Marcaje no Enzimático y Detección no Radioactiva de ADN.

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005
Marcaje no Enzimático y Detección no Radioactiva
de ADN.
Dannelys Pérez-Bello1, Liliam López-Dobarganes2, Ana Maria Riveron-Rojas1, David
Higginson-Clarke1, Mirta Zayas1, Nelson Diaz1, Ramón Gonzalez3, Marquiza Sablón
Carrazana1, Rafaela Perez1, Chryslaine Rodriguez-Tanty1*.
1
Centro de Neurociencias de Cuba. Ave 25 y 128, CP: 11600, C. Habana, Cuba; e-mail: [email protected]. 2
Facultad de Biología, Universidad de La Habana. 3 Centro Nacional de Investigaciones Científicas.
RESUMEN: Varios métodos enzimáticos y químicos se han desarrollado para el marcaje no-radiactivo de
sondas de ADN. Las reacciones de transaminación catalizada por bisulfito y la acilación del ADN son métodos
químicos que se emplean para obtener sondas de ADN marcados. Si estas reacciones se llevan a cabo bajo
condiciones de desnaturalización del ADN, el marcaje se incrementa. Asimismo, la detección de la marca se
puede incrementar con el uso de un brazo espaciador apropiado y también cuando la detección de la misma se
realiza en ADN de simple cadena. En este trabajo, se optimizó un procedimiento para obtener sondas de ADN
marcado mediante síntesis química, usando el radical p-bromobenzoilo como marca. Nosotros desarrollamos un
método para separar ADN de simple cadena de ADN de doble cadena a través de cromatografía de
hidroxilapatita. La sensibilidad de la detección fue evaluada mediante ensayos inmunoenzimáticos
colorimétricos con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-BLC (5H11E5), anteriormente obtenido.
ABSTRACT: Various enzymatic and chemical methods for the preparation of non-radioactive nucleic acid
probes have been developed. Bisulfite-catalyzed transamination and acylation reactions into DNA are employed,
as a chemical method, to obtain labeled DNA probes. If the reactions are carried out under DNA denaturalization
condition, the labelling could be increased. Likewise, the label detection could be increased by means of the use
of an appropriated spacer arm and also, by performing the label detection in single-stranded DNA. In this work,
the procedure for obtainment labelled DNA probes, by chemical synthesis, using the p-bromobenzoyl radical as
label was carried out. We developed a method for separating single-stranded DNA (s.s.DNA) from double
stranded DNA, through Hydroxylapatite (HA3) chromatography. The sensitivity in the label detection was
evaluated by chromogenic dot immunobinding assays using an anti-BLC monoclonal antibody (5H11E5),
previously obtained.
Palabras claves: sondas de AND no radiactivas, reacción de transaminación catalizada por bisulfito,
desnaturalización de ADN y separación de ADN de simple cadena.
Key words: Non-radioactive nucleic acid probes, bisulfite-catalyzed transamination reaction, denaturalized DNA
and single-stranded DNA separation.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, el marcaje in vitro no radioactivo de los ácidos nucleicos ha constituido una importante
herramienta para el análisis de genes en el diagnóstico médico. De este modo, estos métodos han sustituido a
los métodos radioactivos, debido a la inestabilidad de la sonda, el alto costo y los requerimientos especiales que
conlleva trabajar con materiales radioactivos.1-4
La introducción de marcas inmunoquímicas en la molécula de citidina puede llevarse a cabo a través de una
reacción de transaminación del grupo amino en posición 4 de la base pirimidínica de la molécula de citidina, con
el empleo de bisulfito de sodio y diferentes aminas, y posteriormente la acilación del grupo amino.5-7
Shulman71 y Draper73 estudiaron la cinética de esta reacción en el ARN. Este procedimiento también fue
empleado para introducir en el ADN la molécula de biotina, con el objetivo de obtener sondas biotiniladas. Más
recientemente, Avignolo y col. 8, 9 realizaron estudios para optimizar las condiciones experimentales de este
método.
