COMPOSICION FARMACEUTICA ESTABLE DEL FACTOR BNDF

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 38/18
11 Número de publicación:
2 183 170
7
51
ESPAÑA
A61K 47/26
A61K 9/19
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 97922156.1
kFecha de presentación: 26.05.1997
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 910 399
kFecha de publicación de la solicitud: 28.04.1999
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Composición farmacéutica estable del factor BDNF.
k
73 Titular/es:
k
72 Inventor/es: Tanaka, Kaatsumi y
k
74 Agente: Ungrı́a López, Javier
30 Prioridad: 27.05.1996 JP 156070/96
REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
777 Old Saw Mill River Road
Tarrytown, NY 10591-6707, US
SUMITOMO PHARMACEUTICALS
COMPANY, LIMITED
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.03.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 183 170 T3
16.03.2003
Aviso:
k
k
Kumano, Masashi
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 183 170 T3
DESCRIPCION
Composición farmacéutica estable del factor BDNF.
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La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF) en forma de una solución acuosa o de una liofilizada, siendo preparada la
última por medio de la liofilización de dicha composición en solución acuosa.
Las células nerviosas de los vertebrata necesitan de un cierto grupo de polipéptidos -llamados factor
neurotrófico- para su supervivencia. El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) es conocido
como uno de los factores neurotróficos. El BDNF ha sido aislado por primera vez del cerebro porcino por
Barde, Y.E. et al. (cf., The EMBO Journal, 5, 549-553 (1982)), y después de esto, los genes del BDNF
de cerdo, de humano y de ratón han sido clonados en 1989, a través de lo cual ha sido confirmado que
tiene una primera estructura consistente en 119 aminoácidos (cf., Leibrock, J. et al., Nature, 341, 149
(1989)). Ultimamente se viene prestando mucha atención al BDNF, ya que se considera que el BDNF
juega un papel muy importante en el sistema nervioso central.
El BDNF es un polipéptido que exhibe varias actividades farmacológicas en el sistema nervioso, siendo
descritas las actividades farmacológicas del mismo en Seitai no Kagaku (Science of Living Body), 43 (6),
616-625 (1992). Además, se espera que el BDNF sea útil como agente en el tratamiento de algunas
enfermedades, como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la neuropatı́a por intoxicación por agente
anticancerı́geno, la neuropatı́a diabética, la degeneración pigmentaria de la retina, el glaucoma, la corea
de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad del Alzheimer, el dolor por cáncer terminal,
la depresión, la obesidad, etc., basándose en las actividades farmacológicas del mismo (cf., USP 5180820,
Seitai no Kagaku, 43 (6), páginas 616-625, (1992)).
Para que un compuesto pueda ser empleado como un medicamento usualmente se requiere que éste sea
estable, sin cambio de actividad del mismo a lo largo del tiempo, bajo condiciones usuales de almacenamiento, cuando está formulado en forma de una composición farmacéutica convencional. Especialmente,
los polipéptidos altamente purificados -como el BDNF- tienen muchos problemas a resolver a la hora
de mantener su estabilidad durante un largo periodo de tiempo. Por ejemplo, cuando se mantiene el
BDNF en la forma de una solución en una solución salina fisiológica convencional, el BDNF tiene tendencia a agregarse, tanto si se almacena unos dı́as como si es por varios meses, lo cual constituye un
serio problema. Se sabe que la agregación del BDNF causa toxicidad inmunológica al cuerpo vivo, de tal
forma que es muy importante el prevenir que se produzca la agregación del BDNF. Además, a menudo
se produce también BDNF desnaturalizado y/o polimerizado. Hasta ahora no ha habido ningún informe
sobre modos efectivos para solucionar estos serios problemas del BDNF.
