aislamiento de levaduras capaces de producir alcohol a partir de

AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE
MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE
FÚQUENE
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTA DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá D.C
AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE
MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE
FÚQUENE
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al titulo de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTA DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá D.C
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE
MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE
FÚQUENE
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
APROBADO
Patricia Martínez Nieto
Directora
Fundación Humedales
Henry Córdoba
Pontificia Universidad Javeriana
Jorge Robles Camargo
Codirector
Pontificia Universidad Javeriana
Erika Patricia Martínez
CORPOICA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTA DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá D.C
AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE
MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE
FÚQUENE
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
APROBADO
Ingrid Schuler Ph.D
Decana Académica
Janeth Arias Palacios MSc
Directora de Carrera
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTA DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá D.C
AGRADECIMIENTOS
A nuestros padres por su apoyo
A la Fundación Humedales por permitirnos realizar el proyecto
A la Pontificia Universidad Javeriana en especial a la facultad de química por permitirnos el uso
de los laboratorios y los reactivos necesarios para el desarrollo del proyecto.
A nuestra directora Patricia Martínez y codirector Jorge Robles por la colaboración durante la
realización de esta investigación.
A Elizabeth Gil por la colaboración prestada en algunos ensayos realizados.
Al Dr. Jaime Bernal por su asesoría.
Al Hospital San Ignacio por permitirnos realizar la prueba de identificación de levaduras.
Y a todas las personas que de una u otra forma hicieron parte de este proyecto y lograron su
realización.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. Introducción
1
2. Justificación y planteamiento del problema
2
3. Marco teórico
3
3.1. Laguna de Fúquene
3
3.2. Problema ambiental
3
3.3. Macrófitas contaminantes de la Laguna de Fúquene
3
3.3.1 Elodea (Egeria Densa)
3
3.3.2 Buchón de Agua (Eichhornia Crassipes)
4
3.3.3 Alternativas de disposición de las macrófitas
4
3.4 .Bioetanol
2.4.1. Producción de bioetanol
3.5. Hidrólisis
3.5.1. Hidrólisis química
5
5
5
6
3.5.1.1. Hidrólisis con ácidos concentrados
6
3.5.1.2. Hidrolisis con ácidos diluidos
6
3.6.1.3. Hidrólisis enzimática
6
3.6. Fermentación de los azúcares
7
3.7. Cuantificación de etanol
7
4. Objetivos
8
4.1. Objetivo general
8
4.2. Objetivos específicos
8
5. Metodología
9
5.1. Muestreo
9
5.2 Aislamiento de levaduras
9
5.3 Hidrólisis
9
5.3.1 Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético
9
5.3.2 Hidrólisis mixta
9
5.3.3 Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio
10
5.3.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus
10
5.3.5. Azucares reductores
10
5.3.6. Análisis de datos
10
5.4. Determinación de la producción de etanol
10
5.4.1. Prueba de yodoformo
10
5.4.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la
11
técnica del dicromato de potasio
5.4.3. Cromatografía de gases acoplada a masas
5.5. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras
6. Resultados y discusión
11
11
12
6.1. Muestreo y aislamiento
12
6.2. Hidrólisis
12
6.2.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético
12
6.2.2. Hidrólisis mixta
14
6.2.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio
14
6.2.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus
16
6.3. Determinación de la producción de etanol
6.3.1. Prueba de yodoformo
19
19
6.3.2. Determinación semi-cuantitativa de la producción
de etanol por la técnica del dicromato de potasio
19
6.3.3. Cromatografía de gases acoplada a masas
22
6.4. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras
24
7. Conclusiones
26
8. Recomendaciones
27
9. Bibliografía
28
10. Anexos
37
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Concentación de azucares obtenidos en la hidrólisis
con diferentes mezclas de ácido sulfurico y tratamietnos
de buchon (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos
12
Figura 2. Concentación de azúcares reductores en la hidrólisis
con diferentes mezclas de ácido sulfurico y tratamientos
de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos
13
Figura 3.Concentración de azúcares reductores obtenidos en la
hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio al 5% en buchón con
diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos
15
Figura 4. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la
Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio al 5% en elodea
con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos
15
Figura 5. Concentración de azúcares reductores obtenidos en
la hidrólisis biologica con Pleurotus ostreatus en buchón utilizando
diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de incubación
16
Figura 6. Concentración de azúcares reductores obtenidos en
la hidrólisis biologica con Pleurotus ostreatus en elodea utilizando
diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de incubación
17
Figura 7. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas
en el diseño in vitro con buchón durante 48 horas de incubación de forma
semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
20
Figura 8. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas
en el diseño in vitro con elodea durante 48 horas de incubación de forma
semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
21
Figura 9. Cromatograma de la producción de etanol con la
levadura 30 en el medio hidrolizado con Pleurotus ostreatus,
con un tiempo de retención 1.48 minutos
23
Figura 10. Cromatograma de la producción de etanol con la
levadura 23a en el medio sin hidrólisis, con un tiempo de
retención 1.48 minutos
24
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Comparación estadística de los mejores tratamientos de
hidrólisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrólisis
químicas y con la biológica en buchón
18
Tabla 2. Comparación estadística de los mejores tratamientos
de hidrólisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrólisis
químicas y con la biológica en elodea
18
Tabla 3. Identificación preliminar de las levaduras escogidas como
mejores productoras de etanol por el método del yodoformo
25
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Composición de los medios de cultivo utilizados
durante la fase experimental
37
Anexo 2. Curva patrón para al determinación de azucares
reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)
39
Anexo 3. Curva patrón para la determinación de etanol por
el método del dicromato de potasio
41
Anexo 4. Aislamiento de levaduras en cada medio de cultivo
utilizado en la investigación
44
Anexo 5. Crecimiento de las levaduras escogidas en los
medios hidrolizados y sin hidrólisis biológica
45
Anexo 6. Análisis estadístico de los tratamientos de
hidrólisis acida (H2SO4)
47
Anexo 7.Análisis estadístico de los tratamientos de
hidrólisis alcalina (NaOH 5%)
51
Anexo 8. Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis
biológica con Pleurotus ostreatus
53
Anexo 9. Resultados de los controles de la prueba cualitativa
para la determinación de etanol (yodoformo)
55
Anexo 10. Producción de etanol por la prueba cualitativa de
yodoformo y comparación de los resultados con el crecimiento en
buchón o elodea como única fuente de carbono.
57
Anexo 11.Análisis estadístico de la determinación de etanol
por la prueba del dicromato de potasio
59
Anexo 12.Identificación presuntiva de las 13 cepas de levaduras
escogidas como mejores productoras de etanol
61
RESUMEN
En el presente estudio se investigó la capacidad de las levaduras aisladas de la laguna de
Fúquene para la producción de etanol, utilizando como sustrato el buchón de agua (Eichhornia
crassipes) y la elodea (Egeria densa), mediante una técnica cualitativa (prueba de yodoformo),
semicuantitativa (dicromato de potasio) y cromatografía de gases acoplada a masas.
