LABORATORIO No 10 VECTORES DE CLONACION

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
LABORATORIO No 10: VECTORES DE CLONACIÓN
1. INTRODUCCIÓN
Los vectores de clonación en general son capaces de albergar trozos extras de
ADN, por lo que se abre la posibilidad de poner una secuencia de ADN
determinada. En estas circunstancias el vector, en nuestro caso un plásmido,
puede generar resistencia a un determinado antibiótico, haciendo que las células a
las cuales se introduzca (transformantes) también sean resistentes a dicho
antibiótico. Esta característica es utilizada para seleccionar bacterias que
contengan plásmidos frente a otras que no los contengan. Así el plásmido está
funcionando como un “vector”: es capaz de llevar el trozo de ADN (que se
denomina inserto) manteniéndolo mediante la replicación, ya que posee un origen
de replicación.
2. OBJETIVOS
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Identificar la función y ventajas del proceso de clonación de ADN a través
de vectores.
Conocer y diferenciar claramente los diferentes tipos de vectores de
clonación y sus usos específicos según el objetivo experimental.
Adquirir la habilidad para realizar el proceso de clonación y transformación
celular con vectores de clonación.
3. MARCO TEÓRICO
El ADN es el material genético que define las propiedades de cualquier ser vivo, y
en la medida en que lo alteremos podremos modificar sus características.
Teniendo en cuenta esto se han dado grandes avances en la modificación del
ADN, ya que se cuenta con amplio número de enzimas de restricción capaces de
formar fragmentos de ADN de cualquier organismo y después podemos volver a
ligarlo a nuestra voluntad con otras enzimas. A esta metodología se le llama
Ingeniería Genética, la cual puede definirse como la manipulación deliberada de
genes dentro de especies o entre ellas para realizar un análisis genético o el
mejoramiento de cepas. Dentro de esta ciencia encontramos la tecnología de ADN
recombinante, la cual incluye un rearreglo in vitro del material genético gracias a
la manipulación enzimática, estos rearreglos producen una molécula compuesta
de mínimo dos piezas diferentes de ADN. Estos rearreglos serían insignificantes si
no se introducen en un receptor biológico donde se mantengan y multiplique
indefinidamente. Para poder realizar este tipo de experimentos se requiere de:
1. ADN de interés o blanco. Fragmento de ADN que queremos analizar y que va
a insertarse en el vehículo de clonación. Éste debe ser cortado con la misma
endonucleasa de restricción con la que se corta el vector de clonación.
2. Un vehículo de clonación. Son fundamentales ya que el ADN por sí solo no
puede replicarse, por tanto se requiere de un segmento de ADN capaz de esta
función para lograr la replicación del ADN deseado. Los principales vehículos
de clonación son bacteriófagos, virus y plásmidos. Los plásmidos son círculos
pequeños de ADN bicatenario, capaces de replicarse en bacterias
independientemente del cromosoma bacteriano. Para diseñar un vector debe
contarse con los siguientes criterios:
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• Deben estar caracterizados con respecto a la localización de los genes,
secuencia nucleotídica y sitios de restricción.
• Debe propagarse fácilmente en el receptor deseado, con el fin de obtener
grandes cantidades de moléculas recombinantes.
• Debe contar con un marcador de selección, por ejemplo un gen, que permita
distinguir entre las células transformadas de las que no lo han sido.
• Debe contar con un marcador genético adicional que pueda inactivarse con la
inserción del segmento de ADN, lo cual ayudará igualmente a distinguir las
células transformadas y las que no lo son.
• El vector debe tener el mayor número posible de sitios de restricción,
localizados en uno u otro de los marcadores genéticos; esto con el fin de dar
mayor flexibilidad a la clonación de tipos distintos de fragmentos de ADN.
3. Enzima de restricción. Son utilizadas para obtener el fragmento que deseamos
clonar mediante el corte en sitios específicos del ADN; igualmente se utilizan
para cortar el vehículo de clonación en este caso el plásmido. Muchas de las
enzimas de restricción producen cortes en las dos hélices, cuatro pares de
bases. Así los fragmentos resultantes del ADN tendrán extremos de hélice
sencilla que son complementarios, razón por la cual los extremos del plásmido
y del fragmento de ADN pueden solaparse, dando como resultado una
molécula recombinante. Son conocidas como tal la EcoR1, Hind III, Sma I,
entre otras.
4. Enzima ligasa del ADN. Las moléculas recombinantes solo quedan unidas
covalentemente cuando son incubadas en presencia de la enzima DNA ligasa.
5. Una célula huésped, ya sea eucarióticas o procarióticas. Es la célula donde va
a introducirse la molécula recombinante para su replicación.
el metabolismo de la lactosa. El gen lacY codifica la B-galactósido permeasa,
una proteína de unión a la membrana que se encarga de transportar los Bgalactósidos al interior de la célula. El gen lacA codifica la B-galactósido
transacetilasa, la cual transfiere un grupo acetilo del Acetil-CoA a los Bgalactósidos.