En el presente trabajo introducimos el radical p-bromobenzoilo, como una marca inmunoquímica, en la molécula
de 5-metil citidina en el ADN, según los procedimientos desarrollados por Avignolo y col.8
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PARTE EXPERIMENTAL
Obtención de ADN simple cadena (sc).
El ADN de timo de ternera (Koch-Light Laboratory) se disuelve (1mg/mL) en una disolución tampón de NaH2PO4
(0.05 M, pH=6.8) y a continuación se desnaturaliza térmicamente ( 5 min a 100 ºC) e inmediatamente, después,
se enfría a 0 ºC.
A grosso modo la columna de hidroxiapatita se prepara de la siguiente forma. 5 g de hidroxiapatita (Laboratorio
de BioMateriales, CNIC) se resuspenden en 10 mL de un tampón de NaH2PO4 (0.05 M, pH=6.8). La matriz se
adiciona a una columna (de 5x1 cm), la cual se enfría a 0 ºC.
La muestra de ADN desnaturalizado (1mg/mL, 5 mL) se adiciona a la columna y a continuación, la misma se
eluye con un gradiente del tampón de NaH2PO4 (0.05 M-0.2 M) en frascos plásticos de 2 mL. La velocidad de
elución fue de 30 mL/h. Una vez eluido todo el ADN la columna se regenera con un tampón de NaH2PO4 (0.5 M,
pH=6.8) a un flujo de regeneración de 50 mL/h.
Detección de ADN doble cadena (dc) y simple cadena (sc) en geles de agarosa con anaranjado de
acrilina.
La tinción del ADN sc y dc se lleva a cabo in situ en el gel de agarosa de corrida de electroforesis. La
preparación del gel se llevó a cabo utilizando agarosa (Promega) al 1% en el tampón de NaH2PO4 (0.01 M) y
adicionando anaranjado de acridina. La concentración final de anaranjado de acridina es de 3 mg/mL en el gel.
Marcas Inmunoquímicas.
La síntesis de agentes acilantes, empleando el radical p-bromobenzoilo como marca, fue llevada a cabo en el
Laboratorio de Síntesis del centro de Neurociencias.2
Los agentes acilantes utilizados fueron: éster de N-hidroxisuccinimida del ácido p-bromobenzoico (B-NHS, 1´),
éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-p-(bromobenzoilamido)propionico (BLC2-NHS, 2´) y éster de Nhidroxisuccinimida del ácido 6-p-(bromobenzoilamido)caproico (BLC5-NHS, 3´).
Conjugación de proteína-BCL5:
El radical p-bromobenzoilo fue unido a diferentes proteínas, como: IgG ratón (antiratón-carnero) y gelatina
mediante la acilación de las proteínas con BLC5-NHS.
Marcaje de ADN en fase líquida.
La reacción de transaminación tuvo lugar con ADN de timo de ternera (0.2376 mg/mL ó 1.7 mg/mL, Koch-Light
Laboratory) en presencia de bisulfito de sodio (2 M) y etilendiamina (1 M), pH 7, durante 1 hora a 100 ºC. El
ADN se precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto y NaCl (0.2 M). La fracción de ADN transaminada fue
resuspendida en un mínimo volumen de una disolución de NaHCO3 (0.1 M, pH= 8.5). A continuación, se realizó
la acilación del ADN transaminado con el empleo de los agentes acilantes: B-NHS, BLC2-NHS, y BLC5-NHS,
en presencia de trietilamina a pH 8,5. La mezcla de reacción fue calentada a 100 ºC durante 1hora. El ADN se
precipitó con 2 volúmenes de etanol absoluto y una disolución de NaCl (0.2 M) y luego, se purificó en una
columna de Sephadex G-25. Finalmente, el ADN marcado (BLC5-DNA, BLC2-DNA y B-DNA) fue resuspendido
en H2O destilada estéril y guardado a 4 ºC.