Cuarenta y nueve levaduras fueron aisladas y se identificaron las 13 cepas que presentaron un
sobrenadante amarillo laminado característico de etanol en la prueba de yodoformo. Estas
cepas se acercaron bioquímicamente a los géneros Candida sp, Brettanomyces sp͘ y
Hansenula sp. Adicionalmente, se realizaron 3 pre-tratamientos hidrolíticos (ácido, alcalino y
biológico) a los sustratos vegetales estudiados (determinando la cantidad de azucares
reductores por el método de DNS), encontrando una mayor cantidad de azucares liberados en
g/L con el tratamiento biológico (Pleurotus ostreatus) a un nivel de significancia de 0.01. Lo
anterior permitió escoger este método hidrolíticos para adecuar los sustratos para la producción
de etanol
A partir de esto se realizó un diseño al azar inoculando las mejores levaduras productoras de
etanol (escogidas mediante una prueba cualitativa de yodoformo) en los medios específicos de
buchón y elodea con el pretratamiento biológico y sin pretratamiento. La concentración de
etanol fue determinada a las 24 y 48 horas de cultivo por la prueba del dicromato de potasio; al
igual que las concentraciones de azucares y la cantidad de células/ml. Al final de la
fermentación se determinó que las levaduras que mayores concentraciones de etanol
produjeron con este método fueron C. albicans en medio hidrolizado de buchón (54.97 g/L) y C.
lusitaniae en medio hidrolizado de elodea (37.80 g/LͿ. A partir de esto se realizó una
cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas de estas levaduras, donde se
comprobó la producción de etanol en los medios hidrolizados y no hidrolizados con un tiempo
de retención del catión molecular de 1.48 minutos.
1. INTRODUCCION
La laguna de Fúquene es una importante fuente hídrica para los departamentos de Boyacá y
Cundinamarca; lamentablemente está desapareciendo, debido a la eutroficación producida por
la contaminación proveniente de desechos agrícolas, ganaderos y de aguas residuales. Estos
desechos contienen alta concentración de nitrógeno (N), fósforo (P) y materia orgánica,
promoviendo el crecimiento de plantas acuáticas como buchón de agua y elodea brasilera, que
están deteriorando conjuntamente con otros factores el ecosistema y reduciendo el espejo de
agua.
A partir de este problema, los pescadores de la Asociación “Los Fundadores” con el apoyo de
La Fundación Humedales, el Instituto de Desarrollo Rural -ICONDER- y la Corporación Andina
de Fomento –CAF-,empezaron a utilizar como materia prima los desechos de las malezas
acuáticas en la producción de abono orgánico. Pero, a pesar de ser efectivo, controla solo
parcialmente la problemática de la disposición final de estos desechos, ya que la cantidad de
buchón de agua destinada para la producción de bioabono es solo una pequeña proporción
comparado con la cantidad extraída mensualmente de material vegetal.
Estudios recientes han empleado el buchón de agua, principalmente, en la producción de papel
y biocombustible (bioetanol). El Jacinto de agua o buchón es un excelente candidato como
materia prima para los anteriores procesos debido a su contenido de celulosa. La celulosa se
hidroliza por acción química o enzimática produciendo azucares que se fermentan
posteriormente a etanol. El empleo de esta planta acuática como sustrato puede disminuir la
problemática que se presenta en la laguna Fúquene y otras lagunas colombianas con el mismo
problema de infestación, y reducir los costos de producción de este biocombustible, ya que el
buchón de agua presenta un rápido crecimiento, es de fácil cultivo y propagación.
Por lo anterior esta investigación pretende aislar levaduras procedentes de la laguna de
Fúquene capaces de producir alcohol a partir de las plantas acuáticas invasoras, buchón de
agua y elodea, como punto de partida en la búsqueda de alternativas para solucionar la
disposición final de estas plantas acuáticas una vez extraídas de la laguna de Fúquene y
mejorar la calidad de vida de los pescadores de la zona.
ϭ
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA
La laguna de Fúquene constituye una fuente de sustento y seguridad alimentaria para más de
200 familias, muchas de ellas dedicadas a la pesca artesanal; que junto con la agricultura se
constituyen en dos campos de donde proceden los ingresos de las mismas.
Desafortunadamente en la laguna por causa de la contaminación se acumulan grandes
cantidades de nutrientes que permiten el crecimiento de maleza acuática como buchón de
agua y elodea. Estas plantas generan eutroficación en la laguna y crea no solo un gran impacto
medioambiental, sino también un problema socio económico ya que muchas familias de
pescadores dependen de ella (Fundación Humedales, 2001; Cruz, 2004; Estrada et al., 2004)
Estudios recientes han demostrado que el buchón de agua puede ser una opción viable como
sustrato para la producción de biocombustible y aunque hasta el momento no se han
encontrado estudios reportados para la macrófita elodea, dado el rápido crecimiento y fácil
obtención de la laguna, podría ser una alternativa económicamente sustentable y amigable con
el medio. Lo anterior debido a que no solo se disminuye la biomasa extraída de la laguna, sino
también se contribuye a control de las emisiones de gases tóxicos a la atmosfera por parte de
los combustibles provenientes del petróleo (García, et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya, et al
2007).
Ϯ
3. MARCO TEORICO
3.1. Laguna de Fúquene
La laguna de Fúquene, se ubica en el sistema hídrico de los ríos Ubaté y Suárez en el
departamento de Cundinamarca, con una altitud de 2539 m. Esta laguna tiene una superficie
total de 3150 ha, un volumen de 50 millones de m3 y una profundidad media de 2 m (Japan
International Cooperation Agency-JICA-, 2000; Ministerio del Medio Ambiente, 2002;
Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca -CAR-, 2009). La laguna posee una alta
biodiversidad, con una fauna de 91 especies de vertebrados (mamíferos, aves, peces), y hace
parte de los humedales del altiplano de Cundinamarca y Boyacá, que son centro de diversidad
biológica y endemismo de la biota de agua dulce Andina, más importante del Norte de
Suramérica (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial -MAVDT-, et al 2006;
Valderrama, 2007).
Esta importante red hídrica soporta una población de más de 200 mil habitantes que viven de la
ganadería, la agricultura, la minería, el desarrollo agroindustrial y la pesca; siendo esta ultima
una fuente de seguridad alimentaria (Instituto Colombiano para el Desarrollo Rural-INCODER-,
2009). Otro importante servicio ambiental radica en que el complejo de humedales es fuente de
agua para el consumo de más de 70,000 personas y como proveedor para el sistema de riego,
sobre el cual se basa una de las industrias lecheras más prósperas del país (Maya y Castillo,
2005; Fundación Humedales, 2008).
3.2. Problema ambiental
Hoy día, el avance de la frontera agrícola continúa siendo una de las principales causas de la
disminución del 70% de la extensión de la laguna. Actualmente hay más de 21.000 hectáreas
sembradas con cereales, maíz, arveja y fríjol y la situación se agrava con la ganadería
extensiva en ladera e intensiva en la zona plana. Además se usan fertilizantes químicos para
adaptar la zona a la actividad agropecuaria y varios concentrados, sales y otros suplementos,
cuyos residuos van a parar a la laguna al igual que las excretas (Tognetti, 2006).
Ademas lo anterior, la explotación minera de carbón que saca más de 763.000 toneladas del
mineral al año y el desarrollo urbano, le descarga a la laguna las aguas residuales domésticas
e industriales de los habitantes de 14 municipios (CAR, 2000 y 2009).
El alto deterioro de este cuerpo de agua esta representado en los excesivos niveles de fosfatos
y nitratos agregados por el sector ganadero y agricultor, así como la proliferación de plantas
acuáticas como buchón de agua y la elodea, que han acelerado procesos de eutroficación y
por consiguiente de desecación de la laguna. El espejo de agua se ha reducido
considerablemente haciendo imposible la navegación (Fundación Humedales, 2008).
