3.- TECNOLOGIA EN EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

3.- TECNOLOGIA EN EL DIAGNOSTICO MOLECULAR
3.1.- INTRODUCCIÓN
Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la
aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de
técnicas moleculares. El objetivo de este capítulo consiste en realizar un
repaso por una selección de las distintas técnicas empleadas en el diagnóstico
molecular, incidiendo en su fundamento.
3.2.- EXTRACCIÓN DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos son las dianas que vamos a emplear para realizar todos
nuestros ensayos y un primer paso en la mayoria de las técnicas moleculares
es la obtención de éstos.
Los ácidos nucleicos se pueden extraer de cualquier tipo de muestra, de hecho
se han empleado muestras tan insignificantes como células epiteliales de
saliva, pelos e incluso fósiles incluidos en ambar para buscar genes de
antiguos animales prehistóricos u otros organismos ya extinguidos.
Aunque existen muchos métodos de extracción de ácidos nucleicos y el
proceso se encuentra automatizado en muchos laboratorios, creemos
conveniente explicar el fundamento de la extracción.
3.2.1.- Extracción de ADN
Primeramente hablaremos de la extracción de ADN. El método clásico más
conocido es la extracción con fenol-cloroformo y consta de tres etapas
1. Lisis celular
2. Eliminación de proteínas
3. Precipitación y limpieza del ADN
La etapa de lisis consiste en desestabilizar las estructuras que confinan el
citoplasma y liberar al medio su contenido. Para ello se emplean unos
tampones de extracción que contienen los siguientes compuestos: detergentes
como el SDS o el Triton X100, que eliminaran membranas y lípidos; agentes
quelantes como el EDTA que elimina los cationes de la solución,
desestabilizando las membranas celulares e inhibiendo las ADNasas (enzimas
que podrían degradar el ADN libre lisándolo en pequeños fragmentos); sales
como el cloruro de sodio (NaCl) que forma una capa iónica alrededor del ADN
protegiéndolo; un tampón como el Tris HCl que mantiene un pH de la solución
estable y proteinasa K que degradará proteínas y enzimas. La lisis se suele
realizar a temperaturas elevadas alrededor de 50ºC (nunca mayor de 80ºC, ya
que a esta temperatura comienza a degradarse el ADN) facilitando la ruptura
de lípidos de la membrana y por ende la liberación de ADN de la estructura
celular.
Posteriormente se procede a la eliminación de proteínas que se realiza
mediante la adición de una mezcla de fenol:cloroformo: alcohol isoamílico
(proporción 50:49:1) y posterior centrifugación, lo que provoca que el ADN
permanezca en el sobrenadante y en la interfase queden las proteínas. El
fundamento es el siguiente: el fenol y el agua (solución acuosa donde se
encuentra el ADN) no se pueden mezclar, por lo que el ADN que es muy polar
debido a su carga negativa, permanecerá en la fase acuosa de la solución,
mientras que las proteínas (formadas por grandes cadenas cuyos componentes
elementales son aminoácidos algunos polares y otros no) quedarán tras la
centrifugación en la interfase y en la fase orgánica debido a su polaridad. Hay
que extraer el sobrenadante con cuidado para no arrastrar las proteínas.
La precipitación y limpieza del ADN se realiza añadiendo al sobrenadante
recuperado en el paso anterior una sal a alta concentración (p.ej. acetato de
sodio, cloruro de sodio o acetato de amonio). Con la adición de la sal, el ADN
que está cargado negativamente va a obtener una capa iónica positiva que
facilitará su precipitación. Posteriormente añadiremos alcohol en la solución de
precipitación para eliminar la concentración residual de sales y promover la
precipitación del ácido nucleico, ya que el alcohol va a sustraerle las moléculas
de agua al ADN y por tanto deshidratarlo Cuando se trata de muestras con baja
concentración de ácidos nucleicos, comúnmente se utiliza isopropanol
(volumen a volumen). La precipitación del ADN es casi inmediata en presencia
de la sal y el alcohol, sin embargo se recomienda incubar la muestra durante
varios minutos a -20ºC o -80ºC para acelerar el proceso de precipitación.
Posteriormente, se centrifuga la muestra unos minutos para recuperar el
precipitado de ADN, lavándose el pellet obtenido varias veces con etanol al
70% para eliminar todas las sales que permanezcan en la solución.
Posteriormente se vuelve a centrifugar, se elimina cuidadosamente el
sobrenadante con una pipeta y se deja secar para eliminar las trazas de
alcohol. El ADN así obtenido es rehidratado con agua bidestilada o tamponada
con tampón Tris.
