NaI NaI

TECNICAS DE RADIOCOMPETICION PROTEICA
Nociones de Radioactividad
Recordemos que los átomos están formados por un núcleo, que contiene protones,
neutrones y la energía de interacción nuclear y por una zona extranuclear donde se
mueven los electrones por caminos energéticos definidos llamados órbitas. La
radioactividad es un fenómeno nuclear, es el proceso por el cual un núcleo inestable
se desintegra, perdiendo partículas o energía de excitación para formar una especie
nuclear más estable.
Los átomos poseen en su núcleo protones y neutrones, y su identidad la define el
número de protones Z (un elemento de Z = 6 siempre va a ser C, no importa el
número de neutrones). En la naturaleza podemos encontrar C con 6, 7 u 8
neutrones, pero siguen siendo C porque su Z = 6. A estos se los denomina isótopos.
Muchos de los isótopos de los elementos representados en la tabla periódica de
Mendeleiev poseen una inestabilidad en su núcleo, ya sea por exceso de masa,
neutrones, protones o energía; en otras palabras son radioactivos. Para ganar
estabilidad deben perder ese exceso emitiendo partículas o fotones (desintegración).
En el RIA, los elementos radioactivos frecuentemente utilizados para marcar los Ag
son: 125I y 3H (tritio).
El
125
I posee un exceso de energía y para ganar estabilidad desintegra emitiendo
fotones γ. Como los fotones no poseen masa, su interacción con la materia es pobre,
por lo que pueden recorrer grandes distancias antes de colisionar con moléculas del
medio circundante (tienen alta penetrancia). El número de desintegraciones que el
125
I emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador de centelleo sólido.
Este instrumento de medición lo que determina es el número de coaliciones que se
producen entre los fotones γ emitidos y un cristal de NaI, en otras palabras
determina cómo interacciona con la materia.
Muestra con 125I
Fotón γ
NaI
Contador de centelleo sólido
El
125
I se utiliza para marcar moléculas proteicas. La mayoría de las proteínas posee
en su estructura residuos de tirosina, y son precisamente los anillos aromáticos los
que se iodinan (así como ocurre con la tiroglobulina en la glándula tiroidea). Las
hormonas esteroideas no pueden ser marcadas con
125
I, por lo que se debe recurrir
a otro elemento radioactivo mucho más pequeño, el tritio: 3H.
El 3H posee un exceso de neutrones en su núcleo y para ganar estabilidad emite una
partícula cargada llamada β-. Esta partícula posee cierta masa y rápidamente
interacciona con la materia, por lo que su penetrancia es baja. El número de
desintegraciones que el 3H emite en la unidad de tiempo no podría jamás medirse en
un contador de centelleo sólido debido a su baja penetrancia. La partícula βcoalicionaría primero con el tubo o con el aire antes de interaccionar con el cristal.
Para ello, la materia que va a interaccionar con el 3H debe mezclarse con la muestra
que posee
3
H. Dicha materia se denomina líquido centellante. El número de
coaliciones entre la partícula β- y las moléculas del líquido centellante se miden en el
contador de centelleo líquido.
Tanto para el contador de centelleo sólido como líquido, la eficiencia de medición no
es del 100%, siempre pierde alguna que otra coalición, por lo que la medida arrojada
la da en cuentas por minuto (cpm) y no en desintegraciones por minuto (dpm).
Para marcar las hormonas esteroideas lo que se hace es recurrir a una marcación
isotópica, reemplazando algunos de los átomos de H de la molécula por 3H.
En la figura se observa como ejemplo la marcación de la testosterona con 8 átomos
de 3H.
H
3H
3H
3H
C
C
C
C
H
C
C
C
H
C
H
H
3H
H
C
H
C
C
C
H
C
C
H
H
H
3H
3H
C
3H
H
C
C
H
3H
1,2,6,7-3H-testosterona
Introducción a la radiocompetición proteica
La sangre y otros fluidos biológicos son mezclas químicas complejas. La
determinación en sangre de sustancias tales como glucosa, urea, lípidos, etc, que
están presentes en concentraciones del orden de los mg% se puede llevar a cabo
mediante ensayos de laboratorio convencionales, de baja sensibilidad.