3.3. Macrófitas contaminantes de la laguna de Fúquene
3.3.1. Elodea (Egeria densa)
Esta planta se conoce comúnmente como Elodea, y científicamente como Egeria densa, de la
Familia Hidrocharitaceae. Es una de las plantas acuáticas más comunes, originaria de
Sudamérica y América central que se caracteriza por su rápido crecimiento (Morgan, 2009).
Es una planta que puede estar tanto enraizada en el sustrato como flotante, además es una
gran consumidora de nutrientes y tiene la ventaja debido a su rápido crecimiento que
desprende una sustancia antibiótica que ayuda a evitar el crecimiento de las algas verdeazuladas. Al mismo tiempo consume tantos nutrientes que evita la aparición de otros tipos de
algas (Feijo et al., 1993; Calixto y Del Basto, 2005). La planta vive enteramente bajo el agua,
salvo sus pequeñas flores que flotan unidas a la planta por delicados tallos (Feijoó et al., 2002).
En el verano, se desprenden hijuelos de la planta madre, que luego enraíza, y comienza una
nueva planta, formando grupos densos que cubre a los invertebrados acuáticos, peces y
anfibios.
Esta planta afecta el movimiento del agua, su calidad y el uso para la pesca, navegación y
recreación. (Dirección General de Aguas-DGA- et al., 2005). Al igual que otros hidrófitos de
crecimiento laminar-tapizante, la explosión demográfica de esta especie produce desajustes
ecosistemáticos, como condiciones de anoxia, eutroficación, alteración del ciclo de los
nutrientes, reducción de la penetración lumínica y desplazamiento de especies nativas (Dillon
ϯ
et al., 1988). Además, su crecimiento puede dar lugar a obstrucciones de conductos y
canalizaciones con la consiguiente pérdida económica para los sectores perjudicados (Ozbay,
2001; The Nature Conservancy of Vermont, 2003)
En nuestro país se encuentran varios cuerpos de agua con invasión de macrófitas acuáticas
en Cundinamarca y Boyacá como la laguna de Fúquene, Tota. Sochagota y Palagua (Ramsar,
2008).
3.3.2. Buchón de agua (Eichhornia crassipes)
Esta planta se conoce con el nombre de Buchón, Jacinto o Lirio de agua y científicamente
como Eichhornia crassipes, de la Familia Ponteridaceae (Petrell y Bagnall, 1991). Puede vivir
en aguas duras o blandas con temperaturas de 15 a 30°C, rangos de pH amplios, de 5.5 a 9.0,
e iluminación alta o muy alta. Puede alcanzar un diámetro de 30 cm y una altura de 20 cm.
Posee hojas en rosetón, peciolos cortos hinchados casi bulbosos, flores vistosas grandes en
forma de espiga y de color violeta o azul claro (Schouben, 2005; Masterson, 2007).
El Buchón de agua es una planta de crecimiento rápido que flota sobre la superficie del agua
ofreciendo un excelente refugio para los peces y protegiéndolos del sol excesivo y las heladas;
sus extensas raíces cuelgan por debajo, donde pueden alcanzar la altura de un metro o más;
en estas condiciones su crecimiento se caracteriza por formar masas compactas que son
arrastradas por el viento (Aweke, 1993). Estas grandes masas pueden ocasionar problemas en
los cuerpos de agua como: Reducción de la biodiversidad, obstrucción de los ríos y
alcantarillado interfiriendo físicamente con la navegación, el flujo del agua y las actividades de
pesca. Estos bloques compactos toman la luz del sol, impidiendo el desarrollo del fitoplancton,
que son básicos en las cadenas alimenticias acuáticas, disminuyen el oxigeno disuelto
producido normalmente por las plantas acuáticas sumergidas. Así como alteración en la
química del agua (Ozimek et al.1993; Schouben, 2005).
Son consideradas entre las 100 especies más invasoras del mundo por la Unión Internacional
para la Conservación de la Naturaleza (UICN) ya que pueden obstruir en poco tiempo una vía
fluvial o lacustre (Sáenz, 2003). Tiene la capacidad de absorber nutrientes (N, P, Ca, K, entre
otros) de los cuerpos de agua, los cuales normalmente se pierden. Como consecuencia de su
proliferación en ríos y lagos importantes, están causando problemas en canales de riego
agrícolas y afecciones a los ecosistemas ribereños; ya que cubre como una manta toda la
superficie del río, por su fácil reproducción vegetativa y sexual (Gunnarsson y Petersen, 2007).
Además es una especie sin predadores, ni competidores en muchos sitios (Schouben, 2005;
Valderrama, 2007)
3.3.3. Alternativas para la disposición de las macrófitas
El buchón de agua se ha convertido en un sustrato para el proceso de compostaje como una
alternativa de gestión al problema generado por la disposición final en Colombia y otros países
del mundo (Eslava y García, 2001; Fundación Humedales y Netherlands Antilles Healthy
Islands Foundation, 2004; Cruz, 2004; Calixto y Del Basto, 2005; Martínez-Nieto, 2004, 2006 y
2007; Palacios, 2007; Fundación Humedales, 2008). Otros usos que se le han dado a esta
planta es su utilización para la fabricación de pulpa de papel, a nivel veterinario la alimentación
de aves de corral, en la fabricación de muebles y bolsos, como fuente de medicamentos, entre
otros. Esta macrófita puede ser económicamente procesada para generar humus de lombriz,
biogás y es comúnmente usada en el reciclaje de aguas, ya que contribuye en la reducción del
DQO, sólidos solubles, nitritos, fosfatos y potasio principalmente (Abraham y Kurup, 1996;
Sharma et al., 1999; Gajalakshmi et al., 2001; Nigam, 2002; Singhal y Rai, 2003; MartínezNieto, 2006; Gunnarsson y Petersen, 2007; Palacios, 2007).
Se ha buscado otras disposiciones finales para el buchón de agua dentro de los cuales esta la
utilización de estos residuos como materia prima para la industria papelera, por el manejo
ecológico de los procesos bajo el esquema de producción más limpia compatible con los
ecosistemas. Además está la utilización de este como filtro biológico para la remoción de
contaminantes orgánicos e inorgánicos y otras sustancias tóxicas, y la producción de
biocombustible como el etanol (Gajalakshmi et al., 2001; Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Lara et
al., 2007).
ϰ
3.4. Bioetanol
El alcohol etílico o etanol es un producto químico obtenido a partir de la fermentación de los
azúcares que se encuentran en los productos vegetales, tales como cereales, remolacha, caña
de azúcar, sorgo o biomasa. Cuando se produce por la fermentación de los azúcares
contenidos en la materia orgánica de las plantas, se denomina bioetanol o etanol de biomasa
(Hernández, 2001; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007 y Corporación
Colombiana Agropecuaria -CORPOICA, 2009). Para la fabricación de este, se puede utilizar
una gran cantidad de materias primas como almidón de maíz, cereales, remolacha o residuos
forestales (Gray et al., 2006). El buchón de agua se ha considerado como posible substrato
para la producción de etanol ya que tienen una ventaja por su rápido crecimiento y obtención a
bajo costo (García et al., 2006; Masami et al., 2008; Mishima et al., 2008).
