Directo Plus - GT Laboratorio

AVANCE
Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L.
HbA1c
Método Directo para determinar
Hemoglobina A1c
Inmunoturbidimetría exaltada por látex
Directo Plus
GT Lab ha introducido un sistema de detección directa de la hemoglobina
A1c (HbA1c) que permite realizar la medición sin necesidad de determinar la
hemoglobina total, consecuentemente empleando un solo canal en los analizadores automáticos.
El método emplea anticuerpos monoclonales y una exaltación de la respuesta
inducida por partículas de látex.
La primer etapa de la reacción se basa en la unión inespecífica de las proteínas
a las partículas de látex. En la segunda fase de la reacción actúan anticuerpos
anti humanos altamente específicos que permiten la determinación directa de
la HbA1c por turbidimetría.
Los reactivos son presentados en forma líquida estables, los que pueden emplearse en analizadores capaces de usar dos reactivos por método. Si bien se
proveen cuatro calibradores para cubrir todo el rango útil de la determinación,
la notable linealidad del método permite trabajar rutinariamente con dos.
Algunos analizadores permiten la realización totalmente automatizada de la
determinación sin siquiera necesitar el paso de hemólisis.
1
HbA1c DIRECTO PLUS
2
HbA1c DIRECTO PLUS
INTRODUCCIÓN
La HbA1c se forma por conjugación no enzimática de la glucosa al terminal N de la cadena beta de la hemoglobina durante la vida de los eritrocitos, reflejando la concentración
media de glucosa en ese período, sirviendo como control en
individuos diabéticos.
La glucohemoglobina ha sido definida como la fracción rápida
que eluye primero en columnas cromatográficas, fracción que
incluye HbA1a, HbA1b y HbA1c. El presente método emplea
una reacción inmunológica que determina directamente la
HbA1c.
Hasta la publicación del Estudio de Cuidado y complicaciones
de la Diabetes (DCCT por su nombre en inglés: Diabetes Care
and Complications Trial) en EEUU en 1993, la idea de un mejor
control de la glicemia fue solamente una teoría.
Este estudio comparó pacientes que tenían una terapia intensa con los que recibían un cuidado convencional de su diabetes tipo 1. El estudio determinó que aquellos mantenían un
nivel menor de glicemia y niveles significativamente menores
de HbA1c.
Luego, estos pacientes demostraron tener valores de morbilidad y mortalidad mejores que los que habían recibido cuidados convencionales, reduciendo los niveles de retinopatías,
nefropatías y neuropatías entre un 40 y un 75%.
Así, los niveles de HbA1c fueron establecidos como un indicador crítico del control de glicemia en el largo plazo en pacientes con diabetes Tipo 1.
A posteriori de la publicación de la DCCT, el Programa Nacional de Estandarización de la Glucohemoglobina de los EEUU
(NGSP por su nombre en inglés: National Glycohemoglobin
Standardization Program) estableció los intentos por estandarizar los resultados obtenidos por los diferentes métodos disponibles, refiriéndolos al empleado por el DCCT. Esto produjo
una exitosa disminución en el bias entre métodos.
Recientemente, la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) desarrolló y aprobó el método de referencia para la
determinación de HbA1c. Se ha notado una diferencia entre
los métodos de la IFCC y de la DCCT. Actualmente, la IFCC
y el DCCT están trabajando en conjunto para proveer al los
médicos y a los fabricantes de reactivos con recomendaciones
actualizadas sobre la determinación
proporcional a la concentración de HbA1c en la muestra, la
que puede cuantificarse por comparación con los resultados
obtenidos con una curva de calibración. El anticuerpo antiHbA1c empleado está dirigido específicamente al residuo
2-deoxifructosa-valina de la HbA1c, epitope Fruc-VHLTPEK.
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS
Lisante: azida de sodio 7 mmol/l. Listo para usar.
R1: suspensión de partículas de látex 0.13%.
R2a: buffer de glicina 80 mmol/l, pH 7.3.
R2b: solución de anticuerpo monoclonal de ratón contra
HbA1c y anticuerpo policlonal de cabra anti IgG de ratón en
buffer glicina 20 mmol/l, pH 7.1.
HbA1c Calibradores y Controles (provistos separadamente
por GT Lab):
Sangre humana liofilizada con concentración indicada en los
rótulos del envase.
