tripsinizadas, diluídas y sembradas en placas de 10 cm con
medio fresco conteniendo 200 µg/ml de geneticina (Sigma). La presión de selección se
mantuvo durante 2 semanas cambiando el medio cada 4 días. Los clones de células
resistentes fueron aislados y crecidos hasta tener una cantidad de células suficiente para
analizar la expresión (incremento o inhibición, según el caso) del gen de p19 mediante
northern blot, en ausencia o en presencia de zinc.
18- Ensayo de MTT: estimación de viabilidad celular.
La viabilidad celular fue estimada con el ensayo de bromuro de 3-[4,5 dimetiltiazol-2-yl]2,5-difeniltetrazolio (MTT). Los clones de células SHSY-5Y estables para p19 sentido o
p19 antisentido se sembraron en pocillos de 3 cm a razón de 2 x 105 células/pocillo con
medio completo, suplementado con 10% de suero fetal bovino y se incubaron 24 horas.
Las células fueron tratadas con las dosis indicadas de luz UV y la supervivencia celular fue
evaluada en los diferentes tiempos reemplazando el medio de cultivo con 1 ml de medio
fresco conteniendo MTT (Sigma) 1mg/ml , e incubando las células otras 4-6 horas. El
medio y el MTT fueron removidos y se agregaron 500 µl de isopropanol para disolver el
precipitado de MTT reducido. Las placas fueron agitadas 15 minutos y la absorbancia en el
solvente fue determinada a 570 nm. El blanco fue calculado utilizando mediciones a dos
longitudes de onda a 570 y 650 nm. Se incluyeron controles de células no tratadas y de
medio solo. En paralelo, se determinó el número de células viables por conteo en cámara
de Neubauer con el colorante azul de tripán descripto previamente.
19- Ensayo clonogénico.
Luego de irradiar con UV células SHSY-5Y estables para p19 sentido o p19 antisentido
se determinó la supervivencia celular con un ensayo clonogénico. Las células fueron
sembradas diluídas para obtener clones aislados (aprox. 1000 células /placa de 10 cm) y
fueron irradiadas con 8 mJ/ cm2 de UV luego de inducir el promotor de MT durante 6
horas con 75 mM ZnCl2. Veinticuatro horas más tarde se cambió el medio por medio
fresco libre de ZnCl2. Las células fueron incubadas 7 días seguido de una fijación con
111
Materiales y métodos
formaldehído al 10%, tinción con el colorante cristal violeta (5 mg/ml en etanol) y
cuantificación de los clones supervivientes. Las colonias que contenían más de 50 células
fueron consideradas como derivadas de células clonogénicamente activas.
112
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