Esquema de extracción de ADN con el método de fenol cloroformo
Actualmente existen muchos kits comerciales de extracción de ADN donde el
proceso es simplificado fundamentalmente en el segundo y tercer paso de
eliminación de proteínas y precipitación y limpieza. Con la ayuda de columnas
equipadas con una membrana de sílice, es posible retener el ADN que se une
al sílice, permitiendo el paso de moléculas como proteínas, lípidos y sales que
acompañan a la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y posterior
elución del contenido.
Esquema de extracción de ADN con kit comercial que emplea columnas rellenas de sílice
3.2.2.- Extracción de ARN:
Existen muchos métodos para la extracción del ARN. Los protocolos más
empleados son aquellos que incluyen agentes caotrópicos como isotiocianato
de guanidinio o fenol para el lisado celular. Estos compuestos inactivan
ARNasas (enzimas que degradan rápidamente el ARN), lo que resulta muy
favorable cuando se trabaja con muestras que poseen altos niveles de
ARNasas endógenas. Posteriormente se realiza una desproteinización con
cloroformo y una precipitación diferencial con una sal (Cloruro de Lítio).
Actualmente ya existen diferentes empresas que ofrecen equipos automáticos
para la extracción de ácidos nucleicos con un excelente rendimiento, evitando
errores de manipulación; toxicidad de los reactivos empleados y permitiendo la
estandarización de la técnica.
3.2.3.- Concentración y calidad del ácido nucleico obtenido
Tras la extracción del ácido nucleico de interés es conveniente evaluar la
concentración y calidad del mismo. Una forma de evaluar si los ácidos
nucleícos han sufrido roturas, consiste en realizar una electroforesis en gel de
agarosa (su fundamento lo veremos en un apartado posterior). Con una
electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra. Si
el ADN no ha sufrido roturas veremos una única banda de alto peso molecular.
Para el caso de muestras de ARN de buena calidad, la electroforesis mostrará
claramente los diferentes tipos ARNs.
Extracción de ARN de distintas muestras donde podemos ver los distintos ARN que se
encuentran en la célula tras su electroforesis en gel de agarosa.
Otra medida de la calidad de los ácidos nucleicos consiste en valorar la
absorbancia de la disolución del ácido nucleico obtenido tras la extracción, en
un espectrofotómetro (instrumento que mide la densidad óptica de una
disolución) a 260nm y 280nm. Un ADN puro tendrá una relación de
A260/A280 (Absorbancia a 260nm/Absorbancia a 280nm) entre 1,8 y 2.
Valores menores indican contaminación con proteínas mientras que valores
mayores se deben a contaminación con sales.
Para calcular la concentración del ADN se mide en un espectofotómetro su
absorbancia a 260nm. Se sabe empíricamente que para el ADN una
absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50ug/ml. Con esta
relación puede calcularse la concentración de ADN de nuestra muestra. Para el
caso del ARN una absorbancia de 1 corresponde una concentración de
40ug/ml.
3.3.- LAS ENZIMAS
Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos
procesos de la Biología Molecular. Entre ellas podemos destacar:
Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos
nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos del interior de la cadena. Las
endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por
bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de ADN de doble
hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II
son las más útiles en los métodos de manipulación del ADN debido a su
especificidad de secuencia absoluta (reconocen una secuencia concreta del
ácido nucleico), tanto para la reacción de unión como para la de ruptura.
Algunas, tras la rotura de la cadena pueden producir extremos cohesivos (esto
permitirá al fragmento generado unirse a otro fragmento de distinta procedencia
que haya sido generado por la misma endonucleasa de restricción) o extremos
romos.
Secuencias de reconocimiento y zona de corte de dos enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que
corresponden a la primera letra del género del microorganismo de procedencia,
y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia
(ejemplo: Sma: Serratia marcescens) . El número señala el orden cronológico
de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.
Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las
endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto
es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe
el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de ADN
siendo esta simétrica respecto al eje binario.
Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar ADN o ARN “in vitro”. La
mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula
complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia
son: ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa
(utiliza como molde ARN para convertirlo en ADN), la ADN polimerasa del
bacteriofago T7, ARN polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq
polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa o
PCR). La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer
complementario al ADN molde para iniciar la polimerización a partir de ese
punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que
añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas
preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.
Hay una polimerasa especialmente interesante y de la que vamos estudiar sus
características en profundidad en el apartado correspondiente a la importante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta polimerasa se llama Taq
polimerasa y su mecanismo de actuación es trascendental en la P.C.R.,
siendo clave en el impulso para el diagnóstico en los últimos años.
