SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO Las circunstancias sobre el

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SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO
Rh
Las circunstancias sobre el descubrimiento del sistema
004(ISBT) llevan aún hoy un vigoroso debate, en 1939,
Philip Levine y Rufus E. Stetson describen un caso de enfermedad hemolítica del recién nacido en
1937, (pueden acceder al Primer trabajo Rh) pero no le dieron un nombre al anticuerpo detectado,
era una paciente Mary Seno, si le hubieran puesto nombre al anticuerpo, así se llamaría en la
actualidad el sistema.
El sistema recibe el nombre casi desde el relato de una fábula: “El conejo y el mono” de la mano
de los autores del hallazgo: Karl Landsteiner y Alexander Wiener en 1940, ellos describen
anticuerpos producidos en los conejillos de indias que habían sido inyectados con glóbulos rojos
de monos Rhesus, de allí su nombre (Les dejo un link para que lo conozcáis:
quiero conocer el Monito ).
En un momento se sugirió que el sistema había sido
descubierto antes por Buchbinder en 1933, Richard
Rosenfield quién se encargó de precisar el primer
modelo genético y acuño la terminología, dijo en los
años 70´ que Buchbinder era un estudiante graduado
en el laboratorio de Landsteiner y sugirió que algunos
de los anticuerpos con especificidades por el sistema
que fueran luego reportadas por Landsteiner y Wiener
habían sido antes demostradas por este joven en 1933.
Adjunto el artículo original “Genetic Model for the Rh
Blood-Group System” Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 70,
No. 5, pp. 1303-1307, May 1973”.
En la actualidad se han propuesto todo tipo de teorías sobre la historia del sistema que tomo el
cuarto lugar en el listado de la ISBT. Si miramos hacia atrás vemos a Wiener en 1941 describiendo
un antígeno C (rhC) presente en la mayoría de los Rh+ dijo él; el mismo año Levine describió el c
(hrc), un antigeno presente en la mayoría de los Rh– decía; luego Race, Wiener and Sonn en 1943,
reportaron el descubrimiento del antígeno E (rh²) presente en algunos Rh + particularmente, dicen
si son Rh+, C– encuentran el antígeno E. Fue Fisher quien postuló que C and c eran antitéticos y
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que esa relación era independiente de D y E. En 1945, Mourant reportó el e (hr²) y lo anticipó
como antitético del E. En 1975 Race y Sanguer publicaron finalmente un resumen sobre los cuatro
antígenos principales del sistema C c E e. Nunca se pudo verificar la existencia de un antitético del
D. Fishe y Race en 1943 ya propusieron lo existencia de tres loci o genes separados, pero
estrechamente ligados en haplotipos en el mismo cromosoma y heredados en grupos de tres.
Tal vez el aporte hacia la comprensión de la herencia (genética) y también en la manufactura de
múltiples anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopes del sistema resultaron y resultan las
contribuciones más trascendentes del sistema 004; seguro aquellos aspectos referidos a la función
biológica, formas variables y su vínculo con circunstancias patológicas, los avances en materia
desarrollo de pruebas automatizadas de genotipado extendido en donadores y pacientes, pero la
importancia en esta bendecida latitud Sur -al menos en Argentina- sigue teniendo su anclaje en el
episodio que dio a luz al conocimiento de la capacidad de los anticuerpos del sistema por dar lugar
a reacciones transfusionales, les
recuerdo que fue una mujer que
padeció
una
reacción
transfusional grave, cuando
recibió una transfusión con la
sangre de su marido después del
alumbramiento de un niño
muerto con eritroblastosis fetal.
Es entonces citable todavía
nuestra preocupación sobre la prevalencia de enfermedad hemolítica fetal y neonatal por Anti-D,
sigue siendo la principal indicación de fototerapia o de transfusiones en los recién nacidos. Mucho
menor frecuencia tienen las reacciones transfusionales tardías de moderada intensidad, porque
los protocolos transfusionales incluyen de manera ampliada pruebas que alcanzan el uso de suero
antiglobulina por diversos métodos, y generalmente se selecciona para pacientes D negativos
células rojas también D ausentes, aunque será un capítulo aparte verificar las pautas correctas
para la selección de los reactivos aptos para la tipificación de pacientes, en contraposición a los
útiles en donadores o recién nacidos.
