Practica Membranas II 2007 [Modo de compatibilidad]

Separación e identificación de
lípidos de membrana
Objetivos
• Separación e identificación de especies de fosfolípidos
por cromatografía de capa fina (TLC, Thin Layer
Chromatography)
– TLC monodimensional (1)
– TLC bidimensional (2)
Tinción:
Æ yodo
Æ cobre-fosfórico
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Separación de lípidos
• Solventes no polares
GLICEROFOSFOLÍPIDOS
– Principio:
ESFINGOLIPIDOS
COLESTEROL
• Diferencias en polaridad =
solubilidad en solventes no
polares
• Interacción diferencial de
los solventes con la
matriz
• Terminología:
– Solventes: fase móvil
– Matriz: fase estacionaria
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Matriz
• Material insoluble y polar
– sílica gel (ácido silícico Si(OH)4)
• La sílica gel se esparce como una capa fina sobre un soporte
– generalmente vidrio
Matriz
3
Separación de Lípidos
•
•
•
•
•
Las muestras se colocan en el borde de la placa
La placa se encuentra en una cámara con un ambiente saturado del vapor del
solvente
A medida que el solvente sube por la placa por capilaridad, va arrastrando a
los lípidos.
Los lípidos polares se unirán fuertemente a la sílica, mientras que los lípidos
neutrales no serán retenidos.
La separación ocurre por una interacción entre los lípidos y la sílica y su
solubilidad relativa en los solventes utilizados.
Sistema de TLC
placa de TLC
tanque de
vidrio con tapa
4
Sistema de TLC
T0
origen
5
T1
Tf
frente de
corrida
6
frente de
corrida
Interacción matriz - solvente
SITUACION IDEAL:
• El solvente que interactúa más fuerte con la silica (A) es
extraído de la mezcla y forma una capa de adsorción en la
superficie (X)
• La mezcla binaria remanente continuúa migrando, y el segundo
solvente en fuerza de interacción (B) es adsorbido formando la
capa Y
• Finalmente el solvente C continúa migrando y forma la capa Z
SITUACION REAL:
• No existe una separación total de los solventes por su
interacción con la sílica, siempre habrán fases con 3
componentes, en diferentes proporciones dependiendo de su
interacción con la matriz.
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Interacción matriz - solvente
• El sistema matriz solvente es difícil de predecir de forma teórica
• El sistema se hace más complejo a mayor número de solventes
y de sus concentraciones relativas
• Lo mejor: hacer pruebas de ensayo y error
– Esto no invalida la exactitud y precisión del TLC como método de
separación y cuantificación de lípidos
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Identificación de Lípidos
• Los lípidos una vez separados pueden ser
detectados en las placas de TLC mediante distintos
métodos de tinción. Las moléculas que actúan como
reveladores reaccionan con diferentes componentes
de los lípidos, como los dobles enlaces de los ácidos
grasos, el fósforo o los grupos amino de la cabeza
p
polar.
Identificación de Lípidos
• Las diferentes especies lipídicas son identificadas en
base a su migración relativa en las placas, al
compararlos con muestras patrón que se incluyen en
las corridas.
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Procedimiento
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primera dimension: cloroformo/metanol/agua (75:25:2.5,v/v)
segunda dimension: cloroformo/metanol/ácido acético/agua (80:9:12:2,v/v)
Separación de Lípidos:
Materiales y Reactivos
•
•
•
•
•
•
Muestra
Estándares de fosfolípidos
Placas de TLC (Merck, Sílica 60 sobre vidrio)
Tanque de TLC
Jeringas Hamilton
Mezclas de solventes:
– solución acetona/hexano (1:3) v/v,
– solución cloroformo/metanol/acético/agua (50:25:8:2) v/v,
• reactivo cobre-fosfórico.
• Nitrógeno grado cromatográfico (AGA S.A., Lima,
Perú)
•
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Procedimiento
• Extracto con isopropanol/cloroformo (11:7) v/v
• ~ 0.2 uMol fosfolípidos / ml = 0.2 nMol fosfolípidos / ul
• Volumen aprox: 20 ml
• Concentrar evaporando bajo corriente de nitrógeno
• Resuspender
p
en 800 ul benceno/metanol ((4:1)) v/v con BHT al 0.05%
• ~ 5 nMol fosfolípidos/ul
TLC Unidimensional (1)
PREPARACION DE LA PLACA
• Colocar las placas de cromatografía en una estufa a
100°C por 20 minutos
• Dejar enfriar las placas en una cámara sellada,
conteniendo un desecante activo
• Una vez fría la placa, trazar una línea paralela a uno
d llos b
de
bordes
d a un centímetro
tí t d
de di
distancia
t
i con un
lápiz blando de punta roma
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TLC Unidimensional (2)
MUESTRAS:
• Sembrar las muestras (5µl, equivalente a 8-12 nmol de fósforo
inorgánico) en forma lineal, dejando 1 cm libre a cada lado de la
placa.
