METABOLISMO DEL DNA Replicación de DNA

Facultad de Química, UNAM
Energía Química derivada de la hidrólisis de ATP
Enlaces fosfoéster
∆G0’ = -14 kJ/mol
Enlaces fosfoanhídrido
1630 Genética y Biología Molecular
METABOLISMO DEL DNA
∆G0’ = -30 kJ/mol
Replicación de DNA
ATP + H2O ↔ ADP + Pi
La hidrólisis de ATP favorece termodinámicamente las
reacciones acopladas
Durante el Ciclo celular se controla la replicación del
DNA y la división de la célula
P-M-A-T
Energía Química derivada de la hidrólisis de ATP
Muchas enzimas involucradas en el metabolismo del DNA
requieren ATP.
• Tienen sitios de unión a ATP
• Tienen actividad de ATPasa
• Transducen la energía
química derivada de la
hidrólisis de ATP a energía
mecánica.
• Se refleja como cambios
conformacionales en la
estructura de la proteína.
1
Experimento de Meselson y Stahl
Generalidades de la Replicación de DNA
La replicación de DNA es:
•
Semiconservativa
•
Semidiscontinua
•
Bidireccional
•
Dependiente de un cebador de RNA
Alimentar cultivo
de E. coli con
fuente de 15N y
purificar el DNA
Separación de DNA por
centrifugación en gradiente de
CsCl
Experimento de Meselson y Stahl
Mecanismo semiconservativo de la replicación del DNA
Comprobación del mecanismo semiconservativo de Replicación
Hebras parentales
Estructura del DNA
Doble Hélice
Replicación
Hebras hijas
Semiconservativo
Cadenas
complementarias
Conservativo
DNA (15N)
DNA
híbrido
(15N/14N)
Dispersivo al azar
¿Pruebas experimentales del mecanismo de
replicación semiconservativo?
Consistente con
un mecanismo
semiconservativo
Se deja otro ciclo
de replicación
2
La replicación del DNA es semidiscontinua
Reiji Okazaki
5’
3’
*
Síntesis continua requiere
que las DNA polimerasas
sintetizen DNA de 5’->3’ y
de 3’ a 5’
5’
*
3’
3’
3’
5’
5’
5’
3’
Síntesis semidiscontinua
predice que una cadena se
sintetiza en forma continua
y la otra en forma
discontinua.
5’
3’
Como la dirección de síntesis de la cadena discontinua es
opuesta a la dirección de apertura de la horquilla, se
comienza una nueva cadena.
En cambio, la cadena continua simplemente se sigue
elongando
Durante la replicación del DNA se sintetizan fragmentos que
varían entre 1000 a 2000 nucleótidos
Reiji Okazaki
5’
Estos fragmentos
corrsponden a la cadena
discontinua.
*
3’
3’
Se llaman fragmentos de
Okazaki.
5’
5’
3’
Como la dirección de síntesis de la cadena discontinua es
opuesta a la dirección de apertura de la horquilla, se
comienza una nueva cadena.
En cambio, la cadena continua simplemente se sigue
elongando
Replicación semidiscontinua:
Una hebra se sintetiza en forma continua y la otra discontinua
Cadena adelantada (leading)/ Cadena retrasada (lagging)
3
¿Es la replicación del DNA unidireccional o bidireccional?
Resultados del Experimento de Gyurasits y Lake
En bacterias, que tienen genoma circular cerrado
Replicación del DNA de E.
coli por 1.5 generaciones
en presencia de
nucleótidos marcados
Autoradiografía
Demostración experimental de que la replicación
del DNA es bidireccional
Experimento de Gyurasits y Lake
DNA de Bacillus subtilis (ventajas?)
Pulso de baja intensidad
en el inicio
La replicación de DNA requiere de la síntesis de RNA
• El antibiótico rifampicina inhibe la
replicación del DNA de fago M13
cuando se usa un extracto de E. coli
como fuente de enzima.
• La DNasa no hidroliza
completamente los fragmentos de
Okazaki. Deja cadenas de 10 a 12
oligonucleótidos de largo.
• La naturaleza de los
oligonucleótidos es RNA.
Pulso de alta intensidad
• La síntesis de DNA requiere ser
comenzada por cebadores de RNA
que luego son elongados por la DNA
polimerasa.
4
Topología del DNA y Topoisomerasas
La naturaleza de doble hebra del DNA tiene varias
implicaciones para su función biológica:
La Replicación se parece facilitar ya que la
información genética está codificada por duplicado en
la estructura del DNA.
