Validacion y Confirmacion de Metodos

VALIDACIÓN Y CONFIRMACIÓN DE MÉTODOS – 2011 Versión 1
Introducción
El objetivo final de la validación de un método analítico es asegurar que los resultados de las
mediciones en los análisis de rutina se encuentran lo suficientemente cerca del valor verdadero
(desconocido) del contenido del analito en la muestra. El laboratorio elige los métodos de ensayo de
acuerdo con las reglamentaciones vigentes (cuando es pertinente), de acuerdo con los requisitos del
usuario final (cliente), o a requerimiento de éste.
Una vez elegido el método existen tres posibilidades:
a) Que el método sea normalizado y se aplique tal cual dice la norma.
b) Que el método sea una modificación de un método normalizado.
c) Que el método se haya desarrollado en el laboratorio o se haya obtenido de bibliografía.
Según el caso elegido, el alcance de la validación será diferente:
Método
a) Normalizado
b) Modificación de un
método normalizado
c) método propio
Parámetros de Validación
repetibilidad, veracidad, incertidumbre, límite de detección (si aplica),
carta de control (material de referencia), participación en ensayos de
aptitud.
Dependiendo de la modificación, se evalúan que parámetros deben ser
verificados.
Evaluar todos los parámetros posibles, dependiendo del método.
2) Parámetros de validación.
Selectividad
Linealidad
Límite de detección, Nivel crítico.
Límite de cuantificación
Precisión (repetibilidad y precisión intermedia)
Veracidad
Rango de trabajo
Robustez
Incertidumbre de medición
Sesgo
Repetibilidad
Parámetro
Selectividad
Linealidad
L.de detección
L.de cuantific.
Precisión
Veracidad
Rango
Robustez
Incertidumbre
Parámetros a validar según el método (caso c)
Tipo de método
Componentes
Cualitativo
Trazas
mayoritarios
x
x
x
x
depende
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
Propiedad física
depende
x
x
x
x
x
Efecto de las modificaciones al método de ensayo sobre los parámetros de validación (caso b)
Método de extracción
Selectividad, veracidad
Matriz de la muestra
Selectividad, veracidad, precisión, LD, LQ
Extensión del rango
Linealidad, precisión
Cambios en el pH
Robustez
Cambio de operador
Repetibilidad, veracidad
Sistema de detección
Selectividad, linealidad, rango de trabajo
3) Determinación de los parámetros de validación.
3.1) Selectividad – especificidad.
Según la técnica analítica utilizada, se harán estudios de selectividad teniendo en cuenta lo
siguiente:
Como es impracticable considerar todas las interferencias posibles, se aconseja estudiar los
casos más importantes (que produzcan más interferencia) y probables. La selectividad de un
método puede expresarse cuantitativamente por medio de la razón máxima tolerada (maximum
tolerated ratio - Trmáx), que es la relación entre la concentración de interferencia (Cint)
respecto del analito (Ca), que produce un desvío en la respuesta analítica que produce un sesgo
en la estimación de la concentración del analito que cae fuera del intervalo de confianza que
deriva del cálculo de la incertidumbre expandida. Esto no siempre es aplicable ya que
previamente hay que conocer la naturaleza de las posibles interferencias para poder realizar el
ensayo.
Llevar a cabo análisis de:
a) Blanco de reactivos.
b) Soluciones de analito en el solvente adecuado según la técnica y en concentraciones
similares a las presentes en las muestras de ensayo.
c) Matriz libre de analito. (de ser necesario, preparar una matriz sintética a partir de los
conocimientos previos de la muestra).
d) Matriz con agregado de analito (usar concentraciones similares a b).