El combustible bioetanol se emplea como alternativa para disminuir la dependencia de las
importaciones de crudo y minimizar el impacto que las fluctuaciones del mercado ocasionan en
los precios (Inga, 2009). Adicionalmente a esto, la preocupación actual por el cambio climático
debido a las emisiones de los gases del efecto invernadero, ha generado la búsqueda de
prácticas que sean más compatibles con el medio ambiente (Kafarov et al., 2006). Por ejemplo
se puede mezclar la gasolina con bioetanol, ya que las emisiones de gases tóxicos a la
atmosfera por la utilización de etanol es mucho más baja que las emisiones generadas por el
petróleo y sus derivados fundamentalmente disminuyen la emisión de óxidos de azufre y
nitrógeno (Nigam, 2002; Isarankura-Na-Ayudhya et al., 2007; Masami et al., 2008).
Concretamente, emiten un 88% menos de emisiones de dióxido de carbono (CO2) a la
atmósfera; sin embargo, su proceso de fabricación supone un gran esfuerzo para producir
moléculas de azúcar simple que se consigue por el calentamiento de la biomasa o el
tratamiento con ácidos (Campo, 2006; Linde, 2006; Kumar, 2009).
En la actualidad se trabaja fundamentalmente en la búsqueda de materias primas baratas, que
sustituyan a las tradicionales materias azucaradas, como melazas para alcanzar mayor
eficiencia en los procesos de fermentación, recuperación y purificación de alcohol producido
(Hernández, 2001 y Miliarium Aureum, 2004). A raíz de esto se empezó a utilizar como materia
prima la biomasa vegetal, desechos agrícolas o madereros, para producir alcohol, denominado
de segunda generación (González, 2008).
3.4.1 Producción de Bioetanol
En la naturaleza, este proceso es llevado a cabo por diferentes organismos que usan enzimas
para “liberar” el azúcar contenido en la celulosa como algunos géneros bacterianos como
Clostridium sp y Zymommonas sp que fermentan los azúcares y los transforman en alcohol
(Inga, 2009).
Los residuos vegetales contienen una mezcla compleja de carbohidratos como celulosa,
hemicelulosa y lignina que son llevados hasta etanol por acción enzimática (Nigam, 2002; Bon
et al, 2007; Masami et al., 2008). Las celulosas no pueden ser fermentadas directamente, es
necesario degradarlas a azucares más sencillos (García et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya et
al; 2007). Para esto se utilizan pre tratamientos de hidrólisis con ácidos concentrados, diluidos
y la hidrólisis enzimática (Miliarium Aureum, 2004; Kovacs, 2009).
Los materiales para producir etanol que se encuentran disponibles en gran cantidad y bajo
costo son los lignocelulósicos, su empleo podría reducir costes de producción (Angenent,
2007; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007). Una fuente lignocelulolìtica es el
buchón de agua, considerada maleza acuática, que puede ser empleada en la producción de
biocombustible, ya que puede proporcionar los azucares necesarios para la bioconversión a
etanol (Abraham y Kurup, 1996; Nigam, 2007; Misami et al., 2008).
3.5. Hidrólisis
La biomasa lignocelulósica presenta una estructura compleja compuesta de tres fracciones
(celulosa, hemicelulosa y lignina) que deben ser procesadas. La fracción mayoritaria de esta
biomasa es la celulosa cristalina, que debido a su estructura química se dificulta su hidrólisis y
conversión a azúcares fermentables (Reese, 1955; Angenent, 2007; Kovacs, 2009). Por el
contrario la hemicelulosa es fácilmente hidrolizable, pero su carbohidrato principal, la xilosa, es
ϱ
difícil de fermentar a alcohol. Por último la lignina, no puede convertirse en etanol, porque no es
un carbohidrato, sino un polímero rígido aromático.
Mediante un proceso químico (hidrólisis) que divide la celulosa y la hemicelulosa por acción de
la molécula de agua en medio ácido, en moléculas más pequeñas, se logra una solución
azucarada. La hidrólisis permite también eliminar productos de la descomposición que puede
tener efectos desfavorables durante la fermentación como el furfural e hidroximetilfurfural (Bon
y Ferrara 1996; Miliarium Aureum, 2004; Campo, 2006; García, et al., 2006).
3.5.1. Hidrolisis química
3.5.1.2 Hidrólisis con ácidos concentrados
En este proceso se añade ácido sulfúrico a la biomasa seca a una temperatura controlada de
50ºC. Después se añade agua para diluir el ácido de la mezcla, aumentando la temperatura
hasta 100ºC. El producto de este proceso se prensa para posteriormente separar la mezcla de
ácido y azucares (Badger, 2002; García, et al., 2006).La principal ventaja del proceso de
concentración es la alta eficiencia de recuperación del azúcar, que puede ser en el orden de
más del 90% de los azúcares de la hemicelulosa y celulosa. Desafortunadamente, es un
proceso relativamente lento y costoso en cuanto a la recuperación del ácido. Si este no es
recuperado, se deben utilizar grandes cantidades de cal para neutralizar el ácido en la solución
de azúcar, lo cual crea gastos adicionales, por lo que industrialmente no se realiza (Badger,
2002).
3.5.1.3 Hidrólisis con ácidos diluidos
Esta es la hidrólisis más empleada y se realiza mezclando la biomasa con una proporción de
ácido sulfúrico de 0.7% o 1% para hidrolizar la hemicelulosa a 190ºC. Para hidrolizar la
celulosa que es más resistente se usa ácido sulfúrico al 0.4% y 215ºC. Finalmente el producto
hidrolizado se neutraliza y recupera mediante percolación (García et al., 2006; Isarankura-NaAyudhya et al., 2007).
La mayoría de los procesos de diluir el ácido se limitan a una eficiencia de recuperación de
azúcar de alrededor del 50% (Badger, 2002); ya que en la primera reacción convierte los
materiales celulósicos en azúcar y la segunda convierte los azúcares a otros productos
químicos (Biocombustibles, 2007). La mayoría de los otros productos son el furfural (un
producto químico utilizado en la industria del plástico) que puede ser tóxico para los
microorganismos empleados en la fermentación (Campo et al., 2006).
La mayor ventaja de los procesos que utilizan el ácido diluido es su rápida tasa de reacción,
que facilita la continua transformación. Su mayor desventaja es su bajo rendimiento en azúcar.
Para procesos rápidos y continuos, a fin de permitir la penetración del ácido, las materias
primas deberán reducirse en tamaño, de manera que la dimensión máxima de las partículas
está en el rango de unos pocos milímetros (Badger, 2002).
3.5.2. Hidrólisis enzimática
Consiste en transformar la celulosa en azucares de menor peso molecular por la acción de
enzimas llamadas celulasas, para que los microorganismos como levaduras o bacterias
puedan producir etanol (Reese, 1955). En síntesis, el proceso consiste en descomponer la
celulosa y la hemicelulosa del residuo, en azúcares sencillos y transformarlos en etanol por
fermentación. En primer lugar se lleva a cabo un pretratamiento del residuo cuyo objetivo es
alcanzar los mejores resultados en las etapas siguientes (hidrólisis y fermentación) (Gray et al.,
2006). Como resultado del pretratamiento se obtiene una disolución de azúcares provenientes
de la ruptura de la hemicelulosa y un residuo sólido (constituido principalmente por la celulosa
del residuo original) (Kovacs et al., 2009).
Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos,
mesófilos o termófilos. Sin embargo, sólo algunos de ellos producen enzima celulasa
extracelular capaz de hidrolizar la celulosa (Chacón y Waliszewski, 2005).