También, las limitaciones impuestas por la naturaleza
de doble hélice en el DNA implica que muchos
eventos que involucran desenrollamiento (relajación)
causan tensión en la molécula.
Las distintas formas de enrollamiento de un DNA se
pueden resolver por electroforesis en geles de
agarosa
El DNA superenrollado
migra más
rapidamente que una
molécula relajada del
mismo tamaño.
El DNA separado
solamente difiere en
su topología, por lo
que a las distintas
formas se les llama
topoisómeros.
Muchos eventos metabólicos del DNA requieren la apertura de la doble hélice.
El DNA puede pasar de una forma
superenrollada a una forma más relajada
• La apertura de la doble hélice está restringida puesto que las
hebras que se separan no tienen rotación libre. El
desenrollamiento de las dos hebras se convierte en un evento
topológicamente imposible.
• A un segmento de DNA que está constriñido en la rotación de
los extremos, se le llama dominio topológico.
• Un ejemplo canónico de un dominio topológico es un DNA
circular, que es típico del genoma de bacterias, mitocondria,
cloroplastos y los plásmidos.
Aunque los cromosomas eucariontes son lineales, forman
asas de DNA que están unidas a la matriz nuclear.
Estas asas representan dominios topológicos que son
equivalentes a los dominios de DNA circular.
5
Mecanismo de la Topoisomerasa
Una cadena de la doble hélice es cortada y la enzima
permanece unida covalentemente al fosfato en el extremo 5’.
La hebra intacta del DNA pasa a través del corte y la enzima
vuelve a formar el enlace fosfodiéster.
La replicación de DNA comienza en una zona definida
del genoma llamada origen de replicación
En Escherichia coli el locus oriC es de 245 pb
La secuencia del origen de replicación en procariontes
está altamente conservada
Relación entre las propiedades de la
replicación de DNA y las enzimas que lo
realizan
El origen de replicación en procariontes es muy
conservado
¿Cómo es reconocido el origen de replicación?
¿Cómo se separan las dos hebras de DNA?
¿Cómo se mantienen las dos hebras separadas?
¿Qué enzima sintetiza el cebador de RNA?
¿Cómo se unen los fragmentos de Okazaki?
4 cajas dnaA (nonámeros)
3 repeticiones de 13 nucleótidos/ Región donde comienza a
abrirse el DNA (65 – 70% A + T) Región P1
GATC: Sitios de reconocimiento Metiltransferasa Dam
6
Proteína Dna A
Reconocimiento del oriC
1. La proteína HU causa torsiones en el DNA y facilita su unión a
la proteína DnaA
• Tiene una muy alta afinidad por ATP y lo hidroliza
lentamente a ADP en una forma dependiente de
DNA.
• Actúa como regulador de la iniciación.
• Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a
las cajas dnaA de oriC. Aprox. 30 subunidades de
DnaA por origen de replicación.
• Se une a DNA de cadena sencilla.
• Facilita la unión de la helicasa al origen de
replicación.
2. La unión del complejo HU-ATP-DnaA desestabiliza la doble
hélice en la región P1
3. Unión de DnaB a la región abierta del DNA.
7
Proteína DnaB. Helicasa
Proteína SSB “Single-strand binding”
Forma un homohexámero.
Tiene dominios que se requieren
para:
•Unión a DNA de cadena doble
La proteína SSB se une al DNA de cadena sencilla con alta
afinidad y así previene que se vuelva a formar el híbrido DNADNA. Actúa de manera cooperativa con la actividad de helicasa.
• Activación de la primasa
• Hidrólisis de ATP
La helicasa rodea una de las hebras del
DNA duplex y se desplaza logrando la
apertura de la doble hélica por exclusión
estérica.
Una hebra es excluida del canal interno,
mientras que la otra hebra es retenida en
el interior del anillo.
Unión de la helicasa (dnaB) al origen de replicación y
apertura de la doble hélice de DNA
DnaG Primasa
La primasa sintetiza oligoribonucleótidos de 10 a 12 unidades
de longitud, usando rNTPs. Es
dependiente de molde y la
secuencia corresponde al origen de
replicación.