Los vectores que contienen el gen lacZ son capaces de sintetizar la enzima Bgalactosidasa a pesar de que puede suceder una variación en un pequeño
número de aminoácidos del fragmento amino-terminal de la enzima. Las
células hospederas para estos vectores por lo general son aquellas que
codifican la porción carboxilo-terminal de la B-galactosidasa. A pesar de que ni
el fragmento sintetizado por la célula huésped ni el sintetizado por el plásmidos
son activos por sí solos, éstos tienen la capacidad de asociarse para formar
una proteína enzimáticamente activa, y a esto es lo que se le conoce como acomplementación.
Cuando el vector contiene un fragmento de DNA en el sitio de policlonación del
gen lacZ, se produce una forma amino-terminal de la B-galactosidasa incapaz
de realizar la a-complementación.
Para reconocer aquellas células que llevan el plásmido recombinante se induce
la síntesis del fragmento amino-terminal de la B-galactosidasa mediante la
adición al medio de isopropiltio-B-D-galactósido (IPTG) y se enfrentan las
células al sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-Dgalactósido). Si se lleva a cabo la a-complementación las células bacterianas
crecerán como colonias azules; si no son capaces de realizar dicha
complementación debido a la presencia de ADN foráneo, crecerán como
colonias blancas.
PRODUCCIÓN DE INSULINA POR INGENIERÍA GENÉTICA
Uno de los ejemplos más claros de la utilidad de la ingeniería genética es la
producción de hormonas de interés para el hombre, como lo es la Insulina para los
pacientes con diabetes mellitus que son incapaces de producir insulina para la
asimilación de la glucosa. Dado que se conoce la secuencia nucleotídica de las
cadenas A y B que conforman la insulina, se pudieron diseñar dos fragmentos de
DNA sintético que codifican los 21 aminoácidos de la cadena A y los 30 de la
cadena B. Estos genes son fácilmente clonables en el vector pBR322, que tiene
sitios específicos de corte para las enzimas EcoR1 y BamH1 formando así
extremos cohesivos y complementarios a los genes sintéticos. Al insertar las
secuencias sintéticas en el plásmido se inactiva el gen de resistencia a la
tetraciclina, de esta manera las células transformantes presentan un fenotipo
tetraciclina-sensible, y ampicilina-resistente.
Debido a que el plásmido híbrido no contiene un promotor adecuado para ser
reconocido por la ARN polimerasa para poder transcribirse a ARN mensajero, y
posteriormente ser traducido en proteína, es necesario colocar un fragmento de
ADN que contenga un promotor de E. coli antes de la secuencia nucleotídica de
los genes sintéticos.
Muchas veces cuando las proteínas que desean obtenerse son muy pequeñas son
fácilmente degradadas por la E. coli y por tanto no se expresan a pesar de que
poseen el plásmido híbrido. Para evitar esto, puede obtenerse una proteína más
estable utilizando lo que se conoce como fusión de genes. Este método se realiza
uniendo las cadenas A y B de la Insulina con una proteína que la bacteria no
reconozca como extraña y por tanto no sea degradada; una de las proteínas más
estudiadas es la que produce el operón lacZYA, que se encarga de codificar para
la B-galactosidasa, una permeasa un transacetilasa de la lactosa.
La enzima EcoR1 reconoce dos sitios en el operón de la lactosa, el primero entre
el gen i que es un represor y la región P que es el promotor, y el segundo sitio se
encuentra a 3009 pb después del codón de iniciación de la B-galactosidasa. Al
obtener este fragmento podemos clonarlo fácilmente en los plásmidos derivados
de pBR322 que contienen cada uno la secuencia que codifica para una de las
cadenas de la insulina; al realizar la clonación de este fragmento de ADN la
orientación que este debe tener es aquella en que el promotor del operón se
encuentre en el extremo distal con respecto al ADN de las cadenas de insulina,
esto se realiza mediante la caracterización de los plásmidos con las enzimas de
restricción.
Estas moléculas resultarán en un gen híbrido el cual tienen información para
codificar casi toda la B-galactosidasa y para codificar las cadenas de la insulina,
ya sea A o B. Al traducir la información del gen se obtendrá una proteína que
constará de casi toda la B-galactosidasa y una de las cadenas de la insulina unida
a la porción carboxilo-terminal de la B-galactosidasa en dos aminoácidos y hay un
residuo de metionina entre las dos secuencias. La proteína híbrida no tiene
actividad enzimática sobre la lactosa y es insoluble en agua, contrario a la Bgalactosidasa nativa que es soluble en agua.