A partir de los hongos aeróbicos se han obtenido los complejos celulolíticos utilizados en la
mayoría de los estudios (Eriksson y Wood 1985), debido a que son capaces de degradar la
celulosa, la hemicelulosa y la lignina por un complejo de enzimas hidrolíticas y oxidativas (Gosh
y Gosh, 1992). Entre los otros microorganismos productores del complejo enzimático, los
ϲ
termofílicos son de interés por su capacidad para producir enzimas celulolíticas termoestables,
las cuales son en general estables bajo condiciones severas, incluso en niveles de pH
altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta 90 °C (Lamed y Bayer 1988;
Nigam, 2002).
La hidrólisis enzimática es un proceso que presenta ventajas frente a la hidrólisis química,
como bajos costos, mayor rendimiento y la no utilización de agentes químicos (García et al.,
2006; Mishima et al., 2006; Bon et al., 2007;). Además la producción de subproductos puede
ser controlada y las necesidades de energía son relativamente bajas (Badger, 2002; Bell y
Attfield, 2007).
3.6. Fermentación de los azúcares
Este proceso es llevado a cabo por microorganismos como las levaduras, bacterias y hongos
aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos que fermentan los azucares liberados del
pretratamiento. Gracias a la enzima invertasa presente en las levaduras los azucares se
convierten en glucosa y fructosa (Hernández, 2001; Inga, 2009). Estas a su vez reaccionan con
otra enzima llamada zimasa, que también está presente en la levadura para producir el etanol y
dióxido de carbono (Miliarium Aureum, 2004; Garcia et al.,2006; Masami et al.,2008).
3.7. Cuantificación de etanol
Existen varios métodos para medir la concentración de etanol. Están los métodos químicos de
oxidación simple como la prueba del dicromato de potasio, permanganato, cobre y la prueba
del yodoformo. También hay métodos enzimáticos (alcohol oxidasa), de inmunoensayo
(atenuación de la energía radiante) y los cromatográficos en fase gaseosa que utilizan
columnas de acero inoxidable o vidrio y HPLC (Rovida, et al. 1984; Taylor, et al.1984; Sharma
y Quantrill, 1994; Fletcher y Van Staden, 2003; Machinski et al, 2003; Machinski y Nishiyama,
2003; Universidad Nacional de la Plata, 2009). Al igual se encuentran los métodos de
picnómetria y refractometria (Masson, 1997; Morrison y Boyd, 1998; Matiz, 2002).
ϳ
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Aislar de la laguna de Fúquene cepas nativas de levaduras capaces de producir alcohol a partir
de Jacinto o Buchón de agua (Eichhornia crassipes) y/o Elodea brasilera (Egeria densa) como
primer paso en la búsqueda de alternativas sostenibles para solucionar la disposición final de
esta macrófitas extraídas mecánicamente de la laguna de Fúquene.
4.2. Objetivos específicos
• Obtener de la laguna de Fúquene cepas nativas de levaduras que utilicen el buchón y/o
elodea (con o sin pretratamiento de hidrólisis de carbohidratos) como fuente de
carbono.
• Escoger las levaduras nativas que produzcan alcohol a partir de la utilización de las
macrófitas acuáticas extraídas de la laguna de Fúquene.
• Caracterizar a un nivel taxonómico preliminar las levaduras que produjeron alcohol a
partir de buchón de agua y elodea, especies contaminantes de la laguna de Fúquene.
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5. METODOLOGIA
5.1. Muestreo
Se escogieron 5 puntos dentro de la extensión de la laguna de Fúquene y se tomaron 3
muestras de agua en cada uno, para un total de 15 muestras. En cada punto se midieron las
características fisicoquímicas con sonda multiparámetro, en cuanto a temperatura, pH,
conductividad y sólidos disueltos; al igual se midieron parámetros como la profundidad, olor y
color. Los puntos fueron georeferenciados con un sistema de Global Position System (GPS),
marca GARMIN NUVI 200w suministrado por la Fundación Humedales y a la Asociación de
pescadores de Fúquene “Los Fundadores”.
En dos de los sitios muestreados, además se recolectaron muestras por triplicado de las
plantas acuáticas buchón y elodea y adicionalmente se tomaron muestras de suelo y compost
a un Km en inmediaciones a la laguna de Fuquene del embarcadero en la vereda Guatancuy
del municipio de Fúquene.
5.2. Aislamiento de levaduras
Un volumen de 5 mL de las 15 muestras de agua obtenidas de la laguna de Fúquene se
sembraron en los medios líquidos melaza, YGC, soya-malta, arroz, buchón (Anexo 1). Este
mismo procedimiento se llevo a cabo con 5 g. de las muestras sólidas (buchón, elodea, suelo y
compost) que fueron agregados a los seis medios descritos anteriormente. Los medios fueron
incubados a temperatura ambiente y a las 48 horas se realizó coloración de Gram para
comprobar el crecimiento.
Al observar crecimiento en las muestras se realizaron pases a medios sólidos para su
aislamiento y se les asignó una denominación consecutiva. A las colonias sospechosas
compatibles con morfología de levaduras, se les realizó coloración de Gram y se sembraron en
medios de cultivo YGC y Sabouraud hasta su purificación.
5.3. Hidrólisis
Este procedimiento se realizo como pretratamiento de las macrófitas Jacinto de agua y Elodea
brasilera para liberar los azucares contenidos en la pared celular de buchón de agua y elodea
mediante los tipos de hidrolisis acida, alcalina y biológica.
5.3.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético
Suspensiones en agua destilada de las macrófitas, buchón y la elodea, en una proporción 1:9
m/v, sometidas o no a filtración previa, fueron hidrolizadas con ácido sulfúrico (Masami et al.,
2007) o peracético (Abraham y Kurup, 1996), según el método utilizado. En el primer
procedimiento se utilizaron soluciones de ácido sulfúrico en tres Concentraciones (2%, 1% y
0,5% m/v), las cuales se mezclaron con las suspensiones de buchón y elodea (con y sin
filtración previa) en proporciones 1:1, 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 v/v. Cada mezcla se sometió a
esterilización por autoclave a 121ºC, evaluando dos tiempos diferentes 30 y 60 min. Este
procedimiento se realizó por triplicado y las unidades experimentales fueron neutralizadas por
adición gota a gota de hidróxido de sodio al 10% m/v. La distribución de este diseño fue
completamente al azar con arreglo factorial teniendo como factores el tratamiento del sustrato,
la concentración del ácido sulfúrico, mezcla sustrato y tiempo de esterilización; con tres
repeticiones por tratamiento y un total de 216 unidades experimentales.
El otro método de hidrólisis acida se llevó a cabo hirviendo 10 g del buchón o la elodea lavados
y cortados con 100mL de ácido peracético a 100ºC durante 30 minutos. Posteriormente se
realizaron lavados con agua destilada hasta que el agua estuviera neutra y el buchón se llevo a
80º C durante toda la noche (Abraham y Kurup, 1996., Masami et al, 2007).
5.3.2. Hidrólisis mixta
Para la hidrólisis mixta el buchón y la elodea fueron secados previamente en horno a 105ºC
durante 24 horas. Posteriormente, una cantidad del buchón o la elodea secos fueron
mezclados por triplicado a una relación 1:8 en ácido sulfúrico al 1% m/v, la mezcla se agitó por
7 horas en agitador magnético a 250 rpm y temperatura ambiente. Esta mezcla se filtró y se
lavó con agua caliente a 60ºC y luego se calentó la mezcla de filtrado más agua de lavado a
ϵ
100ºC durante 15 minutos y se llevó a un pH de 10 con hidróxido de calcio sólido en
combinación con sulfito de sodio 0,1%. La mezcla se neutralizó con ácido sulfúrico 1N hasta
pH 6.0 (Nigam, 2002).
