protocolo_identificacion_cff

SECRETARIA DE AGRICULTURA,
GANADERÍA. DESARROLLO RURAL,
PESCA Y ALIMENTACIÓN
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
PROTOCOLO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Curtobacterium
flaccumfaciens pv. flaccumfaciens MEDIANTE PRUEBAS BIOQUÍMICAS,
ELISA Y PCR.
Elaborar(n):
Nombre
Cargo
M. en C. Adrián Mauricio
García Ortega
Signatario Aprobado
M. en C. Humberto César
Organes De Los Santos
Signatario Aprobado
Ing. Marina Ruiz Machuca
Signatario Aprobado
Firma
Revisan:
Autorizan:
Revisión:
00
Datos de Control
Laboratorios:
Fecha de Elaboración:
Bacteriología, Virus y Biología
29 de Marzo de 2011
Molecular (CESVBC)
1
No. de Páginas
38
ÍNDICE
Página
3
Antecedentes
Sinónimos; Taxonomía
3
Síntomas
4
Rango de Hospedantes
4
Importancia y Transmisión
4
Distribución Geográfica
5
Vector Biológico
5
Figuras 1-5: Sintomatología
6-7
Métodos de Diagnóstico
8
Envío/Recepción de Muestras
9
Aislamiento de la Bacteria
9
Identificación Fenotípica
10
Purificación y Caracterización
11
Figuras 6-9: Morfología colonial
12
Tabla 1. Caracterización fenotípica de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens.
13
Interpretación de Resultados
14
Destrucción de la muestra y Manejo de desechos
14
Composición de Medios de Cultivo
15-22
Detección por ELISA
23
Interpretación de Resultados
25
Detección por PCR (Punto Final)
28
Extracción de ADN genómico a partir de Tejido
28
Extracción de ADN genómico Bacteriano
30
Preparación de la reacción de PCR
32
Tabla 2. Condiciones de PCR con oligonucleótidos CF4 y CF5
32
Figura 11. Detección de Cff por PCR
33
Interpretación de Resultados
34
Bibliografía
35
2
ANTECEDENTES
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) (Hegdes) (Collins y Jones,
1983) es el agente causal de la marchitez bacteriana del frijol (también conocida como
marchitez vascular o marchitez bacteriana de la soya). Esta enfermedad, se observó por
primera vez en el sur de Dakota en los EE.UU. en Phaseolus vulgaris (Hedges 1922). La
bacteria invade el xilema y con frecuencia mata o impide el desarrollo de plántulas de
frijol. En las plantas adultas, las hojas y tallos pierden turgencia, provocando desecación
y una apariencia arrugada. A veces las lesiones se desarrollan en forma irregular con
áreas necróticas entre las venas principales y puede confundirse con el tizón común
causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Sin. X. campestris pv. phaseoli). A
menudo solo una o dos plantas laterales pueden ser afectadas y éstas pueden estar
ocultas entre el follaje sano. En estado avanzado, los tallos de las plantas infectadas se
rompen fácilmente con el viento (Hedges, 1926). En vainas los síntomas son poco
visibles, sin embargo, el tejido vascular de las suturas (que une a las valvas) puede ser
oscuro. Las semillas infectadas pueden presentar una coloración amarillenta, naranja o
morado (Fahy y Persley 1983). La difusión en campo es lenta (Richard y Walker, 1965),
pero la enfermedad puede alcanzar gran importancia si los niveles de infección
aumentan por las semillas infectadas que se producen. La enfermedad puede
controlarse mediante la utilización de semillas sanas y con la rotación de cultivos.
SINÓNIMOS (Moffett y Dye, 1983; Bradbury, 1986)
Corynebacterium flaccumfaciens subsp. flaccumfaciens (Hedges) (Carlson y Vidaver, 1982)
Corynebacterium flaccumfaciens (Hedges) (Dowson, 1942)
Bacterium flaccumfaciens (Hegdes, 1922)
TAXONOMÍA
Grupo: Actinobacteria
Subclase: Actinobacteridae
Órden: Actinomicetales
Suborden: Micrococcineae
Familia: Microbacteriaceae
Género: Curtobacterium
Especie: flaccumfaciens
3
SÍNTOMAS
La enfermedad se caracteriza por el marchitamiento gradual de las hojas de las
plántulas, extendiéndose hacia el interior, seguido por necrosis del parénquima. La
bacteria puede invadir los haces vasculares. En algunas ocasiones se presentan
combinaciones simultáneas de síntomas como: manchas, enanismo, muerte de algunos
brotes jóvenes (si sobrevive la etapa de plántula). La enfermedad puede provoca la
muerte en plántulas de 5-8 cm de altura. En plantas adultas los síntomas son menos
pronunciados, con un desarrollo más lento de la enfermedad (EPPO⁄CABI, 1997). Las
manchas consisten en tonalidades verde pálido, verde marrón a marrón rojizo que en
ocasiones presenta un halo. En un principio las manchas en la hoja se observan flácidas
y después adquiere una apariencia seca como papel. En ocasiones la hoja completa
(incluyendo el peciolo) se seca quedando colgada del tallo, mientras que en otros casos
solo parte de la hoja presenta síntomas de marchitez y clorosis. El resto de la lamina
foliar permanece turgente. Alrededor del sistema vascular infectado por la bacteria, se
observa un color marrón (Stapp, 1961).
Las semillas también se pueden infectar por medio de los conductos vasculares. Sin
embargo las semillas infectadas pueden o no presentar síntomas. Éstos se presentan
con manchas a lo largo de la sutura, algunas veces extendiéndose lateralmente. Las
manchas pueden ser de color amarillo, amarillo verdoso, naranja o morado con forma y
tamaño irregular (EPPO⁄CABI, 1997). En vainas inmaduras presentan manchas amarillo
verdoso y marchitez. En vainas maduras las lesiones son de color verde marrón
mientras que el resto de la vaina es de color amarillo. Cuando se abre la vaina infectada
se observa un exudado bacteriano de color amarillo (Stapp, 1961).