En cambio, existe un gran número de sustancias como hormonas proteicas y
esteroides, vitaminas, etc, que también son de gran importancia clínica y que se
hallan en muy bajas concentraciones, del orden de los nanogramos/ml (ng/ml) o
picogramos/ml (pg/ml).
1 ng = 1 x 10-9 g
1 pg = 1 x 10-12 g
Para poder cuantificar estas sustancias se requiere un método de alta sensibilidad
y especificidad, como las técnicas de radiocompetición proteica. La sensibilidad
es la capacidad de detectar un compuesto que se encuentra en muy bajas
concentraciones. La especificidad es la capacidad de reconocer únicamente a una
sustancia dada en una mezcla compleja.
En el método de radiocompetición proteica, la sustancia que se quiere valorar en el
suero del paciente es enfrentada en un tubo de ensayo con una proteína ligadora
que la une específicamente, que tiene alta afinidad por ella y que es saturable por
ella (afinidad es la tendencia que presenta la sustancia ligadora de unirse al ligando,
mientras que saturabilidad es la propiedad de la sustancia ligadora de unir una
cantidad máxima fija de ligando). Las proteínas ligadoras empleadas en este tipo de
ensayo pueden ser:
- Proteínas plasmáticas: por ejemplo transcortina sérica, empleada para determinar
glucocorticoides en fluídos biológicos; o la proteína ligadora de esteroides sexuales,
empleada para la determinación de estradiol y testosterona en suero.
- Receptores celulares: en este caso el método recibe el nombre de radiorreceptor.
Se emplea por ejemplo en la determinación de estradiol en suero usando receptor
estrogénico uterino.
- Anticuerpos (Ac): en este caso el método recibe el nombre de radioinmunoanálisis
(RIA). Los Ac, inmunoglobulinas o γ-globulinas aparecen en la sangre y en ciertos
tejidos de vertebrados en respuesta a la inyección de un Antígeno (Ag), proteína o
macromolécula que le es extraña al individuo. Cada proteína foránea (Ag)
desencadena la formación de un conjunto de diferentes anticuerpos que reconocen
distintas porciones (epitopes) de su estructura. Los Ac se combinan con los epitopes
del Ag para formar un complejo Ag-Ac.
En cuanto a la estructura de los Ac, estos son proteínas que presentan forma de Y y
están constituidas por cuatro cadenas polipeptídicas. Tienen dos sitios de unión que
son complementarios a los epitopes del Ag, llamados paratopes.
epitope
Paratope
Ag
Ac
Los Ac necesarios se obtienen en animales de laboratorio por inyección del Ag, que
en nuestro caso es la sustancia a determinar. Las hormonas proteicas suelen tener
buena capacidad antigénica, en cambio las hormonas esteroides, por ser pequeñas
no dan buena respuesta y se las suele administrar conjugadas a proteínas de gran
tamaño. Otra posibilidad es aumentar la antigenicidad empleando “adyuvantes”
como el de Freund completo o incompleto, que consiste en una suspensión compleja
de aceites minerales con o sin micobacterias. La preparación antigénica suele
administrarse en repetidas ocasiones para obtener una mayor producción de
anticuerpos.
Hasta aquí la reacción que tendríamos en el tubo de ensayo sería:
Ac + Ag
Ag-Ac
Pero qué pasaría si al tubo de ensayo le agregáramos una cantidad conocida de la
sustancia a dosar, o sea el Ag, pero marcada radioactivamente (Ag*, también
llamada trazador).
Las características inmunoquímicas del Ag* deben permanecer idénticas a las del
Ag sin marcar, en otras palabras, la presencia del átomo radiactivo en la molécula no
debe distorsionar ningún epitope. De esta forma, el Ag y el trazador competirán por
su unión al Ac que no podrá distinguir entre ellos. Existirán entonces dos equilibrios
simultáneos:
Ag + Ac
Ag-Ac
+
Ag*
Ag*-Ac
Resumiendo: dentro del tubo de ensayo, en un medio de pH y temperatura
adecuados, se establece una competencia entre las moléculas marcadas y las no
marcadas del Ag para unirse al Ac. Dado que la cantidad de Ac es limitante, luego
de un tiempo de incubación adecuado se llegará a un estado de equilibrio en el que
parte del Ag se unió al Ac para formar el complejo Ag-Ac y otra parte del Ag quedó
libre en el medio de reacción. Lo mismo sucede con Ag*.
