máster en zootecnia y gestión sostenible

MÁSTER EN ZOOTECNIA Y GESTIÓN SOSTENIBLE: GANADERÍA
ECOLÓGICA E INTEGRADA
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD INTRARRACIAL DE LA RAZA
EQUINA MARISMEÑA Y SU CONTRIBUCIÓN A LA
BIODIVERSIDAD EQUINA ESPAÑOLA
MONTSERRAT PABLO GÓMEZCURSO 2011-2012
Tutora: Dª Amparo Martínez Martínez
Departamento de Genética Animal
El éxito no se logra sólo con cualidades especiales. Es sobre todo
un trabajo de constancia, de método y de organización.
J.P. Sergent.
1 AGRADECIMIENTOS
A Amparo Martínez y Vincenzo Landi, por sus amplios conocimientos, porque son un ejemplo
para mí, por su inestimable apoyo y por hacerme sentir siempre como si estuviera en mi casa.
¡Todos los días aprendo algo de vosotros!
A Juanvi, por despertar en mí una revolución interna que se durmió hace muchos años, y que ha
resurgido con fuerza gracias a su contagioso entusiasmo y saber hacer.
A mis compañeros del Master, por ser eso, verdaderos compañeros de fatigas, por su amistad
sincera y por haberme hecho sentir una más. Habéis hecho que todo esto sea una gozada.
¡Nunca olvidaré los buenos ratos que hemos pasado juntos!
A Jesús, por aguantar mi mal humor, por estar ahí en todo momento, por levantarme el animo
cuando me hizo falta, por ser mi compañero, por permitir que me descuidara de tantos y tantos
asuntos para poder atender todo lo demás…por creer en mí, más que yo misma…por todo lo que
me das todos los días…¡mi deuda contigo es para siempre!
Y a mi pequeño, Jesús…todo este esfuerzo, es por ti, porque, a fin de cuentas, el motor de
nuestras vidas eres TU.
2 INDICE
Cita……………………………………………………………………..………….…………...……….pág. 1
Agradecimientos……………………………………………………………...……………………….pág. 2
Indice…...……………………………………………………………………………………………….pág. 3
Indice de tablas/índice de figuras……………………………………………………………………pág. 4
RESUMEN-ABSTRACT………………………………………………………………………………pág. 5
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………pág. 6
OBJETIVOS…………………………………………………………………...…………….…………pág. 9
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA…………………………………………………………………………pág. 9
Diversidad genética……………………………………………………………………………………pág. 9
Marcadores genéticos como herramienta para estudiar la diversidad genética……………….pág.11
Parámetros estadísticos empleados en los estudios de diversidad genética………...…….…pág. 16
Diversidad genética intra-racial………………………………………………………………...…..pág. 16
Cálculo de frecuencias alélicas……………………………………………………………...……..pág. 16
Análisis de heterocigosis………………………………………………………………...…….……pág. 16
Heterocigosis observada……………………………………………………………...…………….pág. 17
Diversidad genética o heterocigosis esperada……………………………………………………pág. 17
Contenido de Información Polimórfica (PIC)………………………………………...……………pág. 17
Desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg……………………………………….………..…...pág. 18
Estadístico Fis………………………………………………………………………………………..pág. 19
Estructura poblacional………………………………………………………..………….………….pág. 19
Contribución a la diversidad…………………………………………………………………...……pág. 20
MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………...……………pág. 21
RESULTADOS y DISCUSIÓN……………………………………………..……………………….pág. 28
CONCLUSIONES………………………………………………………………...………………….pág. 35
Bibliografía…………………………………………………………………………………..….…….pág. 36
3 Índice de tablas
Tabla 1. Animales de caballo marismeño muestreados…………………………………………pág. 23
Tabla 2. Microsatélites analizados, secuencias, rango de tamaños y referencia
bibliográfica…..........................................................................................................................pág. 26
Tabla 3. Microsatélites analizados, número de alelos por marcador (NA), Riqueza Alélica (RA),
Heterocigosis observada (Ho), Heterocigosis esperada (He), Contenido de Información
Polimórfica (PIC), Coeficiente de Consanguinidad (FIS) y p-value de las desviacones del Equilibrio
Hardy-Weinberg…………………………………………………………………………………...…pág. 29
Tabla 4. Cálculo de la diversidad de Weitzman y pérdida de la diversidad
marginal……………………………………………………………………………………………….pág. 34
Índice de figuras
Figura 1. Secuencia de un microsatélite……………………………………………………..……pág. 13
Figura 2. Representación del polimorfismo de un microsatélite……………...…………...……pág. 13
Figura 3. Esquema del proceso de genotipado: PCR-electroforesis………………..…..……..pág. 14
Figura 4. Esquema del proceso de genotipado: Genotyper………………………………….....pág. 15
Figura 5. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4
poblaciones equinas españolas………………………………………………………………….…pág. 31
Figura 6. Representación gráfica de la composición genética individual de 4 poblaciones equinas
españolas……………………………………………………………………………………………..pág. 32
Figura 7. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4
poblaciones equinas españolas…………………………………………………….………………pág. 33
4 RESUMEN
En la actualidad existe una gran proporción de razas que se encuentran en peligro de extinción,
cuyas perspectivas de futuro dependen del establecimiento de programas de conservación que
deben estar apoyados, entre otros, sobre estudios de diversidad genética.
Este trabajo estudia el estado genético de la raza equina Marismeña, que está en peligro de
extinción, mediante el uso de 25 microsatélites, ya que han demostrado ser la herramienta más
adecuada hasta ahora para detectar la variabilidad genética intra e inter-racial.
Se han realizado análisis estadísticos de los datos con distintas herramientas para valorar la
diversidad intra-racial, la estructura genética de la raza y su contribución a la diversidad equina en
la Península Ibérica. Todos los marcadores utilizados han resultado muy informativos a la hora de
detectar variabilidad genética, y se ha podido hacer una evaluación en cuanto a la aportación que
hace la raza Marismeña a la diversidad. De todos modos, habría que valorar otros factores
(culturales, económicos, ambientales, etc.) antes de plantearse una línea u otra en el momento de
abordar una estrategia de conservación.
ABSTRACT
Nowadays, a great number of local breeds are threatened, and their future depends on
establishing conservation programs which must be supported on studies of genetic diversity.
This paper studies the genetic status of the equine race Marismeña, which is endangered, by the
use of 25 microsatellites, as they have proven to be the most appropriate tool so far to detect the
genetic variability intra and inter-racial.
Statistical analyzes were made of the data with different tools to assess intra-racial diversity, the
genetic structure of race and its contribution to equine diversity in the Iberian Peninsula. All
markers used have been very informative in detecting genetic variability, and has been able to
make an assessment as to the contribution made Marismeño race to diversity. Anyway, we should
evaluate other factors (cultural, economic, environmental, etc.) before considering a line or
another in the time to address a conservation strategy.
5 ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD INTRARRACIAL DE LA RAZA EQUINA
MARISMEÑA Y SU CONTRIBUCIÓN EN LA BIODIVERSIDAD EQUINA
ESPAÑOLA
INTRODUCCION
Se calculan en al menos 75 millones de años los que tiene el fósil más antiguo encontrado de uno
de los antepasados del caballo actual (Simpson, 1951). Al contrario que otras especies animales
que han evolucionado a merced de la selección natural, la domesticación y la concomitante
intervención del hombre en su selección, en un periodo de tiempo relativamente corto, han
influido lo suficiente para que en la actualidad se encuentren tipos raciales distintos que se utilizan
para diferentes actividades.
A finales del siglo XIX se empieza a poner de manifiesto un gran interés en la protección y mejora
de cada una de las principales razas equinas, apareciendo desde entonces, un gran número de
asociaciones de criadores de caballos. El propósito de estas asociaciones es la definición de
modelos raciales teóricos y el diseño de planes de selección animal para conseguir dichos
modelos. Para ello es indispensable la identificación y conocimiento de la genealogía de cada
individuo, así como la valoración y selección de los reproductores. Inicialmente los métodos de
identificación y selección se han basado en unos pocos caracteres morfológicos y funcionales,
pero cada vez es mayor la necesidad de establecer unos parámetros más objetivos y exactos,
que contribuyan no sólo a disminuir los errores y, por qué no decirlo, los fraudes en las
asignaciones de paternidades, sino también a conocer mejor la estructura genética de las
poblaciones.
En la década de los años 60 aparecen nuevas perspectivas con la posibilidad de estudiar unos
marcadores que no han sido objeto de la selección dirigida por el hombre. Estos marcadores son
loci genéticos que presentan al menos dos variantes alélicas detectables. La identificación de los
alelos paterno y materno de un mismo locus en distintos individuos, permite, en muchas
ocasiones, diferenciarlos unos de otros y controlar la filiación de los mismos. Esta variabilidad o
polimorfismo genético se estudia clásicamente mediante métodos inmunológicos (grupos
antigénicos eritrocitarios y leucocitarios) o electroforéticos (proteínas sanguíneas).
Rápidamente comienzan a aparecer, en diferentes países, laboratorios de identificación y control
de paternidad equinos cuyo objetivo es apoyar a las asociaciones de criadores en el control de los
libros de registro de genealogías.
Los marcadores genéticos equinos, proporcionan un medio apropiado para la identificación y
control de filiación de los individuos. También son útiles para el estudio de la diversidad genética
intra-racial y del establecimiento de relaciones genéticas entre razas mediante el cálculo de
distancias genéticas, que podrían permitir en un futuro elaborar programas de conservación de la
biodiversidad. Por el contrario han tenido poca influencia en los métodos de selección de
reproductores, por no haberse podido establecer claramente relaciones directas entre caracteres
de producción y variantes alélicas determinadas.
6 Los métodos de mejora animal se basan en la selección de individuos que transmitan unos
caracteres productivos muy concretos, lo que a medio o largo plazo, implica un aumento de la
consanguinidad y, por lo tanto, una mayor homogeneidad genética de la raza. Este fenómeno
dificulta cada vez más, la identificación de los individuos y el control de su genealogía, por lo que
se hace necesario definir nuevos marcadores que detecten las cada vez menores variaciones
entre los ejemplares de una misma familia, ganadería o grupo racial.
Para la obtención de nuevos marcadores genéticos resulta muy útil abordar el estudio de la
información que poseen las células de un individuo directamente sobre los ácidos nucleicos, y no
sólo su expresión en forma de proteínas. Esto es posible por la simplificación de las técnicas de
investigación del ADN ocurrida a finales de la década de los años 80, que constituye uno de los
avances más significativos en el campo de la Bioquímica y de la Genética.