RANGO DE HOSPEDANTES
Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max L. y Pisum sativum L. (Dunleavy, 1963, 1983;
Zaumeyer 1932; Zaumeyer y Thomas 1957).
IMPORTANCIA Y TRANSMISIÓN
La marchitez bacteriana del frijol causada por Cff es una plaga cuarentenaria A2 según
EPPO para Europa (CABI/EPPO, 1998). Los requisitos de cuarentena de la EPPO
consideran que, ya que esta bacteria se transmite por semilla se debe asegurar que las
semillas deberán proceder de zonas donde Cff está ausente o cuando la cosecha de
semilla se encuentre libre de la bacteria durante la última temporada de crecimiento. Cff
puede sobrevivir durante 2 años en las semillas en el suelo, o más cuando las semillas
son almacenadas en condiciones óptimas. Las semillas representan el vehículo para la
propagación de la enfermedad a través de distancias cortas y largas (OEPP/EPPO,
1990).
4
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Estados Unidos de Norteamérica (Thomas y Graham 1952; Coyne y Schuster 1979;
Venette et al. 1995), Europe, Australia, Asia, Norte y Sudamérica, Africa (Bradbury 1986;
Smith et al. 1997).
VECTOR BIOLÓGICO
No se reporta en literatura algún vector vinculado con la transmisión de la bacteria a
plantas sanas.
5
Figura 1. Síntomas de marchitez en follaje causados por Curtobacterium flaccumfaciens
pv. flaccumfaciens (Cff) en frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Créditos: D. Caffier,
Organización: Lab. National de la Protection des Végétaux, Francia (2008). Disponible
en: www.invasive.org.
Figura 2. Lesiones causadas por la infección de Cff en vainas maduras de Phaseolus
vulgaris L. Créditos: Ministry of Agriculture and Regional Development Archive, Hungría.
Disponible en: www.invasive.org.
6
Figura 3. Cultivo de Phaseolus vulgaris L. afectado por Cff en el estado de Colorado (EE.UU.).
Créditos: Howard F. Schwartz, Colorado State University, EE.UU. (2008). Disponible en:
www.invasive.org.
Figura 4. Síntomas de marchitez generalizada en P. vulgaris L. en plantas adultas con vaina.
Créditos: Howard F. Schwartz.
Figura 5. Síntomas en tallo de P. vulgaris L. en etapa avanzada de la enfermedad en plantas adultas.
Créditos: Howard F. Schwartz.
7
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Cff puede ser aislada de la planta afectada, semilla y suelo. La identificación puede
realizarse a nivel fenotípico por pruebas bioquímicas para género y patovar; mediante el
Ensayo Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay) y a nivel molecular por técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR). El diagnóstico confirmatorio para los aislamientos sospechosos y positivos de
ELISA se realiza por PCR.
MUESTRA
SEMILLA / SUELO
TEJIDO
ELISA
AISLAMIENTO
AISLAMIENTO
ELISA
PCR
RESULTADO POSITIVO
RESULTADO NEGATIVO
TERMINA
DIAGNÓSTICO
8
PROTOCOLO
ENVÍO/RECEPCIÓN DE MUESTRAS
Las muestras que se reciben para diagnóstico, primeramente se registran en la bitácora
con el número de control que la acompaña. La muestra debe estar en buen estado, esto
es, que no presente necrosis, hongos, que no esté deshidratada y que el tejido esté lo
más fresco posible.
El tejido vegetal para realizar la detección puede incluir: vainas, brotes, peciolos, hojas
con síntomas y lesiones en el tallo. Para el caso de suelo y semilla, 1 Kg de muestra es
suficiente para realizar el diagnóstico.
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA
TEJIDO
1. Utilice medios no selectivos como YDC, CPG, PDA o BK. Las partes de la planta
que se pueden utilizar con frecuencia son hojas (hasta 1 cm2), tallo y peciolo
(Fahy y Persley, 1983).
2. Lave el tejido tres veces con suficiente agua destilada estéril. Agite con una pinza.
3. Elimine el exceso de agua con papel secante estéril. No se recomienda
desinfectar el tejido con hipoclorito de sodio al 1%.
4. Coloque el tejido sobre el agar e incube entre 23-29 °C de 3 a 6 días. Incluya un
control de contaminación.
5. Selle las cajas e identifíquelas con el número de muestra y la fecha de siembra.
SEMILLA BOTÁNICA
1. Desinfecte el área de trabajo con alcohol etílico o isopropílico al 70%.
2. Rotule un vaso de precipitado estéril con el número de muestra.
3. Tome una cantidad suficiente para sembrar hasta 4 cajas, colóquela en un tamiz y
lave con agua corriente por 30 segundos.
4. Ponga la muestra en el vaso etiquetado y desinfecte con una solución de
hipoclorito de sodio al 1% por 1 minuto. Mezcle con una pinza.
9
5. Enjuague tres veces con suficiente agua destilada estéril, agite con una pinza.
6. Después de procesar cada muestra lave el tamiz y las pinzas con detergente;
enjuáguelos con agua corriente.
7. Quite el exceso de agua de la semilla con papel secante estéril.
8. Siembre en los medios B de King, YDC, PDA o CPG. Distribuya las semillas en la
caja. Incluya un control de contaminación.
9. Flamee las pinzas entre cada caja.
10. Selle las cajas e identifíquelas con el número de muestra y la fecha de siembra.
11. Incube las cajas a una temperatura entre 23 y 29 ºC por 3 días. Descarte aquellas
colonias de bacterias saprófitas que aparezcan en las 24-36 horas.