PREPARACION DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO
R2T: este paso es crítico para el correcto funcionamiento del
reactivo. Trasvase una pequeña porción de R2a (aproximadamente 1-1.5 ml) al envase de R2b, cierre nuevamente el
envase y mezcle por inversión suavemente. Vuelque todo el
contenido del frasco de R2b dentro del R2a, empleando pequeñas porciones de la mezcla R2T resultante para arrastrar
restos que pudieran quedar en el frasco R2b.
Calibradores: agregue 0.5 ml de agua destilada o deionizada
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Kit de HbA1c: Conserve refrigerado (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja.
R2T: 30 días refrigerado (2-8ºC).
Calibradores: 30 días refrigerado (2-8ºC) o 6 meses congelado
(-20ºC).
MUESTRA
Sangre. No es necesaria preparación alguna del paciente ni
estar en ayunas. Obtenga la muestra de la manera usual empleando EDTA como anticoagulante. Homogeneice la muestra
por inversión suave antes de ensayar.
Nota: Algunos analizadores de química pueden ser programados para realizar el paso de la hemólisis en el instrumento
mismo, proveyendo una alternativa de trabajo totalmente automatizada. El ejemplo aplicado a Hitachi puede verse al final
de la presentación.
PRINCIPIO
Nuestro método emplea una reacción antígena anticuerpos
para determinar directamente el porcentaje de HbA1c en
sangre humana. Tanto la hemoglobina total como la HbA1c
tienen la misma tasa de absorción sobre partículas de látex,
lo que da sustento a la primera reacción, producida al poner
en contacto la muestra con el reactivo R1. Al agregar el reactivo R2, que contiene anticuerpo monoclonal anti–HbA1c de
ratón, se forma un complejo látex-HbA1c-anticuerpo que es
aglutinado por un anticuerpo de cabra anti-ratón, también
contenido en R2. Resulta así el desarrollo de turbidez que es
VALORES DE REFERENCIA
Pacientes no diabéticos: <6%
Pacientes diabéticos controlados: <7%
Cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores
normales.
EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE HBA1C DIRECTO PLUS
Estudio de comparación
Se realizó un estudio comparando los resultados obtenidos
3
HbA1c DIRECTO PLUS
con el presente método y un método comercial basado en
HPLC. Se emplearon 30 muestras suministradas por un laboratorio que efectúa la determinación, con un rango de valores
de 4.7-11.8%. El método HbA1c Directo Plus fue realizado en
un Olympus AU400, empleado sangre entera como muestra y
lisando directamente en el instrumento.
Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.992 y una ecuación de regresión y = 0.86 x + 0.32. Los resultados se muestran en la TABLA I y están graficados en el GRAFICO I.
Otro experimento se hizo sobre 24 muestras en un Hitachi
717 a los efectos de comparar la hemólisis efectuada en el
aparato y como pretratamiento. Se obtuvo un coeficiente de
correlación de 0.985 y una ecuación de regresión y = 0.98 x +
0.34 en un rango de valores de 4.4-10.4%
(Tabla II y Gráfico II).
moglobinas F y E no han mostrado aun resultados suficientes
para sacar conclusiones.
Los datos obtenidos se muestran en las tablas V, VI y VI y en
los gráficos III, IV y VII respectivamente.
ESTUDIO DE LINEALIDAD
El rango útil de linealidad de HbA1c Directo Plus se estableció
a partir de una muestra comercial preparada para dar 25%
HbA1c por HPLC, provista por Sandare Chemical of DeSoto,
Texas.) El estudio arrojó un rango de uso de 2-16%. Los resultados se muestran en la TABLA IX.
ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS, CALIBRADORES Y
CONTROLES
La vida útil de los reactivos HbA1c Directo Plus, medida en
tiempo real, demostró ser de 18 meses en refrigeración. Del
mismo modo, los Calibradores y Controles demostraron una
estabilidad de 24 meses refrigerados.
ESTUDIOS DE PRECISIÓN
La precisión del método GT Lab se evaluó empleando los Controles de HbA1c Directo Plus como muestra y de acuerdo a la
modificación del protocolo EP5-T2 del National Clinical Controls and Laboratory Standards (NCCLS).
La evaluación de precisión en el día se realizó corriendo dos
muestras en duplicado 20 veces en el mismo día. La evaluación día a día se efectuó procesando dos muestras durante
20 días.
Las determinaciones se efectuaron en un Hitachi 917 con hemólisis en el aparato. Los resultados obtenidos son los que se
muestran seguidamente.
En el día (n=20)
Media..... 4.66 10.4
D.S..........0.06 0.13
C.V.%.......1.29 1.25
ESTABILIDAD DE CALIBRACIÓN DEL INSTRUMENTO
La estabilidad de la calibración depende del instrumento, ya
que es función de sus características específicas.
