MYCOFAST® Screening EvolutioN 2 COMPLEMENT - Medica-Tec

10.2.2 Numeración (pocillos 1, 2, 3 y 10)
Marcar los pocillos de numeración que hayan virado al rojo e interpretar según la tabla siguiente:
Galería MYCOFAST EvolutioN 2
Galería de 2 tests de 2 x 10 pocillos que comprende 4 partes de los dos lados:
MYCOFAST® Screening EvolutioN 2
Diagnóstico de Micoplasmas urogenitales
Detección, numeración, identificación y determinación de la resistencia a los antibióticos
40 tests (Ref. 00033)
COMPLEMENT MYCOFAST® Screening EvolutioN 2
12 tests (Ref. Nr. 00034)
UMMt - UMMlyo
ES-2006-10
20 tests (Ref. Nr. 00072)
1 - FINALIDAD
El estuche MYCOFAST Screening EvolutioN 2 permite la detección, el cultivo, la numeración y la identificación del Ureaplasma urealyticum (U.u.) y
del Mycoplasma hominis (M.h.) a partir de muestras endocervicales, uretrales, urinarias, gástricas y en esperma. El estuche MYCOFAST EvolutioN
2 permite, además, la detección de las resistencias de U.u. y M.h. a ciertos antibióticos. Un estuche permite realizar 40 tests de detección y 10 tests
positivos.
El estuche COMPLEMENT MYCOFAST Screening EvolutioN 2 es un complemento de 6 galerías MYCOFAST Evolution 2 y de suplemento M.h. para
12 tests positivos suplementarios.
El estuche UMMt-UMMlyo es un complemento de medio UMMt (50ml) y UMMlyo (+50ml UMMt) para 20 detecciones suplementarias.
2 - INTRODUCCIÓN
Con una talla comprendida entre 0,15 y 0,25 µm, los micoplasmas son los más pequeños y los más simples procariotas capaces de autorreproducirse. (1). Los micoplasmas, que comprenden 15 especies censadas al día de hoy en el hombre, pertenecen a la clase de los mollícutes (de cutis mollis:piel blanda). Se diferencian de las otras bacterias en numerosos aspectos, entre ellos, la ausencia de pared que les confiere una resistencia natural a las beta-lactaminas, así como una membrana con esteroles proveniente de las membranas de las células eucariotas sobre las que se fijan. Los
micoplasmas son organismos relativamente frágiles, que no se multiplican en medio acelular mas que en presencia de numerosos factores de crecimiento y a una temperatura constante entre 35 y 37 ºC.
La mayoría de los micoplasmas humanos son simples comensales. De las 9 especies aisladas a partir del tracto urogenital, Ureaplasma urealyticum
y Mycoplasma hominis son los encontrados más frecuentemente. U.u.ó M.h. se transmiten por vía sexual y pueden comportarse como verdaderos
patógenos.
En el recién nacido, la contaminación se produce en el paso por el cordón genital y puede llevar consigo daños respiratorios así como daños meníngeos (3).
En el adulto, U.u. y M.h. son directamente responsables de las patologías descritas en el cuadro siguiente (6) :
Uretritis no
gonocócicas
Uretro-prostatitis
Epididimitis
Cálculos urinarios
Pielonefritis
Inflamación pélvica
Fiebre post-partum/aborto
Corioamnionitis
U. urealyticum
M. hominis
++++
++
+++
++
++
++
++++
+++
++++
-
El diagnóstico convencional se basa en el cultivo en medio con agar (tipo A7) seguido de la identificación con microscopio de las colonias U.u (en
forma de erizo) o de M.h. (de huevo en plato).
Al ser U.u. y M.h. organismos comensales, el diagnóstico de las infecciones por micoplasmas dependerá de la determinación de un umbral patológico y, por tanto, de una cuantificación precisa.
3 - PRINCIPIO
La técnica MYCOFAST Screening EvolutioN 2 es un método "todo líquido" basado en la capacidad de U.u y M.h. de metabolizar respectivamente la
urea y la arginina. El crecimiento de los micoplasmas en medio líquido se visualiza por el viraje de un indicador coloreado -el rojo fenol- del amarilloanaranjado al rojo que traduce la alcalinización del medio debido a la liberación de amoniaco.
El crecimiento de micoplasmas visualizado de esta forma permite:
- la detección en medio UMM ; y luego, en caso de resultado positivo :
- la numeración basada en la velocidad de hidrólisis de los sustratos, que es proporcional a la cantidad de gérmenes que contiene la muestra (cinética enzimática - patentes: europea n° 0311541, US n° 5.091.307).
- la identificación basada en la sensibilidad o no del germen frente a tres antibióticos (identibiotique®).
- la detección de la resistencia a tres antibióticos: doxicilina, roxitromicina y ofloxacina.
4 - REACTIVOS
Description
U.M.M.t :
Frasco de medio de transporte
de micoplasmas (50ml)
U.M.M.lyo : : Frasco de medio de
crecimiento liofilizado (+50ml UMMt)
Galerie MYCOFAST EvolutioN 2: Galería con
2x10 pocillos presentada en sobre de aluminio.
S. M.h. : Activador del crecimiento
de Mycoplasma hominis (4,5 ml)
Tubo plástico estéril
Galería Screening : Galería de 20 pocillos
vírgenes cubiertos con una película adhesiva.