Los estudios sobre el ADN permitieron descubrir en el genoma humano unas secuencias muy
peculiares que fueron denominadas microsatélites (Litt and Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber and
May, 1989). Se trata de repeticiones en tándem de motivos simples (ejemplo (TG)n donde
10<n<30). La función que tienen, así como su mecanismo de acción, son poco conocidos.
Las razones básicas para la conservación de las razas de caballo doméstico se pueden clasificar
en cuatro:
1.
2.
3.
4.
Razones genéticas
Razones históricas y culturales
Razones científicas
Razones ecológico-ambientales
Dentro del primer grupo de motivaciones, las genéticas, están aquéllas que ven las razas como
una garantía de futuro, de modo que la variabilidad conservada en la actualidad pueda ser útil en
un futuro cuando surjan cambios en el tipo de individuos que se demandan. Hay que tener en
cuenta que gran parte de las razas de caballos actuales han sufrido un proceso largo de
adaptación a muy diversos hábitats, y por tanto su genoma posee una amplia gama de
información que puede ser necesaria para la supervivencia bajo la selección natural y/o artificial
en condiciones muy diferentes.
El segundo tipo de razones, históricas y culturales, han sido ignoradas en numerosas
ocasiones de forma egoísta. Ellas son una de las vías para no olvidar nuestro pasado y de este
modo devolver a la naturaleza lo que ella nos ha brindado durante un largo período de tiempo. En
el caso de los caballos, es difícil desligar la memoria histórica de los movimientos migratorios
humanos asociados a los caballos como medio de transporte. Estos animales forman parte de
nuestro patrimonio natural y cultural, y es justo y necesario tratar de perpetuarlos para
conocimiento de las generaciones futuras. En este sentido, la raza marismeña presenta un
enraizamiento profundo en las costumbres y tradiciones de la zona donde se asientan, el parque
Nacional de Doñana, y su desaparición, sin duda, causaría una gran pérdida a la identidad del
pueblo que la acoge.
El tercer tipo de motivación, es que poblaciones diferentes poseen diferentes variantes genéticas,
si estas variantes desaparecen, la posibilidad del avance científico disminuye.
El cuarto tipo, el ecológico-ambiental, es muy importante y a tener en cuenta, pues el cambio
climático no se avecina, sino que es un hecho ya. Los ecosistemas son el resultado del equilibrio
7 entre flora, fauna y clima, y cualquier factor que afectara cualquiera de estos tres componentes,
estaría atentando contra este precioso equilibrio, deteriorando el medio y la simbiosis ecológica
de la zona (Simon, 1984; Anonymous, 1992).
Con el objetivo de ampliar los conocimientos sobre la diversidad genética de multitud de razas de
diferentes especies se han desarrollado numerosos trabajos basados en el uso de distintas
técnicas, cuyos resultados aportan una información muy valiosa a la hora de plantearse
estrategias de conservación, y que pueden servir de modelo para futuras razas aún sin estudiar,
salvaguardando las diferencias particulares de cada situación.
Para conocer cuales son las expectativas de futuro de muchas razas, es necesario conocer
profundamente cual es su situación actual, siendo éste un trabajo que engloba numerosas
materias, y entre ellas una muy importante, que es su estado genético.Para conocer el
estadogenético de la población del caballo marismeño, se ha desarrollado el trabajo que ahora
mismo nos ocupa.
8 OBJETIVOS
1. Estudio de la diversidad genética intrarracial de la raza equina Marismeña con el objetivo
de conocer los niveles de heterocigosis para la posterior vigilancia de la evolución de los
niveles de consanguinidad en esta población sometida a una estricta gestión genética.
2. Estudio de la posible subestructura de la raza lo que permitirá encaminar las actuaciones
de gestión de una forma racional.
3. Estudio de la contribución de la raza a la biodiversidad equina española.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
DIVERSIDAD GENÉTICA
Las primeras demostraciones de variación genética a nivel molecular fueron realizadas a
principios del siglo XX por Landsteiner en 1901 y por Nuttall en 1904. Estos estudios pioneros
demostraban que los seres humanos mostraban una variación heredable en el sistema ABO de
grupos sanguíneos, y este concepto se aplicó posteriormente en el primer estudio sistemático de
variación genética en diferentes grupos humanos realizado por Hirszfeld y Hirszfeld en 1919
(Cavalli-Sforza et al., 1994). Con el comienzo del uso más extendido de las técnicas de estudio
del polimorfismo de marcadores moleculares en los años 80, gracias a la aparición de técnicas
como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), el número de investigaciones realizadas
directamente sobre la variación de la secuencia del ADN aumentó rápidamente y se popularizaron
este tipo de estudios no solamente en humanos, sino también en animales. Dentro de estos
estudios están los estudios de caracterización genética y de diversidad genética de razas de
animales domésticos.
Según la FAO (Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas), la
biodiversidad es “la variación de la vida en todas sus formas, niveles y combinaciones, incluyendo
la diversidad genética, la diversidad en las especies y la diversidad en los ecosistemas”. La
pérdida de biodiversidad producida durante el último siglo debe ser tenida en cuenta y alertar
tanto a individuos como a instituciones para tomar medidas que eviten que esta pérdida continúe.
Sirva como ejemplo el hecho de que la alimentación de la población mundial se basa sólo en
unas 30 especies vegetales y unas 14 especies animales (aves y mamíferos) y se calcula que el
30% de las razas de mamíferos y aves domésticas están amenazadas (FAO, 2000) La
conservación de la diversidad genética es fundamental para llevar a cabo una gestión sostenible
de los recursos genéticos animales (AnGR).
La diversidad genética del ganado es un valor que condiciona otros muchos como son la
adaptación y la viabilidad de una especie o raza a entornos muy variables y por tanto debe
tenerse en cuenta a la hora de plantear estrategias de conservación. Además, la existencia de
una elevada diversidad genética garantiza el desarrollo de futuras líneas de investigación
9 orientadas a la identificación de genes relacionados con caracteres productivos o con la
resistencia o susceptibilidad a determinadas enfermedades.
Normalmente cuando se plantea desarrollar un programa de conservación, las razas a conservar
presentan escasos censos, nula estructura y son prácticamente desconocidas desde el punto de
vistatécnico-científico. Uno de los primeros pasos sería crear las estructuras necesarias para la
recogida, clasificación y almacenamiento de información referente a las relaciones de parentesco
entre los animales de la población, así como la información productiva y morfológica En este
contexto es de crucial importancia organizar las declaraciones de cubrición y de nacimientos por
parte de los ganaderos y disponer de métodos de contraste de las genealogías declaradas
mediante marcadores microsatélites de ADN. Además pueden realizarse dos tipos de análisis
usando los datos de un estudio sobre poblaciones con marcadores polimórficos autosómicos
como los microsatélites: el cálculo de parámetros de la variación genética intra e interpoblacional
y el análisis de la estratificación y subestructura dentro de poblaciones y grupos de poblaciones.
La raza equina Marismeña se encuentra ubicada dentro de las razas autóctonas en peligro de
extinción, según el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España (Anexo I del Real Decreto
2129/2008, de 26 de diciembre). Su censo global se sitúa alrededor de las 1500 cabezas que,
casi su totalidad, se encuentran integradas en el Libro Genealógico gestionado por la Asociación
Nacional de Criadores de Ganado Marismeño, reconocida como entidad colaboradora de la
Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía a tal efecto. Esta raza tiene una
reconocida importancia social en el entorno de las Marismas del Guadalquivir, ya que entre otros
motivos, es el soporte de una importante fiesta local conocida como “Saca de Yeguas”, que
congrega anualmente a miles de visitantes que desean asistir a las labores de manejo de estos
animales. En este trabajo se presentan los resultados de los estudios genéticos del caballo
Marismeño encaminados a conocer la diversidad genética intra-racial de la raza así como la
diversidad genética entre varias razas equinas y la contribución de la raza equina Marismeña a la
diversidad genética equina española. Estos estudios tienen como objetivo conocer los niveles de
heterocigosis de la raza para observar la evolución de los niveles de consanguinidad en esta
población sometida a una estricta gestión genética. Se estudiará también la posible subestructura
de la raza lo que permitirá encaminar las actuaciones de gestión en años sucesivos. Se hará un
estudio de distancias genéticas con otras razas equinas españolas y foráneas, analizadas
previamente en nuestro laboratorio, y se estudiará la contribución de la raza equina Marismeña a
la biodiversidad equina española con modernas metodologías estadísticas. Con la realización de
estos estudios se pretende obtener un conocimiento básico que facilite la gestión genética de la
raza con el fin de mantener los niveles de heterocigosis en unos niveles aceptables y que no se
produzca un aumento de la consanguinidad o una subdivisión poblacional como resultado de una
inadecuada gestión reproductiva.
10 Marcadores genéticos como herramienta para estudiar la diversidad genética
Los avances técnicos en el análisis de ADN y la eficacia de la metodología han facilitando su
rápida implantación. En la década de los años 60, ciencias como Genética, Bioquímica e
Inmunología, ofrecen la posibilidad de estudiar unas estructuras variables de unos individuos a
otros que no han sido objeto de la selección dirigida por el hombre. Se trata de proteínas que
presentan, al menos, dos variantes detectables. La identificación de las variantes paterna y
materna de una misma proteína en distintos individuos, permite, en muchas ocasiones,
diferenciarlos unos de otros y controlar la filiación de los mismos. A estas proteínas útiles en las
pruebas de identificación se las denomina con el término de marcadores genéticos. Estos
marcadores deben cumplir algunos requisitos:
1. Ser estables a lo largo de la vida de un individuo,
2. Estar controlados por un solo gen o locus genético
3. Las técnicas empleadas para su caracterización deben ser científicamente probadas,
reproducibles y precisas.
La variabilidad o polimorfismo de estos marcadores genéticos se estudia clásicamente sobre
muestras de sangre y mediante métodos inmunológicos (reacciones antígeno-anticuerpo) o
bioquímicos (electroforesis). Ya en esta misma década de los 60 comienzan a aparecer
laboratorios de identificación y control de paternidad en diferentes países. El objetivo de dichos
laboratorios es detectar las variantes presentes en los marcadores de un ejemplar y, a
continuación, comprobar que son compatibles con las que presentan los supuestos progenitores,
apoyando de manera científica a las asociaciones de criadores en el control de los libros de
registro de genealogías. Los estudios de caracterización genética de razas animales domésticos
han proliferado también desde entonces, apareciendo también nuevas metodologías estadísticas
que permite hacer estudios de estructura poblacional, de diferenciación genética y de relaciones
genéticas entre razas a partir de los datos de marcadores moleculares, concretamente
microsatélites.