En general, cuando un compuesto de un peso molecular bajo es inestable en la forma de una solución
acuosa usualmente se intenta liofilizar la solución para conseguir su estabilización. Sin embargo, se sabe
que los polipéptidos no son estables durante los procedimientos de liofilización (cf., Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (i.e., Protein, Nucleic Acid, Enzyme), 37 (9), 1517 (1992)). Además, los estabilizadores
convencionales muestran sus efectos estabilizadores en una solución acuosa de un polipéptido por medio
de la ayuda en la hidratación entre una molécula de agua y un polipéptido. Por lo tanto, estos estabilizadores en muchos casos no pueden mostrar sus efectos estabilizadores en una composición liofilizada, ya
que no existe en la misma ninguna molécula de agua (cf., Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (i.e., Protein,
Nucleic Acid, Enzyme), 37 (9), 1517 (1992)). Hasta ahora no se ha conocido ninguna composición farmacéutica liofilizada del BDNF, y no hay ninguna persona experta en la materia que pueda concebir la
estabilidad fisicoquı́mica y biológica de la composición farmacéutica liofilizada del BDNF.
Cuando se mantiene el BDNF a una baja temperatura o a temperatura ambiente, de unos dı́as a
varios meses, el BDNF se agrega, mostrando propiedades variadas, y produciéndose la desnaturalización
y/o polimerización del BDNF. De esta forma, la estabilidad fisicoquı́mica del BDNF es baja, no pudiendo
mantenerse el BDNF durante un largo periodo de tiempo. La inestabilidad ha impedido el desarrollo
del BDNF como un medicamento para humanos o para otros animales en la forma de una preparación
farmacéutica, como una preparación inyectable.
Bajo las circunstancias antes mencionadas, los presentes inventores han estudiado intensamente el desarrollo de una composición farmacéutica del BDNF, y han descubierto que la adición de un surfactante
es bastante efectiva para la estabilización del BDNF, y han llevado a cabo la presente invención.
Esto es, la presente invención proporciona una composición farmacéutica estable de un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la cual comprende como ingrediente activo un BDNF, y como
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un estabilizador un surfactante, preferiblemente un surfactante no iónico y, opcionalmente, una sal y/o
un agente tamponador y, opcionalmente además, un estabilizador adicional, como un aminoácido y un
alcohol de azúcar, que pueden estar en forma de una solución acuosa, o en forma liofilizada.
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La presente invención proporciona también un método para estabilizar un BDNF en una composición
farmacéutica, por medio de la incorporación a la composición de un surfactante como estabilizador y, opcionalmente, añadiendo además una sal y/o un agente tamponador y, opcionalmente además, añadiendo
un estabilizador adicional, como un aminoácido y un alcohol de azúcar.
Mas abajo se da un ejemplo de realizaciones de la composición de la presente invención.
(1) Una composición farmacéutica estable, la cual comprende un BDNF y un surfactante.
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(2) La composición farmacéutica, conforme al punto (1), en donde el surfactante es un surfactante no
iónico.
(3) La composición farmacéutica, conforme al punto (2), en donde el surfactante no iónico es el Tween
R
.
80
20
R
en una
(4) La composición farmacéutica, conforme al punto (3), en donde se contiene el Tween 80
cantidad de entre un 0,001 % (w/v) y un 10 % (w/v).
(5) La composición farmacéutica, conforme al punto (1), la cual además comprende una sal.
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(6) La composición farmacéutica, conforme al punto (5), en donde la sal es el cloruro de sodio.
(7) La composición farmacéutica, conforme al punto (1), la cual además comprende un agente tamponador.
30
(8) La composición farmacéutica, conforme al punto (7), en donde el agente tamponador es un tampón
de fosfato.
(9) La composición farmacéutica, conforme al punto (1), la cual tiene un valor de pH en el rango de
5,5 a 7,5.
35
(10) La composición farmacéutica, conforme al punto (1), la cual está en la forma de una composición
liofilizada.
40
(11) La composición farmacéutica, conforme al punto (10), la cual comprende además un estabilizador
adicional.
(12) La composición farmacéutica, conforme al punto (11), en donde el estabilizador adicional pertenece al grupo de aminoácidos y de alcoholes de azúcar, o es una combinación de los mismos.
45
(13) La composición farmacéutica, conforme al punto (12), en donde el aminoácido es la glicina, y el
alcohol de azúcar es el manitol.
(14) La composición farmacéutica, conforme al punto (11), en donde se contiene el estabilizador adicional en un rango de entre un 0,1 a un 10 % en peso del peso del BDNF.
50
(15) Una composición farmacéutica liofilizada del BDNF, la cual contiene como estabilizador el Tween
R
, y como un estabilizador adicional el manitol, en la cantidad total de entre un 0,01 % (w/v) y un
80
10 % (w/v), basado en el peso total de la composición reconstituida.