3.2) Linealidad
Si corresponde, según el método analítico, realizar curva de calibración de acuerdo a lo
siguiente.
a) El analista determina el ámbito lineal en función de los conocimientos previos de la
magnitud a medir. Este debe ser tal que en la medida de lo posible caiga aproximadamente
en el centro de la curva.
b) Analizar al menos seis puntos de la curva, incluido el blanco.
c) Los puntos deberán estar igualmente espaciados.
d) Hacer tres replicados de cada punto, en lo posible de manera aleatoria.
Evaluar la linealidad del método por medio de una inspección visual de la recta, gráfico de
residuos y estadística de la regresión. En función de los resultados obtenidos y de las
características de la muestras, se determinará posteriormente la estrategia a seguir en las
mediciones de rutina, es decir, el uso de un solo punto, algunos o todos los puntos de la
calibración.
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
Estimación de los parámetros de la regresión:
Medir las respuestas analíticas de los patrones de concentración conocida, por triplicado (n=3).
Para el caso en que se miden 6 patrones por triplicado, el número de niveles de diferentes
concentración (p) es 6, y el número total de puntos de la recta de calibrado (m) es 18.
El análisis de los datos, implica el cálculo de la pendiente A y la ordenada al origen B de la
recta de regresión, ajustada a la ecuación y = A ⋅ x + B . Los valores estimados de A y B se
calculan mediante:
m
A=
Qxy
Qxx
=
∑ ( x − x)( y − y)
i
i =1
i
(1)
m
∑ ( x − x)
2
i
i =1
B = y − A⋅ x
(2)
donde xi es la concentración de cada uno de los m patrones, x es el promedio de las
concentraciones de calibrado, yi es la respuesta en cada punto e y es el promedio de las
respuestas de los patrones de calibrado.
Además de A y B, se calcula el desvío estándar de estos parámetros, mediante las siguientes
fórmulas:
sA =
sy/ x
(3)
Qxx
2
sB = s y / x
1 x
+
m Qxx
(4)
siendo el desvío estándar de los residuos de la regresión:
m
sy / x =
∑ ( y − y)
i =1
2
i
(5)
m−2
donde yi es la respuesta experimental a cada patrón e y i representa la respuesta estimada en
cada punto, o sea, y = Ax + B .
i
i
Estos parámetros dan una idea de la bondad de la regresión. Es deseable que s y / x sea lo más
pequeño posible, a pesar que su valor está limitado por el ruido instrumental. La distribución de
los residuos, es decir el modo en que los valores ( yi − y) debe ser analizada, hacer un gráfico
para ver la adecuación de los datos al modelo lineal.
Observación: el coeficiente de correlación, a pesar de su amplio uso como indicador de
linealidad, resulta engañoso e inapropiado para este fin, y no debe ser usado (ref 2 – A3)
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
3.3) Límites de detección y cuantificación.
El límite de detección que es la mínima concentración detectable de manera confiable por la
técnica, se calcula en función del desvío estándar de la concentración predicha para una
muestra blanco (s0). Para estimar este valor, se usa la siguiente ecuación:
s0 =
sy / x
A
2
1 1 x
+ +
n m Qxx
(6)
usualmente se usa n=3, como ya se mencionó antes.
El límite de detección es igual a: LOD = 2 ⋅ t 0,05;m-2 ⋅ s0
El valor t, se obtiene de la tabla de distribución Student:
TABLA 1
Dist t 1 cola alfa=0,05
GL
t
GL
t
1 6,31
13
1,77
2 2,92
14
1,76
3 2,35
15
1,75
4 2,13
17
1,74
5 2,02
18
1,73
6 1,94
20
1,72
7 1,89
23
1,71
8 1,86
27
1,70
9 1,83
32
1,69
10 1,81
39
1,68
11 1,80
52
1,67
12 1,78
77
1,66
infinito 1,64
El límite de cuantificación LOQ, que es la mínima concentración cuantificable en forma
confiable, se toma como la concentración correspondiente a 10 veces el desvío estándar:
LOQ = 10 s0
Por lo que se asegura que el desvío estándar relativo (DSR) para una concentración igual al
LOQ sea del 10%, el que se toma como el máximo DSR aceptable para cuantificar.