#00033
2
2
CANTIDAD
#00034
-
1
1
-
6
40
3
-
Medio UMMt - Composición en g/l de agua destilada:
Caldo micoplasmas.........................................20
Antibióticos......................................................10 ml
pH : 6.0 ± 0.2
Medio reconstituido (UMMt+UMMlyo) - Composición en g/l de agua destilada:
Caldo micoplasmas..........................................20
Suero de caballo........................................... 200 ml
Extracto de levadura..........................................5,8
Cisteína............................................................ 0,3
Arginina............................................................. 9
Urea.................................................................. 3,6
Rojo de fenol.....................................................0,04
Antibióticos..................................................... 10 ml
pH : 6.1 ± 0.1
1
-
5
1
#00072
-
-
Temp.
2 - 8°C
2 - 8°C
2 - 8°C
2 - 8°C
2 - 30°C
2 - 30°C
Pocillos
1à3
4à6
7à9
10
Objetivo
Cuantificación de U.u para tasas de 103 à >105 UCC/ ml
Evaluación de las resistencias de U.u y M.h. a 3 antibióticos :
Doxiciclina 8 (g/ml (D), Roxitromicina 4 (g/ml (ROX) y Ofloxacina 4 (g/ml (OFX)
Identibiotique®: Identificación de U.u y M.h. por su perfil de resistencia o sensibilidad a: Lincomina (L), trimethoprimsul
toxazol (SXT) y Eritromicina (E).
Cuantificación de M.h. para tasas >104 UCC/ ml
fame-
Para obtener una cuantificación específica, los pocillos 1 al 3 reservados para la numeración de U.u. contienen lincomicina que inhibe el crecimiento
de M.h. eventualmente presente; el pocillo 10 reservado para la numeración de M.h. contiene eritromicina que inhibe, de forma selectiva, el crecimiento de U.u.
5 - PRECAUCIONES DE EMPLEO
l Los reactivos de este estuche son únicamente para uso in vitro y deben ser manipulados por personas autorizadas.
l Las muestras y los reactivos sembrados son potencialmente infecciosos; deben ser manipulados con precauciones de uso y desecharse a continuación respetando las reglas de higiene y la reglamentación vigente para este tipo de productos en el país de utilización.
l Los reactivos que contienen materias primas de origen animal deben ser manipulados con las precauciones de uso correspondientes.
l No utilice los reactivos pasada la fecha de caducidad.
l No utilice los reactivos deteriorados o mal conservados antes de usar.
l Un resultado positivo con el método MYCOFAST traduce una colonización por parte de los micoplasmas urogenitales, pero no puede servir por sí
solo para realizar un diagnóstico clínico. Éste debe realizarlo el médico en función de los resultados biológicos y la sintomatología clínica.
6 - RECOGIDA Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Toma de muestras endocervicales/vaginales
Utilizar únicamente un hisopo de Dacron® ó de rayón, un "cytobrush " ó un Bact. Efectuar la toma de muestra después de una eliminación cuidadosa
de las secreciones del exocervix con ayuda de un primer hisopo.
Los micoplasmas tienen una fuerte afinidad con las células mucosas sobre las que se adhieren; es esencial raspar bien la mucosa para obtener
un buen rendimiento (2).
Toma de muestras uretrales
Limpiar el meato y recoger con el hisopo ó por raspado de las células.
Esperma, orinas
Colocar el esperma o el primer chorro de orina en un frasco estéril.
Líquido gástrico
El líquido gástrico de los recién nacidos se toma por aspiración con la ayuda de un catéter y colocar en un frasco estéril.
7 - PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
l Los reactivos conservados a 2-8ºC en su estado original son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja.
l En caso de utilizar una sola mitad de galería, guardar la otra mitad cubriéndola con su adhesivo en la bolsa de aluminio original cerrada herméticamente. La mitad de la galería conservada de esta forma permanece estable durante 3 semanas a 2-8°C.
l Preparación del medio de cultivo UMM:
Regenerar un frasco UMMLyo (+50ml UMMt) con la totalidad de un frasco UMMt (50ml).
Distribuir en forma estéril 2,5ml de este medio en cada uno de los 20 tubos esterilizados que contiene el estuche.
l Conservación del medio UMM tras la distribución: 1 semana a 2-8°C y 2 meses -20°C.
l El suplemento Mh permanece estable 3 meses después de abierto
8 - MATERIAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO
l Material para la toma de muestra (hisopos de Dacrón o de rayón, cilobrochas, frascos estériles para la toma de muestras líquidas).
l Pipetas y conos de transferencia
l Recipiente para residuos contaminados.
l Congelador a -20°C
l Vaselina líquida estéril
l Estufa calibrada a 37°C ± 1°C
9 - PROCEDIMIENTO
Llevar los reactivos a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.
9.1 Detección
Para las muestras líquidas se recomienda no realizar la etapa de detección y proceder directamente a la numeración e identificación con la
galería MYCOFAST EvolutioN 2.
9.1.1 Inoculación del medio UMM
l Descargar el hisopo o 200 µl de muestra líquida homogeneizada en un tubo que contenga el medio UMM anteriormente regenerado (§7).
l Proceder enseguida a la inoculación de la galería Screening.
Importante: El medio de cultivo UMM sembrado debe ser conservado a 2-8°C como máximo 48 horas.
9.1.2 Inoculación e incubación de la galería Screening
l Despegar la película adhesiva.
l Distribuir 100 µl de medio UMM sembrado en un pocillo de la galería Screening. Conservar el tubo a 2-8°C.
l Agregar 2 gotas de vaselina líquida y volver a colocar el adhesivo.
l Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 horas.