– La muestra se aplica sobre una superficie lineal de 5 mm
– El espacio entre muestra y muestra es de 5 mm
– IMPORTANTE: evaporar el solvente con una corriente de aire, a medida
que se va aplicando la muestra sobre la placa
TLC Unidimensional (3)
• Desarrollar la placa en la cámara estabilizada
previamente por 10 min con acetona/hexano (1:3) v/v
– este sistema arrastra a los lípidos no polares
• Retirar la placa de la cámara y secar por 15 min con aire
caliente.
• Una vez seca la placa, desarrollar la placa en una cámara
para cromatografía de capa fina estabilizada por 10 min
con cloroformo/metanol/acético/agua (50:25:8:2) v/v
– IMPORTANTE: Terminar la corrida antes que el solvente llegue al
borde superior de la placa.
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TLC Unidimensional (4)
• Luego de la cromatografía,
cromatografía secar la placa con aire
caliente por 15 minutos, y posteriormente a 100°C
por 20 minutos
• Dejar enfriar la placa en una cámara sellada
conteniendo un desecador activo (sílica gel)
TLC Bidimensional (1)
PREPARACION DE LA PLACA
• Colocar las placas de cromatografía en una estufa a
100°C por 20 minutos
• Dejar enfriar en una cámara sellada, conteniendo un
desecante activo
• Una vez fría la placa, trazar una línea paralela a dos
d llos b
de
bordes
d convergentes,
t
a un centímetro
tí t de
d
distancia con un lápiz blando de punta roma
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TLC Bidimensional (2)
MUESTRA
• Sembrar la muestra (8 µl, equivalente a 16 - 20 nmol
de fósforo inorgánico) en forma de punto, en la
intersección de ambas líneas
– IMPORTANTE: Evaporar el solvente con una corriente de
aire, a medida que se va aplicando la muestra sobre la placa
TLC Bidimensional (3)
• Desarrollar la primera dimensión de la placa la cámara
estabilizada por 10 minutos con
cloroformo/metanol/hidróxido de amonio (13:5:1) v/v
• Secar la placa con aire caliente por 15 minutos
• Una vez seca la muestra, desarrollar la segunda
dimensión de la placa en la cámara estabilizada por 10
minutos con cloroformo/acetona/metanol/acético/agua
(6:8:2:2:1) v/v
• IMPORTANTE: Terminar la corrida antes que el
solvente llegue al borde superior de la placa
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Identificación de Lípidos:
Materiales y Reactivos
• Reactivo cobre
cobre-fosfórico:
fosfórico:
– 10 gr de CuSO4.5H2O en 100 ml de ácido fosfórico 8%
– PRINCIPIO: La tinción es proporcional a los ácidos grasos
presentes en los fosfolípidos.
• Tinción de yodo:
– recipiente saturado con vapor de yodo
– PRINCIPIO: El yodo interactúa reversiblemente con los
dobles enlaces de los ácidos grasos, dando un color
amarillo
Identificación de Lípidos:
Procedimiento
COBRE – FOSFORICO
• Una vez fría, rociar la placa con un aspersor cargado
de reactivo cobre-fosfórico
• Colocar la placa húmeda en una estufa a 120°C por
20 minutos
• Identificar las especies lipídicas en base a las
muestras
t
patrón
tó
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Identificación de Lípidos:
Procedimiento
YODO
• Una vez fría, colocar la placa sobre un recipiente con
yodo. Esperar que los vapores de yodo impregnen la
placa
• Identificar las especies lipídicas en base a las
muestras patrón
TLC Unidimensional:
Resultados esperados
PA
PE
PI / PS
PC
SM
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TLC Bidimensional:
Resultados esperados
PA
PE
PS
PI
LPC
PC
SM
Rodamina 6G
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Cálculos
(Rf)
• Factor de Retardo:
Rf = distancia recorrida por la muestra (d1)
distancia recorrida por el solvente (d2)
• Cada especie molecular presenta un Rf particular:
– para un tipo de matriz
– Para un sistema de solvente determinado
TLC Unidimensional:
Rf
PA
PE
PI / PS
Rf – d2
PC
Rf – d1
.
SM
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TLC Bidimensional:
Rf
PA
PE
PS
Rf1-d2
PI
Rf1-d1
Rf2 – d2
LPC
PC
SM
Rf2 – d1
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