Por ejemplo, el Beckman Coulter Cx tiene un sistema de medida basado en dos puntos de lectura. Estos sistemas tienen
una estabilidad de calibración de 7 a 10 días.
Los analizadores Hitachi, por su parte, toman solamente un
punto de lectura al final de la reacción. Esto les da una estabilidad de calibración de 21 a 28 días.
ADAPTACIONES A INSTRUMENTOS AUTOMÁTICOS
Están disponibles adaptaciones para los siguientes
analizadores:
Abbott Aeroset
Abbott Alcyon
ATAC 8000
Beckman Coulter Cx
Beckman Coulter Lx
Dade Dimension
Cobas Mira, Mira Plus
Express 550
Hitachi 704, 717, 902, 911, 912, 914, 917
Pointe 180
Olympus AU400, 600, 640, 800
RA 500/1000/XT
Selectra E
Targa 3000
Tokyo Bokei Prestige 24i
Día a Día (n=20)
Media.....4.69 9.52
D.S..........0.18 0.20
C.V. %.....3.84 2.10
Los datos a partir de los cuales se obtuvieron estos valores
figuran en las tablas III y IV.
ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS
Se estudió la interferencia por ácido ascórbico, bilirrubina,
triglicéridos, hemoglobina acetilada y hemoglobina carbamilada, mediante una modificación del protocolo EP7-P del
NCCLS.
No se observaron interferencias por bilirrubina hasta 50 mg/
dl, ácido ascórbico hasta 50 mg/dl, triglicéridos hasta 2000
mg/dl, hemoglobina carbamilada hasta 7.5 mmol/l y hemoglobina acetilada hasta 5.0 mmol/l.
Los datos se muestran en la TABLA V.
ESTUDIO DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA
Las variantes de hemoglobina A2, C y S no mostraron interferencias en el uso de HbA1c Directo Plus. Los estudios con He4
HbA1c DIRECTO PLUS
ADAPTACIÓN A HITACHI 917
ANALYZE
TEST NAME
[HbA1c ]
ASSAY/ POINT
[1-POINT ] [10 ] [34 ] [0 ] [0 ] [0 ]
WAVE (SUB/MAIN)
[none ] [660 ]
S. VOL. (NORMAL)
[4.0 ] [4.0 ] [200]
S. VOL. (DECREASE)
[4.0 ] [4.0 ] [200]
S. VOL. (INCREASE)
[4.0 ] [4.0 ] [200]
DILUENT
[DW ] [99 ]
REAGENT VOL (R1)
[150 ] [0 ]
[0 ]
[0 ]
REAGENT VOL (R2)
[0 ]
[0 ]
[0 ]
[0 ]
REAGENT VOL (R3)
[50 ] [0 ]
[0 ]
[0 ]
REAGENT VOL (R4)
[0 ]
[0 ]
[0 ]
[0 ]
ABS. LIMIT
[25000 ][0 ]
[INCREASE ]
PROZONE LIMIT:
[-32000 ] [0 ] [LOWER ]
CELL DETERGENT
[Detergent ]
TWIN: [ ]
CALIBRATION
CALIB TYPE
[SPLINE ] []
POINT
[5 ] SPAN POINTE [5 ]
WEIGHT[0 ]
AUTO TIME OUTN
Auto change
BLANK
[0 ] CHANGE LOT: [0 ]
SPAN
[0 ] CHANGE BOTTLE: [ ]
2 POINT[0 ]
FULL
[0 ]
SD LIMIT
[999 ] DUPLICATE: [99] [32000 ]
SENSITIVITY