Importante: Para la búsqueda particular de Mycoplasma hominis dejar incubar 24 horas suplementarias de ser necesario.
9.1.3 Lectura e interpretación de la galería Screening
l Verificar que el contenido del pocillo esté límpido. Si el medio se torna turbio, el test es imposible de interpretar.
l Observar el color del medio :
En presencia de micoplasmas, el medio vira al rojo.
En ausencia de micoplasmas, el medio permanece amarillo.
En caso de notar la presencia de micoplasmas, continuar el diagnóstico.
9.2 Numeración, identificación y test de resistencia
9.2.1 Inoculación de la galería MYCOFAST EvolutioN 2
l Tomar el tubo conservado a 2-8°C correspondiente a la muestra positiva y llevarlo a temperatura ambiente.
l Identificar la galería MYCOFAST EvolutioN 2.
l Despegar la película adhesiva y distribuir sucesivamente en los pocillos:
pocillos 1-10
100 µl de medio UMMlyo regenerado
pocillos 9-10
50 µl de suplemento S.Mh
pocillos 1-10
2 gotas de la vaselina estéril
l Recubrir la primera serie de pocillos con ayuda de película adhesiva
9.2.2 Incubación de la galería
Incubar la galería a 37°C ± 1°C durante 24 horas.
Para la enumeración de los U.u y M.h, leer los resultados en 24 horas. Prolongar la incubación hasta 48 horas para destacar las cepas de poca actividad enzimática.
Importante: la incubación se puede prolongar hasta 72 horas para las muestras de tipo orina, esperma y líquido gástrico.
10 - LECTURA E INTERPRETACIÓN
10.1 Validación
Verificar que todos los pocillos de una misma serie están limpios. Un pocillo turbio indica contaminación bacteriana. En este caso empezar otra vez
la prueba.
10.2 Lectura e Interpretación
La lectura de los resultados consiste en identificar las coloraciones obtenidas en los diferentes pocillos de las galerías.
El crecimiento de los micoplasmas urogenitales en los pocillos, se traduce por una alcalinización del medio que vira al rojo. En ausencia de crecimiento de micoplasmas urogenitales, el medio permanece amarillo.
Importante: Una coloración anaranjada debe ser considerada como un test positivo (tasa límite).
10.2.1 Identificación (pocillos 7, 8 y 9)
La identificación se realiza en función del viraje específico de los pocillos (ver capítulo 10.2.2.) así como por la lectura de los pocillos 7, 8, y 9 para la
determinación del perfil Identibiotique® :
Color de los pocillos #
7 (L)
8 (SXT)
9 (E)
Ureaplasma
urealyticum
Mycoplasma
hominis
rojo
rojo
amarillo
amarillo
rojo
rojo
viraje al rojo
de los pocillos #
1
1y2
1, 2 y 3
10
Interpretación (UCC/ml)
tasa U.u. 103
tasa U.u. 104
tasa U.u. > 105
tasa M.h. > 104
Notas
l La numeración de los micoplasmas urogenitales ha sido validada en las muestras donde pueden estar presentes en estado de comensales (cérvico-vaginales y uretrales).
l La aparición de U. urealyticum y de M. hominis a partir de muestras normalmente estériles, sea cual fuere su tasa, es significativa (5).
l En los hombres, la tasa de U. urealyticum es >104 UCC/ml para una muestra uretral; en las mujeres, la tasa de M. hominis es > 104 UCC/ml para
una muestra cervo-vaginal (5).
l El valor que normalmente se indica para U. urealyticum en un primer chorro de orina, en esperma o en una muestra endotraqueal es de > 103
UCC/ml (5).
10.2.3 Detección de las resistencias (pocillos 4, 5 y 6)
Perfil resistente: El viraje del medio al rojo en los pocillos conteniendo un antibiótico traduce la capacidad de la cepa para desarrollarse en presencia del antibiótico analizado.
Perfil sensible: El color amarillo del medio traduce la incapacidad de la cepa para desarrollarse en presencia del antibiótico analizado.
Notas
l Los pocillos reservados para el test de resistencia no contienen suplemento S.Mh. En caso de un resultado positivo para el Mycoplasma hominis,
la lectura e interpretación del perfil de resistencia deben efectuarse después de 48 horas de incubación.
l Como el inóculo no está estandarizado, los resultados de la numeración deben tenerse en cuenta para la interpretación del test de resistencia a los
antibióticos (§13).
11 - CASOS PARTICULARES
Tasas muy elevadas de U.u y de M.h
Se produce un viraje al rojo de todos los pocillos de la galería. Por ende se recomienda proceder a una dilución de la muestra para obtener un resultado más preciso. En este caso, proceder de la siguiente manera:
l Sembrar un nuevo tubo de medio UMM con 200 µl del medio UMM sembrado y conservado 2-8°C. Comprobar la ausencia de viraje al sacarlo del
refrigerador.
l Sembrar una nueva galería utilizando el medio obtenido (§ 9.2.1)
l Tener en cuenta la dilución (1:10) para la interpretación de la numeración.
l De ser necesario, confirmar en gelosa A7 la presencia de micoplasmas volviendo a aislar a partir del medio UMM sembrado y conservado a 28°C.
12 - CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad puede realizarse a partir de una cepa de colección liofilizada (Ureaplasma urealyticum ATCC 27618).
Realizar un precultivo después de sembrar 100µl de la cepa regenerada en un frasco de medio UMM reconstituido (UMMt+UMMlyo).
Incubar 37°C ± 1°C durante 6 horas.