Las mujeres en edad reproductiva y niñas deben
recibir transfusiones idéntico antígenos Rhesus
como C, C, E y e, además del antígeno K reza la
norma Alemana vigente desde el año 2000
(Richtlinien zur Gewinnung von und Blut und zur
Blutbestandteilen
Anwendung
von
Blutprodukten) Más sobre la Norma Alemana…
nunca un paciente con anti-D debe recibir
hematíes D positivos.
Es importante reflexionar que el profundo
conocimiento sobre el sistema Rh, ha permitido la toma de conciencia en los colegas y hasta en los
pacientes, pero no se ha extendido aún en Argentina el cribado sistemático en los Bancos de
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Sangre en forma exclusiva, siendo el sector privado (laboratorios de bioquímica) quienes mediante
técnicas no subordinadas a las normas específicas llevan adelante muchas veces dicha práctica
inmunohematológica, llegando los pacientes a la situación de parto, sin haber sido estudiados
conforme las guías perinatológicas acordadas.
Herencia genética y bioquímica del sistema
Desde 1960 hasta mediados de los años 80, la Prof. Patricia Tippett de Londres, junto a Ruth
Sanguer y otros, describieron la teoría sobre la existencia de dos genes estrechamente
relacionados: RDH y RHCE, y la base
de mosaico de epítopes* y formas
variantes. Colin observó la presencia
exclusiva del gen RHCE en los
negativos.
Los antígenos principalmente se
encuentran en dos proteínas Rhesus
«RhD»
y
«RHCE».
En
la
nomenclatura de CD, se denominan
CD240D
y
CD240CE.
Son
polipéptidos de paso múltiple,
acilados,
palmitilados
no
glicosilados, de 417 aminoácidos con
sus terminales NH2 y COOH
orientados al citoplasma.
A diferencia de las proteínas de otros
grupos sanguíneos, las proteínas Rhesus se expresan sólo en las membranas de las células rojas de
la sangre y sus precursores inmediatos. Los progenitores hematopoyéticos aislados de sangre de
cordón tras cultivo de 9 a 10 días y en los fetos de 6 semanas ya hay productos de RHD. El sistema
es uno de los más polimórficos e inmunogénicos conocido hasta ahora, en los seres humanos. En
los últimos 20 años una intensa investigación ha dado como resultado la clonación de los
antígenos C o c, junto con E o e, y el antígeno D.
Posiblemente son proteínas transportadoras de cationes
(Amonio), pueden funcionar como canal de gases de
CO2. La situación Rh null se acompaña en ocasiones bajo
la forma de estomatocitos#. Menos expresión de los
antígenos del sistema encontramos, en pacientes
leucémicos, con metaplasia mieloide, mielofibrosis y
policitemia. Los genes que gobiernan el Rh también dan
lugar a esferocitosis hereditaria. Algunos sujetos con
débil expresión Rh en el sudeste de Asia presentan ovalocitosis.
*(referido a: parte de una molécula que actúa
como determinante antigénico; una macromolécula puede contener muy diferentes epítopes, cada uno de ellos capaz de estimular la
producción de un anticuerpo específico) # (referido a: Invaginación central con forma de boca de los glóbulos rojos, hiperhidratación +
la resistencia osmótica decreciente + incremento sustancial de escape de cationes monovalentes, en comparación con los controles, y
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una menor importancia de la función del escape para bajar la temperatura. Los frotis sanguíneos muestran un elevado porcentaje de
estomatocitos bien formados. Se observa macrocitosis, concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) baja y un elevado
número de reticulocitos. La electroforesis revela que la proteína de membrana estomatina está ausente o presenta niveles muy bajos
(Más sobre estomatocitosis video).
En la actualidad hay 54 antígenos listados por la ISBT en el sistema 004, y un total de 7 obsoletos:
004013 (RhA) 004014 (RhB) 004015 (RhC) 004016 (RhD) 004024 (ET) 004025 (LW) 004038
(Duclos).