12. Para semilla mantenga el resto de la muestra original cerrada y consérvela a
temperatura ambiente. Para material perecedero conserve en refrigeración.
SUELO
1. Pese 1 gramo de muestra y coloquelo en 9 mL de solución fisiológica estéril (NaCl
0.85%).
2. Prepare diluciones de hasta 1 x 10-5 (Madigan et al., 2008).
3. Coloque asépticamente 100 µL de la dilución en agar BK, CGP y YDC. Realice
por duplicado.
4. Siembre por estría cruzada.
5. Selle las cajas e identifíquelas con el número de muestra y la fecha de siembra.
6. Incube a una temperatura entre 24 a 29°C por 2 a 6 días. Descarte las colonias de
bacterias saprófitas que aparezcan en las primeras 24 horas.
7. Conserve el resto de la muestra a temperatura ambiente.
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA
Género Curtobacterium. Bacilos pequeños, cortos e irregulares en cultivos jóvenes,
0.4-0.6 x 0.6-3.0 µm, agrupados en forma de “V”, “Y” o sencillos. Gram positivos, móviles
por flagelos perítricos. No formadores de espora, aerobios obligados. En medios
nutritivos producen colonias amarillas o naranja con consistencia suave y ligeramente
convexas. Quimioorganótrofos con metabolismo respiratorio. Producen bajas cantidades
10
de ácido a partir de D-glucosa y otros carbohidratos. Catalasa positivo. Temperatura
óptima de crecimiento de 25-30°C (Yamada y Komagata, 1972; Holt et al., 1994).
Patovar flaccumfaciens (Cff). En medio CPG la pigmentación de las colonias puede
variar. Las cepas silvestres producen pigmentos extracelulares de color rosa pálido a
salmón. Respecto a las características de las colonias, varían de opacas a brillantes,
translucidas, con bordes regulares, con elevación que va desde planas a ligeramente
convexas. Temperatura óptima de crecimiento de 30°C (Hedges, 1922; Stapp, 1961;
Schaad et al., 2001). La licuefacción de gelatina es lenta (15 días), así como la hidrólisis
de almidón (28 días) (Stapp, 1961). En los medios BK y CPG produce colonias circulares
y ovales de >3 mm de diámetro (48-72 hrs) con consistencia suave. En medio LB
enriquecido con leche descremada produce colonias amarillas o naranjas con
consistencia mucoide de >3 mm de diámetro (48-72 hrs).
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
1. Seleccione aquellas colonias bacterianas con características similares a Cff y
siembre por el método de estría cruzada.
2. Observe y registre la morfología colonial. Revise las colonias bajo el
estereoscopio y continúe purificando cuando se observen mezclas de bacterias.
3. Determine el tipo de bacteria (Gram positiva o Gram negativa) con la prueba de
Ryu (KOH 3%).
4. Determine el género con las pruebas de citocromo oxidasa y catalasa; así como el
tipo de metabolismo con la prueba de Oxidación/Fermentación.
5. Realice las pruebas de utilización de carbohidratos, aminoácidos y sustratos
siguiendo las indicaciones de la literatura.
6. Realice cada prueba cuando sea posible por duplicado. Utilice un testigo sin
inocular (negativo) y de preferencia un testigo positivo.
7. Identifique los aislamientos con el número de muestra de la que se obtuvieron.
8. Aquellos aislamientos identificados como C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, se
envían al laboratorio de Biología Molecular para su corroboración por la técnica de
la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
9. Los cultivos puros de los aislamientos confirmados pueden preservarse por
congelación de -20°C a -80ºC en medio NBY adicionado con glicerol al 30% (Sly
LI, 1983; Schaad et al., 2001).
11
5
6
7
9
8
Morfología colonial de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (García-Ortega A.M. y
Ruiz-Machuca M., 2011). Figuras 5 y 6) Prueba de degradación de caseína en agar LB
adicionado con leche descremada al 1.6% a las 48 horas de incubación a 27°C, donde se
observan zonas de aclaramiento en el medio; 7) Cepa con pigmentación salmón en medio B
de King; 8) Colonias color naranja, brillantes, ligeramente convexas en agar YDC; 9)
Variante color crema en medio B de King donde produce colonias brillantes, con bordes
enteros y ligeramente convexas con consistencia suave. Esta cepa produce colonias color
amarillo en medios enriquecidos como YDC o NBY. Ver Tabla 1.
12
PRUEBAa
RESULTADOb
Género Curtobacterium
Prueba de Ryu (KOH 3%)
Citocromo Oxidasa
Catalasa
Movilidad en medio líquido a las 12 horas (observado a 40X)
+
+
Patovar flaccumfaciens
Pigmentos en agar NBY
Pigmentos en agar YDC y LB-SMd
Pigmentos en agar CPG
Pigmentos en agar B de King
Crecimiento en CNS
Crecimiento en TTC
Crecimiento a 4, 30, 37 y 40°Cc
Hidrólisis de Almidónc
Licuefacción de Gelatinac,f
Hidrólisis de Caseínad
Hidrólisis de Esculina
Reducción de Nitratos a Nitritos
Tolerancia a NaCl 5-9%
Producción de Indol a partir de L-Triptófano
Producción de H2S a partir de L-Cisteína
Producción de Ureasa
Amarillo, naranja, rosa
Amarillo, naranja
Crema, rosa, salmón
Crema, naranja, rosa, salmón
V
+
+
+DT
+T
+
+
+
+
-
Producción de ácido (débil, sin gas) a partir de: e
L-Arabinosac, D-Fructosa, D-Xilosa
D-Ribosa
D-Glucosa, D-Galactosa, D-Manosa, L-Ramnosa
D-Maltosa, D-Lactosa, Sacarosac,f, D-Celobiosa, Rafinosa
D-Melezitosa, Adonitol, D-Manitol
Glicerol, myo-Inositol
D-Sorbitol
Inulina
+
+T
+
+
V
+
-
Utilización de:
Acetato, Fumarato, Gluconato
Formato
+
-
Tabla 1. Caracterización fenotípica de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. Citas: aPruebas
realizadas en este estudio de 12 cepas aisladas de semilla de frijol, provenientes de los EE.UU.