El extremo 3‘ del último
ribonucleótido es extendido como
DNA por la acción de la DNA
polimerasa. Se forma una unión
covalente entre RNA y DNA
8
ELONGACION
INICIACION
DNA POLIMERASAS
La actividad de DNA polimerasa
cataliza la adición de un dNTP al
extremo 3’-OH de un
polidesoxinucleótido por un
mecanismo de desplazamiento
nucleofílico .
Éste es complementario al DNA molde.
Una vez que el cebador está en su lugar comienza la
síntesis de DNA: ELONGACION
DNA polimerasa I (A. Kornberg)
Fue la primera DNA polimerasa
descrita y caracterizada.
Representa la función de otras DNA
polimerasas.
Enzima dependiente de molde (DNA)
Síntesis de una cadena de DNA en
dirección de 5’ Æ 3’
Es un monómero de 102 kDa
Tiene 3 actividades:
Fragmento Klenow de la DNA Pol I
1. Polimerización DNA
2.
Actividad de exonucleasa 3’-> 5’
3.
Actividad de exonucleasa 5’ -> 3’
324
520
928
N
Exo 5’-3’
C
Exo 3’-5’
Pol
9
Hay dos propiedades importantes de las DNA
POLIMERASAS:
FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD
La FIDELIDAD se refiere al
seguimiento exacto de la secuencia
que sirve como molde. En promedio,
las DNA pols, 1 error por cada 108 nts
La actividad de exonucleasa 3’Æ 5’ de
la DNA polimerasa contribuye a la
fidelidad pues tiene actividad
correctora (proofreading).
Competencia cinética entre la actividad de Polimerasa y de Exonucleasa
La PROCESIVIDAD se refiere a la capacidad de una DNA
polimerasa de elongar una cadena de DNA por muchos nucleótidos
antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato.
La DNA polimerasa III requiere de la subunidad β
para incrementar su procesividad
Cuando se une la subunidad β se incrementa la procesividad de
la DNA pol III de 10 nts. a mas de 50,000 nts. Así, puede
sintetizar 1000 nts/seg.
La subunidad β es el factor de procesividad y actúa como una
abrazadera o pinza móvil que se une al DNA.
Forma un homodímero
funcional compuesto por dos
subunidades de 40.6 kDa
que permanecen unidos a
DNA circular cerrado.
La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja.
La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.
Descubrimiento de la DNA polimerasa III
Mutantes de E. coli en el gen de Pol I son viables, por lo que la DNA
Pol I no es la principal enzima en replicación.
El ensamblado del complejo γ requiere la unión de
ATP que es hidrolizado durante el cargado de la
subunidad β al DNA
Sin embargo, en E. coli w.t.; por cromatografía de intercambio iónico,
copurifica y enmascara otra actividad de DNA polimerasa.
La DNA polimerasa III está compuesta por muchas
subunidades distintas. Holoenzima Pol III
Subunidad α: 129 kDa, tiene actividad de DNA polimerasa
Subunidad ε: 27.5 kDa, tiene actividad de exonucleasa 3’Æ 5’
10
En la DNA polimerasa III hay dos núcleos del
elemento catalítico (core).
TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN EN
PROCARIONTES
Las dos horquillas de
replicación se aproximan a la
misma región que contiene
las cajas Ter. Son secuencias
de 22 pb, tambien llamados
sitios de terminación. Están
presentes en tandem (seis)
en forma invertida.
A estas secuencias se unen
las proteínas TUS (TBP).
La presencia de estas
proteínas de unión a DNA
causa que se detenga el
avance de las horquillas.
Función de la DNA pol III dimérica
Para que la DNA polimerasa
dimérica pueda sintetizar DNA
sobre ambas cadenas, el molde de
DNA de la cadena retrasada se
debe doblar unos 180o para
aparecer que va en la misma
dirección que la cadena
adelantada.
Tus: termination utilization
substance TBP: Termination
binding protein. Proteína de 36
kDa que afecta la actividad de
la DNA helicasa (DnaB).
TERMINACIÓN. Desenrrollamiento y Síntesis
reparativa.
Las dos hebras duplex, productos de la
replicación están enrrolladas
La topoisomerasa IV contribuye a la
desnaturalización y descatenación de las
hebras. Mutantes en el gene de TopoIV
exhiben cromosomas que no se han
separado totalmente.
Ocurre síntesis reparativa para llenar los
huecos
11
Función de la DNA polimerasa I en la replicación
REPLICACIÓN DE DNA EN EUCARIONTES
En eucariontes, la replicación comienza en muchos sitios a lo
largo de los cromosomas.