A partir de los años 80 los estudios del ADN comienzan a ofrecer nuevos y numerosos
marcadores genéticos moleculares que presentan unas posibilidades enormes para realizar
estudios de variación. Estos marcadores genéticos se pueden agrupar según sus características.
A continuación se citan alguno de estos grupos:
Polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLPs). Consiste en realizar una fragmentación
del ADN y una electroforesis para separar los fragmentos generados en función de su tamaño; a
continuación se emplean sondas que se unen a fragmentos determinados y dan lugar a un patrón
de bandas muy característico que se ha denominado clásicamente como huella genética. Aunque
es una técnica eficaz para realizar pruebas de paternidad, su complejidad, su baja repetibilidad y
la necesidad de un ADN en condiciones óptimas, han relegado su empleo a circunstancias
excepcionales dentro del mundo animal.
Polimorfismo del ADN mitocondrial. Se trata del estudio del ADN que se encuentra dentro de las
mitocondrias. Esta técnica es útil solamente cuando se necesitan referencias de la línea materna,
11 pues el espermatozoide no aporta ninguna mitocondria a la célula huevo, por lo que el material
genético que posee la misma siempre procede de la madre (Brown et al., 1997).
SNPs (single nucleotide polymorphisms). Cuando los polimorfismos se originan por la aparición
de mutaciones puntuales, como inserciones o delecciones, en lugares que no afectan a ninguna
diana de restricción conocida, los fragmentos de DNA variantes pasarían inadvertidos con los
sistemas de detección habituales. A estas variaciones se les denomina SNPs (single nucleotide
polymorphisms). Los SNPs son las variaciones más comunes en el genoma humano,
calculándose que existen cada 100-300 pb. Se encuentran en posiciones definidas del genoma
llamadas STS (sequence tagged sites) y se pueden usar para la elaboración de mapas genéticos,
para definir la estructura genética de una población o para realizar estudios funcionales. Pueden
usarse para realizar estudios genéticos a gran escala como determinar el ligamiento entre las
variaciones de una secuencia y los fenotipos heredados. También son una herramienta eficiente
para la identificación genética en aplicaciones legales y forenses. Son muy interesantes como
marcadores genéticos ya que muchas enfermedades conocidas, como por ejemplo la anemia
falciforme en humanos, se produce por mutaciones de una simple base. Algunas ventajas de los
SNPs sobre otros marcadores genéticos son que se presentan en un gran número de
localizaciones, están distribuidos uniformemente por todo el genoma y están en regiones
codificantes, en intrones y en regiones que flanquean los genes, las técnicas empleadas para su
detección son simples y producen patrones de lectura no ambiguos, siguen una herencia
mendeliana, presentan una baja tasa de mutación y una alta heterocigosis en las poblaciones.
Actualmente existe una fuerte corriente internacional hacia la sustitución de los
microsatélites como marcadores de elección para estudios de diversidad genética a favor de los
SNPs. Esto se debe fundamentalmente a algunos inconvenientes que presentan los
microsatélites como son la dificultad técnica del genotipado; dificultad de estandarizar resultados
entre las diferentes tecnologías disponibles para el genotipado, dificultad de estandarizar
resultados entre laboratorios y el hecho que los diferentes estudios publicados están realizados
con diferentes sets de marcadores, lo que dificulta el poder hacer grandes estudios de relaciones
genéticas entre razas.
Polimorfismo de los microsatélites. Estudios sobre el ADN (Litt and Luty, 1989; Tautz,
1989; Weber and May, 1989) permitieron descubrir en el genoma humano unas secuencias muy
peculiares que fueron denominadas microsatélites. Se trata de repeticiones en tándem de motivos
simples (ejemplo [TG]n donde 10<n<30) (Figura 1). La función que tienen así como su
mecanismo de acción son poco conocidos. El interés de emplear los microsatélites como
marcadores genéticos descansa sobre una serie de características que poseen:
1. Son muy frecuentes y están repartidos por todo el ADN y, a menudo, presentando un alto
grado de polimorfismo en cuanto al número de repeticiones de la secuencia.
2. El modelo de herencia es mendeliano y los alelos detectados presentan codominancia.
3. Se necesitan cantidades muy pequeñas de material biológico para la determinación de las
variantes alélicas, incluso aunque el ADN esté bastante degradado, lo que permite el estudio de
muestras muy antiguas.
4. Las técnicas empleadas para la detección de la variabilidad son muy simples en comparación
con otras técnicas de investigación del polimorfismo del ADN.
12 Estas caracte
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de elecciión para conseguir,
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a 1994).
F
Figura
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S
de
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mo de los microsatélites se basa en la variación
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en el núme
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e
ello
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Figura 2.- Repressentación de
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m
tre
es
alelos diferenttes de un mismo
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La variación genética de los microsatélite
es es dete
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aiki et al., 1989) y una
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a es generralmente sangre
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arse tamb
bién pelo y otros tejidos biológ
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c
clásicamen
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A
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a, y la terccera es la fase de elongación
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por
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a. Despuéss de 30-35
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on el incre
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punto, de
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a donde se halla la secuen
ncia con el microssatélite y, mediante
e técnicas de
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a amplifica
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ura 3). Este
e proceso es fácilme
ente autom
matizable y la electro
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ser llevada a cabo mediante
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e empleo de secue
el
enciadoress automátiicos que ofrecen otras
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dicionales para
p
la identificación de las varriantes y su
u procesad
do informá
ático.
13 Los geles obtenidos se analizan con diversos programas informáticos (Genescan Analysis 2.3.2 y
Genotyper 2.5) para denominar a los diferentes alelos según una nomenclatura consensuada
internacionalmente por la International Society on Animal Genetics (ISAG) (Figura 4) mediante
pruebas
de
intercomparación
internacionales
o
Equine
Comparison
Test
(http://www.isag.org.uk/comptest.asp). En los dos últimos años, el Laboratorio Central de
Veterinaria del Ministerio de Medio Ambiente, Medio Rural y Marino de Algete (Madrid) ha
organizado un Test de Intercomparación equino a nivel nacional. El Laboratorio de Genética
Molecular Aplicada y Caracterización participa en estos dos Tests de manera que está
garantizado que el genotipado se realiza siguiendo las normas nacionales e internacionales al
respecto. Como resultado de todo este proceso se obtiene la fórmula genética de cada uno de los
animales analizados.
Figura 3.- Esquema del proceso de genotipado: mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(arriba) se amplifican los alelos de los diferentes individuos y éstos se separan mediante una electroforesis
en gel de poliacrilamida realizada en un secuenciador automático (abajo)
14 Figura 4.- Esquema del proceso de genotipado: Denominación alélica de los fragmentos o alelos
obtenidos utilizando el programa informático Genotyper.
Estas técnicas basadas en la caracterización de variantes de microsatélites han teniendo un gran
empuje por varias razones: 1. El coste económico se compensa por la cantidad de información que se obtiene.
2. Cualquier laboratorio que quiera empezar a llevarlas a cabo sólo necesita una infraestructura
adecuada, no dependiendo de un plantel de animales para realizar las inmunizaciones y
obtención de sueros reactivos.
3. Son más sencillas de desarrollar ya que se emplea siempre el mismo protocolo y equipamiento,
independientemente del marcador que se estudie.
4. Si bien la sangre es el material de elección para obtener el ADN de un individuo, se puede
obtener fácilmente a partir de pelo, leche, semen, huesos y otros tejidos biológicos.
Los resultados obtenidos del análisis del polimorfismo de microsatélites pueden ser tratados
igual que los de otros loci polimórficos cualesquiera con herencia mendeliana codominante. Se
pueden así hacer análisis de poblaciones examinando la variabilidad de una serie de loci intra e
intergrupos, determinando distancia y similitud genéticas, análisis de parentesco y análisis de
ligamiento de los diferentes loci. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que el polimorfismo de
los microsatélites se genera por variaciones en la longitud de estas secuencias, debidas a la
acción de mecanismos como el deslizamiento de la polimerasa de DNA durante las labores de
replicación o el sobrecruzamiento desigual durante la meiosis (Hoelzel and Bancroft, 1992). Se
trata de mecanismos diferentes a los implicados en los procesos usuales de mutación puntual.
Por esta razón, los análisis de poblaciones usando estos marcadores deben ser interpretados con
precaución y, cuando sea posible, compararlos con los análisis efectuados con otros tipos de
caracteres.
15 PARÁMETROS ESTADÍSTICOS EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE
DIVERSIDAD GENÉTICA
Pueden realizarse dos tipos de análisis usando los datos de un estudio sobre poblaciones con
marcadores polimórficos autosómicos: el cálculo de parámetros de la variación genética intra e
inter-racial y el análisis de la estratificación y subestructura dentro de razas y grupos de razas.
Hay que tener en cuenta la importancia del tamaño de la muestra y del número de marcadores
estudiados aunque los conceptos básicos pueden aplicarse a cualquier marcador autosómico
codominante, incluyendo los microsatélites. Los parámetros más comunes derivados de datos de
genotipos son los cálculos de frecuencias alélicas, heterocigosis y distancia genética.
DIVERSIDAD GENÉTICA INTRA-RACIAL
Cálculo de frecuencias alélicas
Una población en sentido genético sería no sólo un grupo de individuos, sino un grupo
reproductivo (Falconer, 1990), de tal forma que la constitución genética de los individuos se
transmite de una generación a la siguiente. Durante dicha transmisión los genotipos de los padres
se disocian y un nuevo grupo de genotipos se constituye en la progenie. Los genes transmitidos
en la población de esta forma tienen continuidad de generación en generación.
Se puede definir la frecuencia alélica o génica como el cociente resultante de dividir el número de
alelos iguales en una población por el número total de alelos. El cálculo de las frecuencias se
hace por recuento directo de los alelos presentes, asumiendo que la observación de un solo alelo
se corresponde con la condición de homocigosis, por lo tanto que no hay alelos nulos. El error
estándar del cálculo de las frecuencias disminuye drásticamente a medida que aumenta el
tamaño de la muestra, pero se acerca a cero asintóticamente a partir de unos 30 individuos. Se
puede considerar, por tanto, que un tamaño óptimo de muestra sería de 30 a 60 individuos.
Análisis de Heterocigosis
Se acepta generalmente que un locus es polimórfico cuando el alelo más común tiene una
frecuencia inferior a 0,95. Una medida de la variación genética es la proporción de loci
polimórficos, o simplemente polimorfismo, en una población. No obstante, dado que no siempre
se utiliza el mismo criterio de polimorfismo, una mejor valoración de la variación genética es la
heterocigosis de la población medida como la frecuencia media de individuos heterocigotos por
locus (Lacadena, 1981).