Sembrar un nuevo caldo UMM reconstituido mediante 200µl del precultivo homogeneizado.
Sembrar la galería MYCOFAST® Evolution 2 y continuar el test según las presentes instrucciones (§9.2 y 10).
Resultado esperado :
103 104 >105 D ROX OFX
L SXT
E
>104
+
+
+
+
Importante: En el caso de una cepa liofilizada debilitada en actividad ureásica, la incubación puede se prolongada hasta 18-24 horas. El caldo será
sembrado con 20 µl.
13 - LÍMITES DEL MÉTODO
l Algunas bacterias, presentes en cantidad >106-7 UFC/ml y que poseen una ureasa, pueden hacer virar todos los pocillos de la galería. Se puede
verificar su presencia volviendo a aislar sobre gelosa chocolate a partir del medio UMMlyo original conservado a 2-8°C (ver § 9.2).
l Un pH de muestra básica (pH > 8) puede hacer virar el medio UMM. En ese caso, diluir la muestra (1:10) en otro medio UMM y realizar la interpretación teniendo en cuenta la disolución.
l Como sucede con cualquier método de búsqueda de gérmenes, la calidad de la muestra condiciona el resultado del test. Un test negativo no significa necesariamente una ausencia de infección.
l El test de resistencia se realiza a partir de la muestra, y sólo brinda una estimación de la resistencia a 3 clases de antibióticos. El resultado debe
ser apreciado en función de la numeración de la especie detectada (tasa recomendada: 104-5 UCC/ml).
l Una muestra débilmente cargada de micoplasmas (<103 UCC/ml) puede causar un viraje aleatorio en los distintos pocillos de la galería.
l La siembra de la galería a partir del inóculo conservado a 2-8°C durante la etapa de la detección puede provocar una pérdida en cuanto a detección y numeración en comparación con el método directo.
14 - PERFORMANCES
Las performances del método MYCOFAST han sido evaluadas en relación con el cultivo en gelosa A7 a partir de muestras clínicas. Los resultados
de identificación se resumen en la siguiente tabla:
n=
Prevalencia
Sensibilidad
Especificidad
Uretrales
Vaginales
100
52%
98,2%
100%
MUESTRAS
Esperma
150
13,3%
88%
98,4%
Orina
150
16%
86,4%
98,4%
El método MYCOFAST también ha sido validado para la detección e identificación en muestras de secreciones gástricas de recién nacidos (n=208,
prevalencia 19,2%) y, en forma paralela, sobre las muestras cervicales-vaginales de la madre (n=208, prevalencia 48,1%). Todas las cepas de micoplasmas presentes en la gelosa A7 han sido detectadas con el método MYCOFAST (4).
15 - ELIMINACIÓN DE LOS DESECHOS
Los desechos deben ser eliminados respetando las reglas de higiene y la reglamentación en vigor para este tipo de productos en el país de utilización.
16 - BIBLIOGRAFIA
1. BEBEAR C., DE BARBEYRAC B. 1994. Les mycoplasmes, p. 1443-1463. Dans FRENEY J., RENAUD F. , HANSEN W. , BOLLET C. (éd.).“Manuel
de bactériologie clinique”, 2ème éd., vol.3, Elsevier, Paris .
2. BOUCAUD-MAITRE Y. et THOINET S. 1993. Analyse des prélèvements en bactériologie médicale - 2ème partie : prélèvements génitaux. Feuil.
Biol., 34 : 21-24.
3. GENIAUX M. 1994. Microbiologie des MST chez les mineurs de moins de 15 ans. Méd Mal Infect. 24:409-424.
4. GRATTARD F., SOLEIHAC B., DE BARBEYRAC B., BEBEAR C., SEFFERT P. and POZZETTO B. 1995. Epidemiologic and molecular investigations of genital mycoplasmas from women and neonates at delivery. Pediatr. Infect. Dis. J. , 14 : 853-858.
5. PEREYRE S., BEBEAR C.M., BEBEAR C. 2001. Les mycoplasmes en pathologie humaine. Revue Française des Laboratoires. Supplément au
N°329, 34-36.
6. TAYLOR-ROBINSON D. 1995. Ureaplasma urealyticum (T-strain Mycoplasma) and Mycoplasma hominis, p. 1713-1718. Dans MANDELL G. L. ,
BENNET J. E. and DOLIN R. (ed.). Principles and Practices of Infectious Diseases, 4th ed., vol. 2, Churchill Livingstone, New York.
MYCOFAST® es una marca registrada de ELITech France SAS
Sitio de fabricación :
ELITech France
Parc d’activités
Allée d’Athènes
83870 SIGNES
(FRANCE)
ELIT ECH France SAS
305, allée de Craponne
13300 SALON DE PROVENCE
(FRANCE)
Tél. : 33 (0)4 90 17 54 50
Fax : 33 (0)4 90 17 54 51
Galeria MYCOFAST Evolut ioN 2
Galeria de 2 testes de 2 x 10 poços com um total de 4 partes:
P oç o
O bj e ct i vo
1a3
Quantificação de U.u. de 103 a >105 UCC/ ml
4a6
Avaliação das resistências de Uu e Mh em relação a Doxiciclina 8 µg/ml (D), Roxitromicina 4 µg/ml (ROX) e Ofloxacina 4 µg/ml (OFX)
Identibiotique®: Identificação de U.u. e M.h. pelo seu perfil de resistência ou de sensibilidade à: Lincomicina (L),
7a9
Trimetoprim-sulfametoxazole (SXT) e Eritromicina (E)
10
Quantificação de Mh para taxas >104 UCC/ ml
MYCOFAST ® S c r e e n i n g E v o l u t i o N 2
D ia g n ó s ti c o d o s mi c o pl a s ma s u ro g e n it a is
Rastreio, Quantificação, Identificação e Análise da resistência aos antibióticos
40 testes (Réf. 00033)
COMPLEMENT MYCOFAST® S c r e e n i n g E v o l u t i o N 2
12 testes (Réf. 00034)
UMMt - UMMlyo 20 testes (Réf. 00072)
PT-2006-10
1 - OBJECTIVO
O kit MYCOFAST Screening EvolutioN 2 permite efectuar o rastreio, cultura, quantificação e identificação de Ureaplasma urealyticum (U.u.) e de Mycoplasma
hominis (M.h.) em amostras endocervicais, uretrais, urinárias, gástricas e de esperma. O kit MYCOFAST EvolutioN 2 permite ainda a detecção das resistências
de U.u. e M.h. a certos antibióticos. Uma embalagem permite realizar 40 testes de rastreio e 10 testes positivos.