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
3.4) Precisión y precisión intermedia.
Es conveniente (en caso que sea posible) utilizar tres niveles de concentración (bajo, medio,
alto) cubriendo el rango de trabajo con un número n de replicados en cada nivel de
concentración m.
Es conveniente que n se encuentre entre 2 y 5. Se analizan n replicados de cada muestra de
nivel m durante un mínimo de 5 días ( p). No es necesario que sean días seguidos.
Con estos datos se realiza un análisis de la varianza (ANOVA) del cual se puede obtener una
estimación de la repetibilidad (precisión) y precisión intermedia, y compararlas, considerando
los diferentes días como principal fuente de variación.
Cálculo de la varianza de repetibilidad:
p
S r2 =
n
∑∑ ( z
− zi ) 2
ij
i =1 j =1
(7)
p (n − 1)
n
∑z
ij
j =1
siendo z i =
n
la varianza “entre días” se calcula:
p
S B2 =
∑ (z
i
− z )2
−
i =1
p −1
p
(8)
n
∑∑ z
i =1 j =1
siendo z =
S r2
n
ij
pn
y la varianza de precisión intermedia se calcula:
S Ri2 = S r2 + S B2
(9)
Calcular los desvíos estándar de las varianzas mencionadas, obteniendo la raíz cuadrada de las
mismas.
Calcular los desvíos estándar relativos para cada parámetro:
RSDr =
RSDRi =
SDr
(10)
z
SDRi
(11)
z
Para comparar la variabilidad entre días con la repetibilidad, se hace un test de Fischer:
Se calcula la varianza entre días ( sE2 ) pero sin corregir por la repetibilidad ( sr2 ):
p
∑ (z
i
− z )2
S E2
Sr2
p −1
el valor F, se compara con el de la tabla F para α=0.05 con p-1 grados de libertad en el
numerador y pn-p grados de libertad en el denominador.(Tabla 2).
S E2 =
i =1
⋅ ni
y se calcula es estadístico F: F =
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
Tabla 2
GL Num
GL Den
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
30
35
40
50
60
80
100
1
Tabla de Fischer
2
3
4
161
18,5
10,13
7,71
6,61
5,99
5,59
5,32
5,12
4,96
4,84
4,75
4,67
4,60
4,54
4,49
4,45
4,41
4,38
4,35
4,32
4,30
4,28
4,26
4,24
4,17
4,12
4,08
4,03
4,00
3,96
3,94
199
19,0
9,55
6,94
5,79
5,14
4,74
4,46
4,26
4,10
3,98
3,89
3,81
3,74
3,68
3,63
3,59
3,55
3,52
3,49
3,47
3,44
3,42
3,40
3,39
3,32
3,27
3,23
3,18
3,15
3,11
3,09
216
19,2
9,28
6,59
5,41
4,76
4,35
4,07
3,86
3,71
3,59
3,49
3,41
3,34
3,29
3,24
3,20
3,16
3,13
3,10
3,07
3,05
3,03
3,01
2,99
2,92
2,87
2,84
2,79
2,76
2,72
2,70
225
19,2
9,12
6,39
5,19
4,53
4,12
3,84
3,63
3,48
3,36
3,26
3,18
3,11
3,06
3,01
2,96
2,93
2,90
2,87
2,84
2,82
2,80
2,78
2,76
2,69
2,64
2,61
2,56
2,53
2,49
2,46
5
230
19,3
9,01
6,26
5,05
4,39
3,97
3,69
3,48
3,33
3,20
3,11
3,03
2,96
2,90
2,85
2,81
2,77
2,74
2,71
2,68
2,66
2,64
2,62
2,60
2,53
2,49
2,45
2,40
2,37
2,33
2,31
alfa = 0,05
6
7
234
19,3
8,94
6,16
4,95
4,28
3,87
3,58
3,37
3,22
3,09
3,00
2,92
2,85
2,79
2,74
2,70
2,66
2,63
2,60
2,57
2,55
2,53
2,51
2,49
2,42
2,37
2,34
2,29
2,25
2,21
2,19
237
19,4
8,89
6,09
4,88
4,21
3,79
3,50
3,29
3,14
3,01
2,91
2,83
2,76
2,71
2,66
2,61
2,58
2,54
2,51
2,49
2,46