Los términos heterocigosis y diversidad genética suelen usarse indiscriminadamente en la
bibliografía. Generalmente se usa el término heterocigosis para referirse a heterocigosis
observada (Ho), y el de diversidad genética para referirse a la heterocigosis esperada He).
16 Heterocigosis observada
Es la proporción de individuos heterozigotos observada en una muestra de la población. Si se
calcula directamente a partir de los genotipos encontrados en la población para todos los loci se
trataría de la heterocigosis media observada ( H ). Puede revelar episodios pasados de
consanguinidad o de "cuello de botella" en la población si se estudia estratificando la población en
el tiempo. La exactitud del cálculo de la heterocigosis media depende igualmente del tamaño de
la muestra y del número de loci estudiados.
Diversidad genética o Heterocigosis esperada
La heterocigosis esperada ( H e) o diversidad genética de un locus se calcula (Nei, 1973):
k
He = 1 − ∑ xi 2
xi: frecuencia del alelo i y k: número de alelos
i=1
Este estadístico es equivalente a la heterocigosis observada sólo en el caso de poblaciones en
completo equilibrio.
La heterocigosis esperada corregida o no sesgada se calcula para cada combinación
locus/población mediante la siguiente ecuación (Nei and Roychoudhury, 1974):
k
⎛
⎞
2 n ⎜⎜ 1 − ∑ x 2i ⎟⎟
⎝
⎠
i =1
He =
( 2 n − 1)
Nei y col. demostraron que el error estándar de la diversidad genética es menor cuando aumenta
el número de loci empleados y que el tamaño de la muestra es menos crítico.
Contenido de Información Polimórfica (PIC)
El contenido de información polimórfica (PIC) es un parámetro introducido por Botstein y col. en
1980, como un indicador de la calidad de un marcador en estudios de cartografía génica. En los
últimos años se ha popularizado su cálculo a fin de obtener una valoración de la calidad de un
marcador para estudios genéticos (de segregación, de identificación y control de paternidad, de
población) pues refleja el polimorfismo detectado. No obstante, dada su dependencia del número
de alelos y de sus frecuencias, la información que aporta no es suficiente para basar en ella la
elección de un marcador u otro (Moazami-Goudarzi et al., 1994).
Se calcula mediante la fórmula:
⎛ k 2 ⎞ k −1 k
⎜
PIC = 1− ⎜ ∑ xi ⎟⎟ − ∑ ∑ 2x i2 x 2j
⎝ i=1 ⎠ i =1 j= i +1
17 Desviaciones del Equilibrio Hardy-Weinberg
La ley de Hardy-Weinberg fue enunciada por Hardy y Weinberg independientemente en 1908 y
dice que en una población grande bajo apareamiento aleatorio, sin selección, mutación o
migración, las frecuencias alélicas y genotípicas permanecen constantes de generación en
generación. Una forma clásica de comprobación del equilibrio se basa en la comparación de los
genotipos observados con los esperados dentro de una muestra. Este sistema es adecuado para
polimorfismos que se caracterizan por tener pocos alelos, como es el caso de las proteínas. Pero
en el caso de los microsatélites, que poseen gran número de alelos, el número de genotipos es
tan elevado que algunas frecuencias genotípicas son cero, sobre todo cuando las frecuencias
alélicas son muy bajas. Este fenómeno es una de las limitaciones de la prueba χ2 para probar el
equilibrio.
Una población diploide se considera que está en equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) para un locus
genético polimórfico si la proporción de genotipos observados en la población puede ser
completamente definida por las frecuencias alélicas del locus en cuestión. En otras palabras, los
alelos del locus están distribuidos al azar en la población y no existe asociación entre el par de
alelos que un hijo recibe de sus padres. Las desviaciones del HWE pueden producirse debido a
varios factores como son:
•
Los apareamientos no se producen al azar
•
Existen subdivisiones dentro de la población (Principio de Wahlund)
•
Coancestros, antepasados comunes
•
Selección natural (ventaja de los heterocigotos)
•
Migración o flujo de genes desde una población externa
•
Diferencias sexo-específicas en las frecuencias alélicas
•
Técnica de muestreo incorrecta
•
Presencia de alelos nulos no detectables experimentalmente
En un estudio sobre variación genética debe determinarse si hay desviaciones significativas del
HWE en los loci estudiados. Si la proporción de genotipos para un locus no está en HWE en
algunas poblaciones, puede sospecharse que ha habido una selección que afecte a dicho locus o
la existencia de alelos nulos. Al contrario, si una población se desvía significativamente del HWE
para un número independiente de loci puede deberse a que dentro de la población existen
subdivisiones, a que existe migración o flujo de genes desde una fuente externa o se están
produciendo apareamientos dirigidos (no aleatorios) (Callen et al., 1993).
La diferencia entre la heterocigosis observada y la heterocigosis esperada calculada a partir de
las frecuencias alélicas bajo la asunción de equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) puede usarse como
un método muy básico para detectar perturbaciones en la estructura de una población. No
18 obstante, un método mucho más exacto es comparar la distribución de genotipos observados con
la distribución esperada si la población estuviera en HWE. Cualquier desviación significativa
indicará que la población está subdividida, que existe una consanguinidad significativa o que
existe un flujo de genes de otra población. Estas circunstancias pueden ser estudiadas usando
tests exactos o procedimientos de proporción de verosimilitud. Estos análisis se requieren debido
al gran número de alelos de los loci microsatélite y por tanto el elevado número de posibles
genotipos. Con este fin pueden usarse aplicaciones informáticas que realizan la enorme cantidad
de cálculos que las probabilidades exactas requieren.
Estadístico FIS
Wright (1969) introdujo un método para partir el coeficiente de endogamia en una población
subdividida (FIT) entre el componente debido a apareamientos no aleatorios dentro de
poblaciones (FIS) y la subdivisión entre poblaciones (FST). Así, la endogamia total tendría un
componente generado por la cruza entre parientes dentro de una población (FIS) y otro por el
balance entre deriva génica y flujo (FST). La definición original de Wright se basaba en el
coeficiente de endogamia. Así, los estadísticos F pueden ser vistos como la correlación entre
genes homólogos tomados de un nivel de la subdivisión en relación con cualquier otro nivel
superior: la correlación entre los genes de los individuos (I) y los de la población total (T) es
representada por FIT, que corresponde a la endogamia total. La correlación entre los genes de los
individuos y los de la subpoblación (S) es representada por FIS, mientras que la correlación entre
los genes de la subpoblación y los de la población total está representada por FST(Excoffier et al.,
1992), que es igual a la probabilidad de que dos alelos idénticos por descendencia (identical by
descent) se combinen en un cigoto, o autocigosis. Cuando se estudia la diversidad genética de
una raza, como en este caso el Caballo Marismeño, sólo se determina el estadístico FISque da
una idea la de consanguinidad de la raza y si esta se desvía significativamente de Equilibrio
Hardy-Weinberg.
ESTRUCTURA POBLACIONAL
Para analizar la estructura genética generalmente se parte de una agrupación predefinida
formada por una o más poblaciones, en este caso razas, integradas por un conjunto de
individuos. La estimación de las frecuencias alélicas de una muestra de la población permite
analizar el grado de relación entre diferentes poblaciones y con las herramientas adecuadas
asignar individuos de origen desconocido a una población u otra. Los resultados obtenidos
dependen de la estructura de las poblaciones inicialmente definidas, lo que en ocasiones plantea
ciertas dificultades ya que un individuo se incluye en una u otra población basándose en criterios
geográficos, morfológicos, etc., que pueden no coincidir con criterios genéticos, consiguiendo
separar en poblaciones distintas individuos que en términos genéticos se incluirían en una misma
población o viceversa.
Utilizando información molecular (microsatélites, RFLPs o SNPs) Pritchard y col., (Pritchard et al.,
2000), desarrollaron un método basado en la agrupación de frecuencias alélicas y no en
clasificaciones a priori (razas o variedades) El método basado en un algoritmo bayesiano (Monte
Carlo Markov Chain), asigna cada individuo a partir de un modelo combinado (admixture model),
en el que se permite la mezcla de las poblaciones ancestrales; es decir, una fracción qk del
genoma de un individuo viene de la subpoblación K (∑k qk =1). Por otra parte, (Falush et al.,
19 2003) introdujeron un modelo en el que se acepta ligamiento entre los marcadores, el cual se
incluye en el modelo combinado, para explicar la correlación entre los marcadores ligados. Este
permite la estimación del origen de la región del cromosoma dentro del individuo y proporciona
una mejor resolución en el estudio del proceso histórico de la muestra.
Los supuestos principales de los que se parte son que las frecuencias alélicas están en equilibrio
de ligamiento y que existe equilibrio Hardy-Weinberg dentro de las poblaciones, por tanto, la
similitud del genotipo del individuo i está condicionada por las frecuencias alélicas en su población
de origen (Zi)
El algoritmo de Pritchad y col., (2000), es una herramienta muy poderosa, que permite detectar
clusters y además da una fiabilidad elevada a los resultados. Tiene también la ventaja de que
aunque se desconozca el origen de las poblaciones, de acuerdo a las frecuencias alélicas de los
individuos, asigna estos al cluster correspondiente, a la vez que indica el número de clusters o
poblaciones involucradas en la muestra.
CONTRIBUCIÓN A LA DIVERSIDAD
Como se ha descrito en la sección correspondiente, la medida de la diversidad genética dentro de
razas (intra-racial) utilizando marcadores moleculares se realiza mediante el cálculo de una serie
de parámetros como la heterocigosis, la riqueza alélica o el estadístico FIS entre otros, mientras
que para medir las diferencias genéticas entre razas (diversidad genética inter-racial) se suelen
calcular distancias genéticas entre ellas. La medida de la diversidad genética entre razas
mediante el cálculo de distancias genéticas ha sido criticado por varios autores (Caballero and
Toro, 2002; García and Cañón, 2007) y como consecuencia en los últimos años se han
desarrollado nuevas medidas de la diversidad genética más complejas con el objeto de priorizar
razas para la conservación de una forma objetiva según la contribución de cada una de ellas a la
diversidad genética global. Weitzman propone un método que utiliza distancias genéticas entre
pares de poblaciones para obtener una única medida que tiene la propiedad de que si se añade
una población, la diversidad total es al menos la misma que había antes y si las distancias
genéticas entre las poblaciones aumentan también lo hace la diversidad. La contribución de una
raza a la diversidad total puede conocerse calculando la diversidad total incluyendo y excluyendo
esta raza y comparando los valores de diversidad obtenidos (Weitzman, 1992, 1993). Este
método tiene el inconveniente de que no tiene en cuenta la diversidad genética dentro de razas.