Otras enzimas: Ligasas (une extremos de ADN protuberantes o romos),
Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5´ de los ácidos nucleicos,
Quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5´ que han dejado las fosfatasas)
etc...
3.4.- LA CLONACION
Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos de
ácido nucleico a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento
de ADN que se quiere clonar (para este aislamiento podemos emplear las
endonucleasas de restricción antes citadas que son capaces de reconocer y
cortar al ADN en zonas concretas que nos puedan interesar ), se liga a un
transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) mediante el empleo
de varias enzimas entre ellas las ligasas, posteriormente es introducido en el
interior normalmente de una bacteria (para ello se emplean métodos químicos
o impulsos eléctricos que permiten la permeabilización de la membrana), y
finalmente se replica mediante cultivo. Una vez replicado considerablemente
se recupera junto con el vector correspondiente.
Introducción en una bacteria para su cultivo
Cultivo
Esquema del proceso de clonación
Posteriormente se le separa del vector generalmente con la misma enzima de
restricción que hemos empleado para obtenerlo, obteniendo como resultado un
gran número de copias del fragmento de interés.
3.5.- LA ELECTROFORESIS
Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño.
Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas
poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es
conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde
unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pb (pares de bases). La
poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de
ácidos nucleicos y para separación de proteínas.
El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:
- ADN: en pares de bases o bp.
- ARN : en nucleótidos o nt.
- Proteínas: en Daltons o Da.
Existen muchos tipos de electroforesis:
-
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida para identificar
proteínas.
Electroforesis 2D o electroforesis bidimensional para separación de
proteínas con arreglo a su carga/masa.
Electroforesis en Geles de poliacrilamida para ADN desnaturalizado:
para analizar fragmentos de ADN < 100 pb.
Electroforesis en Geles de Agarosa: Separación de ADN en base a su
tamaño para fragmentos > 100 pb.
Electroforesis de campo pulsante para analizar grandes fragmentos
de ADN (mayores de 10 megabases).
Electroforesis capilar: Para separar mezclas complejas de pequeñas
moléculas de ADN (50-100 pb). Actualmente se ha ampliado este rango
y automatizado el proceso.
3.5.1.- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de
ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del
tampón en el que se encuentran), y al someterlas a un campo eléctrico migran
hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de
sus tamaños (una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel
más fácilmente que una molécula grande). Las velocidades de migración de las
moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los
logaritmos de sus pesos moleculares. La detección tras la migración se realiza
fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante como el bromuro de
etidio (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el
propio gel y el ácido nucleico es visualizado al emitir luz visible cuando el gel
se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la
migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la
configuración espacial que adopte la molécula.
REPRESENTACION DE UN GEL DE AGAROSA TRAS LA ELECTROFORESIS DE
MUESTRAS DE PCR.
En las carreras primera y última corren los marcadores de peso molecular, en la posición 2 se
encuentra el control positivo, en la posición 3 el control negativo, la posición 4 y 5 son dos
muestras positivas y en las posiciones 6 y 7 son muestras negativas. El peso molecular de los
casos positivos oscilará alrededor de 2,5KB (KILOBASES) al compararlo con los marcadores
de peso molecular laterales.
FOTOGRAFIAS REALES DE GELES DE AGAROSA
PCR de Hepatitis C donde vemos marcador de pesos moleculares, en el pocillo 2 control negativo, en el
pocillo 3 control positivo y en el pocillo 4 PCR+ de muestra real de Hepatitis C
3.5.2.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
Son geles normalmente realizados en un soporte vertical constituyendo un
excelente medio para separaciones electroforéticas. Los geles de
poliacrilamida se forman por copolimerización de la acrilamida y bis acrilamida.
La reacción de polimerización es iniciada/catalizada por el compuesto químico
TEMED (tetrametiletilendiamida) y por persulfato sódico. El radical persulfato
activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que
polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la
bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que
puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las
concentraciones de los monómeros.
Existen distintas aplicaciones para la electroforesis en este tipo de soporte.
Generalmente se emplean para la separación de proteínas (SDS PAGE: de las
siglas polyacrylamide gel electroforesis en condiciones desnaturalizantes
causadas por el detergente SDS). También son empleadas para la separación
de pequeños fragmentos de ADN, generalmente fragmentos que han sido
generados tras corte con enzimas de restricción.