En la nomenclatura desde esta cátedra vamos a basarnos en la descrita por Rosenfield, también
aceptada por la ISBT, esto es que los haplotipos más heredados son: CDe para los sujetos R y cde,
para los sujetos r. La letra R se refiere a la presencia
del antígeno D (Ro, R1, R2 y ocasionalmente Rz ) y la
presencia de la letra r siempre se refiere a la
ausencia del antígeno D. El número 1 o la marca (´)
se refiere a la presencia del C. El número 2 o la
marca (“) se refiere a la presencia de E. A los
haplotipos muy poco frecuentes que tienen C y E se
les asignan las letras finales del alfabeto (y, z). Para
los sujetos Rh positivo será: CCDEE, CCDEe, CCDee,
CcDEE, CcDEe, CcDee, ccDEE, ccDEe y ccDee y para
los sujetos con Rh negativo: CCdEE, CCdEe, CCdee,
CcdEE, CcdEe, Ccdee, ccdEE, ccdEe y ccdee.
Las reglas elementales para generar el genotipo probable a partir del fenotipo son:
Determinar inicialmente los cuatro antígenos principales (C, c, E, e) y establecer el estatus D
positivo o negativo. Si el sujeto es D negativo, se acepta que es “d d”. En ausencia de C, se anota c
en cada haplotipo (c/c), si es CC se coloca C en cada uno (C/C), y si tiene C y c, se coloca C en el
primer cromosoma y c en el segundo (C/c).
Se inscribe la D en el mismo cromosoma donde está C, por ejemplo para heterocigoto C c: CD/cd.
En presencia o ausencia de E, se anota e
en cada cromosoma (e/e); E en cada
cromosoma (E/E); Ee se anota E en el
primero y e en el segundo. Se ubica la E
en el mismo cromosoma donde está D, a
menos que ya existe una C, se coloca e,
en el otro cromosoma. El fenotipo CDe es
más común que cDE y CDE.
En la tabla anterior vemos las frecuencias
del haplotipo cada 100 individuos, quiero
que presten atención a la posibilidad de
tener que transfundir un sujeto de raza negra con hematíes provenientes de un donador de raza
caucásica y que piensen el riesgo de inmunizarlo para el antígeno C.
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El número de copias por células de los antígenos,
varían dentro de cada fenotipo la tabla verde a
continuación nos muestra la dispersión entre
diferentes fenotipos, este rasgo resulta de utilidad
a la hora de pensar en pruebas de
semicuantificación relativa de anticuerpos
“titulación”. Es natural que si a un mismo
espécimen de suero con idiotipo c, lo someto a
titulación con las células DcE/DcE no resultará el
mismo título que si lo hago con las células Dce/dce.
Los antígenos del grupo sanguíneo del sistema Rh son productos directos de los genes RHD y RHCE
(colectivamente denominados RH30 o RHCDE), homólogos, estrechamente vinculados que
residen en el cromosoma en el brazo
corto del cromosoma 1, región 3, banda 4
sub-banda 11 (1p34-34.11). Son 10
exones los que componen ambos genes,
con una secuencia genómica de 60,00069,000 pb, con una composición idéntica
en el 97.8 % de la secuencia, con
orientación opuesta, enfrentados en su
posición 3´y separados por el Gen SMP1
quien dará hibridez RHD/RHCE, 31 a 35 aminoácidos de diferencian RhD de RhCcEe.
A consecuencia de la supresión del gen RHD o alteraciones de otros involucrados, el potente
inmunógeno D, no se expresa en un segmento relativamente importante de la población; es decir,
el fenotipo RhD negativo es aproximadamente de 10% de la población.
RHCE existe en cuatro formas alélicas y
cada alelo determina la expresión de dos
antígenos o una combinación: Ce, ce, cE o
CE (RHCE es el nombre colectivo de los
cuatro alelos). Cada uno de los genes
(RHD) gen duplicado y RHCE (ancestral)
contiene 10 exones y la longitud de
secuencia
de
ADN
es
de
aproximadamente 75kb.
Otros genes también participan de las
formas D, la expresión de la glicoproteína
accesoria RhAG cuyo gen responsable RHAG es similar a las RhD organizada en 10 exones, con
36% de homología con la secuencia RHCE , pero se encuentra en un lugar separado del
cromosoma 6p11-21.