Se han desarrollado otras metodologías para priorizar razas para la conservación en los que se
tiene en cuenta la diversidad genética entre y dentro de razas (Boettcher et al., 2010), aunque no
existe un consenso en cuanto al peso relativo que cada una de ellas debe tener a la hora de
plantear un programa de conservación y muchas veces los resultados obtenidos difieren en
función de la metodología utilizada.
20 MATERIAL Y MÉTODOS
Se han analizado 100 muestras de animales de Caballo Marismeño obtenidas aleatoriamente
(Tabla 1). Todas las muestras proceden de animales inscritos en el Libro Genealógico. Las
muestras de pelo se han recogido en sobres de papel perfectamente identificados con los datos
de cada animal (número de microchip, año de nacimiento, sexo y ganadería a la que pertenecen)
y se han mantenido a temperatura ambiente hasta su envío al laboratorio. Las muestras de pelo
se han recibido en el Laboratorio de Genética Molecular Aplicada y Caracterización de la
Universidad de Córdoba y una vez allí, se les ha asignado a cada una un número de laboratorio.
El ADN se ha extraído de muestras de pelo mediante siguiente método:
1.- Material Empleado:
- TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH=8.
- Tampón K: 0,372 g de KCl, 0,051g de MgCl2, 1 ml de Tris-HCl 1 M (pH=8,5), 0,5 ml de Tween
20 y 98 ml de H2O. Añadir 100 ug/ml de Proteinasa K justo en el momento en que se va a utilizar.
- Muestra de pelo con raíz.
2.- Método:
- Lavar de 3 a 5 pelos con raíz de cada animal con agua bidestilada y después con etanol 100%.
Dejar secar.
- Cortar las raíces de los pelos con unas tijeras esterilizadas con alcohol e introducirlos en
microtubos.
- Añadir 100 μl de tampón K.
- Incubar a 56 ºC durante 45 minutos.
- Elevar la temperatura a 95 ºC e incubar durante 10 minutos.
- Conservar a –20 ºC.
Se han amplificado 25 microsatélites (Tabla 2) mediante la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) realizando tres reacciones multiplex. Hay que señalar que el microsatélite LEX3
está ligado al cromosoma X y no se utiliza en los estudios de diversidad genética. Sin embargo,
se ha dejado en el presente informe puesto que estos mismos animales se han sometido a control
de filiación como paso previo para su inscripción en el Libro Genealógico y por tanto se ha
analizado este marcador en todos los animales. Los fragmentos obtenidos mediante la PCR se
han sometido a una electroforesis en un secuenciador automático ABI377XL (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA) Los 25 microsatélites se han analizado endos geles. El análisis de
losfragmentos y la tipificación alélica se ha realizado mediante los programas informáticos
Genescan Analisys 3.1.2 y Genotyper 2.5 respectivamente utilizando Genescan® 400HD ROX
Size Standard como estándar de tamaños.
21 Diversidad genética intra-racial:
Se ha calculado el numero medio de alelos por locus (MNA) y la riqueza alélica, que corresponde
al mínimo número de alelos basado en un mínimo tamaño de muestra (n=36), mediante el
programa FSTAT (Goudet, 2001). Las frecuencias alélicas, la heterocigosis esperada (He) y
observada (Ho) y el contenido de información polimórfica (PIC) por marcador se han calculado
mediante el programa MICROSATELLITE TOOLKIT software para Excel (Park, 2001). Los
valores de FIS (coeficiente de consanguinidad) con un intervalo de confianza del 95% se han
calculado con el programa informático GENETIX v. 4.02 (Belkhir et al., 2003) y la prueba de
equilibrio Hardy-Weinberg (HW) mediante el programa GENEPOP v. 3.1c (Raymond and
Rousset, 1995), que aplica el test exacto de Fisher usando el método en cadena de Monte Carlo
Markov (Guo and Thompson, 1992).
Estructura genética:
Se ha realizado un análisis de estructura genética de la raza equina Marismeña utilizando
un algoritmo bayesiano del programa de análisis STRUCTURE v 2.1 (Pritchard et al., 2000), que
emplea un modelo basado en método de cadenas Markov de Monte Carlo, que estima la
distribución a posteriori de cada coeficiente de mezcla de cada individuo (q). Las
representaciones gráficas de los resultados del programa Structure se han obtenidos con el
programa DISTRUCT 1.1 (Rosenberg, 2004).
Contribución a la Diversidad
Para este estudio se ha incluido la raza equina Marismeña en un estudio más amplio que
comprende 12 razas equinas, algunas autóctonas de España y algunas razas internacionales. De
esta forma se ha determinado la contribución de la raza equina Marismeña a la diversidad
genética equina global de Iberia.
Mediante el método de Weitzman (1992) se han calculado las contribuciones parciales de
cada raza al total de la diversidad genética utilizado la distancia genética de Reynolds (Reynolds
et al., 1983). Como se comentó anteriormente, este método ha sido criticado por la comunidad
científica puesto que no tiene en cuenta la diversidad genética intra-racial de las poblaciones.
22 Tabla 1.- Animales de Caballo Marismeño muestreados: microchip, sexo, año de nacimiento, ganadería y finca en la que pasta cada
animal.
MICROCHIP
724098100476894
941000002034227
941000001939150
985100009824716
724010260000004
724010260000267
724010260000263
724010260000014
724010260000024
724010260000021
724010260000066
724010260000028
724010260000002
968000003470118
724010260000292
724098100477969
724098100473604
724098100476264
724010260000442
724010260000040
724010260000320
724010260000328
724010260000329
938000000496538
938000000496539
981098100378966
981098100372433
724098100476061
724098100428703
724098100476634
724098100426371
981098100281087
938000000525410
938000000344005
938000000394867
724098100485065
724010260000217
941000002021666
724010260000422
724098100699034
724010260000285
724010260000034
724010260000449
724010260000007
724010260000430
724010260000280
724098100480396
SEXO
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
M
M
M
H
H
H
H
H
H
M
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
M
H
H
H
H
H
H
H
H
H
M
H
H
AÑO
1991
2005
2007
2009
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2009
2008
2009
2004
1997
1992
2010
2010
2010
2010
2010
2008
2008
2001
2006
1996
1991
1998
2000
2006
2009
2008
2009
1993
2010
2006
2010
2000
2010
2010
2010
2010
2010
2010
1993
GANADERÍA
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
MANUEL ANGEL RAMOS RODRIGUEZ
ALFONSO MARTINEZ DE LA TORRE
JOSE CARABALLO LANCHO
JOSE MUNÓZ VILLA
CRISTOBAL ACOSTA VILLA
CRISTOBAL ACOSTA VILLA
CRISTOBAL ACOSTA VILLA
CRISTOBAL ACOSTA VILLA
ANTONIO RAMOS REBOLLO
ANTONIO RAMOS REBOLLO
GREGORIO MARAVER MONDACA
GREGORIO MARAVER MONDACA
ABELARDO CONTRERAS ROLDAN
ABELARDO CONTRERAS ROLDAN
ADAN MARTIN SUSINO
ANTONIO SANCHEZ MESA
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTE
DIEGO ANTONIO MUÑOZ CERRATO
ENRIQUE MARQUEZ GUITART
JOSE MANUEL PEREZ MARTINEZ
JOSE MANUEL PEREZ VILLA
JOSE MANUEL PEREZ VILLA
JOSE GARCIA MARAVER
JUAN JESUS HUELVA VAZQUEZ
JUAN JESUS MOJARRO ARAGON
JUAN JOSE RAMOS RODRIGUEZ
LUIS MAYORGA PI
MANUEL RAMOS HUELVA
SERGIO CORONEL CABRERA
23 FINCA DONDE PASTA
MARISMA DE HINOJOS
RINCON DEL PESCADOR
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
RINCON DEL PESCADOR
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
DEHESILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
MARISMILLA
MARISMILLA
MARISMILLA
MARISMILLA
MARISMILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
DEHESILLA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
PLAYA-VERA
LAS NUEVAS
MARISMA DE HINOJOS
Tabla 1 continuación.- Animales de Caballo Marismeño muestreados: microchip, sexo, año de nacimiento, ganadería y finca en la
que pasta cada animal.