Para obtener la cadena de la insulina debe extraerse la proteína híbrida de la
célula hospedadora y tratarla con bromuro de cianógeno, el cual, corta las
proteínas en los residuos de metionina, y como ninguna de las cadenas de la
insulina contienen metioninas, éstas no serán cribadas, obteniendo de este modo
la cadena completamente libre. Al obtener cada una de las cadenas, se deben
purificar y unir entre sí a través de puentes disulfuro, mediante la oxidación
regulada de sus derivados sulfonados. Existe la posibilidad de que las cadenas se
unan entre sí inespecíficamente, por ello deben seleccionarse solo aquellas
moléculas que presenten la estructura tridimensional adecuada, ya que sólo éstas
son biológicamente activas.
4. PRELABORATORIO
1. Mencione y explique las características de todos los vectores de clonación
utilizados en Biología Molecular.
2. ¿Qué es una célula competente y qué métodos se conocen para obtener
células competentes o células transformadas?
3. Realice un diagrama explicando el funcionamiento del reactivo X-gal en el
proceso de selección de colonias recombinantes
4. Cuáles son las diferencias entre plásmido, cósmido, fago, YAC, BAC y un
vector de expresión. En qué casos es más útil e indicado el uso de cada
uno de ellos.
5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS
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Vector de clonación pGEM
Kit de clonación del vector (enzimas ligación, buffer, vector)
Células para transformar cepa JM101 (E. coli) 1 vial 3 ml de cultivo liquido
Médio LB agar com ampicilina(50ug/ml)
Tubos eppendorf de 1,5 ml estériles
Baño serológico a 37º C
Micropipetas
Cubeta de hielo
6. PROCEDIMIENTO
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Colocar en tubo eppendorf de 1.5 ml:
5 µl de plásmido pGEM
5 µl de buffer de ligación
10 µl de DNA a ligar (producto de PCR)
5 µl de enzima ligasa
Incubar esta reacción durante 30 minutos a 37º C en baño serológico.
Tomar 100 µl de cepa JM101 de E. coli y colocar en un tubo eppendorf de 1.5
ml.
Colocar el tubo a 72º C durante 10 minutos.
Adicionar 25µl de la reacción de ligación obtenida con anterioridad.
Colocar inmediatamente el tubo en hielo durante 10 minutos.
Plaquetear 50 µl de la reacción anterior sobre las placas de medio LB al cual
previamente se le ha adicionado 20 µl de ampicilina (50ug/ml), 20 µl de X-gal
(40mg/ml).
Incubar toda la noche las placas a 37º C.
Evidenciar la presencia o no de colonias recombinantes según la coloración
obtenida en ellas.
7. POST-LABORATORIO
1. Explique el fundamento de la clonación, empleando vectores comerciales como
el pGeM de la casa comercial PROMEGA o de INVITROGENE
2. ¿Cómo se clonan productos de PCR?
3. Un vector de clonación, el cual tiene dentro de su secuencia regiones que le
confieren resistencia a la ampicilina y tetraciclina, es cortado con la enzima EcoRI,
la cual corta dentro del gen de resistencia a ampicilina. En este vector cortado se
introduce en el ADN extraño digerido con EcoRI. Según el procedimiento anterior
responda las siguientes preguntas justificando sus respuestas:
a. ¿Qué antibiótico debe añadirse al medio de cultivo cuando el vector se
introduzca en las bacterias transformadas, para seleccionar las que han
incorporado el plásmido de las que no lo han hecho?
b. ¿Qué patrón de resistencia deberá seleccionarse para obtener los plásmidos
que contengan los insertos de interés clonados?
c. ¿Cómo explicaría la presencia de colonias resistentes a ambos antibióticos?
8. BIBLIOGRAFÍA
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Revista Nature Protocolos Años 2009-2013
Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, 2nd
edition. Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Ochoa, Severo et al. 1986 Bioquímica y Biología Celular: Salvat. Barcelona.
David, L.G., Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basics methods in molecular
biology. Eislever Science publishing Co. Ind. NY. 1996.
Catálogos de PROMEGA casa comercial PROMEGA.
9. AUTOEVALUACION
NUMERO DE
LA PRACTICA
LOGRO (Objetivos
cumplidos)
SI
NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS
A CADA DEBILIDAD
ANEXO COMPLEMENTARIO AL LABORATORIO No.10 CONSTRUCCIÓN DE
BIBLIOTECAS GENOMICAS
Una Biblioteca genómica es una colección de clones de vectores que llevan
fragmentos de ADN, diseñada de modo que, mediante un sistema de
selección, pueden llegar a separarse los clones de interés.