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El BDNF usado en la presente invención puede ser cualquiera de cualquier origen animal -como un
ratón, un cerdo, o humano- y puede ser preparado por medio de varios procesos. Cuando un BDNF aislado de tejidos animales se utiliza en la presente invención, éste puede ser purificado hasta tal punto que
pueda ser usado como un medicamento (cf., The EMBO Journal, 5, 549-553 (1982)). Alternativamente,
un BDNF puede ser obtenido por medio de cultivo de una célula de cultivo primaria, o de una lı́nea celular
establecida que pueda producir BDNF, y aislándolo del caldo de cultivo de las mismas (por ejemplo, el
sobrenadante del cultivo, las células cultivadas). Lo que es mas, puede ser usado un BDNF recombinante,
el cual puede ser obtenido por medio de una técnica convencional de ingenierı́a genética, por ejemplo, por
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medio de la inserción de un gen codificante del BDNF en un vector adecuado, transformando un huésped
apropiado con el vector recombinante, y aislándolo del sobrenadante del cultivo del transformante resultante (cf., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 961 (1991); Biochem. Biophys. Res. Commun., 186, 1553
(1992)), que sea adecuado para la producción a gran escala del BDNF con propiedades uniformes. Las
células huésped para ser usadas en el proceso anterior no son un problema, pudiéndolo ser cualquier célula
huésped convencional que haya sido usada en técnicas de ingenierı́a genética, por ejemplo: Escherichia
coli, Bacillus subtilis, levaduras, células vegetales o células animales.
Una proteı́na modificada del BDNF puede ser obtenida por adición, substitución, borrado o retirada
de una parte de la secuencia del aminoácido de un BDNF natural por medio de una técnica de ingenierı́a
genética. Cualquier proteı́na modificada del BDNF obtenida de esta manera se incluye también en los
BDNF a ser utilizados en la presente invención, aún cuando una parte de la secuencia del aminoácido
de la misma sea borrada o substituida por otro aminoácido, o insertada en la misma una parte de otra
secuencia de aminoácido, o unida con uno o más aminoácidos en la terminal N y/o en la terminal C, en
tanto dicha proteı́na modificada del BDNF muestre que las actividades biológicas son de igual calidad
que aquéllas del BDNF, es decir, las actividades biológicas en las células nerviosas: como una actividad
de supervivencia de las células nerviosas, la actividad de extensión de las neurodendritas, la actividad
de promover la producción de neurotransmisores. Es decir, además de los BDNF maduros, puede ser
utilizado en la presente composición el Met-BDNF que tenga una metionina en el terminal N del BDNF,
etc., en tanto muestre que las actividades neurotróficas son de la misma calidad que aquéllas de los BDNF
naturales.
El término “surfactante” utilizado en la presente invención significa cualquier surfactante farmacéuticamente aceptable que sea útil en medicamentos para humanos, o para otros animales, e incluye,
R
(Polisorbato 80 =
por ejemplo, un surfactante no iónico. El surfactante más preferido es el Tween 80
R
monooleato de sorbitan polioxietilenado), o el Tween 20 (Polisorbato 20 = monolaurato de sorbitan
polioxietilenado), el Plurónico F-68 (= un glicol polioxipropileno polioxietilenado), el glicol polietileno,
etc.. El surfactante es añadido a la composición farmacéutica de la presente invención en una cantidad
de entre un 0,001 % a un 10 % en peso, preferiblemente en una cantidad de entre un 0,001 % a un 0,1 %
en peso, del peso del agua en la composición acuosa.
La “sal” puede ser una sal farmacéuticamente aceptable, que sea útil en medicamentos para humanos,
o para otros animales, e incluye, por ejemplo, el cloruro de sodio. El cloruro de sodio es utilizado con el
fin de mantener adecuada la presión osmótica para una preparación inyectable de la presente composición
farmacéutica, especialmente en una cantidad de entre 150 y 300 mM, por medio de la cual la preparación
inyectable muestra una proporción de presión osmótica de 1 a 2.