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Entre los productos químicos de de RHAG encontramos Banda 3 (AE1) vemos la expresión del
antígeno Diego es una proteína de multipaso (14 veces) e interviene como intercambiador de
aniones-solutos y CO2; la Glicoproteína Duffy (antígenos Fy, DARC); la Glicoproteína A y B (GPA,
GPB) antígenos del sistema MNS, que participa de la glicosidación de la membrana desde el REL y
Golgi; los productos antigénicos LW (Landsteiner-Wienner); una proteína de un solo paso también
llamada ICAM-4 y la CD47 (IAP) proteína de paso múltiple que participa del transporte de calcio.
Y otro gen SMP1 de 30,000 pb sin relación funcional con ambos genes, pequeña proteína de
membrana que tiene 94% de homología Rh boxes da lugar a procesos de hibridización de la
molécula RHD en RHCE y viceversa.
Las proteínas del Rh están confinadas a los vertebrados superiores, sin embargo, se tiene
identificado un gen parecido al RhAG en nemátodos y esponjas marinas.
Se ha demostrado RhAg en el ratón, macaco, chimpancé, gorila, orangután, gibón, babón, monos
del nuevo mundo.
Como en los homólogos invertebrados, el RH parece provenir de una antigua duplicación del gen
probablemente ocurrida hace 250 a 340 millones de años, que provocó la divergencia entre RHAG
y RH para posteriormente continuar por distintas vías evolutivas.
Un segundo evento de duplicación originó el gen RHCE, el cual se duplicó y generó al gen RHD.
El primer evento ocurrió en un primate ancestral hace 5 a 12 millones de años.
Basados en la tasa evolutiva de los genes RHAG y del RHD en diferentes especies, parece que el
Gen RHAG es 2.6 veces más lento que el RHD, lo cual sugiere que el RHAG tiene mayor
importancia funcional que las proteínas del RHD.
El primer haplotipo fue cDe y los otros siete más comunes provinieron de este gen complejo en
eventos genéticos simples o únicos.
En los caucásicos el haplotipo cde es originado por deleción del gen RHD, mientras que el
haplotipo Cde proviene de la conversión del gen RHD en los exones 1 y 2, reemplazando a los
mismos exones del gen RHCE en los sitios de codificación de ce.
Los restantes fenotipos son mutaciones puntuales (polimorfismo E/e) o la rara combinación de
haplotipos.
Los exones son críticos para los epítopes D1, D2, D5, D6-7 y D8. El gen RHD esta flanqueado a
ambos lados por dos segmentos de ADN de 9000 pb, llamados caja Rhesus. Los exones 1 y 2 del
gen RHCE codifican la expresión Cc.
En sentido inverso la secuencia de
codificación es CcE.
Los productos químicos de ambos
genes son proteínas integrales de
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membrana eritrocitaria, que muestra una topología de hélice de transmembrana; con un pasaje de
12 veces.
Los 30 polipéptidos, sitios palmíticos y sus epítopes se definen por cinco aminoácidos específicos
situados en los bucles extracelulares. Rh50 es N-glicosilasa en un sólo sitio con Asn37.
El rol biológico del sistema, se asocia a la mantención de la integridad de la membrana eritrocitaria
y una función de transporte de amonio. Además, en un estudio de las algas verdes mostraron que
las proteínas Rh pueden funcionar como un canal de gases de CO2
La expresión de RHAG no se limita a los tejidos
eritrocitarios, los productos homólogos se
expresan en el riñón, hígado, piel, testículos y en
el cerebro.
La expresión de proteínas Rh y RhAg ocurren
temprano,
durante
la
diferenciación
eritropoyética. Esto es comprobable viendo
como el anti-D se une aproximadamente al 3% a
la BFU-E (Unidad formadora eritroide), y el 68% a la CFU-E (unidades formadoras de colonias de
eritrocitos) y a todas las células eritroides más maduras.
Sin embargo, la unión de Anti-D a
proeritroblastos,
eritroblastos
basófilos,
policromatófilos
eritroblastos y eritroblastos es
respectivamente, 25%, 50%, 66%, y
75% en comparación con la proteína
madura.