Fijación del ADN de timo a membranas.
Las disoluciones de ADN fueron calentadas a 100 ºC durante 10 min., e inmediatamente enfriadas en hielo. A
continuación, se aplicaron 10 µL de ADN sobre el soporte sólido. La membrana se secó a temperatura
ambiente. Las membranas de nitrocelulosa se lavaron dos veces con 50 mL de una disolución 6 x SSC y se
secaron a temperatura ambiente, y posteriormente a 80 ºC a presión reducida, durante 2 horas.
En el caso de las membranas de nylon, una vez aplicada la muestra, se secaron a 80 ºC durante 2 horas.
Detección calorimétrico inmunoenzimático de la marca (Dot Blot)
Las membranas se sumergen en una disolución de leche descremada al 5% en tampón de PBS (pH 7,2)
durante 90 min. a 37 ºC. A continuación se lavó con PBS y seguidamente, se incubó en una disolución del AcM
5H11E5 1 (10µg/mL) en PBS durante 90 min a 37 ºC. Las membranas se lavaron dos veces con disolución de
Tween 80 (0,5% en PBS). Posteriormente se sumergió en una disolución de conjugado anti-IgG de ratón
(peroxidasa o fosfatasa alcalina) (1: 1 000 y 1:5 000 a partir de 1 mg/mL, respectivamente) en Tween 80 (
0,005%) y leche descremada (1%) en PBS, durante 90 min. a 37 ºC. Seguidamente, las membranas se lavaron
dos veces con disolución de Tween 80 (0,5%) en PBS.
Finalmente, se le adicionaron a las membranas una disolución de aminoetilcarbamida (0,2 mg/mL) en acetato
de amonio (5 mM) y H2O2 (8.8 mM) para el conjugado de PO.
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Cuando se empleó FO las membranas se sumergieron en una disolución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/
azul de nitrotetrazolium en agua (tabletas, 10 ml).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La introducción del radical p-bromobenzoilo en el ADN desnaturalizado se realizó a través de las reacciones de
transaminación y acilación del grupo amino de la molécula de citidina (Fig. 1).
NH2
NH2
OH
HO
P
N
HO
O
N
O
H
OH
NH2
O
O
N
P
O
O
SO3-
N
N
N
N
OH
P
N
1- NH2CH2CH2NH2
OH
NH
O
NH2
O
O
NH
O
N
O
O
-
O
N
O
P
OH
N
O
HO
NH
NH2
NH2
O
P
N
O
O
N
P
P
O
N
O
N
OH
N
O
O
O
O
O
O
P
N
O
O
H3C
O
OH
N
O
P
R
O
O
OH
P
OH
O
O
NH
O
O
O
O
OH
O
NH2
NH2
O
O
N
NH
OH
NH
O
2.- BNHS/ BLC2NHS/ BLC5NHS
N
O
OH
NHCH
2CH2NHCO(CH
2)5NHCOPh-
O
N
O
O
HSO3
NH
P
O
O
P
O
OH
O
O
O
OH
OH
Fig. 1 Introducción del radical p-bromobenzoilo en el ADN a través de las reacciones de transaminación y
acilación
Como se observa en la Fig. 1, se emplearon como agentes acilantes tres derivados de tipo ésteres succinimido:
B-NHS, BLC2-NHS y BLC5-NHS. Las reacciones se llevaron a cabo a la temperatura de desnaturalización del
ADN durante 1 hora. Así, se obtuvieron los análogos de nucleótidos: 4-N-(p-bromobenzoilaminoetil) 2´-Odeoxicitidina (1´), 4-N- { 2-[ 3-(p-bromobenzoilamino)propilamino] etil } 2´-O-deoxicitidina (2´) y 4-N- { 2-[ 6-(pbromobenzoilamino)caproilamino] etil }-2´-O-deoxicitidina (3´).