O kit COMPLEMENT MYCOFAST Screening EvolutioN 2 é um complemento de 6 galerias MYCOFAST Evolution 2 e de suplemento M.h. para a realização de
12 testes positivos suplementares.
O kit UMMt-UMMlyo é um complemento de meio UMMt (50ml) e UMMlyo (+50ml UMMt) para a realização de 20 testes de rastreio suplementares.
2 - INTRODUÇÃO
De tamanho compreendido entre 0,15 e 0,25 µm, os micoplasmas constituem os procariotas mais pequenos e mais simples com capacidade de auto-replicação (1). Os micoplasmas, dos quais se conhecem, até ao momento, 15 espécies referenciadas, pertencem à classe mollicutae (de cutis mollis : pele mole).
Diferenciam-se das outras bactérias pela ausência de parede celular, com uma resistência natural aos antibióticos ß-lactâmicos, bem como uma membrana rica
em esteróis proveniente da sua adesão às membranas das células eucariotas. Os micoplasmas são organismos relativamente frágeis que se multiplicam em
meio acelular apenas em presença de numerosos factores de crescimento e a uma temperatura constante, compreendida entre 35 e 37°C.
A maior parte dos micoplasmas humanos são comensais. Das 9 espécies isoladas a partir do tracto urogenital, Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis
são as mais frequentemente encontradas. U.u. ou M.h. transmitem-se por via sexual e podem comportar-se como verdadeiros agentes patogénicos. No recémnascido, a contaminação verifica-se na passagem pelo aparelho genital e pode provocar infecções respiratórias e meningites (3). No adulto, U.u. e M.h. causam
as seguintes infecções (6):
U . u r e a ly ti c u m
Uretrites não
gonocócicas
Uretroprostatite
Epididimite
Cálculos urinários
Pielonefrite
Inflamação pélvica
Febre pós-parto/aborto
Corioamnionite
M . h o mi n is
++++
++
+++
++
++
++
++++
+++
++++
-
O diagnóstico convencional assenta na cultura em gelose A7, seguida de reconhecimento ao microscópio das colónias de U.u. (em forma de ouriço-do-mar) ou
M.h. (em forma de ovo estrelado).
Dado que U.u. e M.h. são organismos comensais, o diagnóstico das infecções por micoplasmas deverá depender da determinação de um limiar patológico
seguida de uma quantificação precisa.
3 - PRINCÍPIO
O MYCOFAST Screening EvolutioN 2 identifica o crescimento de U.u. e de M.h., após uma incubação de 24horas em meio líquido. Durante o crescimento, o
U.u. e o M.h metabolizam respectivamente ureia e arginina, o que resulta numa alteração da cor do meio, que contém o indicador vermelho de fenol, de
amarelo-alanrajado e vermelho. Esta alteração de cor deve-se à libertação de amónia, com alcalinização do meio.
O crescimento visualizado dos micoplasmas permite:
- o rastreio em meio UMM; e em caso de positividade:
- a quantificação de micoplasmas, com base na velocidade de hidrólise da ureia ou da arginina, que é proporcional à quantidade de microorganismos contidos
na amostra (patentes: europeia nº 0311541, US n° 5.091.307).
- a identificação com base na sensibilidade, ou não, do microorganismo, perante três antibióticos (identibiotique®)
- a detecção das resistências a três antibióticos: doxiciclina, roxitromicina e ofloxacina.
4 - REAGENTES
D escr i ção
U.M.M.t : Frasco de meio de
transporte de micoplasmas (50ml)
U.M.M.lyo : Frasco de meio de
crescimento liofilizado a ser reconstituido com
um frasco com 50ml de UMMt)
Galeria MYCOFAST E vol ut io N 2: Galeria de
2x10 poços, acondicionada em saqueta de alumínio
S. M.h. : Factor de crescimento
de Mycoplama hominis (4.5ml)
Tu bo pl ás t i co e st é r i l
Galer ia Scr eeni ng : Galeria de 20
poços virgens coberta com filme adesivo
Q u a n t id a d e
#00033
2
#00034
-
#00072
1
2 - 8°C
2
-
1
2 - 8°C
2 - 8°C
5
6
-
1
1
-
2 - 8°C
40
3
-
-
2 - 30°C
2 - 30°C
M e i o U M M t - C o m p o s i ç ão e m g/ l d e á g u a d e s t i l a d a:
Caldo Micoplasmas ................................................20
Antibióticos ............................................................10 ml
pH : 6.0 ± 0.2
M e i o r e c o n s ti tu í d o ( U M M t+ U M M l y o ), C o m p o s i ç ã o e m g /l d e á g u a d e s t i l a d a :
Caldo Micoplasmas. ..............................................20
Soro de potro........................................................200 ml
Extracto de leveduras ..............................................5,8
Cisteína ....................................................................0,3
Arginina ....................................................................9
Ureia ........................................................................3,6
Vermelho de fenol ....................................................0,04
Antibióticos ............................................................10 ml
pH : 6.1 ± 0.1
A fim de se obter uma quantificação específica, os poços 1 a 3, reservados à quantificação de U.u. contêm lincomicina, que inibe o crescimento de M.h.