Por lo tanto, cuando se llegue al equilibrio en el tubo de ensayo habrá:
- complejos Ag-Ac
- moléculas de Ag libres
- complejos Ag*-Ac
- moléculas de Ag* libres
La interacción de estas moléculas está regida por la Ley de Acción de Masas: la
unión del Ag o Ag* con el Ac se realiza mediante sitios reactivos específicos y las
reacciones se desplazarán de acuerdo con la concentración de estas especies. Así,
cuanto mayor sea la concentración de Ag, mayor será la cantidad del complejo AgAc formado y, por lo tanto, mayor será la cantidad de Ag* desplazada.
Muestra desconocida
Control
Cantidad fija de Ag*
Ag*
Ag
Ac
Se añade la
muestra que
tiene una
cantidad
desconocida
de Ag
Se añade una
cantidad fija
de Ac anti-Ag
Se añade agente
precipitante (Ac
antiinmunoglobulina)
cpm control
Se determina
radioactividad en
los precipitados
cpm desconocido
cpm desconocido
x 100 = %.Ag* unido
cpm control
Principio del radioinmunoanálisis - RIA
En el ejemplo que se muestra las cantidades de Ag* son inferiores a las de Ag, lo
que produce una reducción del antígeno radioactivo unido (3 partículas en el tubo
control versus 1 particula en el tubo muestra).
Es de importancia mencionar que el Ac anti-Ag de interés se agrega en
concentraciones limitantes con el fin de que se establezca la competencia entre
Ag y Ag*.
Podemos entonces hablar de una fracción unida (complejos Ag-Ac y Ag*-Ac) y de
una fracción libre (moléculas de Ag y Ag*). Si con un método adecuado separamos
la fracción libre de la unida, podremos medir la radioactividad presente en cada una
de estas fracciones. Cuanto mayor haya sido la cantidad de Ag presente en la
muestra original, mayor será la cantidad de complejos Ag-Ac y menor la de
complejos Ag*-Ac formados, y mayor será la cantidad de Ag* libre.
La separación de ambas fracciones puede efectuarse por alguno de los siguientes
métodos:
- precipitación con segundo anticuerpo: los complejos formados se precipitan con
un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo utilizado en el ensayo. Este
método se usa principalmente cuando el Ag es una hormona proteica, ya que se
forman complejos proteicos de alto peso molecular que precipitan fácilmente.
- adsorción de la fracción libre: se emplean materiales de alto poder adsorbente
como el carbón activado con o sin agregado de dextrano, talco, florisil, etc, que
retienen, por el fenómeno físico de adsorción, las moléculas de bajo peso molecular.
Al centrifugar el carbón activado con las partículas adsorbidas se encuentran en el
precipitado. Se emplea para hormonas esteroides.
Separadas ambas fracciones se mide la radioactividad en general en la fracción
donde se encuentran los complejos Ag-Ac, llamada fracción unida. Si se usó el
método del 2do Ac, la fracción unida se encuentra en el precipitado; pero si se usó el
método del carbón activado, la fracción unida se encuentra en el sobrenadante. Pero
cómo relacionamos la radioactividad con la concentración de la sustancia a dosar
presente en la muestra?