Función de la DNA ligasa en la replicación
1. Formación del
intermediario
Enzima ATP
Los orígenes de replicación de metazuarios no están definidos por
una secuencia específica, como el oriC.
Sino que consisten en:
• Sitios de inicio de alta frecuencia
• Sitios de inicio de baja frecuencia
2. Transferencia
del adenilo al 5’-P
Los orígenes de replicación se establecen durante la fase G1 del
ciclo celular y dependen de mucho parámetros:
• Estructura nuclear
3. Formación
del enlace
fosfodiéster
• Contenido de G+C ([G+C], mayor que el resto del genoma)
• Modificaciones en el DNA. Baja metilación en G y C.
•Estructura de la cromatina. Histonas H3 metiladas y H4 acetiladas.
Permite modificar el número y localización de los orígenes de rep.
La DNA ligasa de E. coli es una enzima de 75 kDa. Es muy lábil
12
ELONGACIÓN EN EUCARIONTES
TERMINACIÓN EN EUCARIONTES
DNA POLIMERASAS
El dilema de los cromosomas lineales
Se han identificado mas de 20 DNA polimerasas en eucariontes.
La mayoría participa en eventos de reparación de DNA.
Las DNA polimerasas replicativas son:
DNA polimerasa α. Procesividad baja. Tiene actividad de primasa.
DNA polimerasa δ. Procesividad alta en presencia de PCNA.
DNA polimerasa ε. Procesividad alta. No requiere PCNA.
Durante la terminación
en procariontes, hay
hidrólisis del cebador
pero el extremo 3’ de la
cadena funciona para
cebar la síntesis que así
completa la cadena.
Sin embargo, en los
cromosomas lineales de
eucariontes, después de
eliminar al cebador no hay
forma de completar la
síntesis.
Esto implica que los cromosomas se irían acortando después de
cada ronda de duplicación
Proliferating-Cell Nuclear Antigen (PCNA)
TERMINACIÓN EN EUCARIONTES
El dilema de los cromosomas lineales. La Solución
• PCNA es una proteína de 29
kDa.
• Forma un trímero alrededor del
DNA.
• Incrementa la procesividad de
la DNA pol delta hasta 40 veces.
•Se ha demostrado su interacción
in vitro con mas de 50 proteínas.
Entre ellas:
• Ciclina D1, cdk2 y el inhibidor
de cdks
Telomerasa. Enzima que adiciona
secuencias cortas que se repiten
en los extremos de los
cromosomas. Telómeros.
Las secuencias repetidas varían
entre especies:
Tetrahymena
TTGGGG
Humano
TTAGGG
Paramecium
TTGGGG
Trypanosoma
TTAGGG
Arabidopsis
TTTAGG
13
La telomerasa es una DNA polimerasa que utiliza RNA
como molde
Mecanismo de acción de la telomerasa
La telomerasa está
compuesta por dos
subunidades:
• Subunidad catalítica
(proteína)
• Subunidad de RNA
asociada
Funciona como molde
para elongación de
una de las cadenas.
Mecanismo de acción de la telomerasa
El resultado:
La telomerasa está presente en
células embrionarias, pero en
células somáticas su actividad es
muy baja.
14
Facultad de Química, UNAM
Agentes físicos naturales que dañan al DNA.
Radiación UV solar.
Formación de dímeros de timina.
1630 Genética y Biología Molecular
METABOLISMO DEL DNA
Entrecruzamiento
covalente de pirimidinas
adyacentes en la misma
cadena de DNA.
Generalmente son timinas.
Reparación de DNA
El DNA puede ser dañado de muchas maneras, pero este daño
solamente conduce a una mutación cuando no es reparado.
Agentes químicos naturales que dañan al DNA.
AFLATOXINAS
Formación de aductos covalentes con el DNA
• Daño: Se refiere a cambios químicos en el DNA.
• Mutación: Se refiere a cambios en la secuencia de bases
del DNA.
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Agentes químicos sintéticos que dañan al DNA.
EMS => Acetilación / Nitrosamina => Metilación
Los radicales libres que se forman también pueden modificar
quimicamente una base, como la guanina.
Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que
participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la
doble hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.
La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención
de la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.
Agentes físicos que causan daño al DNA.
Rayos X y rayos gamma.
Ionizan moléculas que
rodean al DNA generando
radicales libres, algunos de
estos contienen oxígeno que
tienen un electrón
desapareado. Son especies
altamente reactivas y
pueden atacar la molécula
del DNA causando rupturas
en una o en las dos
cadenas.