(2010). Las pruebas bioquímicas se incubaron a 27°C ± 1°C por triplicado. Abreviaturas: V,
variable; D, débil; T, tardía; bInterpretación de resultados según Schaad et al., 2001: +, 80% o más
aislamientos son positivos después de 5 días; V, entre 21-79% son positivos; -, 80% o más son
negativos. Holt et al., 1994: +, 90% o más son positivos; V, entre 11-89% son positivos; -, 90% o más
son negativos; cStapp (1961); dEn agar LB adicionado con leche descremada al 1.6%; eEn medio
C (Dye y Kemp; 1977); fHolt et al., 1994 reporta como negativo.
13
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
1. La presencia de una bacteria fitopatógena de interés cuarentenado se indica
como POSITIVO y su ausencia como NEGATIVO.
2. Si el control positivo utilizado no presenta ninguna reacción en las diferentes
pruebas se invalida el resultado del diagnóstico y se repite el ensayo.
3. En el control negativo no deberá observarse ningún crecimiento. Si esto ocurre se
invalida el resultado del diagnóstico y se repite el ensayo.
DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA Y MANEJO DE DESECHOS
1. En caso de que el diagnóstico resulte positivo y concluido el tiempo de
almacenamiento reglamentario, la muestra es esterilizada por calor húmedo o
calcinada. En caso contrario, únicamente se almacena en refrigeración para ser
desechadas posteriormente.
2. Las semillas lavadas con hipoclorito que no se sembraron, los medios con las
semillas o con aislamientos de bacterias y pruebas bioquímicas (sin reactivos) se
esterilizan antes de ser desechados.
3. Los restos de reactivos utilizados para la interpretación de pruebas bioquímicas
son colocados en un recipiente con tapa de rosca para ser recolectados por un
proveedor autorizado.
14
COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
AGAR B DE KING (BK)
Peptona
20 g
K2HPO4
1.5 g
MgSO4 • 7H2O
1.5 g
Agar
15 g
Glicerol
15 mL
Agua destilada
985 mL
Preparación: Disuelva los reactivos y esterilice a 121°C por 15 minutos. Volumen final:
1000 mL. Vacíe en cajas Petri.
EXTRACTO DE LEVADURA-DEXTROSA-CARBONATO DE CALCIO (YDC)
Extracto de levadura
10 g
Glucosa
20 g
CaCO3
20 g
Agar
15
Agua destilada
900 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto la glucosa. Esterilice a 121°C por 15
minutos. Para 1 litro de medio, esterilice la glucosa por separado en 100 mL de agua
destilada a 121°C por 5 minutos. Adicione la glucosa asépticamente al medio basal.
Volumen final: 1 L. Mezcle y vacíe en cajas Petri.
15
AGAR CASAMINOÁCIDOS-PEPTONA-GLUCOSA (CPG)
Casaminoácidos (BD®, Oxoid®)
1g
(Hidrolizado ácido de Caseína)
Peptona
10 g
Glucosa
10 g
Agar
15 g
Agua destilada
900 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto la glucosa. Esterilice a 121°C por 15 minutos.
Disuelva la glucosa en 100 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione
asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en cajas Petri.
MEDIO PARA MOVILIDAD
Triptona
10 g
Cloruro de Sodio
5g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Disuelva los reactivos y ajuste a un pH de 6.8-7. Esterilice a 121°C por 15
minutos. Vacíe en tubos estériles.
MEDIO DE HUGH-LEIFSON (O/F)
Peptona
2g
NaCl
5g
KH2PO4
0.3 g
Azul de bromotimol al 1%
(En agua destilada)
3 mL
Agar
3g
Glucosa
10 g
Agua destilada
900 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto la glucosa. Ajuste a un pH de 6.8-7.0 y
esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva 10 g de glucosa en 100 mL de agua destilada y
esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 L. Mezcle y
vacíe en tubos.
16
AGAR CALDO NUTRITIVO-EXTRACTO DE LEVADURA (NBY)
K2HPO4
2g
KH2PO4
0.5 g
MgSO4 • 7H2O
0.246 g
Caldo Nutritivo
8g
Extracto de levadura
2g
Glucosa
2.5 g
Agar
15 g
Agua destilada
980 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el sulfato de magnesio y la glucosa. Esterilice
a 121°C por 15 minutos. Disuelva por separado la glucosa y el sulfato de magnesio en 10
mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione asépticamente al medio. Volumen
final: 1 litro. Mezcle y vacíe en cajas Petri.
MEDIO C PARA CARBOHIDRATOS
NH4H2PO4
1g
KCl
0.2 g
MgSO4 • 7H2O
0.2 g
Peptona
10 g
Carbohidratos
10 g
Azul de bromotimol al 1%
3 mL
(En etanol al 50%)
Agar
10 g
Agua destilada
900 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el carbohidrato. Ajuste a un pH de 7.1 y
esterilice a 121°C por 15 minutos. Disuelva el carbohidrato en 100 mL de agua destilada y
esterilice por filtración. Añada asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 litro. Mezcle y
vacíe en tubos estériles.