MICROCHIP
10010000724010260000046
968000003475875
724098100481417
724098100484740
10010000724010260000282
10010000724010260000006
10010000724010260000447
981098102311184
10010000724010260000225
10010000724010260000042
724098100474215
968000003479305
724098100472301
938000000361687
724098100455320
724098100484873
968000003475390
985100010337131
941000002004937
968000003491863
724098100476591
724098100461128
724098100457167
941000000151270
941000002170589
985100008188528
10010000724010260000286
941000000732838
941000011756332
941000000896211
968000003473075
938000000413376
938000000372148
941000002426852
724098100480103
724098100474699
938000000500584
724098100459866
10010000724010260000302
10010000724010260000301
10010000724010260000268
10010000724010260000269
10010000724010260000270
10010000724010260000283
10010000724010260000272
10010000724010260000297
10010000724010260000296
SEXO
H
H
H
H
H
H
M
M
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
M
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
M
H
M
M
H
H
H
M
H
AÑO
2010
2007
2002
1989
2010
2010
2010
2008
2010
2010
2001
2008
1998
2008
1992
2000
2007
2001
2007
2008
1992
1998
1997
2005
2008
2002
2010
2003
2010
2003
2008
2006
2008
2007
1996
1997
2009
1996
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
GANADERÍA
FINCA DONDE PASTA
MIGUEL ÁNGEL BARRAGÁN ESPINOSA
FRANCISCO JOSE ESPINAR SOLIS
FRANCISCO JOSE ESPINAR SOLIS
FRANCISCO JOSE ESPINAR ROLDAN
ANA CARACER ARAUZ DE ROBLES
JUAN JOSE MARTINEZ IGLESIA
LUIS MAYORGA PI
LUIS MAYORGA PI
ALFONSO MARAVER GARCIA
SEBASTIAN BERMUDEZ RODRIGUEZ
JOSE MANUEL MILLAN BAÑEZ
FRANCISCO MILLAN CABRERA
FRANCISCO MILLAN CABRERA
JOSE MANUEL MILLAN BAÑEZ
ALFONSO MARTIN BIZCOCHO
ALFONSO MARTIN BIZCOCHO
ALFONSO MARTIN BIZCOCHO
JACINTO LOZANO OJEDA
MANUEL MILLAN CABRERA
CURRO MILLAN DAZA
MANUEL MILLAN CABRERA
MANUEL MILLAN CABRERA
JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO
JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO
JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO
IGNACIO MILLAN LOZANO
JUAN MANUEL MARTOS MARTIN
DIEGO MARTOS MARTIN
JUAN MANUEL MARTOS MARTIN
JUAN MANUEL MARTOS MARTIN
JUAN MANUEL MARTOS MARTIN
JUAN MANUEL MARTOS MARTIN
JUAN MANUEL MARTOS MARTIN
DIEGO MARTOS MARTIN
DIEGO MARTOS MARTIN
FERNANDO MANUEL RODRIGUEZ MARTIN
MANUEL RODRIGUEZ GOMEZ
JUAN MARTOS MARTIN
SERGIO PEREZ RAMOS
ALFONSO MARTIN BIZCOCHO
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
JOSE ANTONIO CABRERA MARTINEZ
ANTONIO DAZA REINOSO
ANTONIO DAZA REINOSO
JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO
JUAN FRANCISCO MILLÁN LOZANO
LA VERA
RINCON DEL PESCADOR
LA VERA
LA VERA
LA VERA
PLAYAS DEL ROCIO
PLAYAS DEL ROCIO
PLAYAS DEL ROCIO
LA VERA
LA VERA
E.T. (MARISMA GALLEGA)
E.T. (MARISMA GALLEGA)
E.T. (MARISMA GALLEGA)
E.T. (MARISMA GALLEGA)
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
LA VERA
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
MARISMA DE HINOJOS
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
LA VERA
MARISMA DE HINOJOS
RINCON DEL PESCADOR
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
LA VERA
LA VERA
PLAYAS DEL ROCIO
MARISMILLA
MARISMILLA
MARISMILLA
PLAYAS DEL ROCIO
MARISMILLA
MARISMILLA
MARISMILLA
PLAYAS DEL ROCIO
MARISMA DE HINOJOS
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYAS DEL ROCIO
LA VERA
LA VERA
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
24 Tabla 1 continuación.- Animales de Caballo Marismeño muestreados: microchip, sexo, año de nacimiento, ganadería y finca en la
que pasta cada animal.
MICROCHIP
10010000724010260000298
10010000724010260000044
10010000724010260000043
10010000724010260000412
10010000724010260000018
10010000724010260000303
SEXO
H
M
H
M
M
H
AÑO
2010
2010
2010
2010
2010
2010
GANADERÍA
MANUEL MILLAN CABRERA
JOAQUIN JIMENEZ CABRERA
FERNANDO J. MEDINA HERVAS
JUAN JOSE TRUJILLO ARBON
FRANCISCO JOSE ESPINAR SOLIS
AGUSTIN ASENSIO QUINTERO
25 FINCA DONDE PASTA
MARISMA DE HINOJOS
PLAYAS DEL ROCIO
LA VERA
MARISMA DE HINOJOS
LA VERA
LA VERA
Tabla 2.- Microsatélites analizados, secuencias de los primers directo y reverso, rango de tamaños en pares
de bases (bp) y referencias bibliográficas.
Microsatélite
Directo y reverso (5´-3´)
(bp)
Referencia
AHT4
AACCGCCTGAGCAAGGAAGT
GCTCCCAGAGAGTTTACCCT
138-170
(Binns et al., 1995)
AHT5
ACGGACACATCCCTGCCTGC
GCAGGCTAAGGGGGCTCAGC
128-156
(Binns et al., 1995)
ASB17
GAGGGCGGTACCTTTGTACC
CACAACTGAGTTCTCTGATAGG
89-131
(Breen et al., 1997)
ASB2
CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG
CACAACTGAGTTCTCTGATAGG
222-256
(Breen et al., 1997)
ASB23
GCAAGGATGAAGAGGGCAGC
CTGGTGGGTTAGATGAGAAGTC
179-213
(Lear et al., 1999)
HMS3
CCAACTCTTTGTCACATAACAAGA
CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT
150-174
(Guerin et al., 1994)
HMS6
GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG
CTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA
153-171
(Guerin et al., 1994)
HMS7
CAGGAAACTCATGTTGATACCATC
TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT
167-191
(Guerin et al., 1994)
HTG10
CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA
TTTTTATTCTGATCTGTCACATTT
89-115
(Marklund et al., 1994)
HTG4
CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC
CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC
127-141
(Ellegren et al., 1992)
LEX3
ACATCTAACCAGTGCTGAGACT
AAGAACTAGAACCTACAACTAGG
194-220
(Shiue et al., 1999)
LEX33
TTTAATCAAAGGATTCAGTTG
TTTCTCTTCAGGTGTCCTC
194-220
(Shiue et al., 1999)
VHL20
CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG
AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG
89-107
(Van Haeringen et al., 1994)
TKY312
AACCTGGGTTTCTGTTGTTG
GATCCTTCTTTTTATGGCTG
90-130
(Tozaki et al., 2001)
TKY301
AATGGTGGCTAATCAATGGG
GTGTATGATGCCCTCATCTC
140-170
(Tozaki et al., 2001)
TKY337
AGCAGGGTTTAATTACCGAG
TAGATGCTAATGCAGCACCAG
170-185
(Tozaki et al., 2001)
26 Tabla 2continuación.- Microsatélites analizados, secuencias de los primers directo y reverso, rango de
tamaños en pares de bases (bp) y referencias bibliográficas.
Microsatélite
Directo y reverso (5´-3´)
(bp)
Referencia
TKY297
GTCTTTTTGTGCCTCGGTG
TCAGGGGACAGTGGCAGCAG
215-250
(Tozaki et al., 2001)
TKY344
GTGTCCATCAATGGATGAAG
CTTAAGGCTAAATAATATCCC
75-115
(Tozaki et al., 2001)
TKY343
TAGTCCCTATTTCTCCTGAG
AAACCCACAGATACTCTAGA
135-170
(Tozaki et al., 2001)
TKY321
TTGTTGGGTTTAGGTATGAAGG
GTGTCAATGTGACTTCAAGAAC
175-210
(Tozaki et al., 2001)
TKY287
ATCAGAGAACACCAAGAAGG
TCTCTGCTATAGGTAAGGTC
215-245
(Tozaki et al., 2001)
TKY333
CCTTCACTAGCCTTCAAATG
TTGTGTTTAGACAGTGCTGC
85-155
(Tozaki et al., 2001)
TKY341
TATCCAGTCACCCATTTTAC
TTGTGTCAGTACACTCTATG
135-160
(Tozaki et al., 2001)
TKY 294
GATCTATGTGCTAGCAAACAC
CTAGTGTTTCAGATAGCCTC
210-235
(Tozaki et al., 2001)
TKY394
GCATCATCGCCTTGAAGTTG
CCTTTCTGGTTGGTATCCCTG
230-260
(Tozaki et al., 2001)
27 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diversidad genética intra-racial
En la tabla 3 se pueden ver los resultados para los 25 microsatélites utilizados. Todos los
microsatélites son muy informativos y han resultado polimórficos, mostrando entre un mínimo de
6, para los microsatélites AHT5, HMS6 y HMS7, y un máximo de 12 alelos en el microsatélite
ASB2. Llama la atención la elevada variabilidad alélica que presentan estos microsatélites en la
raza equina Marismeña, con un número medio de alelos de 8,40. Esta alta diversidad alélica
queda confirmada por el alto valor de riqueza alélica (7,365), valor que da una idea de la
diversidad alélica de una raza independientemente del número de muestras analizadas. Este dato
está por encima del valor de riqueza alélica de 24 razas equinas autóctonas europeas (Warmuth
et al., 2011), aunque se asemeja al valor encontrado en 27 razas equinas chinas (Ling et al.,
2010).
La heterocigosis esperada más alta se encuentra para el marcador ASB2 con un valor de 0,874 y
la más baja para el HMS6 con un valor de 0,7198 (tabla 3). Los valores de heterocigosis
observada oscilan entre un máximo de 0,9180 para el marcador TKY333 y un mínimo de 0,0625
para el microsatélite LEX3. Los valores medios de He y Ho son 0,7906 y 0,7444 respectivamente
, valores muy similares a los encontrados en otras razas españolas e internacionales (Vega-Pla et
al., 2006), en razas chinas (Ling et al. 2010) o en razas americanas (Conant et al., 2011).
Considerando que un valor de PIC superior a 0,50 indica que un marcador es muy informativo,
podemos decir que todos los marcadores son muy informativos a la hora de detectar variabilidad
genética en la raza equina Marismeña.
En la tabla 3 se recogen también los marcadores que se desvían significativamente del equilibrio
Hardy-Weinberg y el resultado es que 5 de los 25 marcadores se desvían significativamente del
equilibrio Hardy-Weinberg. El coeficiente de consanguinidad (FIS) muestra que los marcadores
LEX3 y TKY321 detectan un exceso significativo de homocigotos en la población. El valor medio
de FIS de la población es de 0,007 y no es significativamente diferente de 0, lo que nos indica que
la raza equina Marismeña no muestra una desviación significativa del equilibrio Hardy-Weinberg.
Como se comentó en una sección anterior, el microsatélite LEX3 está ligado al cromosoma X por
lo que no es aconsejable para su uso en estudios de diversidad genética. Este hecho queda
comprobado al presentar un fuerte desequilibrio del Equilibrio de Hardy-Weinberg. Otro marcador
desviado significativamente de 0 es el TKY321. Estos dos marcadores no se tendrán en cuenta
en los análisis de la contribución a la diversidad.
28 Tabla 3- Microsatélites analizados, número de alelos por marcador (NA), Riqueza Alélica (RA), Heterocigosis observada (Ho),
Heterocigosis esperada (He), Contenido de Información Polimórfica (PIC), Coeficiente de Consanguinidad (FIS) y p-value de
las desviacones del Equilibrio Hardy-Weinberg.