[-99999] [99999 ] S1ABS RANGE: [-32000 ] [32000 ]
RANGE
TEST CODE [* ]
CONTROL INTERVAL
PANIC VALUE
UNITS
[]
: [% ]
DATA MODE : [ON BOARD ]
INST. FACTOR: [(Y=aX=b) : a=[1.0] b = [0.0] ]
[-99999 ][99999 ]
STANDARD CONCENTRATION
STANDARD SOLUTION
CONC
[0.0 ] [* ] POSITION
[* ] [* ]
SAMPLE:
[4.0 ] [4.0 ] PRE-DILUENT
VOLUME
[4.0 ]
DILUENT
[200 ] CALIB CODE:
[0.0 ] [0.0 ]
*USER DEFINED
[* ] [* ] [4.0]
[* ] [* ]
[4.0 ]
[* ] [* ]
[4.0 ]
[]
[]
[]
[4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [0.0 ]
[200 ] [200 ] [200 ] [200 ] [0.0 ]
[0.0 ] [0.0 ] [0.0 ] [ 0.0]
* Definido por el usuario. Se recomienta procesar 2 niveles de Control por día. Para obtener una performance óptima, se recomienda lavar las cubetas después del ensayo. Use la pantalla principal para agregar un lavado de celda emplando la aguja R1
en la posición Wash 3 (1D3)
5
HbA1c DIRECTO PLUS
GRAFICO 1
y = 0.32138 + 0.86426x R= 0.99236
11
10
HbA1c Directo Plus
9
8
7
6
5
4
4
5
6
7
8
9
10
11
12
HPLC Comercial
GRAFICO 2
y = 0.3375 + 0.98279x R= 0.98499
11
10
Hemólisis en el instrumento
9
8
7
6
5
4
4
5
6
7
8
9
10
Hemólisis fuera del instrumento
6
HbA1c DIRECTO PLUS
11
12
TABLA 1
HPLC
Comercial
4.7
4.8
5.1
5.4
5.5
5.6
6.1
6.1
6.2
6.5
6.9
6.9
7.1
7.3
7.9
8.0
8.2
8.4
8.4
8.5
8.5
8.7
8.9
9.2
9.2
9.7
9.9
10.6
10.8
11.8
HbA1c
Directo Plus
4.3
4.3
4.6
4.9
4.8
5.2
5.7
5.7
5.6
6.0
6.5
6.3
6.4
7.0
7.0
7.2
7.5
7.9
7.8
7.6
7.8
7.9
7.9
8.4
8.2
8.9
8.3
9.8
9.4
10.3
HPLC comercial HbA1c Directo Plus
Mínimo
4.7000
4.3000
Máximo
11.800
10.300
Suma
230.90
209.20
Puntos
30.000
30.000
Mromedio
7.6967
6.9733
Mediana
7.9500
7.1000
RMS
7.9157
7.1569
Desvío Std 1.8807
1.6379
Variancia
3.5369
2.6827
Error Std 0.3433
0.29904
Oblicuidad
0.20291 0.058048
Kurtosis
0.93135
0.62994
Kurtosis
-0.74823 -0.80780
7
HbA1c DIRECTO PLUS
TABLA 2
Hemólisis
Dentro
10.100
6.0000
6.2000
4.4000
7.1000
5.1000
7.3000
10.200
5.1000
7.6000
5.4000
10.400
5.3000
5.2000
5.6000
6.2000
5.1000
4.9000
5.1000
6.5000
5.8000
6.3000
5.6000
Fuera
4.6000
4.8000
9.9000
6.5000
6.8000
4.8000
Hemólisis
7.5000
Dentro
Fuera
6.1000
Mínimo
4.4000
4.8000
7.8000
Máximo10.400
10.600
10.500
Suma
151.10
156.60
5.3000
Puntos
24.000
24.000
7.6000
Promedio
6.2958
6.5250
5.5000
Mediana
5.7000
5.9000
10.600
RMS
6.5183
6.7389
5.3000
Desvío Std
1.7246
1.7208
5.3000
Variancia
2.9743
2.9611
5.6000
Error Std.