5.3.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio
Se realizaron dos tratamientos de hidrólisis alcalina utilizando hidróxido de sodio al 5 y 10 %
m/v. En uno de ellos, se tomaron suspensiones de buchón y de elodea para mezclarlas por
triplicado con Hidróxido de sodio 5% m/v para llegar a proporciones 1:1, 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y
1:99 v/v; las cuales, se esterilizaron a dos diferentes tiempos, 30 y 60 minutos. Las muestras se
neutralizaron mediante lavados con agua. Este procedimiento se baso en la metodología
propuesta por Isarankura (2007). El otro método de hidrólisis química alcalina se realizo
utilizando una relación macrófita: solución de hidróxido de sodio 10 % de 1:10 (gramos de
buchón o elodea en una solución de Hidróxido de sodio 10% m/v). La mezcla se esterilizo en
autoclave a 121 ºC por 30 minutos, luego se filtro y lavo con agua destilada hasta su
neutralidad. El filtrado de buchón o elodea fue secado durante toda la noche a 80ºC (Abraham
y Kurup, 1996). La distribución de este diseño fue completamente al azar teniendo como
tratamientos la mezcla de sustratos e hidróxido de sodio y el tiempo de esterilización; con tres
repeticiones para un total de 36 unidades experimentales.
5.3.4. Hidrólisis biológica con
Champinfung LTDA)
Pleurotus ostreatus (suministrado por al empresa
El hongo Pleurotus ostreatus se sembró en aserrín, sustrato utilizado comúnmente para la
producción industrial de orellanas (Martínez-Nieto, 2009 com. pers.). Una vez invadido el medio
por el micelio blanco característico de este género, el hongo estuvo listo para ser empleado en
los ensayos de hidrólisis.
Se preparó un medio liquido con extracto de malta, aserrín, buchón o elodea, y se distribuyo
un volumen de 45mL en frascos de vidrio, los cuales fueron inoculados con 0.9g, 2.7g y 4.5g
del hongo Pleurotus ostreatus. Este procedimiento se realizó por triplicado para cada
tratamiento con distribución completamente al azar y la incubación se hizo a temperatura
ambiente.
5.3.5. Azúcares reductores
A Todos los tratamientos de las diferentes hidrólisis y sus repeticiones, se les determinó la
concentración de azucares reductores expresada en gramo/litro (g/L) por el método del ácido
dinitrosalicilico (Anexo 2) descrito por Miller (1959) a temperatura ambiente. En la hidrólisis
biológica se tomaron lecturas de azucares reductores a los 5, 7, 10, 11, 12 y 13 días de
incubación del hongo a diferentes Concentraciones; mientras que, en los otros procedimientos
se realizo el análisis al finalizar el tratamiento.
5.3.6. Análisis de datos
Los resultados de la hidrólisis con ácido sulfúrico se analizaron estadísticamente mediante un
análisis de varianza con arreglo factorial a un nivel de significancia de 0.01. Los datos
obtenidos de azúcares reductores en la hidrólisis alcalina con NaOH 5%m/v y biológica fueron
analizados mediante análisis de varianza de dos factores con 0.05 de significancia. Las
diferencias entre tratamientos se determinaron mediante el test de rango múltiple de Duncan
con un nivel de significancia de 0.01 y 0.05 para así poder escoger el mejor tratamiento.
La comparación final de los tratamientos de hidrólisis se realizó mediante un análisis de
varianza de una sola vía (Į 0.01) y Test de rango múltiple de Duncan para las diferencias entre
tratamientos.
5.4. Determinación de la producción de etanol
5.4.1. Prueba del yodoformo
Se determinó cualitativamente la producción de etanol por las levaduras aisladas mediante el
método de yodoformo (Griffin, 1981; Morrison, 1998; Hill et al, 2000) en medios, YGC, Buchón
y Elodea sin hidrolisis (Anexo 1). Este consiste en agregar a 5ml del medio de cultivo con
crecimiento de levaduras durante 48 horas, 2ml de hidróxido de sodio 10%m/v y 3 ml de lugol
(I2-Kl) lentamente, esta mezcla se dejar reposar por 5min y si hay presencia de etanol se
observa un precipitado amarillo correspondiente a la formación de yodoformo. Para poder
ϭϬ
establecer diferencias en la formación del precipitado se prepararon controles de etanol así
como de otras sustancias que pudieran reaccionar con el reactivo o producirse durante la
fermentación alcohólica, como metanol, butanol, isobutanol, acetato de etilo, glicerol, alcohol
amílico, acetona, acetaldehído, alcohol isopropílico y fenol. Las proporciones utilizadas de los
controles fueron 1:1, 1:9, 1:99 (volumen de etanol u otras sustancias en volumen de medio de
cultivo estéril). La interpretación se hizo por cruces, otorgando cuatro cruces al precipitado
presentado en la mayor proporción 1:1 de etanol en el medio de cultivo respectivo y una cruz
para la proporción menor de 1:99.
5.4.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la técnica del dicromato de potasio
Después de escoger el mejor método de hidrólisis a un nivel de significancia de 0.01, y las
posible levaduras productoras de etanol a partir de buchón o elodea con el método del
yodoformo; se procedió a determinar semi-cuantitativamente la producción del alcohol por el
método de dicromato de potasio (Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Oviedo, 2009) mediante dos
diseños completamente al azar (uno para buchón y otro para elodea). Estos diseños tenían
como tratamientos dos medios inoculados con las mejores levaduras escogidas de buchón o
elodea y su respectivos controles sin inocular; con tres repeticiones, para un total de 48
unidades experimentales para buchón y 42 unidades experimentales para elodea. Se utilizaron
como medios de cultivo, preparaciones de buchón o de elodea con pretratamiento hidrolítico (el
mejor método de hidrólisis) y las suspensiones de las macrófitas sin ninguna clase de pre
tratamiento hidrolítico.
La técnica de dicromato consiste en tomar 2 mL de medio crecido de levaduras (centrifugado a
3200rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2 mL de una solución oxidante de dicromato de
potasio (anexo 3) La mezcla se homogenizó en vórtex a 1500 rpm y se calentó en baño
termostatado de 80-85 °C, por 30 min. Se enfrío a t emperatura ambiente y se leyó la
absorbancia a 440 nm y se interpoló en la curva de calibración (Anexo 3), reportando el valor
de etanol en g/L en dos tiempos 24 y 48 horas (Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Zumaqué,
2009). Otras variables que se determinaron fueron azúcares reductores (g/L) por el método
DNS (Miller, 1959) y recuento celular en cámara de Neubauer para determinar el consumo de
azucares y el aumento de biomasa.
Mediante la prueba semi-cuantitativa de dicromato se escogieron las dos mejores levaduras
posibles productoras de etanol, una en el diseño con buchón y otra con elodea, para realizar
cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas y determinar presencia de etanol.
5.4.3. Cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas
Al caldo de cultivo con las dos levaduras escogidas por la metodología anterior, se les realizo
una determinación por cromatografía de gases acoplada espectrómetro de masas en un equipo
Agilent Technologer 6850 series lll, con columna HP5MS apolar de 30 metros, utilizando como
gas de arrastre helio y una temperatura del inyector de 250ºC. El fin de esta prueba fue
comprobar la presencia de etanol en el ensayo.