RhAg es detectables en progenitores
CD34 aislados de sangre de cordón
umbilical, después del cultivo de 3 a 5 días, mientras que RhCcEe aparece después de 5 a 7 días y
RhD aparece después de 9 a 11 días de cultivo.
En el feto, los antígenos Rh se expresan en los glóbulos rojos a la 6° semana de gestación.
La familia de proteínas Rh tienen aproximadamente un 20% de homología con la permeasa
metilamina (MEP) y los transportes de amonio (AMT) de las levaduras, las bacterias y plantas
simples.
Los animales superiores usan nitrógeno y eliminan los amonios tóxicos a través del ciclo de la urea
y de transporte, en forma de glutamina y alanina. El papel del complejo Rh como transportador de
amonio está aún poco definido, pero es seguro que el complejo co-transporta amonio junto con
otros cationes.
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Proteínas accesorias dependientes de RHAG
La Glicoproteína LW también llamada ICAM-4 es una proteína de un solo paso (tipo I), con
homología a las moléculas de adhesión intercelular (ICAM), que son ligandos para B2 integrinas
(Imagen Daniels, 2002)
LW se ha informado que es un ligando para la integrina LFA-1. La glicoproteína está ausente en los
glóbulos rojos en sujetos LW (a-b-) y las personas Rhnull; mientras que en los primeros la expresión
de los antígenos Rh es normal en los glóbulos rojos.
Los Antígenos LW son más abundantes en sujetos D-positivos. Se interpreta que es posible que la
glicoproteína LW interacciona preferentemente con el Rh, en comparación con RhCcEe; sin
embargo, la naturaleza de tal interacción aún espera definición.
Curiosamente, los antígenos LW se expresan igualmente bien en glóbulos rojos D positivos o
negativos de los fetos y de los recién nacidos, y con más fuerza que en los glóbulos rojos adultos.
La IAP es una integrina asociada a proteína, que está presente en la membrana del glóbulo rojo,
donde pasa 5 veces y tiene 6 potenciales N-glucano. Lleva antígenos ABH, pero no es reconocida
por dichos antígenos de grupo sanguíneo.
Se produce como isoformas diferentes en los tejidos donde se une a B3 integrinas. La isoforma de
IAP en los glóbulos rojos puede estar implicada posiblemente en el transporte de calcio, puesto
que el transporte se reduce en las membranas de los glóbulos rojos Rhnull y D - pero se encuentra
normal en la línea linfoblastoide de las personas.
La Glicoforina también llamada GPB es
una sialoglicoproteína de membrana de
tipo I que tiene varios O-glicanos pero no
N-glucano. El complejo de Rh parece
ayudar a la expresión pero no es esencial
para la inserción correcta de ésta a la
membrana del glóbulo rojo. En los
glóbulos rojos S-s-U- donde falta GPB, las
proteínas del Rh son de apariencia normal,
pero aumenta la glicosilación RhAg, lo que
sugiere un ritmo más lento de migración a
través del retículo endoplásmico y aparato
de Golgi. La intaracción de RhAg y GPB es necesaria para la plena expresión del antígeno U y en
menor medida S y s.
La Glicoproteína Fy (Duffy, DARC) posee asociación con el complejo de Rh, la misma se muestra a
través de los sujetos portadores del antígeno Fy5, que está ausente en los sujetos (a-b-) y Rhnull.
Sin embargo, los glóbulos rojos Rhnull son Fya normal, y poseen Fyb, Fy3 y Fy6. La otra parte los
Fy (a-b-) tienen antígenos Rh normales.
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La Banda 3 cuyo sinónimo es AE1 representa la función de intercambiador de aniones-soluto. La
proteína pasa a través de la membrana de los glóbulos rojos de 12 a 14 veces y es el principal
transportador aniónico. Esta proteína es aparentemente normal en los glóbulos rojos Rhnull; su
reducción produce ovalocitosis. El defecto molecular que se presenta generalmente en Asia
Oriental, se analiza por la supresión de un segmento de ADN, que codifica 9 aminoácidos situados
en el límite de la N-terminal citoplasmático y en el dominio de la membrana de la Banda 3.