Una aplicación importante en la que se emplea el soporte de gel de acrilamida
es la técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Su
fundamento está basado en el corte específico del ADN de la muestra
problema con endonucleasas de restricción y la separación del producto
resultante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Una aplicación de
esta técnica consistiría en la detección de una mutación puntual, por ejemplo
una base G que se convierte en T justo en un punto de corte de una enzima de
restricción, lo que provoca que la enzima que antes reconocía la secuencia
diana específica y procedía a su corte, ahora tras la mutación, no la reconozca
y por tanto no la corte. Este cambio sería visualizado después de su separación
en una electroforesis. La técnica RFLP se emplea como marcador para
identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas
enfermedades genéticas, en medicina forense, en pruebas de paternidad y en
otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.
3.6.- LA HIBRIDACION
Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos
nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana
y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana a la
que se le ha unido una molécula reporter.
Esquema de hibridación
El ADN está formado por una doble hélice de dos cadenas complementarias
unidas por puentes de hidrógeno. La unión entre ambas cadenas puede ser
rota (desnaturalización del ADN) por calor o por un incremento del pH,
constituyendo así cadenas de ADN monocatenario. A este fenómeno es
reversible, denominándose renaturalización, al proceso en el que las cadenas
anteriormente separadas se unen de nuevo al bajar la temperatura o al
restablecer el pH, según sea el caso, volviendo a formarse los puentes de
hidrógeno entre ellas. Ahora bien, si tras la desnaturalización añadimos a la
muestra una sonda de ADN marcada, es decir, un fragmento de cadena simple
de ADN de secuencia complementaria a la de nuestro ADN diana y de origen
distinto, cuando se restablecen las condiciones de temperatura o de pH, la
sonda puede unirse a la cadena simple de ADN diana; siendo la señal del
marcador suficiente para su detección. Este proceso se define como
hibridación.
Existe un capítulo completo en este módulo en el que se va a tratar en profundidad la
hibridación y en particular la hibridación in situ para muestras parafinadas. Ahora tan solo
vamos a desarrollar algunos conceptos generales de esta técnica
3.6.1.- Las sondas
Una sonda es un fragmento monocatenario de ADN o ARN marcado con
una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de
una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un
proceso de hibridación.
Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos:
- Fragmentos de ADN
- Fragmentos de ARN
- Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas (sintetizados artificialmente en
equipos automáticos).
3.6.2.- Las moléculas reporter
Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de
esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos
tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas
(Fosfatasa, Peroxidasa ...) , quimioluminiscentes (ésteres de acridina), Plata
etc.
3.6.3.- Factores que afectan a la sensibilidad y especificidad de la
hibridación
- Concentración del ácido nucleico diana
- Complementariedad sonda-ácido nucleico diana
- Concentración de la sonda.
- Longitud de la sonda
- Actividad específica de la molécula reporter.
- Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, ...)
- Tm (temperatura de fusión, temperatura a la que el 50% de las hebras de
ADN están desnaturalizadas )
- Capacidad de acceder al ácido nucleico diana.
- Formato de hibridación
3.6.4.- Formatos de hibridación
- Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran
en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La
velocidad de formación del duplex en estas condiciones es alta. El problema de
este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado,
empleándose entre otros métodos la nucleasa S1-precipitación con
tricloroacético o la hibridación protection assay.
- Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se
encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación
por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación
se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el
ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona,
híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados.
Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución. También se ha
conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación.
Existe un tipo de hibridaciones en fase sólida que son muy empleadas en
Biología Molecular: los Southern blot : ADN cortado con enzimas de
restricción, separado mediante electroforesis, transferido a un soporte sólido
(nitrocelulosa o nylon) e hibridado con una sonda de ADN marcada con una
molécula reporter y Northern Blot : ARN separado e hibridado con sondas de
ADN o ARN marcadas con moléculas reporter. Estas técnicas consisten en
líneas generales en una separación inicial de las moléculas en base a su peso
molecular mediante electroforesis , trasferencia capilar de estas moléculas a un
filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y
detección.
Resultado de un Southern Blot
Hibridación in situ
Aunque este apartado será tratado en extensión en un próximo capítulo
diremos a modo de resumen que permite la detección de genes o expresión de
genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se
requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener
acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente
interpretación y análisis.. El empleo de proteasas, que facilitan el acceso de la
sonda al ácido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no
provocar el desmantelamiento de la morfología celular. Se recomienda el
empleo de oligosondas por su tamaño que permite un mejor acceso al interior
de la célula.
Entre las técnicas de hibridación in situ encontramos el FISH (hibridación in situ
fluorescente) entre cuyas moléculas reporter podemos encontrar la
fluoresceína o el rojo Texas, CISH (hibridación in situ cromogénica) y su
variante DUO-CISH (realización de dos hibridaciones simultáneas y detección
con dos cromógenos de distinto color), SISH (emplea plata como cromógeno).