5.5. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras
Las trece levaduras escogidas para el ensayo semicuantitativo utilizando la técnica del
dicromato de potasio, se identificaron preliminarmente teniendo en cuenta las características
macroscópicas en medios Sabouraud, agar tabaco y Malta-Glucosa; y la formación de
estructuras microscópicas características en medios harina de maíz y Caldo leche. Además se
determinó el crecimiento en caldo YGC a diferentes temperaturas 0º, 37º y 42ºC y
Concentraciones de cloruro de sodio de 10% y 16%; como en agar malta glucosa al 50 % y
agar malta sal glucosa (Anexo1). Posteriormente se evaluó el crecimiento y asimilación de
Nitratos y de Urea.
Adicionalmente se realizò prueba cromogénica empleando el panel para la identificación rápida
de levaduras MicroScan de Dade Behring Inc., para la identificación definitiva de las levaduras.
Esta prueba fue realizada por el laboratorio clínico del Hospital Universitario San Ignacio.
ϭϭ
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1. Muestreo y aislamiento
A las colonias aisladas se le asignó una numeración consecutiva, determinando como
sospechosas de levaduras un total de cuarenta y nueve colonias diferentes; las cuales
crecieron en todos medios empleados incluyendo los medios pre-hidrolizados de buchón y
elodea (Anexo 4). Posteriormente estas cepas se sembraron en buchón y elodea sin
tratamiento hidrolítico previo, observando crecimiento de todas las cepas en las dos macrófitas
(Anexo 5). Esto posiblemente a que estos sustratos fueron previamente secados al aire libre en
el municipio de Fuquene donde pueden actuar microorganismos que poseen actividad
celulolítica, proteolítica y amilolítica (Calixto y Basto, 2005). Existen estudios que indican que
algunas levaduras pueden utilizar parcialmente la hemicelulosa proveniente del buchón de
agua hidrolizada con ácido sulfúrico en medio liquido (Nigam, 2002, Isarankura et al, 2007,
Masami et al, 2008, Mishima el al, 2008).
En los ambientes acuáticos se encuentran una gran variedad de microorganismos, la densidad
y el tipo de microorganismo se relaciona con el estado trófico y las características
fisicoquímicas del agua (Urano et al, 2000., Russo, 2006); sin embargo, en este estudio estos
factores no tuvieron incidencia en el número de aislamientos de levaduras, ya que se presentó
un patrón similar de recuperación de cepas en los diferentes puntos de muestreo (Anexo 4).
6.2 Hidrólisis
6.2.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético
Los resultados obtenidos en la hidrólisis con ácido sulfúrico mostraron diferencias en la
cantidad de azucares reductores liberados de las dos macrófitas (Figura 1 y 2). El análisis de
varianza con arreglo factorial encontró diferencias altamente significativas entre los
tratamientos utilizando como sustrato buchón (Anexo 6). La suspensión de buchón con una
concentración de ácido sulfúrico del 0.5%, en proporción 1:1 y sesenta minutos de
esterilización (0.669g/L), mostro diferencias con los otros tratamientos evaluados, siendo el
mejor resultado para la prueba de rango múltiple de Duncan (Anexo 6); mientras que, para
elodea se encontró que el mejor tratamiento fue en la suspensión, con una concentración de
ácido del 1%, en proporción 1:1 y sesenta minutos de esterilización (1,081g/L), mostrando
diferencias altamente significativas con los otros tratamientos (Anexo 6).
ϭϮ
Figura 1. Concentación de azucares obtenidos en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido
sulfurico y tratamietnos de buchon (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.
Figura 2. Concentación de azúcares reductores en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido
sulfurico y tratamientos de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.
En los resultado para buchón, los picos más altos de azúcares se obtuvieron en las
proporciones de 1:1 y 1:19 en la concentración de 0.5% de ácido con sesenta minutos de
esterilización; como también, en la proporción 1:1 con una concentración de 1% en sesenta
ϭϯ
minutos y al 2% con una proporción de sustrato de 1:1 con 30 minutos de esterilización. El
resto de tratamientos presentaron resultados mucho menores a estos (Figura 1).
La concentración del ácido influyó en la cantidad de azúcares reductores liberados, pero la
biomasa vegetal también fue un factor determinante en los resultados, como se puede observar
en la proporción sustrato-ácido 1:1 de los tratamientos que presentaron la mayor liberación de
azúcares reductores, tanto en buchón como elodea (Figura 1 y 2). Esto se explica porque en
esta proporción se encuentra la mayor cantidad de material vegetal hidrolizable con respecto a
las demás, favoreciendo la hidrólisis de los polisacáridos y traduciéndose por tanto en un
mayor rendimiento de la hidrólisis (Sarrouh et al., 2005). Las otras proporciones tienen una
menor cantidad de fibra en donde el ácido pueda ejercer su acción y por consiguiente la
cantidad de azúcares liberados va a ser menor (Cunningham y López, 1994). Por esta misma
razón se encuentra mayor cantidad de azúcares en los tratamientos de suspensión que en los
filtrados. Esto se evidencia más claramente en las diferencias observadas con los valores
obtenidos en la misma concentración de ácido sulfúrico pero diferentes proporciones del
sustrato (Anexo 6). Por ejemplo en la mejor concentración para buchón de 0.5%, la proporción
de sustrato de 1:1 presenta 0.669g/L de azúcar en sesenta minutos de esterilización, siendo
una cantidad mayor que las proporciones 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 para estas mismas
condiciones, con Concentraciones cada una respectivamente de 0,2919 g/L, 0,5629 g/L, 0,134
g/L, 0,0906 g/L y 0,0877 g/L azúcares reductores (Anexo 6).
En publicaciones se ha encontrado que la temperatura también tiene un efecto positivo en la
cantidad de azúcares que se hidrolizan jugando un papel importante al separar el complejo
celulosa–hemicelulosa al facilitar la acción de las enzimas sobre cada molécula (Mejía et al.,
2007). En los estudios realizados por Campo et al. (2006) y Redding et al. (2008) demuestran
que temperaturas entre 110 -130ºC ayudan a mejorar la hidrólisis de los materiales celulósicos;
o
posiblemente al trabajar en el presente estudio con una temperatura de 121 C se favoreció la
hidrólisis de los componentes estructurales de la pared celular vegetal (Anexo 6 y 7).
Los tratamientos con ácido sulfúrico en Concentraciones generalmente por debajo del 4% en
peso, han sido de mayor interés en los estudios al ser económicos y eficaces (Breijo y Yufera,
1989). Sin embargo se ha demostrado que los materiales que han sido sometidos a la hidrólisis
ácida pueden ser más difíciles de fermentar, por la presencia de sustancias tóxicas que puede
inhibir a las células y afectar a la tasa de crecimiento específico de células y rendimiento de
masa por ATP (Palmqvist, 2000; Mussatto et al., 2004; Galbe y Zacchi, 2007).
La hidrólisis con el ácido peracético mostró una concentración de azúcares reductores de
0,083g/L para buchón y 0,08g/L para elodea; comparados con las mejores Concentraciones
encontradas en el ácido sulfúrico se demuestra una menor capacidad hidrolítica de esta
sustancia, debido posiblemente a que es un oxidante fuerte utilizado en la decoloración,
desinfección y blanqueo de materiales celulolíticos mas que un compuesto hidrolítico (Teixeira
et al., 2000; Zhaoa et al., 2007, Bernal-Castillo, 2009 com. pers.). En investigaciones se ha
encontrado que hidroliza parcialmente los materiales lignocelulósicos, deslignificando y
aumentando la superficie y la exposición de las fibras de celulosa (Neidleman, 1993; Xue-Bing
et al., 2008). Además, como se comento anteriormente, la temperatura influye en la liberación
o
de azúcares y este tratamiento utilizo una temperatura de 105 C menor a la utilizada en la
hidrólisis con ácido sulfúrico y por debajo del rango propuesto por Redding et al (2008) para
mejorar la hidrólisis de celulosa.