El poliformismo RH C/c y RH E/e es causado por sustituciones de nucleótidos en RHCE, son en
total 6 sustituciones de nucleótidos que causan 4 cambios de aminoácidos (Cys16Trp, IIe60Leu,
Ser68Asn y Ser103Pro), están asociados con el poliformismo C/c sólo Ser103Pro).
Sin embargo, la Pro102 parece ser una parte fundamental del antígeno c; por la presencia de 2
residuos adyacentes de prolina (102 y 103) se espera formar una estructura relativamente rígida,
resistente a los cambios. Esto explica el número relativamente bajo de las variantes C, en
comparación con otros antígenos Rh.
Se acepta que una sola sustitución de nucleótido es suficiente para la expresión del poliformismo
E/e (Pro226Ala).
La presencia de Val en el residuo 245
en lugar de Leu, provoca una supresión
de Arg en el aminoácido229 o la
presencia de Cis (en lugar de Trp) en el
aminoácido 16 de residuos, que afecta
la expresión del antígeno “e”.
Se han determinado la base molecular
de los antígenos de E parcial en 4 categorías I, II y III, y el tipo de DVIII.
En la tabla de la página anterior se ven los 8 haplotipos, 64 combinaciones posibles que dan lugar
a 18 fenotipos probables.
Antígeno G
Las proteínas Rh y RhC llevan el antígeno G, que se asocia con residuos en el segundo bucle
extracelular codificado por el exón 2.
Este antígeno está casi invariablemente presente en los glóbulos rojos (GR) que poseen C o D. No
fue detectado por todos los monoclonales anti-G. Por lo tanto, parece que el antígeno G es
dependiente de la conformación y no solo depende del segundo dominio externo de RHC (E/e) o
las proteínas Rh.
Los anticuerpos que lo detectan parecen ser anti- CD pero la actividad anti-G no puede ser
separada en anti-C + anti-D. Las personas D negativas a veces parecen haber producido ambos
anticuerpos. Hay eritrocitos G - en raros casos- que carecen del antígeno D y muestran una
expresión débil o ausente de C (--eG).
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D Variantes
Los fenotipos Rh variante surgen a través, de al menos, 4 mecanismos:
(1) Reordenamiento del RHCE dispuestos en tándem y/o dirección a la derecha.
(2) Mutación puntual (s) en cualquier gen que causa cambio de aminoácido (s), con la
consiguiente pérdida de algunos epítopes y/o la expresión de un antígeno de baja
incidencia.
(3) Mutaciones sin sentido.
(4) Supresión de nucleótidos causando la lectura de un codón de parada prematuro.
En la imagen (página anterior), tan popular de Willy A. Flegel (Institut für Klinische
Transfusionsmedizin
und
Immungenetik
Ulm
und
Insti
tut
für
Transfusionsmedizin,Universitätsklinikum Ulm, Germany) Las sustituciones de aminoácidos se
distinguen como las RhD desde la proteína RHCE que se muestran en amarillo, con los cuatro
aminoácidos que codifican para el
antígeno C en verde y la que codifica la
proteína E en negro. Las sustituciones
de aminoácidos individuales que
codifican para D parcial están en azul, y
aquellos que codifican para D débil
están en rojo. Las mutaciones,
identificadas por el grupo de Ulm,
están en azul claro y naranja.
Los antígenos D Parcial fueron
identificados por la prueba clásica con
anticuerpos policlonales, producto de
inmunizaciones de personas D parcial,
con distintos fenotipos. En la
actualidad son muchos los anticuerpos
monoclonales que están siendo
utilizados para clasificar los antígenos
D y sus variantes.
Un listado de las líneas monoclonales
que probé en el centro queda exhibido.
El modelo molecular original constaba
de 8- 9 epítopes (EPD), pero se ha
ampliado hasta consistir en más de 37
epítopes.
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Cuando se utiliza anticuerpos
monoclonales anti-D para definir
epítopes D, es importante realizar
las pruebas en el pH correcto, la
temperatura, la fuerza iónica y la
concentración
adecuadas.
de
anticuerpos,
Se deben utilizar GR que han sido
almacenados
apropiadamente
e
incluir los controles. La mayoría de los
epítopes D son de conformación, y
pueden estar influenciados por otras
proteínas y lípidos de la membrana
del GR.