2,44
2,42
2,40
2,33
2,29
2,25
2,20
2,17
2,13
2,10
8
9
10
239
19,4
8,85
6,04
4,82
4,15
3,73
3,44
3,23
3,07
2,95
2,85
2,77
2,70
2,64
2,59
2,55
2,51
2,48
2,45
2,42
2,40
2,37
2,36
2,34
2,27
2,22
2,18
2,13
2,10
2,06
2,03
241
19,4
8,81
6,00
4,77
4,10
3,68
3,39
3,18
3,02
2,90
2,80
2,71
2,65
2,59
2,54
2,49
2,46
2,42
2,39
2,37
2,34
2,32
2,30
2,28
2,21
2,16
2,12
2,07
2,04
2,00
1,97
242
19,4
8,79
5,96
4,74
4,06
3,64
3,35
3,14
2,98
2,85
2,75
2,67
2,60
2,54
2,49
2,45
2,41
2,38
2,35
2,32
2,30
2,27
2,25
2,24
2,16
2,11
2,08
2,03
1,99
1,95
1,93
Este mismo estudio de comparación de varianzas, puede realizarse utilizando las herramientas
estadísticas de Excel “Análisis de la varianza de un factor”.
Si el valor F calculado es mayor que el F de tabla, quiere decir que hay diferencia significativa
entre las varianzas y esto requiere un estudio para analizar las causas de tal diferencia y su
posterior eliminación.
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
3.5) Veracidad
Se puede estimar a partir de estudios interlaboratorios, materiales de referencia certificados, o
sobre material fortificado (“Spike”).
En caso que se cuente con un material de referencia certificado (MRC) se realizan un número n
de determinaciones del mencionado material. Cada determinación incluye todo el proceso
analítico. Si no se cuenta con el MRC, se realiza un fortificado sobre una matriz sin analito, o
sobre una muestra que contiene analito, pero deberá realizarse el análisis antes y después del
fortificado.
Se determina el sesgo de la siguiente forma:
Sesgo = X − X ref
o expresado como recuperación: R =
(12)
X
X ref
(13)
Se evalúa mediante una prueba t si la diferencia es estadísticamente significativa (α=0,05)
t=
X − X ref
s
(uref ) + ( ) 2
n
(14)
2
siendo:
Xref: Valor del MRC
X : promedio de las determinaciones experimentales.
Uref: incertidumbre estándar del valor de referencia.
S: desviación estándar de las determinaciones experimentales.
N: número de determinaciones experimentales.
El valor de t, se compara con el valor tabulado para n-1 grados de libertad y nivel de
significación α=0,05. (TABLA 3)
TABLA 3
GL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Dist t 2 colas alfa=0,05
t
GL
t
12,71
13
2,16
4,30
14
2,14
3,18
15
2,13
2,78
16
2,12
2,57
17
2,11
2,45
18
2,10
2,36
19
2,09
2,31
20
2,09
2,26
21
2,08
2,23
22
2,07
2,20
23
2,07
2,18
24
2,06
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
Si el valor del t calculado es menor que el t de la tabla, se concluye que no hay diferencia
significativa. Si existiera diferencia significativa, los resultados de las mediciones se corregirán
por el factor correspondiente o si se decide no corregir, el sesgo se contemplará en el cálculo de
la incertidumbre de la medición.
Ver el procedimiento de cálculo de incertidumbre, para la inclusión de estos datos en su
cálculo, como así también los datos obtenidos de estudios interlaboratorios.