El término “agente tamponador” significa un agente tamponador que sea añadido a la composición
con el fin de ajustar el valor del pH en una preparación en solución o en una preparación liofilizada,
en esta última preparación, el pH una vez reconstituida. El agente tamponador representativo es, por
ejemplo, un tampón de fosfato, un tampón Tris, y un tampón de citrato. El agente tamponador ajusta
el valor del pH de la solución para que se mantenga la estabilidad del BDNF. El valor del pH de la
presente composición no es problemático, pero preferiblemente está en el rango de 5,5 a 7,5. El BDNF
es hidrolizado bajo condiciones acı́dicas con el fin de producir muchos fragmentos derivados del BDNF,
y es después deamidizado o hidrolizado bajo condiciones básicas. La concentración final del agente tamponador en la composición está en el rango de 1mM a 100 mM.
El “estabilizador adicional” incluye, por ejemplo, aminoácidos como la glicina o alcoholes de azúcar,
como el manitol, y estos estabilizadores adicionales pueden ser usados conjuntamente. Cuando se prepara
la composición farmacéutica del BDNF añadiendo el estabilizador adicional mejora en gran medida la
estabilidad de almacenamiento del BDNF en la preparación. El estabilizador adicional -por ejemplo, la
glicina o el manitol- se añade en un cantidad de entre 0,01 y 100 veces en peso, más preferiblemente de 0,1
a 10 veces en peso, del peso del BDNF. La glicina y/o el manitol pueden ser usados en una composición
en solución de la presente invención, pero pueden mostrar efectos de estabilización más importantes en
la composición liofilizada de la presente invención. Estos aminoácidos y alcoholes de azúcar pueden ser
utilizados individualmente pero, preferiblemente, en combinación.
La “composición liofilizada” de la presente invención puede ser preparada al someter una composición
en solución del BDNF a la liofilización por medio de una liofilización convencional, o técnica de congelación-desecación. Por ejemplo, el BDNF es disuelto en un solvente acuoso adecuado, como un agua
destilada para inyección, una solución tamponadora, una solución fisiológica salina, etc., y es añadida al
mismo un estabilizante, un agente tamponador, o una sal, si es necesario, siendo esterilizada la solución
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ası́ obtenida por medio de filtración a través de un filtro, y después liofilizada, con el fin de obtener una
composición liofilizada de la presente invención.
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Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente un aditivo convencional
que sea utilizado usualmente en las preparaciones farmacéuticas, por ejemplo, un solubilizador, un antioxidante, un agente anestésico, un agente isotónico, etc.. El método liofilizador es, por ejemplo, un
método consistente en tres fases: una fase de congelación de una solución bajo presión atmosférica, una
primera fase de desecación de sublimación del agua libre -que no es adsorbida por el soluto o no está
unida al mismo- bajo presión reducida, y una segunda fase de desecación, retirando el agua adsorbida por
el soluto o que está unida al mismo (cf., Pharm. Tech. Japan 8 (1), 75-87 (1992)). El BDNF contenido
en la composición puede ser mantenido de forma muy estable durante los procesos de preparación de la
composición de la presente invención, como por ejemplo: por medio de la disolución en un solvente, por
congelación-desecación del mismo, ası́ como al reconstituir una composición liofilizada.
Puede ser variado el contenido del BDNF en las composiciones, dependiendo de los tipos de enfermedades a ser curadas, o de la ruta de administración del mismo.
La composición farmacéutica del BDNF de la presente invención puede ser introducida en un vial por
medio de su colocación en un vial, rellenándolo de gas nitrógeno, y después sellando el vial. Cuando el
vial es rellenado de gas nitrógeno, éste impide la desnaturalización del BDNF contenido en el mismo y,
de esta forma, puede ser guardado de forma más estable.
La presente invención se ilustra con más detalle por medio de los siguientes Ejemplos, pero no debe
ser preparada para estar limitada a los mismos.
25
Ejemplo 1
Efectos del surfactante 1
30
35
Preparación de una composición en solución del BDNF sin un surfactante (Composición en solución
de Referencia 1)
El BDNF fue disuelto en 10mM de un tampón de fosfato (pH 7,0, 150mM de cloruro de sodio)
para proporcionar una solución del BDNF acuosa (20 mg/ml). La solución ası́ obtenida fue introducida
asépticamente en viales, con el fin de proporcionar una composición en solución del BDNF que no contenga ningún surfactante.