Las predicciones en cuanto a la ubicación de diferentes epítopes D, se hacen sobre la base de que
ciertos epítopes ausentes de hallan en los GR D parcial de base molecular conocida.
Sin embargo, la ausencia de un
etítope D no siempre puede ser un
resultado directo del cambio en la
estructura molecular y la presencia
de proteínas codificadas.
Por
ejemplo, R0Har y DVA no tienen
ningún exón en dirección a la
derecha común; entonces se
solapan con la reactividad de los
anticuerpos monoclonales, lo que
demuestra la dificultad de definir
correctamente la base molecular de epítopes.
Datos recientes sostienen que al
menos algunos epítopes D son
espacialmente diferenciados. Sin
embargo, aún no se ha observado
el impacto de los aminoácidos,
que se encuentran dentro de la
bicapa lipídica o en el lado
citoplamático de la membrana del
GR.
La determinación exacta de los puntos de contacto de interacción entre el antígeno y el anticuerpo
se encuentra en espera de datos cristalográficos confirmatorios.
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Las variantes DVI definidas por la serología son más abundantes en la raza blanca, en nuestro
laboratorio corresponde a un sesgo de 6-10% de todos los resultados que han dado débil o
irresuelto por pruebas tradicionales, siendo en la población la frecuencia mucho menor 0.020.05%.
La mayoría se ha presentado por la existencia de anticuerpos anti-D en pacientes D positivos una
vez descartado el fenómeno autoinmune.
Las variantes se producen en tres categorías: reemplazando exón 4 y 5 de RHD por exón 4 y 5 de
RHCE en el tipo I; agregando el exón 6 de RHCE en el tipo II y el exón 3 al 6 reemplazados por
RHCE en el tipo III.
El número de antígenos por célula en el tipo I varían desde 500 cpc, a 2400 en el tipo II y hasta
12000 para el tipo III.
Variantes débiles
La expresión del D débil no constituye una variante única. corresponde generalmente a la
expresión antigua llamada Du. Vemos en la imagen como puntos rojos (los azules serían parciales)
Existen una importante cantidad de poliformismos (más de 19 en el 2009) que se relacionan con
esta expresión. Por ejemplo, un umbral se ponderó sobre aquellos sujetos que poseen menos de
400 sitios antigénicos, pero estos individuos “D-Débiles” pueden inmunizarse y formar anti-D
luego de la exposición de a antígenos D normales.
Se ha observado que la sustitución de aminoácidos en la variante D débil, se puede localizar en los
segmentos de proteínas de transmembrana e intracelulares; así como en 4 regiones de la proteína
(aminoácidos en la posición 2 a 12, alrededor de la 149, así como los aminoácidos 179 a 225 y los
aminoácidos 267 a 397).
Esto indica que los sujetos con fenotipo D débil, si bien no en todos, se debe a una alteración
cuantitativas de la proteína RhD.
En resumen, cuando decimos D débil nos referimos a un tipo de variante donde se halla
expresado el antígeno D en forma anormal respecto de otro D “normal”; generalmente desde el
punto de vista cuantitativo, puesto que han ocurrido sustituciones de simples aminoácidos con el
consecuente cambio en la presentación química, pero las modificaciones ocurren a diferencia de
los
D
parciales,
en
su
porción
citoplasmática
e
intramembranosa.
Es difícil de asumir, pero se han publicado casos (escasos) de inmunización de sujetos D débil(D17)
a causa de D-normales.
Testeo de antígeno D PACIENTES vs DONANTES
En este párrafo vamos a tratar de aunar los criterios de las guías internacionales, la muestra en el
caso de tipificar pacientes u obstétricas debe diferenciarse respecto de los donadores o recién
nacidos. En el primer caso, las pruebas deben ser simples o pruebas en duplicado si no se realizan
por métodos automáticos y en cualquier caso se deben emplear reactivos con anti-D IgM
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monoclonales que no detecten la presencia de variantes DVI. En el caso de realizarlo por duplicado
cabe hacerlo con dos anticuerpos monoclonales diferentes que reúnan las condiciones antes
dichas. para el tipificado del antígeno. Si las pruebas tienen como propósito la transfusión hay que
evitar llevarlas a fase antiglobulínica, los anticuerpos anti-D actuales son lo suficientemente
potentes para poner en relieve ejemplares débiles del D y si sometemos a un ensayo
antiglobulínico se corren otros riesgos: (D positivo) a causa de PAD (positiva), o pruebas D
(variantes parciales) tipificadas como D (positivas).