Los tres tipos de ADN marcado se denominaron: BLC5-ADN, BLC2-ADN y B-ADN. En todos los casos la marca
fue separada de la base pirimidínica de la citidina, con el empleo de brazos espaciadores de diferente longitud
de la cadena (10, 7 y 3 átomos, respectivamente).
Este método resultó ser un método sencillo y de bajo costo en comparación con los métodos tradicionales de
introducción in vitro en los que se emplean enzimas y derivados trifosfatados de los nucleósidos modificados.
Los resultados de la detección de la marca (Dot-Blot) incorporada al ADN doble cadena (dc) se muestran en la
Fig. 2.
A
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B
C
D
Fig. 2 Detección inmunoenzimática colorimétrica (Dot-Blot) del radical p-bromobenzoilo en ADN dc de timo de
ternera sobre membranas de nitrocelulosa. Filtros A, B, C y D, sección de arriba: control negativo (ADN
de timo de ternera no marcado) y control positivo BLC5 conjugado a gelatina (10-3 mg/mL). Filtro A,
sección de abajo: señales de izquierda a derecha, ADN dc desnaturalizado y marcado (BLC5-ADN,
BLC2-ADN y B-ADN, 26,2µg cada uno) con diferentes largos de brazo espaciador (3, 7, y 10 átomos)
empleados para separar la marca de la base del nucleótido. Filtros B, C, y D, Sección de abajo: muestra
las diluciones seriadas de BLC5-ADN, BLC2-ADN y B-ADN desnaturalizado. La marca fue detectada
con el AcM 5H11E5 1, y conjugado de carnero anti-ratón unido a peroxidasa.
Como se observa de la Fig. 2, en el filtro A, el reconocimiento de la marca se llevó a cabo con 26 µg de ADN
marcado desnaturalizado, en cada caso. La línea control (arriba, filtro A) no muestra señal detectable en el caso
de ADN no marcado (control negativo) y una señal detectable es obtenida para BLC5 conjugado a gelatina
(control positivo). Si comparamos las intensidades de color del reconocimiento del ADN marcado con los tres
brazos espaciadores de diferente longitud de la cadena (3, 7 a 10 átomos), apreciamos que cuando el brazo
espaciador fue de 10 átomos (BLC5-ADN) el reconocimiento fue mejor que con 3 ó 7 átomos (BLC2-ADN y BADN), respectivamente. Como se observa, el nivel de sensibilidad aumenta en la medida que el largo del brazo
espaciador se hace mayor. Esto se debe, posiblemente, a que aumenta la accesibilidad del AcM sobre el
radical p-bromobenzoilo, en la medida que el brazo espaciador se hace mayor.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Avignolo y col.8 cuando emplean brazos espaciadores de 6
y 13 átomos de longitud para la introducción de la biotina (5 veces superior con 13 átomos).
En los filtros B, C y D (Fig. 2) se observan los límites de detección obtenidos para cada ADN marcado: BLC5ADN, BLC2-ADN y B-ADN, respectivamente. De esta manera encontramos que el reconocimiento de la marca
por el AcM en el BLC5-ADN (filtro B) es dos veces más sensible que en los BLC2-ADN y B-ADN (filtros C y D).
Estos resultados concuerdan con la escala, establecida anteriormente, de afinidad del AcM por la marca en los
diferentes brazos espaciadores diseñados. Por ello, se seleccionó como agente acilante el BLC5-NHS.
Se realizó un ensayo inmunoenzimático colorimétrico con ADN dc desnaturalizado (BLC5-ADN) sobre
membrana de nylon para determinar el límite de detección del AcM (5H11E5) contra la marca, empleando un
conjugado de carnero anti-ratón-fosfatasa alcalina (FA) (Fig. 3).