Preparación de una composición en solución del BDNF con un surfactante (Composición en solución
Presente 1)
40
El BDNF fue disuelto en 10mM de un tampón de fosfato (pH 7,0, 150mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (20 mg/ml). La solución ası́ obtenida
de Tween 80
fue introducida asépticamente en viales, con el fin de proporcionar una composición en solución del BDNF
conteniendo un surfactante.
45
Experimento 1
50
Usando la Composición en solución de Referencia 1 y la Composición en solución Presente 1 fue
medido el efecto inhibidor de un surfactante en la producción de agregados. Las composiciones fueron
mantenidas a 25◦ C, con una vibración de 5 cm x 75 golpes/min. El periodo (dı́as) hasta que se produjeron
agregados fue determinado por observación visual. Los resultados se muestran en la Tabla 1. De los datos
R
inhibió la producción de agregados del BDNF en
resultantes, se prueba que la adición del Tween 80
una composición en solución.
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TABLA 1
R
Efectos del Tween 80
en la producción de agregados del BDNF (n=5)
5
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Ejemplo 2
Efectos del surfactante 2
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Preparación de una composición en solución del BDNF sin un surfactante (Composición en solución
de Referencia 2)
25
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio) par proporcionar una solución del BDNF acuosa (0,1 mg/ml). La solución ası́ obtenida fue introducida asépticamente
en viales para proporcionar una composición en solución del BDNF que no contiene ningún surfactante.
Preparación de una composición en solución del BDNF con un surfactante (Composición en Solución
Presente 2)
30
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (0,1 mg/ml). La solución ası́ obtenida
de Tween 80
fue introducida asépticamente en viales para proporcionar una composición en solución del BDNF conteniendo un surfactante.
35
Experimento 2
40
Usando la Composición en solución de Referencia 2 y la Composición en solución Presente 2 fue
medido el efecto inhibidor de un surfactante en la adsorción del BDNF en el recipiente. La concentración
del BDNF fue determinada por medio de la espectrometrı́a de absorción, inmediatamente antes y después
de que la solución del BDNF fuera puesta en un vial de vidrio, y fue calculada la cantidad del BDNF
adsorbida en el vial de vidrio. Los resultados se muestran en la Tabla 2. De estos resultados, se prueba
R
reduce la cantidad de adsorción del BDNF en el vial de vidrio en una
que la adición del Tween 80
composición en solución.
TABLA 2
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R
Efectos del Tween 80
en la adsorción del BDNF en la superficie del vidrio
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Ejemplo 3
Efectos del pH
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Preparación de una composición en solución del BDNF (Composición en solución Presente 3)
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (0,5 mg/ml). El valor del pH de la
de Tween 80
solución del BDNF acuosa ası́ obtenida fue ajustado con 1N HCl o 1N NaOH a 6 grados de pH 4, 5, 6,
7, 8 o 9. Las soluciones ası́ obtenidas fueron introducidas asépticamente en viales para proporcionar una
composición en solución del BDNF.
Preparación de una composición liofilizada del BDNF (Composición Liofilizada Presente 3)
15
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (20 mg/ml). La solución ası́ obtenida
de Tween 80
fue introducida asépticamente en viales y liofilizada bajo las condiciones mostradas en la Tabla 3, con el
fin de proporcionar una composición del BDNF liofilizada. En la Tabla 3, el sı́mbolo → significa que la
temperatura fue cambiada.
20
TABLA 3
Condiciones de Liofilización
25
30
35
40
45
Experimento 3
Usando la Composición en solución Presente 3 y la Composición Liofilizada Presente 3 fueron estudiados los efectos del valor del pH en la estabilidad de almacenamiento del BDNF. Las composiciones
obtenidas más arriba fueron mantenidas a 25◦C o a 40◦C durante 3 meses, siendo determinados los
contenidos del BDNF, del BDNF polimerizado y del BDNF desnaturalizado por los métodos que más
abajo se indican. Según se muestra en la Tabla 4, el contenido del BDNF era reducido bajo condiciones
básicas, pero ligeramente reducido bajo condiciones acı́dicas. Apenas se produjo BDNF polimerizado
bajo condiciones acı́dicas, pero se incrementó bajo condiciones básicas. Por otro lado, el contenido del
BDNF desnaturalizado se incrementó más bajo condiciones acı́dicas que bajo condiciones básicas.