Una Biblioteca de ADN podría ser una colección de fagos que contienen una
muestra representativa de fragmentos de un genoma (biblioteca genómica) o
una colección de bacterias que contienen plásmidos en los que se ha clonado
una muestra significativa de los genes que se transcriben en un determinado
tejido. Para obtener una librería debemos tener:
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Un sistema eficiente de clonaje de ADN
Un sistema de selección de los clones
Un sistema para la obtención de una muestra representativa del ADN a
estudiar.
Existen diversos tipos de bibliotecas:
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Bibliotecas genómicas: se crean a partir de ADN genómico de una especie
que se digiere hasta un tamaño suficientemente pequeño para ser clonado
en el vector. La detección se realiza mediante hibridación de sondas.
Bibliotecas de cromosomas específicos: se elabora a partir de ADN de
determinados cromosomas purificados. La detección se realiza igual a la
anterior.
Bibliotecas de ADNc: se realizan a partir de ARNm de un tejido particular.
La detección se realiza mediante hibridación de sondas.
Bibliotecas de expresión: Similar al anterior pero el clonaje se realiza de tal
forma que la bacteria es capaz de transcribir y traducir la proteína
codificada por el fragmento de ADN. La selección se realiza detectando la
proteína ya sea por anticuerpos, o por su actividad.
BIBLIOTECAS GENÓMICAS
Las bibliotecas genómicas requieren de un vector que permita el clonado de
fragmentos relativamente grandes de ADN. Por lo general se usan fagos, pero
también se emplean BACs. Se aísla ADN genómico de la especie de interés y
se realiza una digestión con una enzima de restricción adecuada de manera
que genere fragmentos de tamaño adecuado para el vector seleccionado.
Muchas veces se utilizan digestiones parciales. Esto además permite que los
distintos clones puedan solaparse, permitiendo cubrir la totalidad del genoma.
El ADN digerido se somete a electroforesis, se aíslan los fragmentos del
tamaño adecuado, se ligan en el vector y se realiza su amplificación. De esta
manera se generan colecciones de colonias de bacterias o de fagos
conteniendo un fragmento determinado del genoma. Para seleccionar el que
nos interesa, dichas colonias se transfieren a una membrana sobre la que se
extrae y desnaturaliza el ADN, que se fija a la misma.
Posteriormente la membrana se hibrida con la sonda del gen conocido. Si una
secuencia suficientemente similar se encuentra en algún lugar de la membrana
se producirá una hibridación que podrá ser detectada mediante
autorradiografia, por ejemplo si se trata de sondas marcadas con
radioactividad. Se denomina cribado (screening) al proceso de selección de un
clon que nos interesa de todos los que forman una librería. Una desventaja de
estas Bibliotecas es el gran tamaño de los genomas, por lo que se necesita un
amplio número de clones para cubrirlas en su totalidad. Por otra parte, los
genes contienen intrones que complican el aislamiento de la región codificante.
BIBLIOTECAS DE ADNc
La construcción de una biblioteca de ADNc comienza con la extracción de
ARNm de un determinado tejido u órgano. Este ARN se copia a ADN de
cadena simple mediante la acción de la Transcriptasa Reversa. El híbrido
ADN-ARN es tratado con ARNasaH, que degrada el ARN, y finalmente se
realiza la síntesis de la segunda cadena de ADN. Estos fragmentos se
introducen en un plásmido (lo más usual) y se transforman bacterias.
BIBLIOTECAS DE EXPRESIÓN
Dado que en el caso de los ADNc los fragmentos corresponden a ADNs
codificantes, se han diseñado estrategias en las que la selección no se realiza
por hibridación sino mediante la producción de proteínas codificadas por el
plásmido. En estos casos los vectores se diseñan de tal manera que el ADNc
posee una región promotora procariota en 5’ que dirige la síntesis de ARNm
que, será traducido a proteína. Así, en principio, las colonias de bacteria
producirían la proteína codificada por cada ADNc. La selección puede
realizarse mediante anticuerpos. Otra posibilidad es que el cribado se base en
algún ensayo biológico. En estos casos se habla de librerías de expresión.
BIBLIOTECAS DE SUSTRACCIÓN
Cuando no se necesita una biblioteca completa de ADNc sino que contenga
ciertos ADNc y no otros. Una biblioteca de sustracción es aquella que contiene
ADNc correspondientes a ARNm presentes en un tejido pero no en otro. Por lo
tanto, requiere eliminarse los ARNm presentes en ambos tejidos. Se preparan
biblioteca de ADNc de ambos tejidos. Se prepara un pool de ADN de cada
biblioteca y la del dador se digiere con un enzima que libere los insertos
(EcoRI, por ejemplo) y la sustraída se digiere con AluI o RsaI, generando
fragmentos cortos. Se mezclan ambas poniendo la segunda en un exceso de
50 veces. Se calienta y se dejan renaturalizar lentamente. Los fragmentos
resultantes se clonan en un plásmido en la diana EcoRI.