Preparando simultáneamente una curva patrón (o de desplazamiento) con
cantidades conocidas y crecientes del Ag (patrón, es decir Ag de concentración
conocida). Evidentemente, todos los tubos, incluyendo los que contienen la muestra,
deberán llevar la misma cantidad de Ac y de Ag* dado que la única variable del
ensayo debe ser el Ag de la muestra, y deberán ser sometidos a las mismas
condiciones de incubación y separación. Entonces, a mayor concentración de Ag
más se desplaza el Ag* y menos complejos Ac-Ag*. Se construye entonces la curva
cpm unido/cpm total
de desplazamiento:
[Ag]
Los valores de radioactividad correspondientes a las muestras pueden entonces
interpolarse en la curva para obtener las concentraciones del Ag. Dado que las
interpolaciones sobre curvas no son precisas se recurre a un tratamiento matemático
de los datos que transforma la curva en recta para trabajar con menor error. Este
procedimiento se conoce como método LOGIT LOG.
Logit T = ln T
1-T
cpm unido
cpm unión máxima
Logit T
T =
Log [Ag]
Por otro lado, cada vez que se realice un ensayo deben considerarse las uniones
inespecíficas. Las uniones inespecíficas son las uniones del Ag* a otras sustancias
que no sean el Ac. Para ello utilizamos tubos procesados de la misma manera que
los restantes pero que carecen del Ac. Toda unión que se observe en estos tubos se
deberá a la fijación del Ag y Ag* a moléculas distintas al Ac. El valor de esta unión
inespecífica se sustrae a los tubos restantes, ya que se asume que en todos los
tubos ocurre en la misma proporción.
EJEMPLO UN ENSAYO RIA
Se realiza un RIA para determinar la concentración de LH en 2 muestras de suero (A
y B). Los datos obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
LH*
LH*
LH*
Ac
LH1
LH*
Ac
LH2
LH*
Ac
LH3
LH*
Ac
LH4
LH*
Ac
LH5
LH*
Ac
LH6
LH*
Ac
LH*
Ac
LH*
Ac
Todos los tubos deben tener igual volumen final, lo que se consigue completando
con solución buffer. Calcule las concentraciones de LH en A y B (en mUI/ml)
utilizando una representación gráfica.
Resolución:
Primero hay que promediar los valores de radioactividad (cpm) para cada par de
duplicados. La unión específica de cada tubo se obtiene restando el promedio de la
unión inespecífica [(396+418)/2=407]. Se hacen los cocientes entre el promedio de
cada punto y el de la unión máxima, tanto para la curva como para las muestras a
determinar. A este cociente se lo denomina T = cpm unido / cpm unión máxima. Se
calcula el valor de Logit T:
Logit T = ln
T
1-T
y se grafica la curva de desplazamiento: Logit T en función de los logaritmos de la
concentración de LH (eje x: log [LH]; eje y: Logit T). Entrando a la curva con el valor
de Logit de las muestras a determinar, se obtiene el valor del logaritmo de la
concentración de LH, a partir del que se calcula la concentración de LH
(antilogaritmo).
T
2.17
3
2,5
2
1,5
A
Logit T
1
0,5
B
0
-0,5 0
0,5
1
1,5
2
2,5
Log [LH]
-1
-1,5
-2
-2,5
Resultados exactos:
[LH] A = 13.72 mUI/ml
[LH] B = 41.58 mUI/ml
ENSAYOS
INMUNOMÉTRICOS
1) IRMA (ensayo inmunoradiométrico)
3
A diferencia del RIA, que como se vió, es un método competitivo, el IRMA es un
ensayo de tipo NO competitivo utilizado en la cuantificación de antígenos de alto
peso molecular que presentan varios determinantes antigénicos ó epitopes. El IRMA
no puede emplearse en la determinación de moléculas pequeñas (ej. esteroides) que
poseen baja capacidad antigénica, ya que en general se requiere que posean varios
epitopes.
Este ensayo requiere de dos anticuerpos específicos (mono ó policlonales) dirigidos
contra epitopes diferentes del antígeno. Ambos anticuerpos deben encontrarse en
altas concentraciones (en exceso). Uno de estos anticuerpos se adsorbe a una fase
sólida y el otro anticuerpo se marca radiactivamente, en general con 125I.
Luego de incubar, se formarán complejos de anticuerpo adsorbido a la fase sólidaantígeno presente en la muestra-anticuerpo marcado radiactivamente. Se lava, y se
determina la radiactividad en un contador de centelleo líquido. La radiactividad
obtenida será directamente proporcional a la concentración de antígeno presente en
la muestra a dosar.