eventualmente presente; o poço 10, reservado à quantificação de M.h., contém eritromicina, que inibe o crescimento de U.u.
5 - PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
l Os reagentes deste kit destinam-se exclusivamente a utilização in vitro e devem ser manipulados por técnicos com formação específica.
l As amostras e reagentes inoculados são potencialmente infecciosos, devendo, por isso, ser manipulados com as precauções habituais, em cumprimento das
regras de higiene e da regulamentação em vigor no país onde este tipo de produto é utilizado.
l Os reagentes contendo matérias primas de origem animal devem ser manipulados com as precauções habituais.
l Não utilizar reagentes cujo prazo de validade tenha expirado.
l Não utilizar reagentes que se apresentem danificados ou em mau estado de conservação, antes da utilização.
l Um resultado positivo pelo método MYCOFAST traduz-se numa colonização pelos micoplasmas urogenitais, mas não serve, só por si, para efectuar um diagnóstico clínico. Este deverá ser realizado pelo médico em função dos resultados biológicos e dos sinais clínicos.
6 - RECOLHA E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
A mo s t r a s e n d o c e r v i c a i s / v a g in a i s
Utilizar unicamente um escovilhão Dacron® ou de fibra de seda, ou uma escova de citologia. Efectuar a colheita após cuidadosa limpeza do colo do útero, com
um outro escovilhão.
Como os micoplasmas aderem fortemente às células das mucosas, é essenci al raspar bem a mucosa a fi m de obt er mat eri al suf ici ente (2) .
C o l h e i t a d e a m o s t ra s u r e t ra i s
Limpar o meato e proceder à recolha por esfregaço ou raspagem das células.
E s p e r m a , u ri n a
Recolher o esperma ou o primeiro jacto de urina num frasco esterilizado.
S uc o g ás t r i co
Recolher o suco gástrico do recém-nascido por aspiração, através de um cateter, e colocar num frasco esterilizado.
7 - PREPARAÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES
l Quando conservados à temperatura de 2 - 8ºC, na embalagem original, os reagentes mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na
embalagem.
l Em caso de utilização de apenas metade da galeria, guardar a outra metade, na saqueta de alumínio de origem e hermeticamente fechada e mantém-se
estável durante 3 semanas, à temperatura de 2-8°C.
l Preparação do meio de cultura UMM:
Restabelecer um frasco UMMLyo (+50ml UMMt) com a totalidade de um frasco UMMt (50ml).
Distribuir, em condições de esterilidade, 2,5ml deste meio em cada um dos 20 tubos estéreis contidos no kit.
l Conservação do meio UMM após distribuição: 1 semana a 2-8°C e 2 meses a -20°C.
l O suplemento Mh mantém-se estável durante 3 meses após abertura
8 - M ATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
l Material para colheitas (escovilhões, escovas de citologia, frascos esterilizados para recolha das amostras líquidas)
l Pipetas e pontas
l Recipiente para resíduos contaminados
l Congelador a -20ºC
l Óleo de parafina
l Estufa calibrada a 37°C ± 1°C
9 - MÉTODO
E s t ab i l i z ar o s r e ag e n t e s à t e m pe r a t u r a a m b i e n t e d u r an t e 2 0 a 3 0 m i n u t o s .
9.1 Rast r ei o
P a r a a s a m o s t r a s l í q u i d a s , r e c o m e n d a - s e q u e n ã o s e j a r e a l i z a d a a e t a p a d e r a s t r ei o e q u e s e p r o c e d a di r e c t a m e n t e à q u a n t i f i c a ç ã o e à i d en t i f i c a ç ã o
com a galeria MYCOFAST E vo l ut i o N 2.
9 . 1 . 1 I no c ul aç ã o do m ei o U M M
l Depositar o escovilhão ou 200 µl de amostra líquida homogeneizada num tubo contendo meio UMM (§7).
l Proceder imediatamente à inoculação da galeria de rastreio.
N o t a : O m e i o d e c u l t u r a U M M e m e x c e s s o d e v e s e r c o n s e r v a d o n o s e u f r a s c o i n i c i a l à t e m p e r a t u r a d e 2- 8 ° C d u r a n t e u m p e r í o d o m á x i m o d e 4 8 h o r a s .
9 . 1 . 2 I n o c u l a ç ã o e i nc u b a ç ã o d a ga l e r i a d e r a s t r e i o
l Retirar o filme adesivo
l Adicionar 100 µl de meio UMM inoculado num poço da galeria de rastreio. Conservar o tubo a 2-8°C.
l Adicionar 2 gotas de óleo de parafina e voltar a colocar o filme adesivo sobre os poços.
l Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 horas.
Nota: Para a detecção de Mycoplasma hominis incubar durante 48 horas, se necessário.