Generación de 8-oxo-guanina. Causa transversiones: GC -> TA
Tipos de mutaciones de pares de bases.
Secuencia silvestre
CATTCACCTGTACCA
GTAAGTGGACATGGT
Transición (T-A to C-G)
CATCCACCTGTACCA
GTAGGTGGACATGGT
Transversión (T-A to G-C)
CATGCACCTGTACCA
GTACGTGGACATGGT
Sustituciones de pares de bases
• transición: pirimidina a pirimidina
• transversión: pirimidina a purina
Deleción o eliminación
CATCACCTGTACCA
GTAGTGGACATGGT
Inserción
CATGTCACCTGTACCA
GTACAGTGGACATGGT
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Cuando los daños no son reparados, se pueden
generar cambios en las secuencia de las bases
durante la replicación, por lo lo que se genera una
mutación.
Reparación de DNA por Escición
Implica la remoción del DNA dañado y de secuencias adyacentes
también.
BER: “Base excision repair”
NER: “Nucleotide excision repair”
REPARACIÓN.
•Corrección directa del DNA dañado.
• Eliminación de la región dañada del DNA y
rellenarlo con DNA recien sintetizado.
Reparación Directa de Daños al DNA. Fotoreactivación
Sistema de reparación que se activa en
presencia de luz.
Fotoliasa. Detecta al DNA dañado y se
une a éste. La enzima absorbe luz azul y
se activa. Rompe los enlaces covalentes
entre los dímeros de timina.
La enzima se disocia y se separa del
DNA.
Reacción
dependiente
de FADH
Reparación de DNA por Escición de Nucleótidos (NER)
Escinucleasa uvrABC realiza
este tipo de reparación en
dímeros de timina, otros
fotoproductos y bases dañadas.
Escinucleasa (246 kDa) está
compuesta por tres
subunidades (A, B y C)
UvrA se une al DNA en la
región dañada.
UvrB/UvrC tienen actividad de
endonucleasa y corta en los
lados adyacentes de la cadena
liberando un oligonucleótido de
unos 12-13 nts de largo.
La región “vacía” es rellenada
por una DNA polimerasa I y
sellada por una DNA ligasa.
17
Reparación sujeta a errores
Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes
Una vez que se ha reconocido el daño, participana las mismas
proteínas en la reparación.
• Cuando se expone E. coli
a altos niveles de radiación
o a un mutágeno, ocurre
un daño extensivo en el
DNA. La célula responde
induciendo la vía SOS de
reparación.
• Se activan los genes
umuC y umuD cuyos
productos componen las
subunidades de la DNA
polimerasa V.
• DNA PolV replica el DNA,
aun en regiones donde hay
daño y es muy propensa a
cometer errores.
• Se observa una alta tasa
de mutación
• TFIIH (XPB + XPD) que tiene
actividad de helicasa es reclutado.
• XPA y RPA contribuyen a mantener
abierta la doble hélice de DNA.
• XPA guía a las endonucleasas para
realizar el corte del DNA.
• Endonucleasa XPG corta el DNA en
el lado 3’.
• El complejo ERCC1-XPF corta del
lado 5’ de la cadena dañada.
• El oligonucleótido (24-32nts) con la
región dañada es liberado.
• Cepas de E. coli nulas en umuC son inmutables.
Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes
1. Reparación global de
genoma. El heterodímero XPC-
hHR23B localiza lesiones que
distorsionan a la doble hélice de
DNA.
2. Reparación acoplada a
la transcripción. La RNA
polimerasa identifica el daño
en el DNA. Se detiene la
transcripción.
• El hueco es rellenado por la DNA
polimerasa δ o ε.
Enfermedades asociadas con defectos en la replicación o
reparación del DNA
Asociadas con una alta frecuencia de mutaciones en cromosomas y
genes. Algunas se asocian a una alta predisposición a tumores.
• Xeroderma pigmentosum
•Mutaciones en genes involucrados en reparación por escición de
nucleótidos. Melanoma
• Ataxia telangiectasia
• Mutaciones en genes que detectan daño al DNA.
• Riesgo incrementado a rayos X.
•Anemia Fanconi.
• Mutación en gene involucrado en reparación al DNA.
•Síndrome de Bloom.
• Mutación en una helicasa de DNA.
• Hipersusceptibilidad a rayos X y a la luz solar.