50
Método para determinar el contenido del BDNF
El BDNF fue diluido en 2 mg/ml, determinándose la concentración del mismo por cromatografı́a en
fase reversa bajo las siguientes condiciones:
55
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Columna:
Solvente:
VYDAC214BTPC4
Solución A: 0,1 % solución ácida trifluoroacética acuosa.
Solución B: 0,1 % solución ácida trifluoroacética en acetonitrilo.
Condiciones de graduación:
La concentración ( %) de la Solución B fue 26, 35, 35, 90, 26 y 26, en un tiempo (minutos) de 0, 36,
42, 46, 47, 66, respectivamente.
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ES 2 183 170 T3
Detección: 215 nm.
Porcentaje de flujo: 1,0 ml/min.
5
Temperatura: 60◦ C
Aplicación: 25 µl
Método para determinar el BDNF polimerizado/desnaturalizado:
10
Método para determinar el contenido del BDNF
El BDNF fue diluido en 2 mg/ml, determinándose la concentración del mismo por cromatografı́a por
filtración por gel bajo las siguientes condiciones:
15
Columna: SUPERDEX75HR
Solvente: 300 mM de fosfato de sodio, 500 mM de cloruro de sodio, 5 % n-Propanol, pH6.
Detección: 215 nm
20
Porcentaje de flujo: 0,6 ml/min.
Aplicación: 10 µl
TABLA 4
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Efectos del valor del pH en la estabilidad del BDNF
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40
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50
55
60
∗
: El porcentaje del área máxima total.
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Ejemplo 4
Estabilidad durante los procedimientos de liofilización, y efectos de las formas de composición
5
10
Preparación de una composición en solución del BDNF (Composición en solución Presente 4)
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 % de
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (5 mg/ml). La solución ası́ obtenida fue
Tween 80
introducida asépticamente en viales, y los viales fueron rellenados con gas nitrógeno y después sellados,
con el fin de proporcionar una composición en solución del BDNF.
Preparación de una composición liofilizada del BDNF (Composición Liofilizada Presente 4)
15
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (5 mg/ml). La solución ası́ obtenida
de Tween 80
fue introducida asépticamente en viales y liofilizada bajo las condiciones mostradas en la Tabla 3, con el
fin de proporcionar una composición liofilizada del BDNF. Los viales fueron rellenados con gas nitrógeno
y fueron sellados.
20
Experimento 4
25
Con el fin de estudiar la estabilidad del BDNF durante los procedimientos de liofilización fueron determinados el contenido del BDNF y las actividades biológicas del mismo en una composición en solución
del BDNF, antes de los procedimientos de liofilización del Ejemplo 4, y en una solución acuosa redisuelta
de la composición liofilizada, por el método que se menciona más abajo. Los resultados son mostrados
en la Tabla 5. No fueron reconocidos cambios significativos ni antes ni después de los procedimientos
de liofilización, por lo cual se prueba que el BDNF es estable durante los procedimientos de liofilización
y la fase de redisolución posterior, y que el BDNF puede ser formulado en forma de una composición
liofilizada.
30
Método para determinar las actividades biológicas del BDNF
35
Las actividades biológicas del BDNF fueron determinadas en base al potencial de proliferación celular
de las células BAF-trkB cuando son tratadas con el BDNF. Dichas células BAF-trkB fueron preparadas
al introducir un gen trkB (un receptor del BDNF) en células pre-B dependientes de la IL3 (cf., Cell, 41,
727-734, Julio 1985) de la misma manera en que se describe en la Patente americana 5.622.862.
TABLA 5
Estabilidad del BDNF durante los procedimientos de liofilización
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Experimento 5
60
Con el fin de estudiar las diferencias en la estabilidad de almacenamiento entre la composición en
solución y la composición liofilizada del BDNF fueron determinados los contenidos del BDNF en las
composiciones preparadas en el Ejemplo 4, inmediatamente después de la preparación de las mismas, o
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después de tres meses de almacenamiento a 25◦C, o 40◦C. Los resultados se muestran en la Tabla 6. En la
composición liofilizada el contenido del BDNF polimerizado fue ligeramente superior al de la composición
en solución, pero el contenido per se del BDNF es superior, y el contenido del BDNF desnaturalizado fue
inferior al de la composición en solución.