9 . 1 . 3 L e i t u r a e i n t e r p r et a ç ão d a g a l e r i a d e r a s t r e i o
l Verificar se o conteúdo do poço se apresenta límpido. Se o meio se tornar turvo o teste não poderá ser interpretado.
lOs resultados são lidos em função da cor do meio:
Em presença de crescimento de micoplasmas urogenitais, o meio passa a vermelho.
Na ausência de crescimento de micoplasmas urogenitais, o meio mantém-se amarelo.
Prosseguir o diagnóstico em caso de detecção de de micoplasmas.
9.2 Qua nti f i cação, id ent if i cação e t est e de r esi st ênci a a ant i mi cr obi anos
9.2. 1 I noculação da galeria MYCOFAST E vo l u t i oN 2
l Utilizar o tubo conservado a 2-8°C, correspondente à amostra positiva, e equilibrar à temperatura ambiente.
l Identificar a galeria MYCOFAST EvolutioN 2.
l Retirar o filme adesivo e distribuir sucessivamente nos poços:
poços 1-10
100 µl de meio UMM inoculado
poços 9-10
2 gotas de suplemento S.Mh
poços 1-10
2 gotas de óleo de parafina
l Cobrir a galeria com filme adesivo.
9 . 2 . 2 I n c ub a ç ão d a g a l er i a
Incubar a galeria a 37°C ± 1°C durante 24 horas.
Para a quantificação de U.u e M.h proceder à leitura dos resultados em 24 horas. Se necessário deixar incubar 24 horas suplementares para permitir que as
estirpes de fraca actividade enzimática possam ser detectadas.
Nota: A incubação pode ser prolongada até 72 horas, para as amostras de tipo urina, esperma e suco gástrico, se necessário.
10 - LEITURA E INTERPRETAÇÃO
10.1 Va li daçã o
Verificar se todos os poços da galeria se apresentam límpidos. Um poço turvo indica uma contaminação bacteriana. Neste caso é necessário repetir a análise.
10.2 L eit ur a e int er pr et ação
A leitura dos resultados resume-se à identificação das colorações obtidas nos diferentes poços da galeria.
O crescimento de micoplasmas urogenitais nos poços traduz-se numa alcalinização do meio, que passa a vermelho. Na ausência de crescimento de micoplasmas urogenitais, o meio mantém-se amarelo.
Nota: Uma coloração alaranjada deve ser considerada como teste positivo (taxa limite).
1 0. 2. 1 I de n t i f i c aç ã o ( po ç os 7 , 8 e 9 )
A identificação efectua-se em função da mudança de cor dos poços específicos de quantificação, bem como da leitura dos poços 7, 8 e 9 para a determinação
do perfil dentibiotique® :
C or dos p oços #
7 ( L)
8 (SXT)
9 (E)
U re a p l a s m a
u r e a ly t i c u m
M yco pl asm a
hom ini s
vermelho
vermelho
amarelo
amarelo
vermelho
vermelho
1 0. 2 . 2 Q ua n t i f i c aç ão ( p oç os 1 , 2 , 3 e 1 0)
Identificar os poços que passaram a vermelho e interpretar :
p a s sa g e m a ve r m e l h o
do s po ço s #
I nt er p r e t a ç ão ( U C C / m l )
1
1e2
1, 2 e 3
10
taxa U.u. de 103
taxa U.u. de 104
taxa U.u. > 105
taxa M.h. > 104
N o ta s
l A quantificação de micoplasmas urogenitais foi validada nas amostras onde eles possam estar presentes em estado comensal (cervico-vaginais e uretrais).
l A demonstração de U. urealyticum e de M. hominis a partir de colheitas normais estéreis, qualquer que seja o nível, é significativa (5).
l No caso do homem, o critério de interpretação é a concentração de U. urealyticum é >104 UCC/ml para uma colheita uretral; no caso da mulher,
o critério de interpretação é a concentração de M. hominis é > 104 UCC/ml para uma colheita cervico-vaginal (5).
l A concentração usualmente citada de U. urealyticum para uma amostra de 1° jacto de urina, esperma ou amostra endotraqueal é de >103 UCC/ml (5).
10.2.3 Teste de r esistência (poços 4, 5 e 6)
Pe rf i l de resi stê ncia: A passagem do meio a vermelho, nos poços que contenham um antibiótico, traduz a capacidade da estirpe em se desenvolver em
presença do antibiótico a uma dada concentração presente no poço.
Pe rfi l de sen sib il i dade : A cor amarela do meio traduz a incapacidade da estirpe em se desenvolver em presença do antibiótico a uma dada concentração
presente no poço.
N o ta s
l Os poços reservados ao teste de resistência não contêm suplemento S.Mh. Em caso de positividade em Mycoplasma hominis, a leitura e a interpretação do
perfil de resistência devem ser efectuadas após 48 horas de incubação.
l Dado que o inoculado não está padronizado, os resultados da quantificação devem ser tidos em conta para a interpretação do teste de resistência aos
antibióticos (§13).
11 - CASOS PARTICULARES
Taxas muito elevadas de U. u e de M.h
Regista-se uma passagem a vermelho de todos os poços da galeria. Neste caso, recomenda-se proceder a uma diluição da amostra, a fim de se obter um
resultado mais específico, da seguinte forma:
l Inocular um novo frasco de meio UMM com 200 µl do meio UMM original conservado a 2-8°C. Verificar a ausência de mudança de cor do meio, ao retirar do
frigorífico.
l Inocular uma nova galeria com o meio obtido (§ 9.2.1)
l Ter em conta a diluição (1:10) para a interpretação da quantificação.
l Se necessário, proceder à confirmação da presença de micoplasmas em gelose A7, isolando de novo a partir do meio UMM inoculado, conservado a 2-8°C
(ver § 9.2).