17
AGAR CNS (MODIFICADO)
K2HPO4
1g
KH2PO4
0.25 g
Caldo Nutritivo
4g
Extracto de Levadura
1g
Agar
7.5 g
Glucosa
2.5 g
MgSO4 • 7H2O
0.062 g
Cicloheximida (10 mg/mL)
2 mL
Ácido Nalidíxico (10 mg/mL)
1.25 mL
Sulfato de Polimixina B
1.6 mL
 6,000 Unidades USP/mg (10 mg/mL)
Agua destilada
500 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el sulfato de magnesio y la glucosa. Esterilice
a 121°C por 15 minutos. Esterilice la glucosa y el sulfato de magnesio por filtración y
adicione junto con los antibióticos al medio basal. Mezcle y vacíe en cajas Petri.
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO A PARTIR DE CISTEÍNA
NH4H2PO4
0.5 g
K2HPO4
0.5 g
MgSO4 • 7H2O
0.2 g
NaCl
5g
Extracto de levadura
5g
L-Cisteína
0.1 g
Agua destilada
990 mL
Preparación: Disuelva los reactivos excepto la cisteína. Esterilice el medio a 121°C por 15
minutos. Disuelva el aminoácido en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración.
Adicione asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos estériles.
18
PRODUCCIÓN DE INDOL A PARTIR DE TRIPTÓFANO
Triptona
10 g
L-Triptófano
1g
Agua destilada
990 mL
Preparación: Disuelva los reactivos excepto el triptófano. Esterilice el medio a 121°C por 15
minutos. Disuelva el aminoácido en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración.
Adicione asépticamente al medio. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos estériles.
REDUCCIÓN DE NITRATOS
Nitrato de potasio
1g
Peptona
5g
Extracto de levadura
3g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Disuelva los reactivos. Regule el pH a 7-7.2 y esterilice a 121°C por 15
minutos. Vacíe en tubos estériles.
MEDIO CON CLORURO DE TETRAZOLIO
Peptona
10 g
Casaminoácidos (BD®, Oxoid®)
1g
(Hidrolizado ácido de Caseína)
Glucosa
5g
Agar
12 g
Cloruro de 2,3,5-Trifenil tetrazolio (TTC)
0.05 g
Agua destilada
990 mL
Preparación: Disuelva los reactivos, excepto el TTC. Esterilice a 121°C por 15 minutos.
Disuelva el TTC en 10 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione el TTC
asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en cajas Petri.
19
HIDRÓLISIS DE ESCULINA
NH4H2PO4
0.5 g
K2HPO4
0.5 g
MgSO4 • 7H2O
0.2 g
NaCl
5g
Extracto de levadura
5g
Esculina
1g
(6,7-Dihidroxicumarina 6-Glucósido)
Citrato de amonio férrico
0.5 g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Disuelva los reactivos y ajuste a un pH 6.8. Esterilice a 121°C por 15
minutos. Vacíe en tubos estériles.
PRODUCCIÓN DE UREASA
NH4H2PO4
0.5 g
K2HPO4
0.5 g
MgSO4 • 7H2O
0.2 g
NaCl
5g
Extracto de levadura
1g
Rojo de cresol
0.016 g
Urea
20 g*
Agua destilada
800 mL*
Preparación: Disuelva los reactivos excepto la urea. Esterilice a 121°C por 15 minutos.
*Disuelva 20 g de urea en 180 mL de agua destilada y esterilice por filtración. Adicione la
urea asépticamente al medio basal. Volumen final: 1 litro. Mezcle y vacíe en tubos
estériles.
20
HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
Agar Nutritivo
8g
Almidón soluble de papa
10 g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Disuelva los reactivos y esterilice a 121°C por 10 minutos. Vacíe en cajas
Petri.
HIDRÓLISIS DE GELATINA
Extracto de carne
3g
Peptona
5g
Gelatina
120 g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Disuelva en agua caliente. Ajuste a un pH de 7. Esterilice a 121°C por 15
minutos. Vacíe en tubos estériles.
TOLERANCIA A CLORURO DE SODIO
Extracto de carne
3g
Peptona
5g
Glucosa
2.5 g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Adicione NaCl para obtener concentraciones de 1-10%. Esterilice a 121°C
por 15 minutos. Vacíe en tubos estériles.
21
AGAR LURIA-BETANI + SKIM MILK 1.6%
AGAR LB (Lennox)
Triptona
10 g
Extracto de levadura
5g
NaCl
5g
Agar
15 g
Agua destilada
900 mL
Preparación: Disuelva los reactivos y esterilice a 121°C por 15 minutos.
SKIM MILK
Leche descremada
16 g
Agua destilada
100 mL
Preparación: Esterilice la leche descremada por separado a 121°C por 15 minutos.
Adicione la leche asépticamente al medio LB. Volumen final: 1litro. Mezcle y vacَíe en
cajas de Petri.
22
DETECCIÓN POR PTA-ELISA
Para la detección de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens se utiliza la técnica serológica
de ELISA que está basada en la habilidad de las proteínas, conocidas como anticuerpos,
para reconocer y enlazar un antígeno específico asociado con el patógeno. Es una
técnica confiable y rápida para la detección de fitopatógenos (Machmud y Suryadi,
2008).
Se han desarrollado algunas variantes de la técnica de ELISA. La variante PTA-ELISA
(Plate Trapped Antigen, por sus siglas en inglés) que a continuación se describe es la
desarrollada por la compañía NEOGEN EUROPE LTD. Consiste en la adsorción inicial
del patógeno (A) a una placa de poliestireno, en la que después de un periodo de
incubación se lava la placa. En seguida se bloquea cualquier sitio libre con un
amortiguador de bloqueo con alto contenido proteico. Posteriormente se lava y se añade
el anticuerpo sonda (IgG) que reacciona con los antígenos adheridos a la placa. Se lava
y se complementa con la adición de un conjugado enzimático (E) (anticuerpo conjugado
con una enzima, que en este caso es Fosfatasa Alcalina) para formar el complejo
antígeno-anticuerpo sonda-conjugado enzimático. Después de lavar se adiciona el
sustrato (S). Si se formó el complejo mencionado, se desarrollará color indicando la
presencia del fitopatógeno (Machmud y Suryadi, 2008).