5
TABLA 6
Efectos de las formas de composición en la estabilidad del BDNF
10
15
20
25
30
Ejemplo 5
Efectos del surfactante 5
35
Preparación de una composición liofilizada del BDNF con un surfactante (Composición Liofilizada
Presente 5)
Fue preparada una composición liofilizada del BDNF siguiendo el mismo método que en el Ejemplo
4, con el fin de proporcionar la Composición Liofilizada Presente 5.
40
45
Preparación de una composición liofilizada del BDNF sin un surfactante (Composición Liofilizada de
Referencia 5)
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio) para
proporcionar una solución del BDNF acuosa (5 mg/ml). La solución ası́ obtenida fue introducida
asépticamente en viales y liofilizada bajo las mismas condiciones que se muestran en la Tabla 3, con el
fin de proporcionar una composición liofilizada del BDNF. Los viales fueron rellenados con gas nitrógeno
y sellados.
Experimento 6
50
55
Con el fin de estudiar los efectos de un surfactante en el aspecto de la solución redisuelta de una
composición liofilizada, la Composición Liofilizada de Referencia 5 y la Composición Liofilizada Presente
5 fueron disueltas en agua purificada, siendo observado visualmente el aspecto de estas soluciones. Los
resultados se muestran en la Tabla 7. Cuando se reconstituyó la Composición Liofilizada Presente 5 la
solución era clara, mientras que la Composición Liofilizada de Referencia 5 -en donde no se añadió ningún
surfactante- era turbia después de la disolución de la misma.
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10
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TABLA 7
Efectos del surfactante en el aspecto de una solución redisuelta de la composición liofilizada
5
10
15
Ejemplo 6
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Efectos de un estabilizante en la estabilidad de la composición liofilizada del BDNF
Preparación de una composición liofilizada del BDNF con un surfactante (Composición Liofilizada
Presente 6A)
25
Se preparó una composición liofilizada del BDNF por el mismo método que en el Ejemplo 4, con el
fin de proporcionar la Composición Liofilizada Presente 6A.
Preparación de una composición liofilizada del BDNF sin surfactantes (Composición Liofilizada Presente 6B)
30
35
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (5 mg/ml). Se añadió manitol a la
de Tween 80
solución, de tal forma que la concentración final de manitol fue de 10 mg/ml. La solución del BDNF
acuosa ası́ obtenida fue introducida asépticamente en viales y liofilizada bajo las mismas condiciones
mostradas en la Tabla 3, con el fin de proporcionar una composición liofilizada del BDNF. Los viales
fueron rellenados con gas nitrógeno y sellados.
Preparación de una composición liofilizada del BDNF con un surfactante (Composición Liofilizada
Presente 6C)
40
45
El BDNF fue disuelto en 10mM de tampón de fosfato (pH 7,0, 150 mM de cloruro de sodio, 0,01 %
R
) para proporcionar una solución del BDNF acuosa (5 mg/ml). Se añadió glicina a la
de Tween 80
solución, de tal forma que la concentración final de glicina fue de 10 mg/ml. La solución acuosa ası́
obtenida fue introducida asépticamente en viales y liofilizada bajo las condiciones mostradas en la Tabla
3, con el fin de proporcionar una composición liofilizada del BDNF. Los viales fueron rellenados con gas
nitrógeno y sellados.
Experimento 7
50
55
Usando las Composiciones Liofilizadas Presentes 6A, 6B y 6C fue determinado el contenido del BDNF
inmediatamente después de la preparación, o después de un mes de almacenamiento a 40◦ C. Los resultados
se muestran en la Tabla 8. Además, usando las Composiciones Liofilizadas Presentes 6A y 6B también fue
determinado el contenido del BDNF inmediatamente después de la preparación, o después de 3 meses de
almacenamiento a 25◦ C o 40◦C. Los resultados se muestran en la Tabla 9. Las composiciones conteniendo
un estabilizador mostraron una mayor estabilidad que las composiciones que no contenı́an estabilizadores.
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TABLA 8
Efectos del estabilizador en las Composiciones Liofilizadas 1
5
10
15
20
25
Nota: En las Composiciones 6A, 6B y 6C utilizadas en este experimento los viales no fueron rellenados
con gas nitrógeno.