En el caso de los pacientes plausibles de recibir transfusión y de los pacientes gestantes se deberá
emplear un reactivo incapaz de determinar las variantes débiles, parciales y débiles-parciales, para
evitar que dicha población se ponga en riesgo asumiendo que representan sujetos D positivos.
Tampoco se recomiendan reactivos que requieran la prueba antiglobulínica, sino los monoclonales
anti-D categorizados como DVI negativos.
En el caso de tipificar la población dadores y recién nacidos se debe emplear el reactivo capaz de
detectar las formas variantes del antígeno, empleando al menos dos líneas monoclonales que
detecten la variante DVI. La fase antiglobulínica podrá o no ser empleada siguiendo estrictamente
las recomendaciones del fabricante.
En algunos países se emplea igualmente el reactivo de las obstétricas DVI- en los recién nacidos,
porque no hay suficientes casos de Recién Nacidos documentados como DVI sensibilizando
madres D negativas, y recomiendan no cambiar el reactivo para no cometer errores, utilizando el
incorrecto luego con las pacientes obstétricas.
Son variadas las situaciones en las que pueden aparecer resultados inesperados o difíciles de
interpretar. Su resolución puede requerir el simple cambio de un reactivo por otro o la utilización
de protocolos realmente diferenciales.
El advenimiento de reactivos cada vez más específicos y la claridad sobre su empleo, evitan en la
actualidad, la propagación de un mayor número de casos con resultados discrepantes en las
pruebas de tipificación D.
Sigue siendo condicionante de una buena práctica la observación de ciertas variables
Variable
Anticuerpos fijados en vivo o C3.
Autoaglutinación.
Expresión débil del antígeno (no variante)
Doble población celular.
Error técnico.
Calidad del reactivo.
Solución
DAT- elución.
Lavados – tratamiento Tiol.
Adsorción proteolítica.
Investigación de mosaicísmo.
Revisar los protocolos.
Control de calidad.
La expresión débil del antígeno –no D variante-.
Puede obedecer a un simple aspecto regular de la herencia mendeliana; por ejemplo en las
personas de raza negra como dijimos, tiene lugar el fenotipo cDe, al someter un reactivo anti-D en
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forma directa a los hematíes, suele resultar una prueba débil que amerita su potenciación con
reactivos antiglobulina.
Otro ejemplo de debilitamiento de la expresión, es el llamado efecto de posición, ejerciendo el
Gen RHC en posición Trans la supresión sobre el Gen RHD en el cromosoma opuesto, así los GR
CDe/Ce presentarán una expresión debilitada de D. Por ejemplo los genotipos CDe/ce y CDe/Ce
codifican para los mismos antígenos, pero las células son más D débiles en el segundo caso.
IMPORTANTE:
(1) Se debe suprimir los términos D débiles, D parcial, Du para mencionar los hallazgos
serológicos en pacientes y donantes en informes. Pues los sujetos deben conocer su
estatus D, llamándolos D positivos o D negativos, sin importar como hallamos nosotros
(profesionalmente) arribado a la conclusión.
(2) Jamás deben emplear reactivos que empleen la fase antiglobulina en pacientes u
obstétricas, sobre todo si son únicos.
(3) En donantes y neonatos siempre se deben emplear el uso de anticuerpos monoclonales
provenientes de al menos dos líneas celulares diferentes y que permitan detectar la
variante DVI (de ser posible en un paso).
(4) De hallar una paciente femenina con una variante débil o parcial se debe aplicar la
profilaxis D (aunque con los métodos indicados en 2 no deberíamos distinguirlas, a todas
ellas las consideraremos D negativas)
(5) Siempre contar con la colaboración de un laboratorio de referencia capaz de resolver
discrepancias D.