Procedimiento:
1. Macere 0.5 g de cada muestra con 2 mL de amortiguador de cobertura (Apéndice
1). Nota 1: En algunos casos será recomendable incrementar la cantidad de
amortiguador de cobertura según la viscosidad del macerado. Nota 2: De acuerdo al
fabricante, el set de reactivos esta diseñado también para poder realizar el análisis
directamente de la cepa aislada. Sin embargo, no tiene disponible la información
23
sobre los límites de detección. No obstante, es posible detectar a Cff directamente de
la cepa aislada probando varias diluciones de la misma.
2. Considerando el formato de distribución de las muestras, adicione a la placa 100 µL
de cada muestra, control positivo y control negativo con su repetición respectiva.
3. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 4°C durante toda la noche.
4. Lave la placa de 6 a 8 veces con PBS-T 1X 1 (Apéndice 1) y seque completamente.
Nota: En algunos casos podrá ser necesario lavar la placa 3 a 4 veces, dejar reposar
durante 1-2 minutos y continuar con otros 3 a 4 lavados.
5. Adicione 200 µl de amortiguador de bloqueo (Apéndice 1) a cada pozo de prueba.
6. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 37º C por 1 hora.
7. Lave la placa 3 veces con PBS-T 1X (Apéndice 1) y seque completamente.
8. Diluya el anticuerpo sonda según la recomendación del fabricante en amortiguador
de dilución de anticuerpo (Ab) (Apéndice 1) en la cantidad suficiente para el
número de muestras a analizar y adicione 100 µl a cada pozo de prueba.
9. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 37°C por 2 horas.
10. Lave la placa de 4 a 6 veces con PBS-T 1X (Apéndice 1) y seque completamente.
11. Diluya el conjugado enzimático según la recomendación del fabricante en
amortiguador de conjugado (Apéndice 1) en la cantidad suficiente para el número
de muestras a analizar y adicione 100 µl a cada pozo de prueba.
12. Coloque la placa en cámara húmeda e incube a 37°C por 1 hora.
13. Lave la placa de 4 a 6 veces con PBS-T 1X (Apéndice 1) y seque completamente.
14. Prepare la solución de sustrato de para-nitrofenil fosfato (pNPP) a una concentración
de 1mg/ml en amortiguador de sustrato (Apéndice 1). Nota: una pastilla de 5 mg en
5 ml de amortiguador de sustrato.
15. Adicione 100 µl de la solución de sustrato a cada pozo de prueba incluyendo el
blanco.
16. Incube en cámara oscura a temperatura ambiente por 1 hora (ver Nota en punto 17).
17. Lea la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm en el lector de placas de
ELISA. Nota: Se pueden realizar lecturas de absorbancia cada 15 minutos después
de haber adicionado el sustrato a la placa. Sin embargo, los resultados se podrán
interpretar después de transcurrida 1 hora.
24
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
18. Los resultados se podrán interpretar de acuerdo a los siguientes criterios (Cruz y
Frías, 1997):
a) La muestra se considera positiva si la lectura de densidad óptica es mayor o igual
a tres veces la media del testigo negativo.
b) Si el testigo negativo presenta en promedio valores de densidad óptica menores
de 0.03, sólo se consideran positivas aquellas muestras con densidades ópticas
mayores a 0.1.
c) Cuando sólo una de las muestras es positiva y/o si la diferencia con su repetición
es mayor o igual al 50% de su valor, la muestra debe procesarse nuevamente
para determinar la presencia del fitopatógeno.
19. Las muestras que resulten positivas deberán corroborarse por la técnica de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para confirmar la presencia del
fitopatógeno.
20. Los resultados se anotan en los registros de laboratorio correspondientes indicando
la fecha de emisión del resultado. Nota: En el caso de que el lector de placas de
ELISA cuente con impresora térmica interna, será necesario incluir a dichos registros
las lecturas de absorbancia que se hayan impreso.
APÉNDICE I
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
a. Solución amortiguadora de cobertura (Amortiguador de Carbonatos)
Disuelva en 1000 mL de agua destilada:
Carbonato de Sodio (anhidro)
1.59 g
Bicarbonato de Sodio
2.93 g
Azida de sodio
0.2 g
25
Ajuste el pH a 9.6 (+/- 0.2). Almacene a 4° C (en refrigeración).
b. Solución amortiguadora salina de Fosfatos (PBS) 10X (Concentrada 10 veces)
Disuelva en 1000 mL de agua destilada:
Cloruro de sodio
80 g
Fosfato de Sodio, dibásico (anhidro)
11.5 g
Fosfato de Potasio, monobásico (anhidro)
2g
Cloruro de Potasio
2g
Diluya 1:10 para utilizar el PBS a una concentración de 1X.
c. Solución amortiguadora de Lavado (PBS+Tween 20; PBS-T)
PBS 1X
1L
Tween 20
0.5 mL
Ajuste el pH a 7.4 (+/- 0.2).
d. Solución amortiguadora de Bloqueo (PBST-M)
PBS-T 1X
100 mL
Leche en polvo baja en grasa
5g
e. Solución amortiguadora de Dilución de Anticuerpo (Ab)/Conjugado
PBS-T 1X
100 mL
Albúmina de Suero Bovino
0.2 g
26
f. Solución amortiguadora para sustrato pNPP (Amortiguador de Dietanolamina 1
M).
Disuelva en 800 mL de agua destilada:
Dietanolamina
90.39 g
Dietanolamina-HCl
19.82 g
Cloruro de Magnesio hexahidratado
0.1 g
Azida de Sodio
0.2 g
Ajuste el volumen final a 1000 mL con agua destilada estéril. Ajustar el pH a 9.8.