Nivel de Microsatélite
NA
RA
He
Ho
PIC
AHT4
AHT5
ASB17
ASB2
ASB23
HMS3
HMS6
HMS7
HTG10
HTG4
LEX3
LEX33
VHL20
TKY287
TKY294
TKY297
TKY301
TKY312
TKY321
TKY333
TKY337
TKY341
TKY343
TKY344
TKY394
7
6
11
12
7
8
6
6
8
7
9
11
9
8
8
9
7
10
9
8
7
7
10
8
8
8,24
6,859
5,861
9,982
9,000
5,969
7,000
5,969
5,000
5,999
4,998
8,998
8,000
8,843
7,905
6,987
7,884
6,980
8,843
7,873
6,000
6,771
6,874
9,943
7,716
7,874
7,365
0,7901
0,7876
0,8820
0,8740
0,8075
0,8174
0,7198
0,7407
0,7230
0,7420
0,8259
0,8536
0,8658
0,7618
0,7443
0,7908
0,8090
0,8153
0,7709
0,8302
0,7255
0,7452
0,7843
0,7513
0,8066
0,7906
0,7869
0,7500
0,7869
0,8036
0,8596
0,7500
0,7193
0,7541
0,7167
0,6721
0,0625
0,8070
0,8056
0,8136
0,7167
0,7333
0,8361
0,8852
0,6833
0,9180
0,6571
0,8333
0,8033
0,7049
0,7500
0,7444
0,7511
0,7407
0,8619
0,8517
0,7704
0,7868
0,6769
0,6977
0,6779
0,6925
0,7900
0,8279
0,8363
0,7235
0,7091
0,7555
0,7743
0,7874
0,7384
0,7988
0,6798
0,7025
0,7559
0,7090
0,7740
0,7548
significación: *p<0,05; **p>0,01; ***p<0,001 29 FIS
P-value
0,044
0,048
0,004
-0,071
-0,046
0,088
0,026
-0,061
-0,021
0,077
0,925***
-0,045
0,071
-0,095
0,035
0,141
-0,038
-0,043
0,260***
-0,087
0,095
-0,159
0,004
0,076
0,115
0,007
0,1596
0,4454
0,0757
0,9475
0,9659
0,0418*
0,1906
0,1353
0,3122
0,0219*
0,000***
0,3195
0,1337
0,3859
0,3068
0,1474
0,4651
0,1416
0,0026***
0,6079
0,0952
0,4428
0,7333
0,0347*
0,0981
Estructura genética
Con este estudio se pretenden dos objetivos fundamentales que son, por una parte conocer si
existe una subestructura interna de la raza equina Marismeña que debería tenerse en cuenta a la
hora de gestionar la raza y por otra evaluar la eficacia de un sistema objetivo de asignación de
individuos a poblaciones. Este último objetivo es fundamental sobre todo en razas muy
amenazadas con escasos censos ya que supone disponer de una herramienta que permita a los
responsables del Libro Genealógico tomar decisiones acerca de inscribir o no en el Libro a
animales con genealogía desconocida o a aquellos en los que se podría sospechar cierto grado
de cruzamiento con animales de otras razas.
Se ha realizado un análisis de la estructura de la población con el programa STRUCTURE v. 2.1
(Pritchard et al. 2000). Se ha utilizado un algoritmo bayesiano del programa que calcula la
distribución a posteriori de cada coeficiente de mezcla de cada individuo (q). La media de esta
distribución representa una estimación de la proporción que el genoma de cada individuo tiene de
las poblaciones parentales. Con este programa se hace un análisis de agrupamiento de los
individuos estudiados en un diferente número de clusters (K) que representarían el número de
poblaciones asumidas utilizando un modelo de mezcla en el cual cada individuo podría contener
en su genoma porcentajes variables de las poblaciones ancestrales de las que proviene.
En la figura 5 se presenta gráficamente la estructura poblacional del caballo Marismeño utilizando
el programa informático Structure v 2.1. Se ha realizado con 100000 iteraciones de Burn-in y con
número de iteraciones de Cadenas de Markov de Monte Carlo (MCMC) de 500000. Cada
individuo se muestra en una barra vertical y cada color representa la proporción del cluster
correspondiente (raza en este caso) en forma proporcional. En este caso, el Caballo Marismeño
se compara con tres razas (Pura Raza Español, Caballo de las Retuertas e Hispano-Árabe) que
se explotan en la misma zona y que a priori podría pensarse que han ejercido alguna influencia
en el Caballo Marismeño.
Cuando se asume la existencia de dos poblaciones ancestrales (K=2), se diferencia el Caballo de
la Retuertas, mostrando el Caballo Marismeño, el Pura Raza Español y el Hispano-Árabe un
ancestro común. Cuando se asume que existen tres poblaciones ancestrales (K=3) se diferencian
el Caballo Marismeño (en rojo) y el Caballo de la Retuertas (azul), compartiendo el Español y el
Hispano-Árabe un ancestro común que concuerda con el origen mixto del caballo Hispano-Árabe.
Cuando K=4 se separan las cuatro poblaciones en clusters independientes. Puede observarse en
la Figura 5 que el caballo Hispano-Árabe es una población heterogénea, esperable dada las
características de esta raza, mientras que el caballo Marismeño se muestra como una población
homogénea (en azul) aunque se detectan algunos individuos diferentes (en verde) y algunos
cruzados (rojo-azul, verde-azul). Esto se puede observar más gráficamente en la figura 6 en la
30 que se representa el genoma de cada individuo como una columna vertical de colores. Cuando
K=5 y K=6, se empieza a detectar una cierta subestructura de la población del caballo
Marismeño: se observa que existen dos grupos de animales diferentes, aunque la mayoría de
ellos son una mezcla de los dos tipos. Para intentar esclarecer estas diferencias entre los
individuos de la raza Marismeña se introducen otras razas de caballos. Algunas de estas razas no
han tenido ninguna influencia en el caballo Marismeño, como es el caso del Potokka o Losino,
pero otras razas (Pura Raza Árabe, Pura Sangre Ingles) sí han tenido influencia en el caballo
Marismeño en el pasado y esta influencia podría todavía detectarse en la población actual (Figura
7). En los resultados obtenidos se observa que el caballo Marismeño (coloreado en verde claro)
no presenta en la actualidad signos de cruzamientos con las razas Pura Sangre Inglés ni Pura
Raza Árabe. Algunos animales clasificados como Marismeños en realidad se asemejarían más al
Pura Raza Español (coloreados de rosa) y otros animales muestran un genoma diferente a
cualquiera de las razas empleadas en este estudio (coloreados en azul turquesa).
Figura 5. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4 poblaciones equinas españolas.
K=2 K=3 K=4 K=5 K=6 1: Caballo Marismeño; 2: Pura Raza Español; 3: Caballo de Las Retuertas; 4: Hispano‐Árabe 31 Figura 6.- Representación gráfica de la composición genética individual de 4 poblaciones equinas españolas.
(1): Caballo Marismeño; (2): Pura Raza Español; (3): Caballo de Las Retuertas; (4): Hispano‐Árabe 32 Figura 7. Representación gráfica de los resultados del análisis de la estructura genética de 4 poblaciones equinas españolas.
MAR: Caballo Marismeño; PRE: Pura Raza Español; RET: Caballo de Las Retuertas; HA: Hispano‐Árabe; MAL: Mallorquí; MEN: Menorquín; TRO: Trotador Español; POT: Potokka; AST: Asturcón; LOS: Losino; ARA: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés Esta herramienta se está aplicando ya en aquellos casos en los que se plantea la posibilidad de
inscribir un animal en el Libro Genealógico pero se desconoce su genealogía bien porque no se
conoce quien es su padre ni su madre, o bien porque aunque estos sí se conocen, no se puede
comprobar la genealogía con marcadores de ADN porque ya están muertos o ilocalizables y no
se puede obtener muestra de ellos. En estos casos, se hace una asignación de individuos a
poblaciones de forma que si el animal problema de asigna a la raza equina Marismeña con una
probabilidad superior al 90%, este animal se podría inscribir en el Libro Genealógico como animal
puro aunque no se pueda comprobar su genealogía con ADN sin producir un deterioro genético
de la raza pues genéticamente sería un animal puro.
33 Contribución a la Diversidad
Con este estudio se pretende valorar la importancia de la conservación de la raza equina
Marismeña por su contribución a la diversidad genética equina global de España. Esta evaluación
se realizará utilizando diferentes medidasde aislamientoy de distancias genéticassiguiendola
metodología de la estima de la contribución a ladiversidad genética global de Weitzman. Los
resultados de este estudio están recogidos en la tabla 4. Independientemente de lametodología
utilizada, el mayor descensoen la diversidadse daría a partirde lahipotética pérdida dela población
del Caballo de las Retuertas. El caballo Marismeño, en principio no produciría una pérdida de
diversidad genética en un hipotético caso de desaparición. Todavía no existe un consenso a nivel
científico sobre qué metodología utilizar a la hora de priorizar las razas en las estrategias de
conservación, puntualizando que estos métodos sólo basan los resultados de priorización en
función de si se da más importancia a la diversidad genética intra o inter-racial. El método de
Weitzman aquí usado ha sido criticado por algunos autores pues sólo tiene la diversidad genética
inter-racial y no la intra-racial, pero en cualquier caso, cualquiera de los métodos empleados en la
bibliografía no tienen en cuenta otros valores que deben valorarse a la hora de tomar una
decisión de si debe conservarse una raza o no como son su valor histórico, cultural, económico,
etc.
Tabla 4.- Calculo de la diversidad de Weitzman y pérdida de diversidad marginal (%)
Diversidad
total
Diversidad
Raza
MAR
PRE
RET
HA
MAL
MEN
TRO
POT
AST
LOS
ARA
PSI
0,789
0,749
0,682
0,759
0,732
0,743
0,757
0,776
0,733
0,741
0,673
0,735
POSA
Distancia de Reynolds
FST
0,885
1,52
0,0815
Pérdida marginal Diversidad
(%)
4,41
1,45
5,54
1,44
10,92
1,24
4,56
1,39
5,06
1,40
5,12
1,41
6,02
1,43
4,98
1,39
5,89
1,38
5,78
1,32
7,40
1,36
5,90
1,37
Pérdida marginal Diversidad
(%)
4,54
0,75
2,22
0,76
12,14
0,68
5,22
0,74
4,68
0,74
4,21
0,73
4,65
0,75
5,18
0,74
4,65
0,71
6,67
0,69
5,22
0,72
7,45
0,72
Pérdida marginal
(%)
5,01
5,67
15,17
4,76
4,78
5,61
5,22
6,11
4,97
5,20
6,89
7,21
MAR: Caballo Marismeño; PRE: Pura Raza Español; RET: Caballo de Las Retuertas; HA: Hispano-Árabe; MAL: Mallorquí; MEN: Menorquín; TRO:
Trotador Español; POT: Potokka; AST: Asturcón; LOS: Losino; ARA: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés
34 CONCLUSIONES
A la vista de los resultados encontrados, se puede concluir que la raza equina Marismeña
presenta una elevada diversidad genética intra-racial, similar a la detectada en otras razas
equinas autóctonas de España o de Europa. Una estricta vigilancia de la evolución de la
diversidad genética intra-racial global de la raza en años sucesivos es necesaria para evaluar si la
gestión genética de la misma está siendo la adecuada. La raza no se desvía significativamente
del Equilibrio de Hardy-Weinberg lo que en principio podría ser un dato favorable pues no se
apreciaría ni exceso de homocigotos ni de heterocigotos. Los datos de diversidad genética intraracial obtenidos en este estudio servirán como referencia para el estudio de la evolución de la
misma en años sucesivos, en los que se abordará además un estudio de la diversidad por fincas
de pastoreo para poder proporcionar a la Asociación de Ganaderos de una información objetiva
que permita valorar si la gestión genética de la raza está siendo la adecuada.