*
*
*
*
Ac específico marcado
radioactivamente
Ac específico
adsorbido a la placa
Ag
con 2 epitopes (pueden ser iguales
o diferente)
Ventajas del IRMA:
• posee mayor sensibilidad que el RIA. Al utilizar anticuerpos en exceso, el
IRMA es capaz de detectar antígeno en muy bajas concentraciones.
• es más fácil marcar radiactivamente anticuerpos (como utiliza el IRMA) que
marcar radiactivamente antígeno (como requiere el RIA).
• es un ensayo rápido y estable.
Desventajas del IRMA:
• requiere de mayor número de pasos, por ejemplo necesita lavados
adicionales que el RIA no utiliza.
• utiliza generalmente anticuerpos monoclonales (Mab), que son más
laboriosos de obtener que los anticuerpos policlonales (Ac). Los Mab son
anticuerpos que proceden de un único clon de linfocitos B activados
(plasmocitos), o sea que poseen la capacidad de reconocer un único epitope
en toda la molécula antigénica y siempre es el mismo. Se obtienen por la
técnica desarrollada por Milstein y Köhler.
• al utilizar sustancias radiactivas está sujeto a legislación restrictiva (a
diferencia del ELISA y el DELFIA que no emplean compuestos radiactivos).
Cuadro comparativo entre RIA e IRMA:
RIA
IRMA
Ensayo competitivo (se establece una
Ensayo NO competitivo.
competencia entre las moléculas marcadas y
las no marcadas por el ligando).
Se alcanza un estado de equilibrio ( en el cual
No se alcanza un estado de
parte del antígeno marcado y no marcado se
equilibrio.
unió al anticuerpo para formar el complejo
antígeno-anticuerpo, y parte del antígeno
marcado y no marcado quedó libre en el
medio de reacción)
El anticuerpo es utilizado en concentración
Los anticuerpos son utilizados en
limitada (para que el antígeno no marcado y
altas concentraciones (en exceso).
el antígeno marcado compitan por el Ac)
Se determina antígeno marcado
Se determina anticuerpo marcado
radiactivamente (libre ó formando parte del
radiactivamente (formando parte
complejo antígeno-anticuerpo).
del complejo Ag-Ac).
El antígeno debe tener un determinante
El antígeno debe tener por lo
antigénico.
menos dos determinantes
antigénicos diferentes.
En general utiliza anticuerpos policlonales
En general utiliza anticuerpos
mono y policlonales
Para aumentar la sensibilidad del RIA debo
Para aumentar la sensibilidad del
colocar el anticuerpo y el antígeno marcado
IRMA debo colocar los anticuerpos
en bajas concentraciones.
muy concentrados, de modo de
atrapar todo el antígeno presente
en la muestra.
La radiactividad obtenida (en los complejos
anticuerpo-antígeno marcado) disminuye a
medida que aumenta la concentración de
antígeno presente en la muestra.
cpm unido
cpm total
[antígeno]
La radiactividad obtenida aumenta
a medida que aumenta la
concentración de antígeno en la
muestra.
cpm unido
cpm total
[antígeno]
2) ELISA
El enzimoinmunoanálisis es una de las técnicas inmunoquímicas más
importante desarrollada en los últimos años. Los inmunoensayos sirven para
detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos y para estudiar la estructura de
los antígenos. Si el ensayo es el adecuado, son muy rápidos y fáciles,
rindiendo información que sería difícil obtener utilizando otras técnicas.
El enzimoinmunoanálisis es un método objetivo y automatizable; a diferencia
del RIA está exento de legislación restrictiva y los reactivos usados se
conservan durante un tiempo relativamente prolongado. Estas consideraciones
unidas al hecho de que sólo se necesita un equipo sencillo y económico, han
llevado al desarrollo reciente de numerosos enzimoinmunoanálisis, muchos de
los cuales son especialmente adecuados para su utilización en laboratorios
pequeños y en países en desarrollo.