19.5 pg
Fig. 3. Detección inmunoenzimática colorimétrica (Dot-Blot) del radical p-bromobenzoilo en ADN dc de timo de
ternera, sobre membranas de nylon. Primera fila de derecha a izquierda, ADN desnaturalizado de timo
de ternera no marcado, (control negativo, 2.6µg) y control positivo BLC5 conjugado a gelatina (10-3
mg/mL). Las filas contiguas, muestran el BLC5-ADN a diferentes concentraciones (2.6 µg-19.5 pg). La
marca fue detectada con el AcM 5H11E5 1, y conjugado de carnero anti ratón unido a fosfatasa alcalina.
De acuerdo a la Fig. 3, el límite de detección para el BLC5-ADN fue de 19,5 pg, el cual resultó 70 veces más
sensible que cuando se utilizó PO y membrana de nitrocelulosa (Fig. 2).
En la reacción de acilación uno de los factores que determina la incorporación de la marca en el ADN es el
impedimento estérico que puede encontrar el agente acilante en la estructura de doble hélice. Por esta razón,
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para incrementar la eficiencia del marcaje del ADN se realizaron ensayos empleando ADN de simple cadena
(sc), obtenidos por cromatografía de adsorción con hidroxilapatita (HA).
Así, ADN dc desnaturalizado se introdujo en una columna de HA y se eluyó con una disolución de NaH2PO4
(0.5M, pH 6.8). De acuerdo con la electroforesis del ADN, en agarosa con anaranjado de acridina, se obtuvo
una fracción de ADN enriquecida en sc (Fig. 4).
1 2 3
Fig. 4. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en presencia de anaranjado de acridina (3µg/mL).
1-ADN sc del Fago filamentoso VJΦ (C+). 2- Fracción de ADN obtenida por crio-elusión a partir de
Cromatografía por Hidroxiapatita (ADN sc de timo de ternera). 3- ADN nativo de timo de ternera (ADN
dc) sin pasar por columna de HA.
A continuación, se llevó a cabo el marcaje del ADN sc con BLC5-NHS, como agente acilante.
La detección de la marca en el BLC5-ADN sc, sobre una membrana de nylon, se llevó a cabo con el empleo del
AcM 5H11E5 y con el conjugado de carnero anti-ratón-PO. La sensibilidad de la detección de la marca fue de
313 pg, lo que representa 4,5 veces más sensible que cuando se emplea ADN dc desnaturalizado marcado y
nitrocelulosa como soporte sólido (Fig. 5).
Fig. 5 Detección inmunoenzimática colorimétrica (Dot-Blot) del radical p-bromobenzoilo en ADNsc de timo de
ternera, sobre membranas de nylon. Primera fila de izquierda a derecha, ADN desnaturalizado de timo
de ternera no marcado, (control negativo, 10.5 µg) y control positivo BLC5 conjugado a gelatina (10-3
mg/mL). Las filas contiguas, muestran el BLC5-ADN a diferentes concentraciones (10.5 µg - 313 pg). La
marca fue detectada con el AcM 5H11E5 1, y conjugado de carnero anti ratón unido a peroxidasa.
REFERENCIAS
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Vélez-Castro, H., Riveron, A-M., Macías, A. Nucleosides and Nucleotides, 14, 219. 1995.
2. Rodríguez-Tanty, Ch., Higginson-Clarke, D., Hernández, M., Pérez, R., Riveron, A-M., Macías, A.
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Higginson-Clarke, D., Riveron, A-M. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20, 1449-14461,2001.
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005
4. Rodríguez-Tanty, Ch., Pérez, R., Miranda, J., Vélez-Castro, H., Rosado, A., Macías, A., Galán, L.,
Higginson-Clarke, D., Riveron, A-M. Nucleosides and Nucleotides, 18, 1113,1999.
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6. Draper, D., Nucleic Acids Research, 12, 989,1984.
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8. Avignolo, A.;Hull, R.; Nucleic Acids Research, 14, 9965,1986.
9. Avignolo, C., Roner, R., Cai, S. y Bignone, F.A., J. Biochem. Biophys. Meth., 23, 193-205,1991.