•Síndrome de Cockayne (CSA/CSB)
• Defecto en reparación acoplada a transcripción.
• Susceptibilidad a luz solar.
• Síndrome de Werner.
• Mutación en un gen de DNA helicasa.
• Envejecimiento prematuro.
18
Mecanismos de la recombinación.
Para que ocurra la recombinación deben darse los siguientes
eventos:
1. Ruptura de las dos cadenas de DNA homólogas
1630 GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Recombinación de DNA
• RECOMBINACIÓN.
Se refiere al rearreglo de la información en
moléculas de DNA e involucra la
interacción de dos moléculas de DNA.
• RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA. Involucra el
intercambio genético entre dos moléculas de DNA
(o dos segmentos de la misma molécula de DNA)
que comparten una región de secuencias
homólogas.
• RECOMBINACIÓN SITIO ESPECÍFICO. Involucra el
intercambio genético en secuencias definidas de
DNA (Ej. Integración del DNA de fago λ al genoma de E.coli)
• TRANSPOSICIÓN DE DNA. La inserción de una
molécula de DNA (transposón) en el cromosoma.
2. Apareamiento de las dos cadenas de DNA homólogas
3. Regeneración de los enlaces fosfodiester para unir las
cadenas homólogas
4. Ruptura de las otras dos cadenas y volver a unirlas.
Modelos de recombinación. Modelo de Holliday
Aunque el modelo de
Holliday describe con
precisión los eventos que
ocurren, no explica
algunos aspectos del
mecanismo.
¿Cómo explicar que
ocurran dos cortes en las
posiciones exactas
correspondientes en
cadenas homólogas de
DNA?
“Holliday junction”
19
Modelo de la vía RecBCD
RecA y RecBCD
Se identificaron en mutantes de E. coli que aceptaban el
plásmido F, pero eran incapaces de recombinarlo.
• Proteína RecBCD:
RecA es una proteína de 38 kDa. Promueve intercambio de
cadenas in vitro. Se distinguen tres etapas.
• Corte en el extremo 3’ de la
secuencia “Chi” χ
• RecBCD también tiene
actividad de helicasa.
• Unión de RecA y SSB al DNA
• Invasión y desplazamiento
del DNA duplex.
• Formación del asa D
• Apareamiento en la región
homóloga.
Pre-sinápsis. RecA se une al
DNAss
Sinápsis. Alineamiento de las
secuencias complementarias que
participan en el intercambio (50 –
150 pb).
Post-Sinápsis. La cadena sencilla
desplaza y reemplaza a la cadena
(+) del DNA de doble cadena.
-+
Modelo de la vía RecBCD
RecBCD
• Apareamiento en la región
homóloga.
Esta enzima tiene cinco actividades:
• Corte en la cadena
desplazada
exonucleasa V; helicasa,
endonucleasa; ATPasa y
exonucleasa sobre DNAss
• Apareamiento.
+
La actividad de helicasa genera asas
grandes antes de que el DNA se
vuelva a renaturalizar.
•Sellado por la DNA ligasa
• RuvA + RuvB = Helicasa
dependiente de ATP.
Desplazamiento de la rama.
• RuvC: Resolvasa, hace los
cortes en las dos cadenas para
la generación de las dos
moléculas de DNA duplex
recombinadas.
Cuando RecBCD encuentra una
secuencai Chi, se disocia la
subunidad D y la la enzima RecBC
actúa como helicasa para abrir el
DNA en un evento dependiente de
ATP. Se realiza el corte en el DNA y
se genera la cadena sencilla de DNA
que es estabilizada por RecA y SSB
para iniciar el proceso de
recombinación.
20
RuvA + RuvB. Desplazamiento de la rama.
Estas proteínas se unen en cruce de Holliday y son las
responsables del desplazamiento de la rama.
RuvA es un homotetrámero con simetría cuadrada plana que
reconoce y se une al cruce de Holliday. Esto facilita la unión
del hexámero RuvB. Helicasa dependiente de ATP, abre la
cadena y la desplaza lo necesario para la migración de la
rama.
RuvC Resolvasa.
Una vez que se han recombinado las cadenas y se han
desplazado, debe ocurrir un corte para liberar el par de DNA
duplex.
Hay secuencias consenso de reconocimiento:
5’- (A/T)TT (G/C)-3’
Actividad de RuvA
www.sdsc.edu/journals/mbb/ruva.html
21