TABLA 9
30
Efectos del estabilizador en las Composiciones Liofilizadas 2
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40
45
50
55
Aplicación industrial
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La composición farmacéutica del BDNF de la presente invención puede mantener estable al BDNF
durante un largo espacio de tiempo al añadir al mismo un surfactante. La presente composición del
BDNF muestra los siguientes efectos:
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ES 2 183 170 T3
(1) previene la producción de turbiedades o agregaciones del BDNF en una composición de una solución farmacéutica del BDNF de la presente invención durante el almacenamiento del mismo;
5
(2) previene la producción de turbiedades o agregaciones del BDNF cuando se disuelve una composición farmacéutica liofilizada del BDNF de la presente invención;
(3) previene, por lo tanto, la adsorción del BDNF en la superficie de un recipiente de vidrio o resina;
y
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15
20
(4) preserva las actividades biológicas del BDNF.
La composición farmacéutica del BDNF que contiene una sal como agente isotónico, un agente tamponador para el mantenimiento de un valor óptimo de pH, o que contenga ambos, una sal y un agente
tamponador, puede estar en forma de una composición farmacéutica apropiada para su uso clı́nico. La
estabilidad del BDNF contenido en la composición en solución farmacéutica de la presente invención
mejora aún más cuando está liofilizada.
La composición farmacéutica liofilizada del BDNF de la presente invención es más estable conteniendo,
adicionalmente, como un estabilizador adicional, un aminoácido y/o alcohol de azúcar. Especialmente,
la composición liofilizada del BDNF conteniendo glicina -como un aminoácido- y/o manitol -como un
alcohol de azúcar-, es la composición más estable.
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50
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REIVINDICACIONES
5
1. Una composición farmacéutica estable de un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la
cual comprende un BDNF y un surfactante mezclados con un portador convencional farmacéuticamente
aceptable o diluyente.
2. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 1, en donde el surfactante es un surfactante no iónico.
10
3. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 2, en donde el surfactante no iónico es
R
.
el Tween 80
4. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 3, en donde está contenido el Tween
R
en una cantidad de entre un 0,001 % (w/v) y un 10 % (w/v).
80
15
5. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 1, la cual comprende además una sal.
6. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 5, en donde la sal es el cloruro de sodio.
20
7. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 1, la cual comprende además un agente
tamponador.
8. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 7, en donde el agente tamponador es
un tampón de fosfato.
25
30
9. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 1, la cual tiene un valor de pH en el
rango de 5,5 a 7,5.
10. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 1, la cual está en forma de una composición liofilizada.
11. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 10, la cual comprende además un
estabilizador adicional.
35
12. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 11, en donde el estabilizador adicional
pertenece al grupo de aminoácidos y de alcoholes de azúcar, o es una combinación de los mismos.
13. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 12, en donde el aminoácido es la glicina, y el alcohol de azúcar es el manitol.
40
45
14. La composición farmacéutica, conforme a la reivindicación 11, en donde el estabilizador adicional
está contenido en un rango de entre un 0,1 y un 10 % en peso del peso del BDNF.
15. Una composición farmacéutica liofilizada del BDNF, la cual contiene como estabilizador el Tween
R
, y como estabilizador adicional el manitol, en la cantidad total de entre un 0,01 % (w/v) y un 10 %
80
(w/v), basada en el peso total una vez reconstituida en un medio acuoso.
16. Un método para estabilizar un BDNF en una composición farmacéutica, el cual comprende la
incorporación de un surfactante a la composición farmacéutica de un BDNF.
50
17. El método, conforme a la reivindicación 16, en donde el surfactante es un surfactante no iónico.
18. El método, conforme a la reivindicación 16, en donde la composición farmacéutica de un BDNF
comprende, además, una sal y/o un agente tamponador.
55
19. El método, conforme a la reivindicación 16, en donde la composición farmacéutica está en forma
de una composición liofilizada.
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14
ES 2 183 170 T3
20. El método, conforme a la reivindicación 19, el cual comprende, además, la adición de un estabilizador adicional, seleccionado de entre un aminoácido, un alcohol de azúcar, o una combinación de los
mismos.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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