Nos ocuparemos ahora de un tipo de enzimoinmunoanálisis conocido como
análisis por enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta técnica
presenta como requisito que los anticuerpos o los antígenos se puedan ligar a
una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunológica como
la enzimática.
En estos ensayos, el antígeno o el anticuerpo se une usualmente a un soporte
de fase sólida para facilitar la separación de los reactivos libres y combinados.
Se ha hallado que antígenos y anticuerpos se pueden unir covalentemente al
material particulado, como celulosa, poliacrilamida, y que también se puede
obtener una adsorción pasiva satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas
de nylon, poliestireno, polivinilo o polipropileno. Como ya se ha mencionado
una parte esencial del ELISA es la conjugación del anticuerpo (o antígeno) con
una enzima. Es necesario que la enzima tenga actividad elevada, sea
económica, fácil de obtener en forma pura, y que posea una reacción con el
sustrato fácilmente medible. Las enzimas consideradas hasta ahora más
satisfactorias son la peroxidasa del rábano picante, la glucosa oxidasa, la βgalactosidasa y la fosfatasa alcalina. Estas son fijadas generalmente a
anticuerpos o antígenos por medio de glutaraldehído o periodato. Los
conjugados así obtenidos han demostrado ser estables durante muchos
meses, incluso años.
La elección del sustrato es crítica en el ELISA. Los sustratos deben ser
estables y solubles antes y después de la reacción enzimática. Los sustratos
cromogénicos deben ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados
después de la degradación. Los sustratos fluorogénicos, que producen un
compuesto fluorescente, pueden ser ventajosos para análisis de alta
sensibilidad.
ELISA INDIRECTO
Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede
clasificar según varios criterios diferentes, describiremos el método más
comúnmente
utilizado,
denominado
Elisa
Indirecto.
Este
método
es
ampliamente utilizado para la determinación de anticuerpos, ya que se
necesitan sólo unos pocos conjugados (ej. anticuerpos anti-inmunoglobulinas
humanas marcadas con enzimas) para analizar anticuerpos de una gran
variedad de enfermedades. La técnica es la siguiente:
1) El antígeno correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego
se lavan.
2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se
lavan nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antígeno
inmovilizado en la superficie de las concavidades.
3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se
incuba en las concavidades; éste reacciona con cualquier anticuerpo
"capturado” en el paso anterior. El exceso de reactivo se lava.
4) Se agrega el sustrato enzimático y las placas se incuban; la velocidad de la
degradación se indica por el cambio de color, que es proporcional a la
concentración de anticuerpo de las muestras del paso (2).
5) Se detiene la reacción y el color se determina en un espectrofotómetro.
2) Se añade suero del paciente. Si hay
Anticuerpos específicos anti-Ag estos se unirán.
LAVAR
E
E
3) Se añade anti γ-globulina humana marcada con
una enzima. Esta se unirá al Ac del paciente.
LAVAR
s
E
E
s
s
s
4) Se añade el sustrato de la enzima.
s
La cantidad de producto que se
obtiene es proporcional a la
cantidad de anticuerpo presente.
Determinacion biológica de hormonas: Bioensayo
Las hormonas se pueden determinar en el suero o plasma de acuerdo a
diferentes criterios: se puede medir la cantidad de hormona que se encuentra
circulante o se puede evaluar la capacidad que tiene ésta de generar una acción, es
decir que se puede medir su capacidad funcional. Para medir la concentración de
hormona circulante se utilizan por ejemplo, las técnicas de radiocompetición proteica o
de enzimo-inmunoensayo. Para medir la actividad biológica de una hormona se
utilizan distinos tipos de bioensayos.
El bioensayo tiene la característica de estudiar la capacidad de la hormona de
producir una respuesta, de manera tal que esta acción se pueda determinar o
cuantificar midiendo el metabolito final producido por esta hormona. De esta manera
se evalúa a la hormona de acuerdo a su actividad biológica. Se recurre a esta
metodología en casos muy particulares donde los resultados de los niveles
hormonales obtenidos en el laboratorio no son consistentes con los síntomas clínicos
observados en el paciente. Para establecer una analogía, se puede pensar que es
similar a cuando se determina la actividad de una enzima de acuerdo a la cantidad de
producto que se forma en la unidad de tiempo y no a la masa de la enzima en
determinado volumen.