Almacene a 4° C en refrigeración en frasco ámbar o envolver con aluminio para proteger
de la luz. El sustrato pNPP se prepara a una concentracion de 1 mg/ml (1 tableta de 5
mg en 5 ml de amortiguador de sustrato).
NOTA: La Dietanolamina y Dietanolamina-HCl son líquidos extremadamente viscosos.
Sin embargo, es más sencillo pesarlos que medir su volumen.
27
DETECCIÓN POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PUNTO FINAL)
1. DESCRIPCIÓN
Los iniciadores publicados por Guimaraes et al., (2001) amplifican un fragmento de
aproximadamente 148 pb, siendo específicos para el patovar flaccumfaciens. Iniciador
sentido CF4: 5’-CACAGCCACCTACATGC-3’, iniciador antisentido CF5: 5’GATCGGGAGTCCGAG-3’. Sensibilidad del método: 100 UFC/mL.
Otros iniciadores reportados por Tegli et al., (2002) amplifican un fragmento de 306 pb.
Iniciador
CffFOR2
5’-GTTATGACTGAACTTCACTCC-3’
y
CffREV4
5’GATGTTCCCGGTGTTCAG-3’. Sensibilidad del método: 100 UFC/mL y 5 pg de ADN
genómico.
5’CACAGCCACCTACATGCCGATCAGCGCCGATCAGGCCGCCCGGCAGCTTCCGA
ACCTGCAGAAGGTCAGCGCCAAGACCGCCGGGTGGCTGCTCGAGGACCTCACCTC
GAGCGCCACTGCAACCGGCGCCGAGCTCGGACTCCCGATCGTCACCGCCGCACGC
CCCACGACAGAGGCGCAGGTTATCGAGATCCGGA 3'
Figura 10. Sitos de unión de los iniciadores CF4 y CF5 (Producto de 148 pb), la cual
corresponde a un fragmento desconocido (198 pb) del genoma de C. flaccumfaciens pv.
flaccumfaciens cepa de referencia NCPPB 559. Número de acceso GenBank AF277098.1.
Tomado de Guimaraes et al., 2001.
2. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL
(Chomczynski et al., 1997)
2.1 Tome 200 mg de tejido, colóquelo en un tubo de 2 mL y macere en 500 µl
amortiguador TE estéril (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8).
2.2 Adicione 500 µL del reactivo DNAzol-ES® (MRC Inc, EE.UU).
2.3 Mezcle con vórtex y mantenga en agitación mecánica por 15 minutos.
2.4 Incube en baño María a 70 °C por 10 min.
2.5 Centrifugue a 12,000 r.p.m. por 1 min.
2.6 Transfiera el sobrenadante a otro tubo estéril.
2.7 Adicione 500 µL de cloroformo 99.8% (4°C) y mezcle con vórtex.
28
2.8 Deje reposar 5 minutos a temperatura ambiente.
2.9 Centrifugue a 12,000 r.p.m. por 10 min.
2.10 Transfiera la fase acuosa a otro tubo y adicione 0.75 volúmenes de etanol
absoluto (-20°C).
2.11 Mezcle manualmente por inversión de 6 a 8 veces y deje reposar por 5 minutos
en el congelador.
2.12 Posteriormente centrifugue a 14,000 r.p.m. por 10 min.
2.13 Elimine el etanol por decantación.
2.14 Lave con 500 µL de etanol 70% (-20°C) y aplique vórtex.
2.15 Centrifugue a 14,000 r.p.m. por 5 min.
2.16 Elimine el etanol por decantación e invierta los tubos sobre papel secante estéril.
2.17 Evapore los restos de etanol a 37°C por 10 min.
2.18 Resuspenda el ADN en 50-100 µL de amortiguador TE estéril.
2.19 Tome 5 µL para detectar por electroforesis y almacene el resto en el congelador.
3. DETECCIÓN DE ADN GENÓMICO
3.1 Prepare un gel de agarosa al 1.2-1.5% en amortiguador TBE 0.5X y adicione
bromuro de etidio (10 mg/mL) a una concentración de 0.5 mg/mL (Maniatis et al.,
1982).
3.2 Utilice 5 µL de ADN para cargar al gel y mezcle con 1 µL de amortiguador de
carga 5x (xilencianol 0.1%, azul de bromofenol 0.1%, naranja G 0.1%, glicerol al
50% en amortiguador TBE 0.5x) (Davis et al., 1994).
3.3 Utilice como referencia 5 µL del marcador de peso molecular de 0.1 a 2 Kpb (0.51 µg/µl).
3.4 Aplique una carga de 100 voltios por 30 minutos.
3.5 Coloque el gel sobre el transiluminador UV y fotografíe los resultados.
29
4. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO BACTERIANO (Ausubel et al., 2002; Maniatis
et al., 1982).
Enzimas:

Proteinasa K (20 mg/mL)

Lisozima (10 mg/mL)
Reactivos:

Amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8)

Dodecilsulfato de sodio al 10%

NaCl 5M

Cloroformo / alcohol isoamílico 24:1

Fenol (Tris-HCl, EDTA 1mM, pH 8) / cloroformo / alcohol isoamílico 25:24:1

Isopropanol al 99% (-20°C)

Etanol al 70% (-20°C)

CTAB 10%-NaCl 0.7 M
PROCEDIMIENTO
1. Tome una colonia y resuspéndala en 1 mL de NaCl 0.85%, centrifugue a 12,000
r.p.m. durante 2 minutos. Elimine el sobrenadante en un recipiente con hipoclorito de
sodio al 1%.
2. Resuspenda el paquete celular en 567 µL de amortiguador TE. Agregue 8 µL de
lisozima, mezcle e incube 25 minutos a 37°C.