El caballo Marismeño no presenta en la actualidad signos de cruzamientos con las razas Pura
Sangre Inglés ni Pura Raza Árabe. Algunos animales clasificados como Marismeños en realidad
se asemejarían más al Pura Raza Español y otros animales muestran un genoma diferente a
cualquiera de las razas empleadas en este estudio.
Independientemente de lametodología utilizada, el mayor descensoen la diversidadse daría a
partirde lahipotética pérdida dela población del Caballo de las Retuertas. El caballo Marismeño,
en principio no produciría una pérdida de diversidad genética en un hipotético caso de
desaparición. Todavía no existe un consenso a nivel científico sobre qué metodología utilizar a la
hora de priorizar las razas en las estrategias de conservación, puntualizando que estos métodos
sólo basan los resultados de priorización en función de si se da más importancia a la diversidad
genética intra o inter-racial.
35 BIBLIOGRAFÍA
Aguilar, P., 1984. Grupos sanguíneos en el caballo español. Universidad de Córdoba. Belkhir, K., Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N., Bonhomme, F., 2003, Genetix: 4.05 Logiciel sous WindowsTM pour la genetique des populations In: U. d. Montpellier (ed.) Montpellier, France. Binns, M.M., Holmes, N.G., Holliman, A., Scott, A.M., 1995, The identification of polymorphic microsatellite loci in the horse and their use in thoroughbred parentage testing. Br Vet J151, 9‐15. Boettcher, P.J., Tixier‐Boichard, M., Toro, M.A., Simianer, H., Eding, H., Gandini, G., Joost, S., Garcia, D., Colli, L., Ajmone‐Marsan, P., 2010, Objectives, criteria and methods for using molecular genetic data in priority setting for conservation of animal genetic resources. Animal Genetics41 Suppl 1, 64‐77. Breen, M., Lindgren, G., Binns, M.M., Norman, J., Irvin, Z., Bell, K., Sandberg, K., Ellegren, H., 1997, Genetical and physical assignments of equine microsatellites‐‐first integration of anchored markers in horse genome mapping. Mamm Genome8, 267‐273. Bretting, P.K., Widrlechner, 1995, Genetic markers and horticultural germoplasm management. HortScience30(7), 1349‐1356. Brown, M.D., Sun, F., Wallace, D.C., 1997, Clustering of Caucasian Leber hereditary optic neuropathy patients containing the 11778 or 14484 mutations on an mtDNA lineage. Am J Hum Genet60, 381‐387. Caballero, A., Toro, M.A., 2002, Analysis of genetic diversity for the management of conserved subdivided populations. Conservation Genetics3, 289‐299. Callen, D.F., Thompson, A.D., Shen, Y., Phillips, H.A., Richards, R.I., Mulley, J.C., Sutherland, G.R., 1993, Incidence and origin of "null" alleles in the (AC)n microsatellite markers. Am. J. Hum. Genet.52, 922‐927. Cavalli‐Sforza, L.L., Menozzi, P., Piazza, A., 1994, The History and Geography of Human Genes. Princeton University Press, Princeton, N.J. Conant, E.K., Juras, R., Cothran, E.G., 2011, A microsatellite analysis of five Colonial Spanish horse populations of the southeastern United States. Animal Genetics, doi: 10.1111/j.1365‐2052.2011.02210.x. De Andrés Cara, D.F., 1982. Pura Raza Española de Caballos. Comparación con otras razas mediante sus polimorfismos enzimáticos sanguíneos. Universidad de Córdoba, Ellegren, H., Johansson, M., Sandberg, K., Andersson, L., 1992, Cloning of highly polymorphic microsatellite in the horse. Animal Genetics23, 133‐142. Excoffier, L., Smouse, P.E., Quattro, J.M., 1992, Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics131, 479‐491. Falconer, D.S., 1990, Introduction to quantitative genetics. Compañía Editorial Continental, S.A. México. Falush, D., Stephens, M., Pritchard, J.K., 2003, Inference of population structure using multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies. Genetics164, 1567‐1587. FAO 2000. World Watch List for Domestic Animal Diversity (Roma, FAO). García, D., Cañón, J., 2007, Diversidad de las especies de animales domésticos: importancia y conservación de la variabilidad genética. FEAGAS31, 61‐66. 36 Goudet, J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). Available from http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html. Updated from Goudet (1995). Guerin, G., Bertaud, M., Amigues, Y., 1994, Characterization of seven new horse microsatellites: HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7 and HMS8. Anim Genet25, 62. Guo, S.W., Thompson, E.A., 1992, Performing the exact test of Hardy‐Weinberg proportions for multiple alleles. Biometrics48, 361‐372. Hoelzel, A.R., Bancroft, D.R., 1992, Molecular Genetic Analysis of Populations. IRL. Oxford University Press. Lacadena, J.R., 1981, Genética. Langella, O. 1999. Populations 1.2.28 CNRS UPR9034 http//www.cnrs‐gif.fr/pge/bioinfo/populations/index.php. Lear, T.L., Brandon, R., Bell, K., 1999, Physical mapping of ten equine dinucleotide repeat microsatellites. Anim Genet30, 235. Ling, Y.H., Ma, Y.H., Guan, W.J., Cheng, Y.J., Wang, Y.P., Han, J.L., Mang, l., Zhao, Q.J., He, X.H., Pu, Y.B., Fu, B.L., 2010, Evaluation of the genetic diversity and population structure of Chinese indigenous horse breeds using 27 microsatellite markers. Animal Genetics42, 56‐65. Litt, M., Luty, J.A., 1989, A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics44, 397‐401. Marklund, S., Ellegren, H., Eriksson, S., Sandberg, K., Andersson, L., 1994, Parentage testing and linkage analysis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites. Animal Genetics25, 19‐23. Moazami‐Goudarzi, K., Vaiman, D., Mercier, D., Grohs, C., Furet, J.P., Leveziel, H., Martin, P., 1994, Emploi de microsatellites pour l'analyse de la diversité genétique des races bovines francaises: premiers resultants. Genetics Selection and Evolution26, 155‐165. Mullis, K., Falcoma, F., Scharf, S., Snikl, R., Horn, G.T., Erlich, H., 1986, Specific amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantityative Biology51, 260. Nei, M., 1972, Genetic distance between populations. American Naturalist106, 283‐282. Nei, M., 1973, Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy Sciences of the USA70(12), 3321‐3323. Nei, M., 1995, Genetic support for the out‐of‐Africa theory of human evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 6720‐
6722. Nei, M., Roychoudhury, A.K., 1974, Sampling variances of heterozygosity and genetic distance. Genetics76, 379‐390. Nei, M., Tajima, F., Tateno, Y., 1983, Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. Journal of Molecular Evolution19, 153‐170. Page, R.D., 1996, TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer applications in the biosciences12, 357‐358. Park, S.D.E., 2001. Trypanotolerance in West African Cattle and the Population Genetic Effects of Selection University of Dublin, Dublin. Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P., 2000, Inference of population structure using moltilocus genotype data. Genetics155, 945‐949. Raymond, M., Rousset, F., 1995, GENEPOP (Version 1.2): Population genetics software for exact test and ecumenicism. Journal of Heredity86(3), 248‐249. 37 Reynolds, J., Weir, B.S., Cockerham, C.C., 1983, Estimation of the coancestry coefficient basis for a short‐term genetic distance. Genetics105, 767‐779. Rosenberg, N.A., 2004, Distruct: a program for the graphical display of population structure. Molecular Ecology Notes 4, 137‐138. Saiki, R., Gelfand, D., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K., Erlich, H., 1989, Primer‐directed enzymatic amplification of DNA with termostable DNA polymerase. 239, 487‐491. Shiue, Y.L., Bickel, L.A., Caetano, A.R., Millon, L.V., Clark, R.S., Eggleston, M.L., Michelmore, R., Bailey, E., Guerin, G., Godard, S., Mickelson, J.R., Valberg, S.J., Murray, J.D., Bowling, A.T., 1999, A synteny map of the horse genome comprised of 240 microsatellite and RAPD markers. Anim Genet30, 1‐9. Simpson, G.C., 1951, Horses. Oxford University Press, New York. Tautz, D., 1989, Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research17, 6463‐6471. Tozaki, T., Kakoi, H., Mashima, S., Hirota, K., Hasegawa, T., Ishida, N., Miura, N., Choi‐Miura, N.H., Tomita, M., 2001, Population study and validation of paternity testing for Thoroughbred horses by 15 microsatellite loci. J Vet Med Sci63, 1191‐1197. Van Haeringen, H., Bowling, A.T., Stott, M.L., Lenstra, J.A., Zwaagstra, K.A., 1994, A highly polymorphic horse microsatellite locus: VHL20. Anim Genet.25, 207. Vega‐Pla, J.L., Calderón, J., Rodríguez‐Gallardo, P.P., Martínez, A.M., Rico, C., 2006, Saving feral horse populations: does it really matter? A case study of wild horses from Doñana National Park in southern Spain. Animal Genetics37, 571‐578. Warmuth, V., Eriksson, A., Bower, M.A., Cañon, J., Cothran, G., Distl, O., Glowatzki‐Mullis, M.L., Hunt, H., Luıs, C., Oom, M., Tupac‐Yupanqui, I., Zabek, T., Manica, A., 2011, European Domestic Horses Originated in Two Holocene Refugia. PLoS ONE6, e18194. Weber, J.L., May, P., 1989, Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics44, 388‐396. Weitzman, M.L., 1992, On diversity. Quarterly Journal of Economics107, 363‐405. Weitzman, M.L., 1993, What to preserve? An application of diversity theory to crane conservation. Quarterly Journal of Economics108, 157‐183. Wright, S., 1969, The Theory of gene frecuencies, In: Evolution and genetics of populations. pp. 291‐293. 38