La metodología del bioensayo, al igual que las otras técnicas descriptas en esta
unidad temática, tiene también una alta sensibilidad y reproducibilidad.
Actividad biológica de la hormona luteinizante
Daremos como ejemplo la medición en el suero de un paciente de la actividad
biológica de la hormona luteinizante. Para estudiar esta actividad, se evalúa la
capacidad que tiene el suero de producir una respuesta biológica sobre una población
celular, por ejemplo, en este caso: células de Leydig de testículo de rata o ratón. La
respuesta que se mide es la capacidad que tiene esa muestra de suero de estimular la
producción de testosterona en las células de Leydig.
La metodología consiste en la extracción de los testículos del animal luego del
sacrificio del mismo. El testículo está formado por dos compartimientos encerrados
dentro de la cápsula o albugínea: el tubo seminífero y el tejido intersticial. Las células
de Leydig se encuentran en el tejido intersticial.
El tejido se decapsula y se trata con una enzima llamada colagenasa. Este
tratamiento permite la liberación de las células intersticiales que generalmente se
encuentran en la conjunción de varios tubos seminíferos. Esta preparación se filtra a
través de una gasa de nylon y de esta manera se aislan las células intersticiales.
Una vez obtenidas las células, se procede a su conteo para conocer el número
de células de Leydig obtenidas y así poder determinar el número de células que se
distribuirá en cada uno de los tubos.
En cada tubo se coloca:
#
Una cantidad determinada de medio de cultivo.
#
La misma cantidad de células en cada uno de los tubos.
#
Una alícuota de la muestra incógnita o diferentes cantidades de hormona standard
(curva de calibración).
Luego se incuban los tubos en un baño de agua a una temperatura y tiempo
adecuados para que las células sean capaces de responder al estímulo hormonal
sintetizando testosterona y segregándola al medio de incubación.
Para cuantificar la respuesta hormonal se debe cuantificar la testosterona
sintetizada y secretada al medio de incubación. Esto se puede realizar, por ejemplo,
por la técnica de radioinmunoanálisis (RIA).
Si se realiza un gráfico con las muestras de concentraciones crecientes de LH
standard (curva patrón), se obtiene un gráfico semejante al de la figura, en donde se
alcanza un máximo en la producción de testosterona debido a la saturación de la
respuesta.
Para determinar la concentración de hormona que produjo la estimulación de las
células se realiza una extrapolación del valor de la concentración de testosterona
producida por la muestra incógnita y se averigua la concentración de hormona
luteinizante biológicamente activa que contenía esa muestra. Como en la técnica de
RIA, también se pueden realizar ajustes matemáticos para obtener rectas en lugar de
curvas en los gráficos.
Pueden existir discrepancias en el valor obtenido para una misma hormona por un
ensayo biológico y otro ensayo inmunológico, ya que la misma masa de hormona
puede tener distinta bioactividad en procesos patológicos o en determinadas
condiciones fisiológicas.
A continuación daremos algunos ejemplos de bioensayos basados en
metodologías muy similares a la descripta para el bioensayo de LH.
a) Bioensayo para ACTH: se utilizan células de glándula adrenal de la zona
fasciculata. Se determinan los niveles de glucocorticoides sintetizados por
acción de ACTH.
b) Bioensayo de angiotensina: en este caso se usan células de glándula
adrenal de la zona glomerulosa, determinándose los niveles de
mineralocorticoides sintetizados por acción de la angiotensina.
c) Bioensayo de la hormona foliculoestimulante: Se utilizan células de Sertoli
y se miden los niveles de estradiol sintetizados por acción de dicha
hormona. También se pueden usar células de la granulosa de ovario y
medir la producción de esteroides.
d) Bioensayo de prolactina: se utilizan líneas celulares en cultivo que
responden a prolactina, determinándose el incremento en el índice mitótico
por acción de la hormona.
Ejercicio: Comparación de técnicas