análisis cuantitativo del rol de la adhesión celular durante los

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
Profesor Patrocinante
Dr. Claudio Araya
Facultad de Cs Marinas y Limnológicas
Universidad Austral de Chile
Profesor Copatrocinante
Dr. Federico Batiz
Facultad de Medicina
Universidad Austral de Chile
ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL ROL DE LA ADHESIÓN CELULAR DURANTE LOS
MOVIMIENTOS MORFOGENÉTICOS DE LA NEURULACIÓN IN VIVO EN EL PEZ
CEBRA
Seminario de Graduación presentada
Como parte de los requisitos para optar
Al Grado de Licenciado en Ciencias Biológicas.
BÁRBARA NICOLS ORTEGA VALENZUELA
VALDIVIA-CHILE
2014
i
No disminuiré mi trabajo por ver que los otros lo hacen; prestaré el mejor servicio de que soy
capaz, porque me juré a mí mismo triunfar en la vida, y sé que el triunfo es siempre resultado del
esfuerzo consciente y eficaz.
Gandhi
ii
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer al Dr. Claudio Araya por haberme dado la oportunidad de
formar parte de su grupo de investigación, por sus enseñanzas, consejos, y su paciencia durante
mi permanencia por el laboratorio.
Quiero dar gracias además a mis padres, Angélica y Javier, por su confianza amor y apoyo
incondicional, por enseñarme que con esfuerzo y perseverancia todo se puede lograr.
Además en este periodo quiero a agradecer a todas las personas que integran el grupo del
laboratorio Biología del Desarrollo, en especial a Alexis, Andrés, por que de cada uno de ustedes
aprendí algo, como también a Luis, Joselyn, Miguel por su buena disposición y por haber
compartido muy buenos momentos.
Y agradecer a mis amigas, Leyla, Rosa, Vanesa que siempre han estado conmigo, a Pablo por su
dedicación y cariño.
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio Biología del Desarrollo del Instituto de Ciencias
Marinas y Limnológicas de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile por el
proyecto FONDECYT N°11110106.
iii
ÍNDICE
1. RESÚMEN.................................................................................................................................1
1.1 ABSTRACT.............................................................................................................................2
2. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………. 3
2.1. Neurulación en vertebrados……………………………………………………….................3
2.2. Estudiando la neurulación in vivo del pez cebra
Danio rerio…………………………………………………………………………………………………..5
2.3. Dinámica Tisular y Celular durante la morfogénesis del tubo neural del embrión
del pez cebra ……………………………………………………………………………………..7
2.4. Adhesión celular durante los movimientos de neurulación……………………………..…..9
2.5. El mutante parachute deficiente en N-cadherina como modelo de estudio de
interacción célula-célula durante la neurulación del pez cebra…………………………………14
2.6. Microscopía Confocal y su utilidad en el registro de la morfogénesis
embrionaria in vivo……………………………………………………………………………………… 19
2.7. Uso de proteínas de fusión durante la visualización de la neurulación en
Vertebrados …………………………………………………………………………………….22
3. HIPOTÉSIS Y OBJETIVOS…………………………………………………………….....23
4. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………...24
4.1. Uso de herramientas cuantitativas para análisis de imágenes confocal…………………....24
4.2.1. Mantención de los peces……………………………………………………………........24
4.2.2. Síntesis de ARNm………………………………………………………………….........24
iv
4.2.3. Inmunohistoquímica……………………………………………………………….........25
4.2.4. Micro-inyección de embriones.........................................................................................25
4.2.5. Time lapse in vivo través de microscopia confocal ……………………………............27
4.2.6. Análisis morfométricos durante la neurulación del pez cebra…………………............ 27
4.2.7. Análisis estadísticos…………………………………………………………………….28
5. RESULTADOS…………………………………………………………………………….28
5.1. Pérdida de N-cadherina en mutantes parachute conduce a una neurulación
aberrante y una organización anormal de la polaridad apico-basal en el embrión
de pez cebra…………………………………………………………………………………..28
5.2. Análisis de la dinámica tisular durante la movimientos iníciales de la
neurulación en animales wild-type y mutantes para N-cadherina/ (cdh2)...............................30
5.3. Análisis in vivo de la motilidad celular durante el proceso de internalización
del tejido neural del pez cebra..................................................................................................34
5.4. Análisis en la orientación celular durante los movimientos morfogéneticos
de la neurulación en embriones wild-type y mutantes para n-cadherina................................36
6. DISCUSIÓN………………………………………………………………………............38
7. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………...............40
8. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………………….41
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Neurulación en vertebrados............................................................................4
Figura 2. Neurulación en el pez cebra...........................................................................6
Figura 3. Dinámica Tisular y Celular durante la formación del tubo neural
en el embrión de pez cebra.............................................................................................8
Figura 4. Molécula Cadherina......................................................................................11
Figura 5. Falta de N-cadherina en la formación del tubo neural…………………..….13
Figura 6. Morfología del mutante parachute/cdh2.......................................................15
Figura 7. Mutante pac codificado en N-cadherina……………………………………17
Figura 8. Esquema del principio de la microscopia confocal…………………………21
Figura 9. Efecto de la adhesión celular mediada por N-cadherina…………………....30
Figura 10. N-cadherina en pez cebra es requerida para la internalización
completa del tejido………………………………………………………………….…33
Figura 11. Se requiere N-cadherina para el comportamiento normal
de las células neurales………………………………………………………………….37
Figura 12. La orientación de las células neurales se ve afectada
en mutantes cdh2………………………………………………………………………………39
vi
LISTADO DE ABREVIATURAS
ADN
Ácido Desoxirribonucleico
AJs
Proteína de unión adherente (del inglés Adherens Junctions)
CAM
Mólecula de adhesión celular (del inglés cell adhesión moléculas)
Ca2+
Calcio
Cdh2
N-cadherina
cDNA
Acido Desoxirribonucleico complementario
DAPI
4 ',6-diamino-2-fenilindol
GFP
Proteína verde fluorescente (del inglés Green Fluorescent Protein)
GFAP
Proteína Acida Glial Fibrilar (del ingles Glial Fibrillary Acidic Protein)
Hpf
Horas post fertilización
LSCM
Microscopía confocal de barrido láser (del inglés Confocal laser scanning
microscopy
MO
Morpholino
Nm
Nanómetro
nl
Nanolitro
FP
Proteína fluorescente (del inglés Fluorescent Protein)
PBS
buffer fosfato alcalino (del inglés Phosphate buffer Saline)
RNAm
Ácido Ribonucleico mensajero
RNasa
Ribonucleasa
µm
Micras
1
1.RESUMEN
La formación inicial del plan corporal durante el desarrollo embrionario es generada a través de
la acción coordinada de grandes grupos de células en el tiempo y el espacio. Un buen ejemplo de
esto son los movimientos celulares altamente orquestados durante la formación inicial del sistema
nervioso central de vertebrados, proceso conocido como neurulación. A pesar de que este
movimiento morfogenético ha sido intensamente caracterizado en animales amniotas a partir de
tejidos fijados, la dinámica celular y molecular in vivo permanece aún poco investigado. En este
trabajo se utilizó al modelo del pez cebra (Danio rerio) como un sistema in vivo para estudiar los
movimientos morfogenéticos responsables de la neurulación. Para ello utilizamos herramientas
genéticas y técnicas de imagenología cuantitativa confocal para estudiar in vivo el rol de la
adhesión celular durante la movimientos iníciales de la formación del tubo neural en el embrión
de pez cebra. Nuestros análisis en mutantes deficientes en N-Cadherina (cdh2) demuestran que a
diferencia de animales wild-type, estos presentan defectos en los movimientos de convergencia
medial originando una invaginación incompleta y una organización apico-basal anormal.
Asimismo, nuestros análisis cuantitativos demostraron que la adhesión celular mediada por NCadherina es importante para permitir la orientación celular correcta durante el proceso de
internalización. Por lo tanto, estos análisis demuestran que la adhesión célula-célula mediada por
N-cadherina es requerida para completar los movimientos de internalización tisular durante la
formación del tubo neural in vivo.
2
1.1. ABSTRACT
The early body plan formation during embryonic development is generated through the
coordinated actions of large groups of cells over at precise time and space. A good example of
this is the highly orchestrated cell movements during the initial formation of the vertebrate
central nervous system, a process known as neurulation. Although this morphogenetic movement
has been extensively characterized in amniotes from fixed tissues, the cellular and molecular in
vivo dynamics remains still unclear. In this work we used zebrafish (Danio rerio) as an in vivo
model system to understand the morphogenetic movements of neurulation. By using genetic and
techniques live imaging tools we study in vivo role in cell adhesion during the initial movements
of the neural tube in the zebrafish embryo. Our analysis in mutants deficient of N-cadherin (cdh2)
show that by contrast to wild-type animals, the initial converging cell movements are severely
impaired upon cdh2 inhibition and embryos generate abnormal apico-basal organization.
Futhermore, our quantitative analysis show that the cell adhesion properties mediated by Ncadherin is important to allow normal orientated cell movements during internalization process.
Taken together, these analyzes demonstrate that cell-cell adhesion mediated by N-cadherin is
required to complete internalization tissue movements during neural tube formation in vivo.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. NEURULACIÓN EN VERTEBRADOS
La neurulación representa las etapas tempranas de la embriogénesis del sistema nervioso central
de vertebrados. Este evento morfogenético se caracteriza inicialmente por el movimiento
coordinado de grandes grupos celulares hacia la línea media embrionaria a fin de consolidar el
desarrollo de una estructura tubular, denominado tubo neural el cual es el responsable de originar
el cerebro y medula espinal en animales vertebrados (Colas y Schoenwolf, 2001; Copp y Colas,
2003). Debido a su relevancia clínica, este evento morfogenético ha sido intensamente estudiado.
En EEUU por ejemplo, se calcula que 1 de cada 10.000 nacimientos ocurridos presentan algún
tipo de defecto en el cierre del tubo neural, incluyendo espina bífida y anencefalia (Copp, 2003;
Figura 1). A pesar de su importancia, el estudio de la neurulación ha sido solamente inferido a
partir de imágenes estáticas (tejido fijado) limitando nuestro entendimiento de los mecanismos
celulares y moleculares que subyacen a su formación. Así, estudios realizados en embriones de
animales amniotas como el ratón y el pollo, indican que las células neurales experimentan una
serie de movimientos de convergencia dorsal e intercalación radial al momento que se dirigen
hacia la línea media (Schoenwolf y Alvarez, 1989; Colas y Schoenwolf, 1991). Sin embargo,
debido a la opacidad natural que presentan estos embriones y la falta de herramientas
cuantitativas para su análisis, el estudio de las conductas celulares in vivo y los mecanismos
celulares y moleculares que subyacen a la neurulación permanecen pobremente descritos. Así, el
objetivo de esta tesis se centra en estudiar las conductas celulares in vivo durante las etapas
iníciales de la neurulación, utilizando al embrión de pez cebra (Danio rerio) como modelo
biológico.
4
Figura 1. Neurulación en Vertebrados. El proceso de neurulación tiene como finalidad la
formación del tubo neural a partir de las células que componen la placa neural (A). Durante este
evento las células convergen en la línea media (B) y se invaginan formando en primer lugar los
pliegues neurales (C) los cuales finalmente se cierran hacia la línea media formando el tubo
neural (D). Defectos en los movimientos iníciales del tubo neural se encuentran estrechamente
relacionados con el cierre incompleto del tubo lo cual produce una serie de malformaciones como
la anencefalia (E-F), la cual es una malformación incompatible con la vida extrauterina que
consiste en la ausencia del cierre de bóveda craneal (flechas en E). En otros casos, estos defectos
pueden ser acompañados por el cierre incompleto a nivel de la medula espinal cráneo
rraquisquisis, (cabeza de flecha en F). Leyenda: Np; placa neural, nf: neural folds (pliegues
neurales), not: notocorda, nc: neural crests (cresta neural), E y F, adaptado de Copp y Cols
(2003).
5
2.2. ESTUDIANDO LA NEURULACION EN VIVO EN EL EMBRION DE PEZ CEBRA
(Danio rerio)
Debido a sus características biológicas (corto ciclo de vida, pequeño tamaño y transparencia en
embriones y larvas) y poderosas herramientas genéticas (uso de transgénicos y micro-inyección
de ADN y ARNm) el embrión de pez cebra (Danio rerio) ha emergido como un modelo ideal
para estudiar los mecanismos celulares y moleculares que gobiernan la embriogénesis. Así en
años recientes, este modelo vertebrado ha sido utilizado especialmente en el estudio de la
morfogénesis tisular in vivo tales como el sistema nervioso central a través de microscopía
confocal ‘time–lapse’ (Lowery y Sive, 2004; Clarke, 2009; Araya et al., 2014). En años recientes,
el laboratorio del Dr. Claudio Araya ha desarrollado una aproximación experimental única al
estudio de la neurulación del pez cebra in vivo a través del uso de microscopía confocal (Figura
2). Bajo esta aproximación, es posible obtener secciones transversales del tejido neural durante la
morfogénesis del tubo neural en un animal intacto.
La formación del tubo neural del embrión de pez cebra se inicia alrededor de las 10 horas postfertilización (hpf), (Schimtz et al.,1993; Papan y Campos-Ortega, 1997). Inicialmente, esto
comprende el movimiento de convergencia dorsal en ambos lados de la placa neural hacia la línea
media (Figura 2 B-C). Más tarde, alrededor de las 12 hpf la placa neural comienza a sufrir
internalización a fin de generar una estructura sólida en forma de quilla (denominado neural keel)
hacia las 13hpf (Figura 2D-F). El neural keel subsecuentemente genera otra estructura sólida,
llamada "neural rod" hacia las 16 hpf (Figura 2H), la cual finalmente cavita hacia las 18-20 hpf a
fin de generar un tubo neural maduro con clara organización dorso-ventral y bien definida
polaridad apico-basal (Tawk et al., 2007; Araya et al., 2014, Figura 2 I).
6
Figura 2. Neurulación en el pez cebra. (A), Esquema de la metodología de registro utilizada
para visualizar la neurulación del pez cebra en un plano transversal. Esta aproximación se basa en
mantener un embrión embebido en medio embrionario y el uso de cámaras de registro el cual son
capaces de fotografiar en forma secuencial un plano transversal del tejido utilizando un objetivo
de inmersión en agua de larga distancia de trabajo (línea roja muestra el plano focal).(B-I),
Indican fotografías de campo brillante seleccionas a partir de un time-lapse en una secuencia de
tiempo que ilustran los pasos en neurulación pez cebra. Las flechas amarillas en (B-D), indican
los movimientos convergentes hacia línea media. (J), las ilustraciones indican los cambios en el
perfil del tejido neural a través de las secciones entre (B-D-K), ilustran cambios en el perfil del
tejido neural a través de las secciones entre (C-F). El tiempo se da en horas (h) y minutos ('). (Dr.
Claudio Araya, 2013).
7
2.3. DINÁMICA TISULAR Y CELULAR DURANTE LA MORFOGÉNESIS DEL TUBO
NEURAL DEL EMBRIÓN DEL PEZ CEBRA.
A través de la combinación de una estrategia de registro visual junto con el uso de herramientas
transgénesis del pez cebra y el uso de animales mutantes es posible visualizar in vivo la dinámica
celular y tisular con gran resolución (Figura 3).
A nivel del cerebro posterior, (romboencéfalo) la estructura tisular inicial, llamada placa neural es
un tejido multilaminar que sufre una serie de movimientos de convergencia hacia la línea media
alrededor de las 10 horas post fertilización (hpf). Posteriormente, entre las 12-13 hpf las células
neurales comienzan a enlongarse a través del eje superficial-profundo de la placa al momento que
convergen hacia la línea media, originando de esta forma el neural keel (Figura 3A-B). Luego,
durante el proceso de neural rod (14-16 hpf) las células localizadas en posiciones más
superficiales se intercalan con las células más profundas durante el primordio neural (Figura 3C).
Finalmente, entre las 17-18 hpf el primordio neural cavita (Figura 3D) a través de un mecanismo
de división celular el cual permite distribuir progenitores neurales en ambos lados del tubo neural
en desarrollo (Tawk et al., 2007). Es posible visualizar núcleos y membranas con proteínas de
fusión (por ejemplo, utilizando un promotor de histona (H2A) unido a una secuencia de una
proteínas fluorescentes como GFP) para lograr observar estas divisiones celulares durante la fase
final de la invaginación tisular. Sin embargo, a pesar que se ha caracterizado los movimientos
tisulares durante el proceso de la neurulación, se desconoce aún cuales son los mecanismos
celulares y moleculares que subyacen a la formación de este tejido.
8
Figura 3. Dinámica celular y tisular durante la neurulación del pez cebra.
(A-D) Secuencia de imágenes transversales de un time- lapse representando el proceso de
formación del tubo neural a nivel del romboencéfalo en un embrión wild-type que fue
previamente inyectado con membrana GFP (blanco/gris) Inicialmente el proceso muestra la
formación de la placa neural por una serie de movimientos dorsales (A) seguidamente el tejido
experimenta un proceso de convergencia dando lugar al neural keel (B) posteriormente las células
neurales migran hacia la línea media dando lugar al proceso de neural rod (C) para finalizar el
tejido cavita dando lugar al tubo neural (D). Los puntos amarillos indican el tejido neural, OV
vesícula ótica (cerebro posterior) y las puntas de flecha amarilla la posición de la ''línea media
posición apical" hacia las18 hpf . (Dr. Claudio Araya, 2013).
9
2.4. ADHESIÓN CELULAR DURANTE LOS MOVIMIENTOS CELULARES DURANTE
LA NEURULACIÓN
Los mecanismos celulares y moleculares responsables de los movimientos coordinados de las
células neurales durante las etapas iniciales de la neurulación en el pez cebra permanecen aún
poco investigado. En años recientes, se ha descrito que la adhesión celular es fundamental
durante el desarrollo de tejidos embrionarios, especialmente durante los procesos morfogenéticos
que implican un alto grado de coordinación celular. La molécula de Cadherina se encuentra
asociada al mantenimiento e integridad de la polaridad de las células durante la inducción de la
placa neural (Hong y Brewster, 2005), así como asociadas con las proteínas de unión adherentes
(AJs) y desmosomas. Su función es establecer adhesividad con moléculas del mismo tipo, es
decir, de tipo homofílico. Un clásico ejemplo que ocurre durante el proceso de neurulación en
vertebrados (Shapiro y Weis, 2009) donde la formación del tubo neural se encuentra mediadas
por la formación del neuroectodermo y gobernada por la expresión de la N-cadherina. Entre las
cadherinas clásicas del tipo I se encuentran la N (neural) presente durante la diferenciación tisular
temprana en la embriogénesis y presente en el mesodermo y sus derivados como somitos,
notocorda, músculo esquelético (Halbleib et al.,2006; Stemmler, 2008). La molécula de Ncadherina está constituida por más de 100 miembros y agrupadas en seis subfamilias, contienen
un único dominio trans-membrana, un único dominio citosólico C-terminal que le permite unirse
al citoesqueleto de actina, a través de numerosas proteínas citosólicas adaptadoras (Figura 4).
Identificada posteriormente con la interacción de proteínas llamadas cateninas (Schapiro y Weis,
2009) que posee una serie de parejas de unión incluyendo la actina, p120 (Kobielak y Fuchs,
2004) que participan en la regulación y establecimiento de la cadherina. También posee cinco
dominios cadherina extracelular (EC1-EC5) necesarios para la unión del Ca+ confiriéndole
10
rigidez a estos oligómeros, y indicando especificidad con otras células del mismo tipo (Tamura et
al., 1998). Los tejidos se forman a través de los contactos célula-célula que se inician por las
cadherinas bajo el reordenamiento del citoesqueleto y su expresión tiene que ser estrictamente
controlado de una manera espacio-temporal específica para permitir el desarrollo normal (Chu et
al., 2004, Stemmler, 2008). En general, el patrón de expresión durante la neurulación parece que
se correlaciona con cambios en la forma celular y motilidad. Mientras que el proceso que implica
la disociación de las uniones adherentes sugiere un posible papel en el epitelio de transición
mesénquima (TEM) desarrollando la progresión de tumores y alteración en la migración celular
(Warga y Kane, 2007).
11
A
Figura 4. Esquema de la molécula cadherina. Cadherina es una proteína de transmembrana que
permite el contacto célula-célula mediante la interacción homofílica de sus cadenas extracelulares
(en verde). Estas uniones adhesivas conectan membranas celulares preferentemente en la región
apical. Adaptado de Stemmler (2008).
12
Durante la neurulación en vertebrados, se ha identificado la N-Cadherina como la principal
molécula de adhesión celular descritas en el sistema nervioso central del ratón y pollo (Chalasani
y Brewster, 2011). La pérdida de esta molécula no tan sólo resulta en el desarrollo anormal de
tejidos embrionarios, sino que además se ha visto asociada en la progresión de tumores
cancerígenos y actividad metastásica (Derycke y Bracke, 2004). Por ejemplo varios estudios han
proporcionado la expresión anormal de la N-cadherina en el ectodermo neural del Xenopus laevis
afectando el tamaño del tubo neural y organización durante los movimientos morfogenéticos de
la neurulación, ocasionando enfermedades tales como espina bífida (Nandadasa et al., 2009)
(Figura 5A) sugiriendo que esta proteína define el tejido que experimenta tal proceso (Detrieck et
al.,1990; Fujimori et al.,1990). En pez cebra la molécula de adhesión celular juega un rol
fundamental durante esta etapas temprana de la neurulación (10-13hpf) en la distribución de
proteínas de unión apical como aPKC y ZO-1, establecimiento de la polaridad de las células,
mantención durante la organización en la superficie apical y regulación en la intercalación
(Clarke, 2009).
13
Figura 5. Efecto de la falta de N-cadherina en la formación del tubo neural. (A) Arriba.
Vista lateral de embrión Xenopus laevis (U), embriones no tratados. Embrión (N-AS), presenta
pérdida de cadherina.(A) Abajo. Vista dorsal embrión Xenopus tratado con morpholinos que
presenta espina bífida. (B) Vista lateral de embrión pez cebra 28hpf. (B, A) exhibe un cerebro
posterior bien formado. (B, B, C) Vista lateral de un embrión morfante de protocadherina (pcdh)
y N-cadherina (ncad) exhibiendo regiones del cerebro dañadas. (D-F) vista frontal de embrión 14
hpf que presenta una neurulación defectuosa (adaptado de Biswas et al., 2010).
.
14
2.5. El MUTANTE PARACHUTE DEFICIENTE EN N-CADHERINA COMO MODELO
DE ESTUDIO DE INTERACCIÓN CÉLULA-CÉLULA DURANTE LA NEURULACIÓN
DEL PEZ CEBRA
En 1996 se realizó un screening genético el identificó una nueva mutación inducida por ENU
causando un fenotipo que exhibía un desarrollo anormal en el cerebro, el cual que conducía a una
formación aberrante del sistema nervioso central en forma de T ó parachute (pac) (paracaídas)
(Jiang et al., 1996). El mutante parachute fué más tarde identificado por tener una mutación
puntual en N-cadherina (Lele et al., 2002) (Figura 6). El análisis de este mutante sugirió que la
N-cadherina/pac era requerido en procesos de adhesión celular durante la formación del sistema
nervioso central del pez cebra (Jiang y Brand, 1996).
15
Figura 6. Morfología del mutante parachute. Fotografías de campo brillante en embrión
silvestre y pac/n-cadherina. En (C) Wild-type y (D) pac/mutante, (C,D) vista lateral ,flechas en D
flechas indican el defecto en este fenotipo en la región del cerebro medio y posterior (E, F).
Flechas indican la magnificación de la zona de la cabeza donde indican pérdida de adhesión
celular y anormalidad en el tejido (Lele et al., 2002).
16
La mutación Pac en pez cebra
Para la búsqueda del mutante deficiente en N -Cadherina se obtuvo ADN genómico a partir de un
pool de embriones con el fin de realizar un mapeo del mutante homocigoto pactm101B. Para
determinar la posición específica de este gen se utilizó microsatélites SSLP (simple-sequencelength-polimorfisms) como marcadores, con el objetivo de encontrar algunas regiones discretas
del genoma del pez cebra (Jiang et al, 1996). Luego se posicionó el mutante pac en LG20 lo cual
exhibió, cierta proximidad del marcador SSLP z3964 en la región ubicada de N cadherina, debido
a la ausencia de meiosis de esos genes retribuyo a pensar de una posible mutación en este lugar
(Figura 7A). La búsqueda de este gen en el mapa, reveló que N-cadherina era un buen candidato,
asignándole el rol de adhesión celular durante el proceso de gastrulación y segmentación (Figura
7 C-F). Para evidenciar aun más el papel que juega N-cadherina se utilizaron los alelos pactm101b y
pac7, los cuales se clonaron y secuenciaron. Estos resultaron revelaron la existencia de una
mutación puntual que consistió en la introducción de un codón de término prematuro en la región
codificante. Por consiguiente el alelo pac fr7 experimentó un cambio de base nitrogenada TCG→
intercambiado por TAG conducido por una Ser→stop en el dominio 3 y 4, mientras que pactm101B
experimentó un cambio de base nitrogenada TAT→ TAA conducido por una Tyr514 al principio
de dominio (EC4) lo cual lo convirtió en una mutación sin sentido TAT→ TAA (Figura 8 B, Lele
et al., 2002).
17
Figura 7. Mutante Pac codificado en N-cadherina. En (A) posición del mapa de la mutación
del alelo pactm101B y el gen ncad vinculado con el cromosoma 20. En (B) estructura de la Ncadherina indicando la codificación del alelo pactm101B y pacfr7donde se exhibe las terminaciones
en la región extracelular. (C-F) A través de hibridación in situ se observó el patrón de expresión
de N-cadherina a nivel de RNAm durante la gastrulación. (C), vista lateral de embrión pez cebra
que se encuentra aproximadamente en 1.25 hpf. En (D) vista lateral de embrión con proceso 8hpf.
En (E), vista lateral embrión con 16hpf. En (F), secciones transversales de embrión que exhibe la
expresión de ncad restringida durante el desarrollo del tubo neural ( Lele et al, 2002).
18
Estudios recientes en el pez cebra demuestran que la pérdida de N-cadherina induce a una
formación aberrante de las regiones posterior y medio del cerebro juntos con otros defectos
neurales incluyendo la disrupción de la migración celular de la región lateral del mesodermo
(Schepis y Nelson, 2012) y alteraciones a los movimientos celulares implicados en la extensión
convergente e invaginación de la placa neural (Lele et al., 2002; Hong y Brewster, 2006). Estos
fenotipos observados en los alelos pac sugieren que la N-cadherina no sólo esencial para el
desarrollo neural y migración radial de las células durante la neurulación, sino también para la
organización celular del cerebro y retina (Schepis y Nelson, 2012). Así los mutantes de Ncadherina en pez cebra generan un tubo neural de forma de “T” resultando aparentemente una
falla en los movimientos latero-mediales de las células lo que confirma la neurulación aberrante
(Lele et al., 2002). Sin embargo, se desconoce como las conductas celulares aberrantes originan
el desarrollo defectuoso del tubo neural en mutantes con pérdida de la N-cadherina. De este
modo, para poder entender el rol de la adhesión celular in vivo y así caracterizar de mejor manera
este proceso es imprescindible desarrollar parámetros cuantitivos morfométricos relativos a la
tasa y dirección del la invaginación in vivo durante las etapas iníciales de la neurulación.
19
2.6. MICROSCOPÍA CONFOCAL Y SU UTILIDAD EN EL REGISTRO DE LA
MORFOGÉNESIS ENBRIONARIA IN VIVO
La morfogénesis es un proceso dinámico en el que las células se mueven a ciertas regiones
definidas dentro de un tejido ó un embrión. Las células adquieren distintos destinos, adoptan
comportamientos específicos que impulsan el crecimiento y los cambios en la forma de la
citoarquitectura, tal como es el caso de la neurulación. En los últimos años sin embargo, debido a
los avances técnicos basados en la microscopía confocal y el uso de marcajes genéticos ha
revolucionado nuestra forma de entender estos procesos (Mavrakis et al., 2010). La tecnología
confocal permite obtener planos ópticos en muestras biológicas sin la necesidad de seccionarlas.
La técnica de microscopía confocal, se consigue en primer lugar, mediante el uso de diafragmas,
filtros ópticos y un espejo dicroico que son capaces de enfocar el espécimen a través de un
objetivo. La señal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve por el
mismo camino óptico, atravesando el espejo dicroico y atravesando un segundo diafragma o
pinhole y finalmente enfocado en un placa foto-detectora. Ambos planos óptico (muestra y
pinhole) deben de estar perfectamente alineados de forma que el segundo de ellos únicamente
deje llegar al detector la luz procedente del plano focal. La utilización de un láser como fuente de
luz permite focalizar la iluminación en una región muy pequeña de la muestra y con una gran
intensidad (Megason et al., 2006). Dado que sólo se ilumina una pequeña zona de la muestra
(punto), para poder visualizarla se necesita un sistema de barrido que permita muestrear todos los
puntos y un sistema de formación de la imagen donde se recoja la información de cada uno de
estos puntos. El sistema de barrido puede ser de dos tipos: que el haz del láser se desplace por la
muestra (beam scanning) o que sea ésta la que se desplace, mientras el haz permanece inmóvil
20
(stage scanning) (Wright et al., 1993). El primer tipo es el más comúnmente empleado, tiene la
ventaja de una mayor velocidad de barrido y por tanto de formación de la imagen, además el
espécimen no necesita ser movido durante el muestreo por lo que no necesita ser fijado, lo que lo
hace especialmente interesante para el estudio de células in vivo. El campo de barrido coincide
con el campo de observación del objetivo permitiendo que la zona de estudio pueda ser localizada
utilizando microscopía de fluorescencia convencional (Paddock, 2000).
La técnica de desplazamiento de la muestra (stage-scanning) presenta como principal ventaja el
permitir la observación de una zona tan grande como se desee sin tener que ceñirse al campo
visual del objetivo, además debido a que el haz permanece estacionario se tiene una iluminación
constante. La luz reflejada o fluorescencia emitida por la muestra es recogida en un
fotomultiplicador donde se transforma en una señal de vídeo que se digitaliza y almacena en un
ordenador, visualizándose a través de un monitor. La mayoría de los sistemas que cuentan con
varios fotomultiplicadores y un sistema óptico que permite recoger en cada uno de ellos
diferentes longitudes de onda (Paddock, 2000). Los compuestos fluorescentes como el GFP, a su
vez han permitido visualizar estructuras celulares y subcelulares registrando su dinámica
inherente en tres dimensiones en vivo (Megason y Fraser, 2003). Esta forma de microscopía
elimina la luz fuera de foco permitiendo delgadas secciones ópticas capturadas en lo profundo de
un espécimen. Esta técnica es especialmente útil para obtener imágenes de alta calidad con este
método de microscopía de amplio campo de fluorescencia convencional (Megason et al., 2006).
21
Figura 8. Esquema del principio de la microscopía confocal. La luz procedente de los puntos
fuera del plano focal es eliminada por el diafragma o pinhole figura adaptada de Paddock, (2000).
22
Secciones ópticas simples
La sección óptica es la unidad básica de imágenes del microscopio confocal. Estas nos permiten
obtener información valiosa de muestras fijadas y teñidas en una, dos ó más longitudes de onda.
Las imágenes resultantes representan un registro preciso de la muestra. La colección de las
imágenes dependerá a su vez del tamaño de la imagen y la velocidad de captura del equipo; por
ejemplo, un archivo de 8 bits de imágenes de 768 por 512 píxeles de tamaño ocupará
aproximadamente 0,3 MB. El uso de la mayoría del microscopio confocal que tarda
aproximadamente 1 segundo para recoger una sola sección óptica.
Time lapse e imágenes en tejidos vivos
Time-lapse se refiere a la colección de secciones ópticas individuales en puntos pre-establecidos
en el tiempo y utiliza la mejor resolución de la LSCM para el estudio de la dinámica de células y
tejidos vivos (Paddock, 2000).
2.7. USO DE PROTEINAS DE FUSIÓN DURANTE LA VISUALIZACIÓN DE LA
NEURULACIÓN EN VERTEBRADOS
Se ha utilizado en estos últimos años la fluorescencia molecular para observar la localización y
dinámica de una diversidad de proteínas y células. El descubrimiento de proteínas que tienen
capacidad fluorescente (proteínas fluorescentes, en inglés, fluorescent proteins ó FP), capaz de
absorber luz a una determinada longitud de onda y posteriormente emite dicha energía en forma
de luz bajo otra longitud de onda (fluorescencia). El descubrimiento (Shimomura et al., 1962),
23
clonación (Prasher et al., 1992) y expresión (Chalfie et al., 1994) de GFP proveniente de la
medusa Aequorea victoria, permitió un gran salto en los estudios de la dinámica molecular in
vivo de células y proteínas y pronto se transformaron en herramientas rutinarias en laboratorio de
biología celular.
Características de la GFP
La proteína verde fluorescente presenta dos picos de excitación: el primero, cercano a los 395
nm; el segundo, de 475 nm y también dos picos de emisión: si es excitada a los 395 nm su pico
de emisión será a los 508 nm y si, por el contrario, es excitada a 475 nm, entonces la emisión
ocurrirá a 503 nm (Tsien, 1998), cuando esto ocurre la proteína capta mayor luz fuera del
espectro visible y la convierte en luz visible verdosa.
Otra característica de gran importancia de la GFP, fue al insertar ADN complementario en un
vector de expresión en células procariotas (Escherichia coli) y eucarióticas (Caenorhabditis
elegans), pudieron comprobar que la Aequorea victoria producía fluorescencia. Por lo tanto se le
atribuyo a esta proteína la cualidad de marcador genético y localizador de proteínas en
organismos vivos (Chalfie et al., 1994).
24
A partir de los antecedentes anteriormente mencionados, se han propuesto la siguiente hipótesis:
“La molécula de adhesión celular, N-Cadherina controla el movimiento y dirección celular
durante la internalización de la placa neural del pez cebra”.
Así el objetivo general de este trabajo de Titulación es:
-Estudiar in vivo el rol de la adhesión celular mediada por la N-cadherina durante los
movimientos iníciales de la internalización de la placa neural del pez cebra.
Los objetivos específicos son:
- Caracterizar el movimiento celular (velocidad y dirección) in vivo durante las primeras etapas
de la neurulación de pez cebra en embriones silvestres y mutantes para N-Cadherina.
- Investigar el rol de N-Cadherina en la orientación celular durante los procesos de
internalización del tejido neural en embriones silvestes y mutantes para N-Cadherina.
25
3. MATERIAL Y METODOS
3.1. Materiales
3.1.2. Uso de Herramientas cuantitativas para análisis de imágenes confocales
El procesamiento de las imágenes se obtuvo a través del software libre: Image j
(http://imagej.nih.gov/ij/).
3.1.3. Mantención de Animales
Peces silvestres (wild-type) y mutantes pac fueron mantenidos bajo condiciones estándar
descritas en el “Zebrafish Book” (Westerfield, 2000). Esto es, en un vivero con sistemas de
recirculación cerrada de agua, con un fotoperiodo de 14/10 horas luz-oscuridad, a 28,5°C de
temperatura constante y separados según su estadio morfológico y edad (horas post-fertilización
(hpf) (Kimmel et al., 1995). Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con el
reglamento del comité de Bioética y uso de animales de la Universidad Austral de Chile.
3.2 Métodos
3.2.1. Síntesis de ARNm
Se emplearon vectores (pCS2+) los cuales llevan insertos cDNA que codifican para; a)
membrana-GFP b) H2B-mcherry (Campbell et al, 2002). Los plásmidos de DNA fueron
obtenidos desde bacterias transformadas (E.coli JM109) y linealizados mediante enzimas de
restricción. ARNm con caperuza de 7-metil-guanosina se transcribieron usando SP6 y T7 RNA
26
polimerasa de acuerdo con el kit mMessagem Machine (Ambion). Por último, los ARNm
transcritos se purificaron en columnas (Roche) y las concentraciones finales se medirán
utilizando espectrofotometría.
3.2.2. Micro-inyección de embriones
Los embriones fueron micro-inyectados usando un equipo de micro-inyección conectado a un
sistema micromanipulador (ASI, USA) y el uso de micro-capilares con filamentos internos
(Harvard Apparatus). Todos los micro-inyección se realizaron bajo un microscopio
estereoscópico con luz transmitida (Nikon, modelo SMZ645). Las agujas de inyección se
calibraron utilizando un dispositivo de calibración y el volumen se calculo como: (volumen de la
esfera = 4/3πr3). RNAm se inyectaron normalmente en la etapa 1 de células en un volumen de 24 nl por embrión.
3.2.3. Inmunohistoquímica
Para la inmunohistoquímica, se utilizó el siguiente protocolo: los embriones se decorionarón y
fueron fijados con una solución de 4% de paraformaldehído en PBS 1% (Sigma). Después de la
fijación, los embriones fueron deshidrataos con metanol (100-75-50-25%, respectivamente). A
continuación los embriones se incubaron en una solución de bloqueo (FBS, Sigma) con agitación
suave. Posteriormente, los embriones se incubaron en anticuerpo primario en solución de bloqueo
al 2,5 % diluido en FBS. Al día siguiente, los embriones fueron lavados en PBS 1% y luego se
incubaron con el anticuerpo secundario en solución de bloqueo 2,5%. Por último, los embriones
27
se lavaron en PBS 1% y luego fueron observados mediante microscopía confocal. Los
anticuerpos primarios que se usaran en el trabajo de tesis fueron mouse anti-ZO-1 en 1:300;
rabbit-anti-GFAP (Dako) en 1:500 rabbit-anti-Laminin (sigma) en 1:500 rabbit-anti-pKC (Sigma)
en 1:300; estos se diluyeron en 2,5% de normal goat serum (Sigma). Los anticuerpos secundarios
usados son Alexa Rabbit 488 (Sigma) a 1:800, y Alexa Mouse 568 (Sigma) a 1:800, ambos se
diluyeron en 2,5% de normal goat serum (Sigma).
3.2.4. Time-lapse in vivo a través de microscopía confocal
Para realizar nuestros “time-lapse”, los embriones fueron previamente inyectados con ARNm
codificante para constructos de fusión fluorescentes (membrana-GFP/núcleo-RFP). Los
embriones fueron más tarde seleccionados de acuerdo a su señal fluorescente en un microscopio
de epifluorescencia. Los embriones fueron manualmente decorionados en el estadio de tail-bud
(10 hpf). Más tarde, fueron transferidos a un molde de agarosa en una placa Petri con medio
embrionario (zebrafish book) donde fueron suavemente inmovilizados al agregar un par de gotas
de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5%. Para el análisis del proceso de neurulación el
embrión se observó en un eje transversal. Las secciones ópticas obtenidas por microscopia
confocal tuvieron una separación de 1 µm y fueron obtenidas con un lente objetivo de inmersión
25x en una cámara termo-regulada a 28,5°C. Los cortes en el eje Z fueron obtenidos cada 1-2
min entre las 10-11 hpf y 18-20 hpf.
28
3.2.5. Análisis morfométrico durante la neurulación del pez cebra
A fin de determinar parámetros cuantitativos, las imágenes fueron procesadas usando el programa
de software libre: Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Este software incluye herramientas de
análisis que me permitieron cuantificar las áreas, longitudes y ángulos del tejido neural, para
posteriormente ser cuantificados (Plugins ImageJ). La escala de medidas utilizada fue la micra
(µm) y los parámetros de la película fueron los siguientes: dimensión 512x512 (µm) el tipo de
datos de 8 bits en escala de grises, la distancia en pixeles fue de 1,00 µm y el radio de pixel 1,00
µm el procesamiento de color de la imagen fue en RGB-color y el formato de archivo se abrió en
TIF debido a que se trabajo con el comando Stack cuya finalidad era comprimir un set de
imágenes en 2D que abrió una carpeta de imágenes en una simple ventana (menú). Se incorporó
el plugin “Manual Tracking” con el objetivo de estudiar la trayectoria de las células, qué fueron
visualizadas con GFP. Este análisis cuantitativo permitió estudiar el movimiento de las células a
través de la opción Overlay dots & Lines (superposición de puntos y líneas) generando una
superposición de un stack original y una vista en donde los puntos y las trayectorias progresivas
se disponen en las coordenadas XY, registrados con colores que se aplicaron para cada track.
3.2.6. Análisis Estadísticos
Los análisis estadístico necesarios para evaluar diferencias entre wild type y mutante se
realizaron utilizando el software GraphPad Prism 6®. Para las comparaciones entre dos grupos se
realizó una prueba de t-test.
29
4. RESULTADOS
4.1. LA PÉRDIDA DE N-CADHERINA EN MUTANTES PARACHUTE/CDH2 CONDUCE A
UNA NEURULACIÓN ABERRANTE Y UNA ORGANIZACIÓN ANORMAL DE LA
POLARIDAD APICO- BASAL EN EL EMBRIÓN PEZ CEBRA
A fin de estudiar el efecto de la adhesión celular mediada por N-cadherina, se realizó una
inmuno-histoquimica para marcadores de polaridad celular, tales como ZO-1, aPKC, Laminina y
GFAP que han sido demostrados en complejos implicados en la estabilización de la polaridad
celular y asociada a la comunicación celular (Ohno, 2001). En embriones wild-type a 24 hpf, los
marcadores de polaridad apical como aPKC y ZO-1 se expresan en la cara apical o luminal del
tubo neural (Figura 9A en rojo representa la expresión Z0-1). A diferencia, los mutantes para Ncadherina presentan una distribución anormal de estos marcadores (Figura 9A). Mediante
secciones transversales, estos defectos fueron confirmados para marcadores de polaridad apical
aPKC y basal como GFAP y Laminina (Figura 9B, puntos amarillos, región basal; puntos rojos,
región apical).
Para evaluar la morfogénesis del tubo neural en mutantes cadherina, se realizó un time-lapse de
campo brillante (Figura 9 C). A través de secciones transversales, se confirmó los defectos de Ncadherina, ya que evidenciaron un comportamiento anormal durante la invaginación del tejido
neural y una disrupción en la migración de las células en la zona lateral, generando un fenotipo
de tubo neural tipo-T.
30
Figura 9. Efecto de la adhesión celular mediada por N-cadherina. (A) proyección máxima de
confocal .Vista dorsal embrión wild–type (izquierda) y mutante de N-cadherina (derecha) hacia
las 24 hpf. El marcador apical ZO-1 se encuentra anormalmente distribuido en mutantes cdh2.
(B) Secciones transversales confirman la pérdida de la organización de polaridad apico- basal
(puntos amarillos, región basal; puntos rojos, región apical). (C) Secciones transversales de
microscopia confocal de campo brillante los movimientos de internalización incompleta en
mutantes de N-cadherina (F). Las flechas indican la invaginación incompleta y defecto en la
convergencia de la región lateral en embriones de 13hpf que da lugar a una forma T en el tubo
neural.
31
4.2. ANÁLISIS DE LA DINÁMICA TISULAR DURANTE LOS MOVIMIENTOS
INICIALES DE LA NEURULACIÓN EN ANIMALES WILD-TYPE Y MUTANTES
PARA N-CADHERINA
A fin de comparar los movimientos de neurulación entre embriones silvestres y mutantes para Ncadherina se decidió realizar un análisis in vivo con la técnica de time-lapse confocal. Además, se
decidió utilizar el software imagen J que nos ofreció entre su plataforma un plugins llamado
Kymograph (Kymograph plugin, Imagej ) para medir la proyección temporal de la intercalación.
Estos análisis confirman que la neurulación en mutantes N-cadherina comienza o se manifiestan
durante el proceso de la neurulación alrededor de 14 hpf. Para ellos se marcó previamente con
membrana-GFP en wt y mutantes (Figura 10A) y durante el transcurso de la neurulación
revelaron los embriones mutantes N-cadherina que son capaces de generar a simple vista una
placa neural bajo condiciones normales, pero al cabo del proceso de invaginación se observa
severamente afectado tras la pérdida de adhesión celular. El análisis a través del kymograph nos
permitió cuantificar la invaginación del tejido en el tiempo (Figura 10B) demostrando así en wt
que la formación de la placa neural logra una invaginación completa dentro del embrión
alcanzando unos 160 µm hacia el final de la etapa de neural rod. Mientras tanto en mutantes de
N- cadherina al observarse defectos durante la internalización no se alcanza a definir
concretamente este proceso alcanzando una medida de 100 µm en el mismo tiempo de desarrollo.
Cuando se analizó el área tisular durante los procesos de neural keel y neural rod (Figura 10 C)
en mutantes y wt estos presentaron mayor diferencias significativas, resultado de una deficiencia
en la adhesión celular en mutantes cdh2, causando una alteración en la cito-arquitectura de la
placa neural. Al igual que los análisis de longitud tisular (Figura 10D) durante el proceso de
32
neural rod se observó mayor diferencias significativas debido a que las células no se extienden lo
suficiente perdiendo el contacto celular durante los movimientos de convergencia hacia la línea
media.
.
33
Wild-type
Mutante N-cadherina
Figura 10. N-cadherina en pez cebra es requerida para la internalización completa del
tejido. (A). Representación de secciones en confocal que muestra el tejido durante la
invaginación del tubo neural en embriones wtycdh2. Los puntos amarillos indican el tejido
neural, la barra azul indica la línea media y fue el punto de referencia para el análisis quimógrafo
(B) nt; notocorda; el tiempo dedicado en minutos; ov; vesícula ótica del marcador apical.
34
B
B). Análisis Quimográfico durante la invaginación de tejido entre wt y mutantes cdh2 que se
ilustra durante el proceso de 14-16 hpf, medido a través del tiempo en um.
.
35
C
D
(C). Cuantificación de la longitud tisular entre wt y mutantes N-cadherina en procesos
representativos de la neurulación. (D) Cuantificación del área tisular entre wt y mutantes Ncadherina presentando una mayor diferencia significativa en procesos de neural keel y neural rod.
36
4.3. ANÁLISIS IN VIVO DE LA MOTILIDAD CELULAR DURANTE EL PROCESO DE
INTERNALIZACIÓN DEL TEJIDO NEURAL DEL PEZ CEBRA
A fin de entender los defectos de invaginación en mutantes de N-cadherina ,se realizó una
análisis comparativo de motilidad celular entre embriones wt y mutantes para N-cadherina
previamente inyectados con histona acoplada a GFP (H2A:GFP). A través del uso del plugins de
manual tracking correspondiente al programa image J, esta herramienta nos permitió hacer el
seguimiento del movimiento nuclear para así lograr dilucidar su dinámica y migración durante la
neurulación. Estos análisis se concentraron específicamente durante los movimientos de
internalización tisular (neural keel). Para tales efectos, se consideró los siguiente parámetros:
velocidad y desplazamiento. El análisis de la longitud del desplazamiento total de las células
(Figura 11A) en ambos embriones, exhiben diferencias significativas entre las zonas mediolateral. En wt resulta un total de desplazamiento de 75 um , mientras que el mutante tiene un total
de 55 um. Al comparar el desplazamiento neto, entre embriones wt y mutantes, también se
observaron diferencias significativas (Figura 11B). Los embriones silvestres presentaron 38µm y
mutantes 27µm de desplazamiento promedio, cuyo resultado indica se requiere N-cadherina para
la orientación medio-lateral y coordinación celular. Mientras tanto los análisis de velocidad de
desplazamiento (Figura 11C) en estos embriones nos indica que en embriones silvestres, las
células neurales se mueven con un desplazamiento de 0.7 µm/minuto y en cambio los mutantes lo
hacen sólo con 0.4 µm/minuto promedio. Estos análisis indican que la pérdida de adhesión es
crítico durante la dinámica celular que subyace al proceso de invaginación.
37
WT
Mutante N-cadherina
Figura 11. Se requiere N-cadherina para el comportamiento normal de las células
neuroectodérmica. A través del eje superficial de profundidad de neural keel. (A) Kymograph
representación de movimientos de núcleos, ilustran los movimientos celulares durante la
neurulación entre embriones wt y cdh2. Todas las imágenes son proyecciones en un máximo de 6
fotografías sucesivas. Puntos de colores indican la asignación de células a través del ejesuperficial de profundidad del neural keel. Línea media está indicada por flecha blanca en todas
las imágenes. Cuantificación (A-B-C). Promedio de cada pista con respecto a la longitud,
desplazamientos y velocidad entre embriones wt y cdh2 (***P<0,001, n = 7 embriones
analizados, las barras indican SEM).
38
4.4. ANÁLISIS DE LA ORIENTACIÓN CELULAR DURANTE LOS MOVIMIENTOS
MORFOGENÉTICOS DE LA NEURULACIÓN ENEMBRIONES WILD-TYPE Y
MUTANTES PARA N-CADHERINA
A fin de comprender el movimiento de la neurulación por pérdida de la N-cadherina se realizó un
análisis con respecto a la orientación celular. Para ello utilizamos la herramienta Image J que nos
permitió cuantificar la longitud del eje celular mayor. Así se estableció un ángulo positivo entre 0
y -90º representado de color rojo y un ángulo negativo de 90 y -180º representación de color azul.
Durante los procesos iníciales de la formación de la placa neural se observó que embriones wildtype y mutantes cdh2 exhibieron una orientación celular muy similar donde la mayor orientación
prevaleció entre los ángulos 0º y 90º (Figura 12A). Sin embargo durante la etapa de neural keel a
diferencias de embriones wild-type, las células del mutante comenzaron a orientarse en un ángulo
de 90º y 180º (Figura 12B-E). Finalmente en proceso de neural rod estas diferencias fueron más
dramáticas marcadas con un ángulos promedio de embriones wil-type entre de 0º y 60º y
mutantes entre un ángulo de 60º y 180º (Figura 12 C-F). Por lo tanto estos análisis permiten
sugerir que las células wild-type poseen mayor proporción entre un ángulo de 30º, asumiendo una
configuración horizontal de las células perteneciente a la región medio-lateral, durante el neural
rod. Mientras que las células del mutantes poseen una mayor proporción entre un ángulo de 90º,
asumiendo una configuración vertical en la región dorso-ventral. Tal análisis reveló que otro
defectos asociado a la pérdida de N-cadherina durante los movimientos de internalización están
dados por mecanismos asociados a la orientación celular.
39
Wild-type
Mutante N-cadherina
D
A
E
B
C
F
Figura 12. La orientación de las células se ve afectada en mutantes Cdh2. Análisis de
orientación celular entre wt y embriones Cdh2 revelaron que se requiere la adhesión célulacélula para un comportamiento normal de las células durante la invaginación de placa neural. En
el panel derecho se encuentran las etapas representativas de invaginación del tubo neural. Las
líneas rojas indican (0 ° -90 °) y las líneas azules indican (90 ° -180 °). Panel de la izquierda; la
cuantificación de la orientación de células.
40
5. DISCUSIÓN
N-cadherina es una proteína de transmembrana que pertenece a la familia de las proteínas de
transmembrana Cell-Adhesion-Molecule (CAM) que a través de la unión a Calcio es capaz de
establecer uniones extracelulares de tipo homofílico (Suzuki, 2012). Esto le permite a NCadherina establecer contactos célula-célula que son importantes durante los movimientos de
remodelación tisular durante la embriogénesis (Hong y Brewster, 2006). Diversos estudios han
demostrado que las moléculas de adhesión mediadas por N-Cadherina se expresan de forma
dinámica durante el desarrollo del sistema nervioso central en vertebrados. Hasta la fecha no
existen estudios cuantitativos in vivo que permitan entender el rol de N-Cadherina durante el
desarrollo de la neurulación en vertebrados. Para nuestro conocimiento, este trabajo de tesis
constituye una primera aproximación a entender el rol de N-cadherina durante los movimientos
de internalización del tubo neural. En el pez cebra, la neurulación comienza a partir de una
estructura no polarizada, llamada placa neural que es capaza de sufrir dramáticos cambios
durante su internalización. Estos cambios deben estar acompañados de un equilibrio entre la
plasticidad y coherencia. Por lo tanto la expresión de un N-Cadherina, un molécula de adhesión
generalmente asociada células mesenquimáticas puede tener un rol fundamental para asegurar
estos procesos en cito-arquitecturas distintas a un epitelio convencional, que exhibe una clara
polaridad y expresión de E-Cadherina (Cadherina Epitelial). Nuestros estudios sugieren que la
perdida de N-Cadherina altera la citoarquitectura y dinámica tisular, demostrando tener un rol
clave durante el comportamiento colectivo de las células neurales durante la morfogénesis del
tubo neural. A través del uso de herramientas morfométricas cuantitativas pudimos lograr una
41
mejor descripción de la organización celular y tisular en mutantes para N-cadherina en pez cebra.
Los resultados de esta tesis demostraron que N-cadherina no solamente estaría implicado en
aspectos de motilidad celular durante la morfogénesis neural, sino también podría participar en
mecanismos de orientación celular. Por lo tanto, estos resultados apoyan fuertemente la hipótesis
que la N-cadherina controla el movimiento y dirección celular durante los movimientos de
internalización de la placa neural del pez cebra. Estos estudios cuantitativos contribuirán al
entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares mediados por la adhesión célula-célula
que controlan la morfogénesis durante el desarrollo de los vertebrados. Futuros estudios se
requieren para analizar el rol de la adhesión celular en el proceso de neurulación a nivel celular y
sub-celular (citoesqueleto).
42
6. CONCLUSIÓN
A tráves del análisis cuantitativo por medio de imagenología confocal y de herramientas de
software computacional nuestros resultados sugirieren que la molécula de N-cadherina juega un
papel clave en los movimientos celulares coordinados durante el proceso de internalización del
tejido neural in vivo en embriones de pez cebra. La pérdida de esta molécula de adhesión genera
una dinámica celular aberrante en células neurales experimentan defectos en su migración y
direccionalidad. A su vez, la falta de N-Cadherina estuvo asociada al cambio en la orientación
celular durante etapas claves de la internalización del tejido neural del embrión de pez cebra. Por
lo tanto, estos resultados confirman la hipótesis que la molécula de adhesión celular, N-cadherina
controla el movimiento y dirección celular durante la internalización de la placa neural del pez
cebra.
A pesar de que este trabajo no contempló estudiar el rol de la N-cadherina desde un punto de
vista mecanístico, futuros estudios centrados en la interacción con otras moléculas de adhesión
como alpha-catenina y beta-catenina así como la interacción con la dinámica del citoesqueleto
(microtúbulos y actina) serán importantes a fin de dilucidar la acción de N-cadherina durante el
desarrollo del sistema nervioso central en vertebrados.
43
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