0.35204 0.35125
7.0000
Oblicuidad
1.4057
1.2642
5.4000
Kurtosis0.93135
0.62994
4.8000
5.2000
6.5000
5.7000
6.6000
5.5000
8
HbA1c DIRECTO PLUS
TABLA 3
Precisión intra día
NIVEL I
NIVEL II
4.6900
10.400
4.8000
10.400
4.7000
10.400
4.6000
10.500
4.7000
10.500
4.6000
10.100
4.7000
10.600
4.6000
10.300
4.6000
10.400
4.7000
10.600
4.6000
10.600
4.7000
10.400
4.7000
10.500
4.7000
10.300
4.7000
10.500
4.6000
10.400
4.6000
10.400
4.7000
10.600
4.6000
10.300
4.6000
10.600
Mínimo
Máximo
Suma
Puntos
Promedio
Mediana
RMS
Desvío Std
Variancia
Error Std
Oblicuidad
Kurtosis
4.6000
4.8000
93.190
20.000
4.6595
4.6950
4.6599
0.059513
0.0035418
0.013308
0.38528
-0.67011
9
HbA1c DIRECTO PLUS
10.100
10.600
208.80
20.000
10.440
10.400
10.441
0.13139
0.017263
0.029380
-0.63421
0.32063
TABLA 4
Precisión inter día
NIVEL I
4.6000
4.7000
4.9000
5.0000
5.2000
4.6000
4.8000
4.5000
4.6000
4.6000
4.7000
4.7000
4.7000
4.6000
4.6000
4.5000
4.4000
4.6000
4.7000
4.7000
Mínimo
4.4000
Máximo
5.2000
Suma
93.700
Puntos
20.000
Promedio
4.6850
Mediana
4.6500
RMS
4.6883
Desvío Std 0.18144
Variancia
0.032921
Error Std
0.040572
Oblicuidad
1.2585
Kurtosis
1.6930
NIVEL II
9.9000
9.8000
9.5000
9.4000 9.6000
9.9000
9.2000
9.7000
9.5000
9.6000
9.6000
9.5000
9.3000
9.5000
9.5000
9.2000
9.3000
9.3000
9.5000
9.6000
9.2000
9.9000
190.40
20.000
9.5200
9.5000
9.5221
0.20417
0.041684
0.045653
0.25583
-0.53627
10
HbA1c DIRECTO PLUS
TABLA 5
Estudio de interferencia
Acido Ascórbico (mg/dL)
HbA1c (%)
0
9.5
10
9.5
20
9.5
30
9.6
40
9.5
50
9.6
Bilirrubina (mg/dL)
HbA1c (%)
0
9.5
10
9.5
20
9.4
30
9.5
40
9.5
50
9.5
Triglicéridos (mg/dL)
HbA1c (%)
0
9.5
400
9.4
800
9.4
1200 1600 2000
9.4 9.4 9.4
Hb Acetilateda (mmol/L)
HbA1c (%)
0
9.1
1
9.0
2.5
9.1
5
9.2
7.5
9.6
10
10.1
Hb Carbamilada (mmol/L) 0
HbA1c (%) 9.1
1
9.1
2.5
9.0
5
9.1
7.5
8.9
10
8.4
TABLA 6
Interferencia de Hemoglobina A2
GT Lab HPLC
4.6
4.8
4.9
5.3
6.4
6.6
6.7
7
7.2
8.1
10.2
4.9
4.8
5
5.6
6.5
7.4
7.4
6.7
7.1
7.9
10.9
Estadísticas de Regresión
Múltiplo R
R cuadrado
Intercepción Pendiente
Observaciones
11
HbA1c DIRECTO PLUS
0.977427
0.955364
0.331388
0.918527
11
% HbA1c
GRAFICO III
Interferencia de HbA2
12
10
8
6
4
2
0
GT Lab
HPLC
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
% HbA1c
GRAFICO IV
Interferencia de hemoglobina C
6
5
4
3
2
1
0
GT Lab
HPLC
1
2
3
12
HbA1c DIRECTO PLUS
4
TABLA 7
Interferencia de hemoglobina C
GT Lab
5.6
4.9
4.5
4.6
Estadísticas de Regresión
HPLC
5.4
5
4.9
4.8
Múltiplo R
R cuadrado
Intercepción Pendiente
Observaciones
0.969748
0.94041
-4.30241
1.831325
4
TABLA 8
Interferencia de Hemoglobina S
GT Lab
HPLC
4.3
4.4
4.5
4.8
5.0
5.1
5.2
5.2
5.3
5.4
7.3
4.7
4.4
4.2
5.2
5.1
4.9
5.4
4.9
5.5
4.6
6.3
Estadísticas de Regresión
Múltiplo R
R cuadrado
Intercepción Pendiente
Observaciones
0.830385
0.689539
-0.64029
1.151144
11
GRAFICO V
Interferencia de Hemoglobina S
% Hgb A1c
8
6
GT Lab
HPLC
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
13
HbA1c DIRECTO PLUS
9 10 11
TABLA 9
Estudio de linealidad
Teórico
25.0
21.2
17.3
13.2
9.4
8.1
7.4
6.6
6.2
5.4
3.9
2.2
Recuperado 1 Recuperado 2
18.7
18.2
17.0
13.1
9.4
8.2
7.7
6.9
6.2
Error
4.0
2.2
18.6
18.2
16.9
13.4
9.5
8.3
7.7
6.9
6.4
5.4
3.9
2.2
Promedio 18.7
18.2
17.0
13.3
9.5
8.3
7.7 6.9
6.3
5.4
4.0
2.2 14
HbA1c DIRECTO PLUS
Desv.%
74.8
85.8
98.3
100.8
101.1
101.2
104.1
104.4
101.6
100.0
102.6
100.0
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15
HbA1c DIRECTO PLUS
16
HbA1c DIRECTO PLUS