Muestras fortificadas:
Proceder de manera similar, aunque en este caso, hay que calcular la incertidumbre de la
muestra fortificada que se calcula combinando la incertidumbre del certificado del fabricante,
y la incertidumbre debida al procedimiento de fortificado. Ver procedimiento de cálculo de
incertidumbre. Recordar que se pueden combinar incertidumbres que tengan las mismas
unidades, caso contrario hay que transformarlas en incertidumbres relativas, hacer la
combinación de las incertidumbres, y luego volver a transformarla en incertidumbre estándar
para aplicar la fórmula (14).
3.6) Rango de trabajo
El rango de trabajo queda definido en función del intervalo de valores de la magnitud que fue
evaluado en los puntos precisión y veracidad.
3.7) Robustez
Personal responsable del laboratorio, establecerá qué parámetros del método de ensayo podrían
ser críticos y se realizarán ensayos con dichos parámetros modificados.
Se realizará una cantidad n de ensayos (mínimo 3) en las condiciones habituales del método y
una cantidad igual de ensayos con los parámetros modificados. Se calcularán las medias y los
desvíos estándar de ambos grupos de mediciones y se realizará una prueba t para diferencia de
medias. Si el valor del estadístico t es mayor que el valor crítico para un α=0.05 y 2(n-1) grados
de libertad, se considerará que el parámetro modificado afecta la medición.
t=
X1 − X 2
(15)
s12 + s22
n
t: estadístico t, se compara con el valor de la tabla 3 para 2(n-1) GL.
Si el t calculado es mayor que el t de la tabla, se considera que el factor modificado afecta a la
medición.
Alternativamente, si existieran varios factores a considerar, se podrá realizar un análisis de la
varianza de dos o más factores, utilizando un diseño factorial. En este último caso, deberá
intervenir personal con los conocimientos estadísticos adecuados.
3.8) Incertidumbre de medición
Ver cálculo de incertidumbre por separado en otro documento.
3.9) Sesgo
ver 3.5
3.10) Repetibilidad
ver 3.4
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
4) Informe de validación
Se realiza un informe de validación, en el que se indicará la siguiente información:
Alcance de la validación: Parámetro a medir (analito, propiedad física o química, índice, etc),
matriz de la muestra y rango de validación.
Instrumental utilizado. Detallar los equipos utilizados y su identificación. Detallar otros
materiales como ser matraces, buretas, etc y su correspondiente identificación.
Muestras utilizadas, materiales de referencia y reactivos indicado el lote siempre que sea
posible.
Personal involucrado en las mediciones y que realizó el informe de validación (nombre y
apellido).
Las mediciones realizadas incluyendo los registros que correspondan (por ej cromatogramas).
En caso de utilizar equipos similares, especificar en qué equipo se hizo cada medición.
Los resultados obtenidos y las conclusiones.
Fecha, firma y aclaración del personal responsable de aprobar el informe.
Referencias
(1) Guía para validación de métodos de ensayo. DC-LE-05 V.2 – 11/06/2008 – O.A.A.
(2) Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl.
Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835-855, 2002 – M. Thompson et al.
(3) A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and
accuracy profiles. A Gustavo González, M. Ángeles Herrador. Trends in Analytical
Chemistry, Vol. 26, No. 3, 2007.
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
INFORME DE VALIDACIÓN
1) Alcance:
Parámetro a medir:
Rango:
Matriz:
2) Instrumental utilizado:
Equipos:
Otro instrumental:
3) Muestras patrón, estándares y/o materiales de referencia.
4) Reactivos:
Droga:
Fabricante:
5) Mediciones:
6) Resultados:
7) Conclusiones:
8) Personal involucrado
9) Elaborado por:
Fecha:
10) Aprobado por:
Fecha:
Fernando Veyretou – Esp. en Ing. en Calidad
Lote: