DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 En este documento encontrara la definición de cada uno de los términos que incluye el protocolo en extenso solicitado para el registro de propuestas de proyectos en el Sistema de Información de las Fundaciones Produce, que respondan a las demandas específicas por parte de las Fundaciones Produce. Asimismo, es indispensable anexarlo vía sistema a su propuesta registrada en línea. Recomendaciones para el registro en línea de la propuesta 1. Desarrollar su propuesta formulando un protocolo para el proyecto en los términos descritos en el formato adjunto. Asimismo, usted podrá destacar en dicho documento algún aspecto que usted considere relevante para ser tomado en cuenta por el comité revisor. 2. Conservar abierto este documento durante la captura de datos en el sistema ya que la información solicitada por las pantallas de captura se podrá “copiar/pegar” con las ventajas que esto representa. 3. Anexar este archivo de protocolo al sistema, el cual formará parte de la base de datos. TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN DATOS GENERALES DE LA PROPUESTA TÍTULO DEL PROYECTO Identificación de microorganismos y compuestos bioquímicos en el pulpo Octopus maya que causan deterioro en su manejo poscaptura. SECTOR Pesca SISTEMA PRODUCTO Moluscos (Pulpo) TIPO PROYECTO Investigación-validación ESLABON Industrialización ESTATUS DEL PROYECTO Nuevo FECHA DE INICIO 01/08/2010 FECHA DE TÉRMINO 30/08/2011 GRUPO DE INTERÉS Pescadores, cooperativas de pescadores y industrializadores de moluscos (congeladoras) Celestún (muestreo) y Mérida MUNICIPIOS 1 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO PALABRAS CLAVE FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN Pulpo, Octopus maya, manejo poscaptura,deterioro INFORMACION GENERAL DEL PROTOCOLO INTRODUCCION El Octopus maya, es un pulpo de mediano tamaño –entre 60 centímetros y un metro- su área de distribución comprende los estados de Quintana Roo, Yucatán y Campeche considerándolo una especie endémica de estas regiones (Pérez-Lozada et al. 2002, Pérez et al., 2004).El pulpo es uno de los productos marinos de importancia en la alimentación por su valor proteico y contenido de vitaminas y minerales (Villaroel et al., 2001). La producción de pulpo en Yucatán en 2006 fue de entre 500 y 800 mil toneladas, siendo el 35 % de la producción anual (SAGARPA 2004). Actualmente el pulpo ha cobrado un importante interés ya que en los últimos años la exportación de este a los mercados europeos ha aumentado considerablemente. Por lo cual para exportarlos el producto tiene que cumplir con las condiciones necesarias de calidad y sanidad, estableciéndose en las congeladoras pesqueras los sistemas HACCP a partir de 1997, para poder comercializar el producto en los países de la Comunidad Europea de a cuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-128SSA1-1994 y NMX-F-491-1994. Para productos de pesca, pulpo congelado (Jiménez-Vera 2001). En el 2009 el Consejo Estatal de Pesca y Acuacultura determinó dar continuidad a la captura de pulpo hasta que se cumpla la meta 11 mil 472 toneladas lo cual se cumplió a mediados de noviembre. En un comunicado, se dio a conocer que la pesquería de pulpo, que se ha convertido en la principal pesquería de la entidad, considerada como una de las pocas pesquerías sanas o sustentables, no solo a nivel estatal o regional sino a nivel nacional e internacional, que da ocupación e ingresos a cerca de 15 mil pescadores de la entidad, que laboran en tres mil 676 embarcaciones menores, 418 embarcaciones mayores y cerca de 11 mil 400 alijos. Yucatán, cuenta con 16 plantas procesadoras de pulpo certificadas por el sector salud y que exportan a países como España, Italia y Japón, 50 por ciento del pulpo capturado, situación que no pasa en Campeche pues este carece de plantas certificadas (SAGARPA 2009). Sin embargo cabe destacar que si no existe un buen manejo poscaptura del pulpo se producirá un deterioro causado por los microorganismos presentes en el molusco impidiendo su comercialización adecuada y generando un foco de contaminación, así como causar enfermedades a las personas que lo llegaran a consumir en caso de desconocer la mala calidad del producto. Actualmente no se cuenta con estudios sobre el manejo postcaptura del pulpo, por lo cual es importante determinar los microorganismos y sus productos metabólicos implicados en el deterioro de este molusco. El desarrollo de este 2 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN proyecto permitirá proponer un mejor manejo poscaptura del pulpo para prevenir la perdida de la calidad del mismo, lo que permitirá una mejor comercialización en mercados nacionales e internacionales. ANTECEDENTES MICROFLORA PRESENTE EN PESCADOS Y MARISCOS La carga microbiana nativa de los productos de origen marino se caracteriza dependiendo de la región donde se captura; los productos de climas templados, su microflora es conformada por bacterias aerobias, anaerobias y psicrfilas, Gram negativas representadas por los géneros Pseudomonas, Achromobacter, Vibrio, Flavobacterium y Proteu, difiriendo de los de regiones tropicales en las cuales predominan las bacterias Gram positivas como Micrococcus, Bacillus y Clostridium (Huss 1997 Centeno et al., 2005) Sin embargo al momento de extraer la materia prima del mar, la flora microbiológica característica tiende a cambiar; ya que en el medio exterior y la manipulación influyen en forma directa en la modificación de la población, la nueva carga microbiana tiende a ser de tanto de naturaleza psicrotrófica como de naturaleza mesófila. Por lo tanto la carga microbiana de los productos de origen marino depende de la composición inicial, la manipulación durante su captura, el manejo durante su procesamiento, almacenamiento y su posterior distribución (Huss 1997; Centeno et al., 2005) ENZIMAS Y COMPUESTOS SECRETADOS POR LAS BACTERIAS EN EL DETERIORO. La mayoría de los microorganismos pueden producir metabolitos como las enzimas extracelulares que tienen como función degradar compuestos orgánicos complejos, transformándolos en sustancias fácilmente metabolizables, que si bien no tienen importancia en la transmisión de enfermedades, si la tienen en el deterioro y la disminución del valor nutritivo de estos alimentos. Existen pocos reportes de las diferentes enzimas secretadas por microorganismos que participan en el deterioro de los alimentos, por lo que es importante estudiar la presencia e interacción de los microorganismos en los alimentos usando herramientas moleculares y la actividad enzimática durante el deterioro. Aminas biogénicas Las aminas biogénicas (AB) son compuestos nitrogenados de bajo peso molecular que se forman principalmente por descarboxilación de aminoácidos. Atendiendo a su estructura química, pueden clasificarse en alifáticas (putrescina, espermidina, espermita, cadaverina), aromáticas (tiramina, 3 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN feniletilamina) o heterocíclicas (histamina, triptamina) y en función del número de grupo aminos de la molécula, podemos hablar de monoaminas (histamina, feniletilamina, tiramina), diaminas (putrescina, cadaverina) o poliaminas (espermidina, espermina) (Huss 1997) Algunas aminas biogénicas pueden ser usadas para indicar la frescura o grado de contaminación de pescados y productos marinos como moluscos. Estos compuestos están ausentes en alimentos de origen marino y su aparición generalmente está correlacionada con la contaminación bacteriana. Las bacterias de diversos géneros que participarían en el proceso deteriorativo y secretan AB son Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Micrococcus, Kocuria, Morganella, Vibrio. MÉTODOS UTILIZADOS PARA IDENTIFICAR MICROORGANISMOS Y COMPUESTOS BIOQUÍMICOS Métodos moleculares para identificar microorganismos. Teniendo en cuenta su potencialidad, la identificación bacteriana basada en el ADNr 16S encontró una aplicación amplia en el estudio de microbiología (Rodicio y Mendoza 2004). Actualmente, han surgido técnicas moleculares que permitieron el avance para la identificación de microorganismos cultivables y no cultivables. Estas técnicas son aplicadas en la biología molecular, la cual permite aislar, identificar y caracterizar el material genético total proveniente de las muestras. Estas técnicas permiten identificar los microorganismos en forma simultánea con una mayor rapidez y confiabilidad. La estrategia general consiste en: primero, extracción de ácido nucleico (DNA o RNA) de una muestra dada; segundo, amplificación de genes que codifican el rRNA 16S y tercero el análisis de los productos de PCR en una electroforesis de agarosas o poliacrilamida. (Villadas et al., 2002). et al., 2000). Métodos de detección de aminas biogénicas Los métodos de detección de AB en los alimentos se han ido desarrollando de forma paralela al desarrollo de la cromatografía. Inicialmente, se determinaba su presencia mediante cromatografía en capa fina, pero este método no permitía la cuantificación, por tal razón, con el fin de mejorar la sensibilidad y hacer posible la cuantificación, diversos investigadores desarrollaron una serie de técnicas que se basan en la separación y la resolución mediante el uso de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), el cual permite cuantificar estos tipos de compuestos, tomando como referencia los estándares indicados en cada tipo de análisis (Novella- Rodríguez et al., 2000). Actualmente, los métodos más aplicados al análisis de las aminas biogénicas son los de 4 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN cromatografía líquida de alta eficacia y la cromatografía de gases para los compuestos volátiles, estos métodos presentan, en general, una mayor precisión, exactitud y especificidad que los anteriores, permiten el análisis simultáneo de varias aminas. PESQUERÍA DEL PULPO La pesca del molusco se realiza a través de su captura por pequeñas lanchas costeras (24 a 30 pies de eslora) que llevan a cabo salidas de un día de duración y el producto de la pesca es entregado a las empacadoras el mismo día de su captura, siendo el Octopus maya la especie predominante en este tipo de captura, por otro lado está la captura realizada por los barcos de la flota mayor, con capacidad de permanecer hasta 20 días de captura en alta mar, y en los cuales el producto es conservado por nevado (almacenado en hielo) y posteriormente es entregado a las empacadoras, en estas embarcaciones la especie capturada de manera predominante es el Octopus vulgaris. El sistema de captura se realiza colocando en un cordel un cangrejo amarrado el cual servirá de carnada para atraer al pulpo, los cordeles son amarados a una perdigas llamadas jimbas, las cuales se colocan en la embarcación que se pone a garetear, lo cual da la apariencia de que el cangrejo se está moviendo, cuando el pulpo detecta la presencia del cangrejo, lo cubre con su corona de brazos, lo cual es aprovechado por el pescador para subir el cordel y atrapar el molusco.Se procede a eviscéralo, lo cual consiste en invertir el manto del pulpo y eliminar todo el conjunto de viseras, si es de la flota mayor se procede a nevarlo, en alguna embarcaciones el pulpo es colocado en bolsas de polietileno para protegerlo y evitar el contacto directo con el hielo. Esta etapa se considera importante pues en función del tipo de manejo previo, el tipo y cantidad de carga microbiana, serán cruciales para la calidad del producto después del nevado, sin embargo no existe información científica a este respecto. Posteriormente el producto es descargado de las embarcaciones y entregado a las plantas procesadoras, donde la etapa siguiente recibe el nombre de recepción, aquí se evalúa la calidad del pulpo y se determina si cumple los requerimientos para su aceptación en la planta, en algunos caso se clasifica como pulpo de primera o de segunda en función de una evaluación organoléptica (tabla 3). Los parámetros a evaluar por lo general son los siguientes: tres descriptores de color (brillo, intensidad y luminosidad), uno de olor (intensidad), tres de textura (flexibilidad, dureza y elasticidad) y tres de aspecto general (forma, mucosidad, plasticidad). Es importante hacer énfasis en que no se han establecido parámetros bioquímicos y microbiológicos con respecto a las características organolépticas utilizadas para la clasificación del pulpo. Algunos estudios se han realizado en pulpo, pero enfocados al almacenamiento refrigerado, evaluando el pH, los 5 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN niveles de trimetilamina, el nitrógeno volátil y el acido 2-tiobarbiturico (Ruiz, C. et. al. 2002). PROBLEMÁTICA La captura del pulpo es una actividad de mucha importancia en el Estado de Yucatán y además su comercialización en el mercado nacional e internacional requiere que sea de buena calidad por lo que el manejo poscaptura y el almacenamiento del pulpo es de suma importancia para evitar que se deteriore debido a la presencia de microorganismos y los productos de su metabolismo. Se ha visto que la carga microbiana varía según la etapa de la cadena productiva, implicando la presencia de bacterias patógenas como la Salmonella, Vibrio, Pseudomomas y otros (Torres, 2007; Cabrera, 2008) por lo que se considera que el estudio de los microorganismos y los productos metabólicos bacterianos que están involucrados en la descomposición del pulpo así como las temperaturas a las cuales se debe de almacenar el productos terminado contribuirá a prevenir el deterioro del pulpo asegurando que llegue al consumidor un producto de buena calidad. Cabe aclarar que no se han establecido parámetros bioquímicos y microbiológicos para evaluar las características organolépticas utilizadas para la clasificación del pulpo por lo que el desarrollo de esta investigación permitirá establecer y validar las técnicas para la evaluación de los microorganismos y compuestos que afectan a la calidad organoléptica y sanitaria del pulpo. JUSTIFICACION La pesquería del pulpo es una de las de mayor importancia en la Península de Yucatán. La cantidad de pulpo que se captura en la Península de Yucatán cada año es variable se encuentra entre las 10,000 y 18,000 toneladas, el pulpo es un producto de exportación, principalmente a Japón y a la Comunidad Económica Europea (CEE). Así mismo es una fuente de divisas muy importante para la región A pesar del gran interés comercial del pulpo en el Estado, en esta especie aun no se han efectuado trabajos relativos a los microorganismos contaminantes causantes del deterioro presentes en esta especie y estudios bioquímicas de los procesos enzimáticos deteriorativos involucrados durante el almacenaje del pulpo en las congeladoras antes de ser exportado o comercializado, dicho deterioro causa que el producto tenga baja aceptación al ser exportado. Considerando la elevada importancia económica y el alto nivel de explotación a la que se encuentra sometido, el pulpo en la Península de Yucatán, es necesario realizar estudios que permita el establecimiento de mecanismos y estrategias de manejo de esta pesquería, de un modo científico y razonado para el adecuado manejo del recurso en beneficio de la economía de la región y del país. El uso de la nueva herramienta de metagenómica poblacional y la utilización combinada de diferentes técnicas moleculares basadas en el 16S rRNA ha permitido un estudio en profundidad de la diversidad, estructura y dinámica de 6 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN comunidades microbianas en general, lo cual indica que podría ser una herramienta importante para el análisis masivo de los microorganismos presentes en muestras de pulpo, este estudio podría ser una alternativa y un gran avance para prevenir el deterioro del pulpo durante su proceso de almacenamiento (Contreras-Araneda. 2005). El análisis molecular de la población microbiana, complementado con los análisis bioquímicos de las enzimas implicadas en el deterioro son de gran importancia para saber las posibles causas de deterioro y la flora microbiana que los contamina durante su proceso de almacenamiento en las congeladora. Por lo que utilizando las herramientas moleculares y bioquímicas se tendrá el conocimiento de que tipos de microorganismos están presentes en el pulpo y cuáles de ellos están involucrados en el proceso de deterioro, por lo que se podría proponer mejores condiciones de almacenamiento lo cual repercutiría en una mejor calidad que conlleve a una mejor comercialización del pulpo. OBJETIVO GENERAL Identificar los principales microorganismos, aminas biogénicas y compuestos volátiles en el pulpo Octopus maya que están involucrados en su deterioro durante su manejo postcaptura. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Aislar y purificar por métodos tradicionales los principales microorganismos (Vibrio y Pseudomonas y psicrofilos) presentes durante el deterioro de pulpo Octopus maya. 2. Confirmar la presencia Vibrio y Pseudomonas mediante la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 3. Identificar Salmonella y microorganismos psicrofilos, que causan deterioro en pulpo Octopus maya mediante la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4. Secuenciar los amplicones obtenidos por PCR de genes de la subunidad 16S rRNA de microorganismos presentes durante el deterioro de pulpo Octopus maya. 5. Identificar las aminas (Cadaverina y Putrefacina), y compuestos volátiles producidas por el metabolismo microbiano durante el proceso de deterioro de pulpo Octopus maya. 6. Evaluar vida de anaquel así como características organolépticas durante el proceso de deterioro de pulpo EVALUACIÓN EX – ANTE El sistema de captura de pulpo se realiza colocando en un cordel un cangrejo amarrado el cual servirá de carnada para atraer al pulpo, los cordeles son amarados a una perdigas llamadas jimbas, las cuales se colocan en la 7 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN embarcación que se pone a garetear, lo cual da la apariencia de que el cangrejo se está moviendo, cuando el pulpo detecta la presencia del cangrejo, lo cubre con su corona de brazos, lo cual es aprovechado por el pescador para subir el cordel y atrapar el molusco. se procede a eviscéralo, lo cual consiste en invertir el manto del pulpo y eliminar todo el conjunto de viseras, si es de la flota mayor se procede a nevarlo, en alguna embarcaciones el pulpo es colocado en bolsas de polietileno para protegerlo y evitar el contacto directo con el hielo. Esta etapa se considera importante pues en función del tipo de manejo previo, el tipo y cantidad de carga microbiana, serán cruciales para la calidad del producto después del nevado, sin embargo no existe información científica a este respecto. Posteriormente el producto es descargado de las embarcaciones y entregado a las plantas procesadoras, donde la etapa siguiente recibe el nombre de recepción, aquí se evalúa la calidad del pulpo y se determina si cumple los requerimientos para su aceptación en la planta, en algunos caso se clasifica como pulpo de primera o de segunda en función de una evaluación organoléptica. Es importante hacer énfasis en que no se han establecido parámetros bioquímicos y microbiológicos con respecto a las características organolépticas utilizadas para la clasificación del pulpo. MATERIAL Y METODO Materia prima Se utilizara pulpo (Octupos maya), que será de temporada del estado de Yucatán. Los puntos de muestreo se realizaran en congeladoras de Celestún Yucatán, se realizaran 2 muestreos de temporada para realizar los aislamientos y purificación de los microorganismos así como los análisis bioquímicos y moleculares. Para homogenizar el muestreo y obtener una muestra representativa, este será no probabilístico, de tipo casual, se trata de un proceso en que el investigador selecciona directa e intencionadamente los individuos de la población (Castro, 2007). El caso más frecuente de este procedimiento es el utilizar como muestra los individuos a los que se tiene fácil acceso. Evaluación de deterioro en pulpo Octopus maya Las muestras se distribuirán en condiciones de esterilidad en tubos falcón conteniendo 15 ml de caldo lactosado, en cada tubo se pondrá 10 gr de pulpo. Cada muestra experimental tendrá un periodo de más 30 días de incubación de acuerdo a la condición de temperatura (0, -5 y -20ºC) utilizada para la evaluación. Transcurrido el tiempo de incubación se realizaran los análisis correspondientes a cada muestra. Aislamiento y purificación de Vibrio y Pseudomonas por técnicas tradicionales: Se utilizarán medios específicos para e asilamiento y purificación y se hará la caracterización macroscópica y microscópica para luego ser comprobadas por 8 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN PCR. Determinación de aminas por HPLC Para la extracción de las aminas biogénicas se realizara de acuerdo al protocolo de (Eerola et al., 1993.La derivación de las aminas biogénicas se lleva a cabo de acuerdo a Proestos et al., 200. Cromatografía de Gas se utilizara el protocolo de Veciana-Nogues et al., 1996 Condiciones: flujo del gas Helio 23 ml/ min, temperatura de inyección 190°C, temperatura del detector de la flama ionizante 190°C, temperatura del horno (temperatura 1 75°C por 5 min, 75 a 150 2.5 min (cambio), temperatura 2 150 °C por 10 min, flujo de hidrogeno de flama ionizante 30 ml/min, flujo de aire de la flama ionizante 430 ml/min. Análisis molecular Extracción y purificación de ADN se realizará por el método tradicional de acetato de potacio con isopropanol. Amplificación de los genes 16S rRNA Los amplificados de los genes de los microorganismos se realizará por medio de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando secuencias de iniciadores universales y específicos y usando como templado el ADN metagenómico obtenido siguiendo el protocolo descrito en Sambrook and Rusell, 2001. Análisis de los productos de PCR por electroforesis Los productos de PCR se fragmentaran en geles de agarosa a 0.8-1.2 % dependiendo del tamaño de los productos. Cargar las muestras y aplicar 80 volts por 20 min. Teñir con bromuro de etidio 30 min en agitación. Posteriormente foto documentar el gel. Secuenciación Los fragmentos obtenidos de que coincidan con los esperados serán recuperados del gel y purificados con el kit de purificación wizard para productos de PCR y fragmentos de geles. Cuantificaran para saber la concentración del producto y se enviaran a la Unidad de Síntesis y secuenciación del Instituto de Biotecnología, UNAM Análisis bioinformático (blast). 9 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN Las secuencias obtenidas se analizaran para identificar a qué tipo de microorganismo corresponde, con la ayuda de las bases de datos de acceso público (NBCI, GenBank, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu/), y el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) http://www.embl-heidelberg.de/. BIBLIOGRAFIA -Ben-Gigirey, B.; Vieites Baptista de Sousa, J. M.; Villa, T. G.; BarrosVelázquez, J. (1999). Histamine and cadaverine production by bacteria isolated from fresh and frozen albacore (Thunnus alalunga). J food Protec, 62 (8): 933939.Bougeois C.M., -Bravo- Martínez (2004). El manejo higiénico de los alimentos. Editorial Limusa, -Bourgeois, C. M., Mescle, J. F. y Zucca, J. 1994. Microbiología alimentaria. Volumen I.Aspectos microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia,España. pp: 35-44 -Cabrera Amaro D. L. (2008). Diagnóstico de Salmonella en la cadena productiva del pulpo. Tesis de Maestría. Instituto Tecnológico de Mérida. -Casas L. 2005. Inocuidad bacteriológica en camarón para exportación en México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. -Contreras-Araneda P. A. (2005) Suelos Contaminados Con Hidrocarburos: RNA 16S Como Indicador De Impacto. Memoria Para Optar Al Título De Ingeniero Civil En Biotecnología Santiago De Chile Diciembre 2004. -Centeno-Briceño, S. y Rodríguez- Bejarano, R. Actividad enzimática de bacterias frecuentes en camarones (Litopenaeus schmitti), mejillones (Perna viridis) y calamares (Loligo plei) congelados producidos en Cumaná, Estado Sucre, -Venezuela. Rev. Soc. Ven. Microbiol., 2007, vol.27, no.1, p.349-363. ISSN 1315-2556. -Eerola, S.; Hinkkanen, R.; Lindfors, E.; Hirvi, T. (1993.)Liquid Chromatographic Determination Of Biogenic Amines In Dry Sausages. J. Aoac Int. 76(3): 575578. -FAO (1991). Documento Técnico de Pesca. No. 334. Roma, FAO. 174p. -Fernández Escartin E.,(1981) Microbiologia Sanitaria, Agua y Alimentos. Vol .EDUG/Universidad de Guadalajara.pp 541-542. -Fonnesbech Vogel B., Jørgensen K., Christensen H., Elmerdahl Olsen J., And Gram L. (1997). Differentiation of Shewanella putrefaciens and Shewanella alga on the Basis of Whole-Cell Protein Profiles, Ribotyping, Phenotypic Characterization, and 16S rRNA Gene Sequence Analysis. Applied And 10 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN Environmental Microbiology, P. 2189–2199. -Gram L, Dalgaard P(2002). Fish spoilage bacteria-problems and solutions. Curr Opin Biotechnol.; 13:262-266. -Huss, H.H. (1997) Aseguramiento de la calidad de los productos pesqueros Documento técnico de pesca Nº 334. Roma. FAO. -Huss, H.H. (1999) El Pescado Fresco: Su Calidad y Cambios de su Calidad. FAO. Documento Técnico de pesca 348 -Jimenez Vera Ramon (2001) Evaluación de la carga bacteriana en productos pesqueros de importancia económica en congeladoras Yucatecas, Tesis. Facultad de Ingenieria Quimica. Universida Autónoma de Yucatan. -Lakshmanan, R.; Leya, S.; Leyasekaran, G. (2002). Surviva of amine-forming bacteria during the ice storage of fish and shrimp. Food Mmicrobiology. 19, 617625 -Microbial Ecology, (1999). Ribosomal RNA as a tool in microbial ecology. Molecular Microbial Ecology Workshop Nayagüez. -Pérez-Lozada, M., A. Guerra y A. Sanjuan. (2002). Allozime divergence supporting the taxonomic separation of Octopus mimus and Octopus maya from Octopus vulgaris (Cephalopoda: Octopus). Bull. Mar. Sci. 71(2): 653-664 -Perez Perez M, Santos Valencia Josefina, Burgos Rogerio Wakida, Kusunoki Armando (2004).”Evaluación de la población de pulpo (Octopus maya) en la península de Yucatán 2004”. S.A.G.A.R.P.A, INP. -Razkin Vela. 2000. Especificidad y sensibilidad de la PCR para detectar Salmonella spp. en cultivos puros y en alimentos. Ingeniero Técnico Agrícola (Industrias Agroalimentarias), Universidad Pública de Navarra. -RODICIO M, MENDOZA MC. (2004) Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica. Enferm Infecc Microbiol Clin 22: 238-45. -SAGARPA. (2004). Anuario Estadístico de Pesca. Secretaria del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, Gobierno Federal. México. -Sambrook, J. and Russell D. W. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press. -Secretaria de Salud Pública, NOM-109-SSA1-1994. Bienes y servicios. “Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos 11 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN para su análisis microbiológico” México (DF): SSA, 1994 -Secretaria de Salud Pública, NOM-129-SSA1-1995. Bienes y servicios. Productos de la pesca: secos-salados, ahumados, moluscos cefalópodos y gasterópodos: frescos-refrigerados y congelados. Disposiciones y especificaciones sanitarias, 1995. -Solís-Ramírez, M.J. 1994. Mollusca de la Península de Yucatán, México. En: Recursos faunísticos del Litoral de la Península de Yucatán. A. YañezArancibia (ed). Univ. Aut. De Camp., EPOMEX. Serie Científica (2):136 p -Torres Martinez, J.G. 2007. Determinación del perfil microbiológico del pulpo. Tesis de Licenciatura. Instituto Tecnológico de Mérida. -Villarroel, R.; Cabello, A.; Figuera, B.; Vallenilla, O. Características bromatológicas de moluscos comerciales. Memorias del VI Congreso Científico de la Universidad de Oriente. 5 al 7 diciembre. File://D:\ALIMENTOS\TA006.HHTM. Diciembre. 2001. CRONOGRAMA DE PRODUCTOS/COMPONENTES DEMANDA ASEGURAMIENTO DE LA CALIDA DEL PULPO PRODUCTO/COMPONENTE Un DOCUMENTO TECNICO CON LA INFORMACIÓN DE (DESCRIPCION) MICROORGANISMOS Y COMPUESTOS BIOQUÍMICOS IDENTIFICADOS EN UN AñO. TIPO DE PRODUCTO Otras PRODUCTO/COMPONENTE Manual con las recomendaciones para el manejo postcaptura del ADICIONAL pulpo para prevenir su deterioro y comercializar un producto de buena calida. TRIMESTRE DE CUMPLIMIENTO Cuarto trimestre CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES POR PRODUCTO/COMPONENTE ACTIVIDADES (DESCRIPCION) TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA ACTIVIDADES 1. MUESTREO DEL PULPO EN EL PUERTO DE CELESTÚN. Primer trimestre. 2. REALIZAR EL ALMACENAMIENTO DEL PULPO A DIFERENTES TEMPERATURAS PARA EVALUAR EL PROCESO DEL 12 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN (DESCRIPCION) DETERIORO. TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA Primer Trimestre ACTIVIDADES (DESCRIPCION) TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA ACTIVIDADES (DESCRIPCION) TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA ACTIVIDADES (DESCRIPCION) TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA ACTIVIDADES (DESCRIPCION) TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA ACTIVIDADES (DESCRIPCION) TRIMESTRE EN EL QUE SE REALIZA 3. AISLAR Y PURIFICAR LOS PRINCIPALES MICROORGANISMOS CAUSANTES DEL DETERIORO POR MÉTODOS TRADICIONALES. Primero y Segundo trimestre 4. IDENTIFICAR Salmonella y MICROORGANISMOS PSICRÓFILOS INVOLUCRADOS EN EL DETRIORO DEL PULPO POR TÉCNICAS MOLECULARES Tercer Trimestre 5. DETERMINAR LA PRESENCIA DE AMINAS (CADAVERINA Y PUTREFACINA), Y COMPUESTOS VOLÁTILES PRODUCIDAS POR EL METABOLISMO MICROBIANO POR CROMATOGRAFIA DE GASES Y HPLC. Tercer Trimestre y cuarto trimestre 6. ESTABLECIMIENTO DE LOS PREREQUISITOS DE BUENAS PRÁCTICAS PARA EL MANEJO DE POSCAPTURA DEL PULPO Y CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO. Cuarto trimestre 7. ELABORAR UN MANUAL CON LAS RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DEL PULPO BASADO EN LA ACTIVIDAD 6. Cuarto Trimestre DESGLOSE FINANCIERO OTROS FONDOS No cuenta con otros fondos. 13 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN APORTACION DE INSTITUCIONES PARTICIPANTES $ 200,000 en equipo e infraestructura, y mano de obra. RECURSOS SOLICITADOS POR TRIMESTRE A LA FUNDACION PRODUCE Primer trimestre: $300,000 Segundo Trimestre: $300,000 Tercer Trimestre: $100.000 RESUMEN DE MEMORIA DE CALCULO Cuarto Trimestre: $100,000 (Desglose por trimestre) Conceptos Trim. 1 TRim 2 TRim.3 TRim.4 Total $40000 $40000 $40000 $40000 $160,000 $210,000 $140,000 $20,000 $30,000 $400,000 $30,000 $10,000 para técnicos $50,000 $20,000 $20,000 $90,000 Viáticos para viajes técnicos científicos $30,000 $10,000 $10,000 $50,000 Honorarios asimilables sueldos a Artículos, materiales y útiles diversos Materiales vegetales animales vivos, y/o Servicios externos y comerciales Documentos servicios información y de Ediciones impresiones e Pasajes eventos científicos $40,000 Equipo y maquinaria $30,000 $30,000 Gastos para trabajos de campo $20000 $20,000 Pasajes para trabajos de campo Viáticos para trabajo de campo $10,000 $10,000 Eventos demostrativos y/o de 14 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN capacitación Total $300,000 $300,000 $100,000 $100,000 $800,000 Se necesita para los muestreos del pulpo, gasolina para transporte, reactivos generales, medios de cultivo, material moleculares (dntps; taq polimerasa, enzimas de restricción, etc.), material para microbiologia (Medios de cultivo, cajas petri, vasos, matraces, etc.).También para la determinación de aminas biogenicas se requiere para la compra de helio, N2 y otros gases. Para el análisis de resultados y la elaboración de manuales se requiere papeleria, material de computo (toners, discos), etc. RELACION BENEFICIOCOSTO Si los pescadores y los industriales de las congeladoras adoptan las recomendaciones para el buen manejo poscaptura del pulpo disminuirá el deterioro y por ende habrá una buena comercialización del producto repercutiendo en un beneficio económico, por lo que la relación beneficio/costo esta justificado. MARCO LÓGICO RESUMEN NARRATIVO fin Contribuir a comercializar productos pesqueros de buena calidad. INDICADORES1 Comercializar productos pesqueros de buena calidad al 100% Lograr la MEDIOS DE VERIFICACION SUPUESTOS 2 Cuando disminuya la presencia de salmonella durante el manejo poscaptura del pulpo. 1 Los indicadores presentan información necesaria para determinar el progreso hacia el logro de los objetivos establecidos por el proyecto. Los indicadores hacen específicos los resultados esperados en tres dimensiones: cantidad, calidad y tiempo Es recomendable, revisar la columna de los indicadores, para lo cual deberá verificarse que: Los indicadores de Propósito no sean un resumen de los Componentes, sino una medida del resultado de tener los Componentes en operación; Los indicadores de Propósito midan lo que es importante; Todos los indicadores estén especificados en términos de cantidad, calidad y tiempo; Los indicadores para cada nivel de objetivo sean diferentes a los indicadores de otros niveles; El presupuesto sea suficiente para llevar a cabo las Actividades identificadas. 2 Cada proyecto comprende riesgos ambientales, financieros, institucionales, sociales, políticos, climatológicos u otros factores que pueden hacer que el mismo fracase. El razonamiento es el siguiente: si llevamos a cabo las Actividades indicadas y ciertos supuestos se cumplen, entonces produciremos los componentes indicados. Si producimos los Componentes indicados y otros supuestos se cumplen, entonces lograremos el Propósito del proyecto. Si logramos el Propósito del proyecto, y todavía se siguen demostrando los supuestos ulteriores, entonces contribuiremos al logro del Fin. 15 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN propósito Conocer los puntos de origen más importantes de la salmonella. Identificar los microorganismos así como las aminas biogénicas y compuestos volátiles producidas por el metabolismo microbiano durante el proceso de deterioro de pulpo octopus maya. comercializacion de los productos pequeros de buena calidad a mediano plazo (3 a 5 años) Cuando se realice un buen manejo poscaptura del pulpo y se reduzca el deterioro del mismo. Saber la incidencia de la salmonella en el pulpo en un año. Documento impreso donde se señale la presencia o ausencia de salmonella durante el manejo poscaptura del pulpo. Que los pescadores adopten las buenas practicas poscaptura del pulpo. Que se incremente en 100% la comercialización del pulpo de buena calidad. Que los resultados obtenidos sobre las condiciones de almacenamiento del pulpo sean adoptados por los comercializadores del pulpo Identificar los microorganismos y los compuestos bioquímicos que estan involucrados en el deterioro del pulpo en un año. Productos con buena Calidad microbiológica en 3 años- Conocer las medidas de prevención, control y erradicación. 16 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN productos/componentes 1. Documento tecnico con la información de microorganismos y compuestos bioquímicos identificados. 2. Manual con las recomendaciones para el manejo postcaptura del pulpo para prevenir su deterioro y comercializar un producto de buena calidad Actividades Producto: documento técnico con la información de microorganismos y compuestos bioquímicos identificados. actividades: 1. Muestreo del pulpo en el puerto de celestún. 2. Realizar el almacenamiento del pulpo a diferentes temperaturas para evaluar el proceso del deterioro. 3. Aislar y purificar los principales microorganismos causantes del deterioro por métodos tradicionales. 4. Identificar salmonella Manual tecnico Manual de recomendaciones Para poder desarrollar este proyecto se requiere un presupuesto de $800,000.00 debido a que los reactivos microbiológi-cos y moleculares son caros por lo que se requiere una fuerte inversión para poder cumplir con el propósito y llevar a buen término los resultados planteados en este proyecto. Documento impreso del manual tecnico. Documento impreso del manual de recomendaciones Informes técnicos trimestrales. Que se identifiquen los microoganismos y sus productos metabolicos. Que se adopte la tecnología Que se apliquen adecuadamente las buenas practicas de manejo del producto pesquero Que se realicen todas las etapas del proceso de manejo de los productos pesqueros Informes financieros trimestrales Contar con los equipos de refrigeración necesarios Que haya un suministro constante de energía eléctrica Para la determinación de los microrganismos y compustos bioquimicos implicados en el deterioro se 17 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN y microorganismos psicrófilos involucrados en el detrioro del pulpo por técnicas moleculares. 5. Determinar la presencia de aminas (cadaverina y putrefacina), y compuestos volátiles producidas por el metabolismo microbiano por cromatografia de gases y hplc. Producto: manual con las recomendaciones para el manejo postcaptura del pulpo para prevenir su deterioro y comercializar un producto de buena calidad actividades: 6. Establecimiento de los prerequisitos de buenas prácticas para el manejo de poscaptura del pulpo y condiciones de almacenamiento. 7. Elaborar un manual con las recomendaciones para el manejo del pulpo basado en la actividad 6. requiere: Muestreos, transporte, reactivos generales, medios de cultivo, material moleculara (dnts; taq polimerasa, enzimas de restricción, etc.), material para microbiologia (cajas petri, vasos, matraces, etc.) Para la determinación de aminas biogenicas se requiere para la compra de helio, N2 y otros gases. CONDICIONES PREVIAS Contar con los recursos económicos en tiempo y forma. Análisis de resultados Elaboración de manuales se requiere papelería, material de computo (toners, discos), etc. Que los proveedores surtan a tiempo los materiales y reactivos. Que haya un abastecimiento suficiente de los productos pesqueros. Que no haya contingencias ambiéntales: lluvias, ciclones entre otros. IMPACTOS ESPERADOS AMBIENTALES Al disminuir el deterioro se disminuye también los efectos ambiéntales causados por los desechos de pulpo descompuesto. ECONÓMICOS Descripción de los cambios económicos con la aplicación de los resultados 18 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN del proyecto. SOCIALES Descripción de los cambios sociales con la aplicación de los resultados del proyecto TECNOLÓGICOS O CIENTIFICOS En el aspecto tecnológico es importante resaltar que todo el conocimiento generado seria nuevo, debido a que no hay información disponible con respecto a los microorganismos y sus compuestos que causan deterioro poscaptura en la pesquería del pulpo. El desarrollo de este proyecto permitirá abrir la ventana al conocimiento científico respecto al comportamiento microbiano en el pulpo con lo cual se podrán establecer estrategias para la conservación y calidad del mismo y evitar riegos alimentarios. De igual modo se implementarán y se adaptarán técnicas analíticas necesarias en el sector pesquero para la detección de microorganismos y compuestos que deterioran este molusco. USUARIOS BENEFICIARIOS DIRECTOS La empresa HULKIN RFC: HKI-960610-Q9A Calle 29 No. 109 A Puerto de abrigo Celestún Yucatán Tel. 91 (991) 62007 Fax: 91 (991) 62021 PESCADORES, COOPERATIVAS DE PESCADORES DUEÑOS DE CONGELADORAS QUE COMERCIALIZAN EL PULPO. INDIRECTOS PRODUCTORES COOPERANTES Publico consumidor del pulpo así como compradores nacionales y extranjeros. Julián A. Reyes Ortigosa Presidente de captura y comercialización de especies marinas. REGISTRO DE PARCELAS Y/O LOTES No aplica GRUPO DE TRABAJO GRUPO DE TRABAJO 1. Dr. Enrique Sauri Duch (Colaborador) Especialidad: Ciencia y tecnología de alimentos Institución: Instituto Tecnológico de Mérida Correo electrónico: [email protected] 19 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN Actividades a realizar: Colaboración en la determinación de aminas biogénicas por HPLC. 2. Dr. Luis Cuevas Glory Especialidad: Bioquímica Institución: Instituto Tecnológico de Mérida Correo electrónico: [email protected] Actividades a realizar: Colaborar en la determinación de compuestos volátiles por cromatografía de gases. Se anexa vía sistema la currícula profesional por colaborador. DATOS DE LA INSTITUCION RESPONSABLE FORTALEZA INSTITUCIONAL Los laboratorios cuentan con las instalaciones y servicios necesarios, (zonas para experimentación, luz, agua, mesas de laboratorio con instrumentación analítica especializada). Entre los principales equipos e instrumentos que se tienen se encuentran: espectrofotómetro ultravioleta-visible, cromatógrafo de líquidos, medidor de pH, horno de microondas, medidor de actividad de agua, refrigeradores con control de temperatura, congelador, cromatógrafo de gases, Equipo HPLC, centrífuga de laboratorio, balanza analítica digital, medidor de color, refractómetro, balanza granataria, estufa de incubación, horno de esterilización, entre otros equipos requeridos para el desarrollo del proyecto. Se cuenta también con una biblioteca especializada con libros y algunas revistas relacionadas con la ciencia y tecnología de alimentos y la biotecnología, así como con bases electrónicas de datos. Se tiene también acceso a Internet. El personal que participa en el proyecto es de alto nivel en su preparación académica y con experiencia en investigación. DATOS DE REPRESENTANTE LEGAL M.C. Abel Zapata Dietrich DATOS DEL RESPONSABLE TECNICO Nombre: Elsy Noemi Tamayo Canul CURP: TACE-551020MYNMNL07 Profesión: Doctorado en Ciencias Químicas 20 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 TÉRMINO FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS DESCRIPCIÓN Especialidad: Microbiología e Ingeniería genética Grado académico: Doctor Correo electrónico: [email protected] Institución a la que pertenece: Instituto Tecnológico de Mérida Adscripción: Departamento Domicilio laboral: Km 5 Carretera Mérida Progreso, Telefono y fax:9 448479 DOCUMENTOS SOPORTES DOCUMENTO DE PROTOCOLO EN EXTENSO DEL PROYECTO A PROPONER Deberá de enviarse a través del sistema archivo electrónico que contenga los elementos que señala el presente formato de protocolo de proyecto. Es requisito indispensable cargar dicho archivo en el Sistema de Información de las Fundaciones Produce (SIFUPRO). CARTA DE APOYO INSTITUCIONAL Deberá de enviarse a través del sistema una carta de apoyo de la institución a la que pertenece el proponente, mismo que estará firmada por el presidente, director, gerente o jefe de campo de dicha institución. Es requisito indispensable cargar dicho archivo en el Sistema de Información de las Fundaciones Produce (SIFUPRO). CURRICULA PROFESIONAL DEL PROPONENTE Documento que resuma la formación académica y experiencia profesional y desarrollos tecnológicos realizados por el responsable técnico del proyecto que permita demostrar los elementos que permitan juzgar la capacidad del líder para coordinar el proyecto. Deberá de enviarse a través del sistema archivo electrónico que contenga el curriculum profesional del proponente. Es requisito indispensable cargar dicho archivo en el Sistema de Información de las Fundaciones Produce (SIFUPRO). OTROS DOCUMENTOS ANEXOS Se podrán cargar documentos que se consideren importantes para la evaluación del proyecto. COMENTARIOS ACLARATORIOS COMENTARIOS ACLARATORIOS Se esta considerando iniciar en agosto porque la temporada del pulpo es de 1 de agosto a 15 de diciembre de cada año. 21 DEFINICION DE TERMINOS CONTEMPLADOS EN PROTOCOLO EN EXTENSO CONVOCATORIA 2010 Bibliografía consultada: Resumen de la Matriz del Marco Lógico, Fundación Produce Nuevo León, A.C. Formato de protocolo de proyecto de investigación (Convocatoria 2010), Fundación Produce Nuevo León, A.C. Formato de protocolo de proyecto de transferencia de tecnología (Convocatoria 2010), Fundación Produce Nuevo León, A.C. Formato de proyecto en extenso, Fundación Produce Sinaloa, A.C. Metodología del marco lógico para la planificación, el seguimiento y la evaluación de proyectos y programas, Instituto Latinoamericano y del Caribe de Planificación Económica y Social (ILPES)/Naciones Unidas-CEPAL. 22