12 - CONTROLO DE QUALIDADE
O controlo de qualidade pode ser realizado a partir de uma estirpe de referência liofilizada (Ureaplasma urealyticum ATCC 27618).
Efectuar uma pré-cultura após inoculação de 100µl da estirpe regenerada, num frasco de meio UMM reconstituído (UMMt+UMMlyo).
Incubar a 37°C ± 1°C durante 6 horas.
Inocular um novo caldo UMM reconstituído com 200µl da pré-cultura homogeneizada.
Inocular a galeria MYCOFAST® Evolution 2 e prosseguir o teste como indicado neste folheto de instruções (§9.2, 9.3 e 10).
R e s u l ta d o e s p e r a d o :
103
104
>105
D
ROX
OFX
L
SXT
E
>104
+
+
+
+
Nota: No caso de uma estirpe liofilizada com baixa actividade ureásica, a incubação pode prosseguir até 18-24 horas. O caldo será inoculado com 20 µl de précultura.
13 - LIMITES DO PROCEDIMENTO
l Algumas bactérias, presentes em quantidade >106-7 UFC/ml e que possuem urease, podem fazer mudar de cor todos os poços da galeria. A sua presença
pode ser verificada isolando de novo em gelose chocolate, a partir do meio UMM original, conservado a 2-8°C (ver § 9.2).
l Um pH básico da amostra (pH > 8) pode fazer mudar de cor o meio UMM. Neste caso, diluir a amostra (1:10) num meio UMM fresco e interpretar os
resultados, tendo em conta a diluição.
l Tal como em qualquer método de detecção de microorganismos, a qualidade da amostra condiciona o resultado do teste. Um teste negativo poderá assim
não traduzir forçosamente uma ausência de infecção.
l O teste de resistência é realizado a partir da amostra, pelo que fornece apenas uma estimativa da resistência em relação às 3 classes de antibióticos. O
resultado deve ser apreciado em função da quantificação da espécie detectada (taxa recomendada: 104-5 UCC/ml).
l Uma amostra com fraco teor de micoplasmas (<103 UCC/ml) pode dar origem a uma mudança de cor aleatória nos diferentes poços da galeria.
l A inoculação da galeria a partir do inóculo conservado a 2-8°C durante a fase de rastreio pode provocar uma perda em detecção e em
quantificação, relativamente ao método directo.
14 - DESEMPENHO
O desempenho do método MYCOFAST foi avaliado relativamente a uma cultura em A7, utilizando amostras clínicas. Os resultados de identificação estão resumidos no quadro seguinte :
AMOSTRAS
Ur et r ai s
Va gi na i s
Es p e r ma
U r in a
n=
100
150
150
P r e v a lê n c i a
52%
13,3%
16%
S e n s i b il i d a d e
88%
86,4%
98,2%
E spe ci f i ci dad e
100%
98,4%
98,4%
O método MYCOFAST foi igualmente validado para detecção e identificação em amostras de secreções gástricas de recém-nascidos (n=208, prevalência
19,2%) e em paralelo em amostras cervico-vaginais da mãe (n=208, prevalência 48,1%). Todas as estirpes de micoplasmas presentes na gelose A7 foram
detectadas pelo método MYCOFAST (4).
15 - ELIMINAÇÃO DOS RESÍDUOS
Os resíduos devem ser eliminados em conformidade com as regras de higiene e a regulamentação em vigor para este tipo de reagentes, nos países onde são
utilizados.
16 - B I B L I O G R A F I A
1. BEBEAR C., DE BARBEYRAC B. 1994. Les mycoplasmes, p. 1443-1463. Dans FRENEY J., RENAUD F. , HANSEN W. , BOLLET C. (éd.).“Manuel de bactériologie clinique”, 2ème éd., vol.3, Elsevier, Paris .
2. BOUCAUD-MAITRE Y. et THOINET S. 1993. Analyse des prélèvements en bactériologie médicale - 2ème partie : prélèvements génitaux. Feuil. Biol., 34 : 21-24.
3. GENIAUX M. 1994. Microbiologie des MST chez les mineurs de moins de 15 ans. Méd Mal Infect. 24:409-424.
4. GRATTARD F., SOLEIHAC B., DE BARBEYRAC B., BEBEAR C., SEFFERT P. and POZZETTO B. 1995. Epidemiologic and molecular investigations of
genital mycoplasmas from women and neonates at delivery. Pediatr. Infect. Dis. J. , 14 : 853-858.
5. PEREYRE S., BEBEAR C.M., BEBEAR C. 2001. Les mycoplasmes en pathologie humaine. Revue Française des Laboratoires. Supplément au N°3329, 34-36.
6. TAYLOR-ROBINSON D. 1995. Ureaplasma urealyticum (T-strain Mycoplasma) and Mycoplasma hominis, p. 1713-1718. Dans MANDELL G. L. , BENNET J.
E. and DOLIN R. (ed.). Principles and Practices of Infectious Diseases, 4th ed., vol. 2, Churchill Livingstone, New York.
MYCOFAST® é uma marca registada da ELITech France SAS
Local de fabrico :
ELITech France
Parc d’activités
Allée d’Athènes
83870 SIGNES
(FRANCE)
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305, allée de Craponne
13300 SALON DE PROVENCE
(FRANCE)
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