3. Adicione 30 µL de SDS, 3 µL de proteinasa K y mezcle por inversión.
4. Incube a 37°C por 25 minutos.
5. Adicione 100 µL de NaCl 5M y mezcle por vórtex.
6. Agregue 80 µL de solución CTAB/NaCl. Mezcle e incube 10 minutos a 65°C en baño
María.
7. Adicione 0.7 mL de cloroformo/alcohol isoamílico, mezcle por vórtex y centrifugue 5
minutos a 12,000 r.p.m.
30
8. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo. Agregue un volumen igual de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, mezcle por vórtex y centrifugue 5 minutos a
12,000 r.p.m.
9. Transfiera la fase superior a un tubo nuevo. Agregue 0.6 volúmenes de isopropanol y
mezcle por inversión.
10. Centrifugue 10 minutos a 14,000 r.p.m. Elimine el isopropanol por decantación.
11. Lave con 1 mL de etanol al 70%. Centrifugue por 5 minutos a 14,000 r.p.m.
12. Elimine el etanol por decantación y coloque el tubo invertido sobre papel secante
estéril.
13. Evapore el etanol a temperatura ambiente ó a 37°C por 5 minutos.
14. Disuelva el ADN en 100 µL de amortiguador TE.
15. Detecte por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1-1.2%.
16. Almacene el ADN resuspendido a -20°C.
31
5. PREPARACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR:
5.1 Utilice material estéril y guantes durante la preparación de la reacción. Mantenga los
reactivos, controles e iniciadores en hielo mientras prepara la reacción.
5.2 Utilice como control positivo ADN genómico de la cepa Cff (Fuente: Colección de
laboratorio).
5.3 Como control negativo utilice agua.
5.4 Dependiendo del número de muestras prepare un coctel (excepto ADN) y calcule la
cantidad total de cada componente según la siguiente tabla:
Componente
Cantidad µL
Agua grado PCR
Iniciador CF4 (0.1 µg/µL)
Iniciador CF5 (0.1 µg/µL)
Master Mix 2X (Promega®)
4.25
0.5
0.5
6.25
ADN genómico (cepa aislada)
Volumen final
1
12.5
Concentración final
N/A
4 ng/µL
4 ng/µL
Taq polimerasa 0.025 U/µL; ATP,
dCTP, dGTP, dTTP 200 µM; MgCl2
1.5 mM; amortiguador pH 8.5
20 ng por reacción
-
5.5 Mezcle con vórtex ligero y recupere la mezcla en el fondo del tubo con un pulso en
la centrífuga.
5.7 Adicione a cada tubo 11.5 µL de la mezcla de PCR.
5.8 Adicione 1 µl de ADN o agua. El volumen de la reacción es de 12.5 µL para un PCR
de la cepa aislada y de 25 µL para ADN genómico total de tejido.
5.9 Mezcle con vórtex ligero y recupere la mezcla con un pulso en la centrífuga.
5.10 Coloque los tubos en el termociclador y ejecute el siguiente programa:
Temperatura °C
Tiempo
Evento
Ciclos
94
94
55
72
72
4 min./5 min.
30 seg.
20 seg./25 seg.
45 seg.
5 min.
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Alineamiento de los iniciadores
Extensión
Extensión final
1
30
1
Tabla 2. Condiciones de PCR con los oligonucleótidos CF4 y CF5 (Guimaraes et al., 2001). Para
ADN genómico de la cepa aislada utilice un tiempo de desnaturalización de 4 minutos y un
tiempo de alineamiento de 20 segundos. Para ADN genómico total de tejido, use un tiempo de
desnaturalización de 5 minutos y 25 segundos para el alineamiento.
32
5.11 Detecte mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Utilice amortiguador TBE
0.5x (Tris[hidroximetil]aminometano 44.5 mM, ácido bórico 44.5 mM, EDTA 0.5 mM, pH
8.3).
5.12 Para 12.5 µL de producto de PCR, adicione 2.5 µL de amortiguador de carga 5x y
mezcle por vórtex.
5.13 Recupere la mezcla en el fondo del tubo con un pulso en la centrífuga y utilice 10
µL para cargar al gel.
5.14 Utilice como referencia un marcador de peso molecular de 0.1 a 2 Kpb.
5.15 Aplique una carga de 100 voltios por 30 minutos.
5.16 Coloque el gel sobre el transiluminador UV y fotografíe los resultados. Ver Figura
11.
5.17 Los productos de PCR pueden almacenarse a 4°C hasta que sean detectados.
1
2
3
4
5
6
7
2 Kb
0.6
0.3
0.2
0.1
Figura 11. Detección de Cff por PCR de punto final (iniciadores CF4/CF5) de cepas aisladas
de semilla de frijol procedentes de los EE.UU. (2010). Carriles: 1) Marcador 0.1-2 Kpb, 2)
CP, 3) CN, 4) Cff (variante color crema en agar B de King), 5) Cff (pigmentación rosa pálido),
6) Cff (pigmentación rosa) y 7) Cff (pigmentación salmón). De las 12 cepas aisladas y
analizadas en este estudio, solo se muestran las más representativas.
33
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
DETECCIÓN POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PUNTO FINAL)
1. La presencia de una bacteria fitopatógena se indica como POSITIVO y su ausencia
como NEGATIVO.
2. Si en el control positivo no se observa amplificación se invalida el resultado del
diagnóstico y se tendrá que repetir el ensayo de PCR.
3. En el control negativo no deberá observarse amplificación alguna. Si esto ocurre, se
invalida el resultado del diagnóstico. Es recomendable preparar de nuevo los
reactivos e iniciadores con agua recién esterilizada.
MANEJO DE RESIDUOS QUÍMICOS
Los restos de reactivos químicos peligrosos para el medio ambiente, corrosivos e
inflamables son separados y almacenados en contenedores adecuados para que sean
recolectados por un proveedor autorizado.
34
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