Para muchos autores la hidrólisis acida presenta bajos rendimientos y una elevado formación
de subproductos tóxicos (furfural y hidroximetilfurfural) con un alto consumo de energía; por
eso investigadores como Mussatto et al., (2006) recomiendan la mezcla de hidrólisis ácida y
alcalina para mejora los resultados que pueden obtenerse solamente usando ácidos. También
otros investigadores como Lazaro y Arauzo (1994) recomiendan la hidrólisis enzimática que
usa menos energía y da productos puros con rendimientos cuantitativos.
6.2.2. Hidrólisis mixta
Los resultados obtenidos en cuanto a concentración de azúcares reductores fue de 0,09g/L
para elodea y buchón. Esta cantidad es un poco superior a la obtenida con el ácido peracético,
ϭϰ
y comparada con la hidrólisis con ácido sulfúrico es inferior en las dos macrófitas (Anexo 6).
Las Concentraciones de azúcares reductores deberían haber sido mayores que en los
tratamientos con ácido sulfúrico; ya que la adición de sustancias alcalinas se usan como una
forma eficaz de acondicionamiento para reducir la toxicidad de los hidrolizados generados a
partir de pre-tratamiento de la biomasa lignicelulolitica para la producción de etanol (Ranatunga
et al., 2000; Horváth et al., 2005). Sin embargo, en este estudio la liberación de azúcares
reductores fue menor a otras hidrólisis; pero hay que tener en cuenta que el ajuste de pH con
hidróxido de calcio si no se hace en un tiempo corto hay perdida del 10 % de la glucosa (Kumar
et al.,2009).
6.2.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio
Los resultados encontrados la hidrólisis con NaOH al 5% evidenció la menor cantidad de
azúcares reductores tanto en buchón como elodea (Figura 3 y 4), comparado con las hidrólisis
con ácido sulfúrico, peracético y la mixta. El análisis de varianza encontró diferencias
significativas en los tratamientos con NaOH al 5% a un nivel de 0.05 (Anexo 8). El mejor
tratamiento en buchón (0.16 g/L de azúcares reductores) (Figura 3) fue con una proporción de
sustrato 1:1 y una esterilización durante 30 minutos al igual que en elodea (0.09 g/L azúcares
reductores) (Figura 4).
Figura 3.Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido de
sodio al 5% en buchón con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.
ϭϱ
Figura 4. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido
de sodio al 5% en elodea con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.
La menor cantidad de azúcares reductores en buchón se dio en la proporción de sustrato 1:49
y 1:99 (Figura 3) en los dos tiempos de esterilización; y para elodea se presentó en las
proporciones de 1:4, 1:9, 1:49 y 1:99 (Figura 4) .
Comparando los azúcares obtenidos en este tratamiento con respecto a la mejor concentración
obtenida en la hidrólisis con ácido sulfúrico, son mucho menores; debido posiblemente, a que
la hidrólisis alcalina provoca un hinchamiento de la celulosa que no necesariamente conlleva a
una hidrólisis, ni modifica su composición química (Fuentes et al., 2008). La concentración en
los procesos industriales en los que se utiliza el hidróxido de sodio está entre el 1 y el 5% como
la utilizada en este estudio, e implica un aumento en volumen de 30 a 60% respectivamente de
la celulosa, sin llegar a hidrolizarla (Fuentes et al., 2008; Núñez, 2008), razón por la cual estos
resultados no mostraron un incremento significativo en la concentración de azúcares
reductores.
En los resultados obtenidos con NaOH al 5% con los del 10% se observa en buchón una
concentración de 0.12g/L de azúcares reductores que es menor que la encontrada al 5%, y en
elodea se obtuvo la misma cantidad de azúcares 0.09 g/L en las dos Concentraciones;
demostrándose así, que Concentraciones un poco mayores de hidróxido de sodio no ejerce
resultados significativos en los rendimientos de azúcares reductores.
6.2.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus
Los resultados encontrados durante los 13 días de incubación del hongo muestran que en
buchón la concentración de azúcares reductores comienza a aumentar al inicio del tratamiento
hasta el día 10 donde empiezan a disminuir ligeramente (Figura 5 y 6).
ϭϲ
Figura 5. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis biologica con Pleurotus
ostreatus en buchón utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de
incubación.
En la macrófita elodea también se observó al día 10 un aumento de los azúcares donde
después comienzan a disminuir (Figura 6). En la figura 6 no se observa claramente la
disminución al haber una variación pequeña entre los valores, pero al observar los datos como
por ejemplo en la concentración del 2% en el día 10 se obtuvieron 2,44 g/L de azúcares
reductores y al día 11 fue de 2,38 g/L, donde se aprecia la disminución (Anexo 8).
Figura 6. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis biologica con Pleurotus
ostreatus en elodea utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de
incubación.
ϭϳ
Según el análisis de varianza se presentó diferencias significativas entre los tratamientos
(Anexo 8) y se evidencio mediante la prueba de Duncan que los mejores resultados en buchón
se obtuvieron con la concentración del hongo del 10% a los 10 (4,256g/L) y 7 días (4,375g/L)
de incubación (Anexo 8). Para la elodea el análisis estadístico mostró que los tratamientos del
hongo a los 7 (3,37 g/l), 10 (3,48 g/l) y 11 días (3,48 g/l) con concentración de P. ostreatus del
10 %, al igual que en la concentración del hongo al 3% a los 10 (3,27 g/l) y 11 días (3,21 g/l),
no presentaron diferencias significativas entre ellos (Anexo 8).
Después de los diez días de incubación se observó la disminución de los azúcares reductores
en las dos macrófitas desde el día once hasta el trece, día en el cual se realizó la última lectura
de azúcares reductores debido a su tendencia a disminuir (Anexo 8). La reducción de la
actividad enzimática podría atribuirse a la acumulación de subproductos que la inhiben; los
cuales son producidos durante el metabolismo del hongo, como resultado de la hidrólisis de los
diferentes componentes de los ácidos orgánicos esterificados de la hemicelulosa, y de los
derivados fenólicos solubilizados de la lignina (Palmqvist, 2000; Rodríguez et al., 2003;
Sánchez y Carlos, 2005).
Al comparar los azúcares obtenidos con las demás hidrólisis realizadas se observo como la
actividad enzimática es mucho más eficiente que cualquier sustancia química utilizada. Al
comparar estadísticamente los mejores tratamientos de cada tipo de hidrólisis, el análisis de
varianza muestra diferencias significativas a un nivel de 0.01 entre tratamientos y de acuerdo
con la prueba de Duncan, los tratamientos con el hongo P. ostreatus a una concentración del
10 % a los 10 y 7 días de incubación fueron los de mayor liberación de azúcares (Tabla 2). En
elodea la mayor cantidad de azúcares se presentó con una concentración del hongo de 10% a
los 10 y 11 días de incubación (Tabla 2).
Tabla 1. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con
NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en buchón.
Tratamiento
Suspensión buchón -0.5 % Ácido Sulfúrico 1:1- Esterilización 60min
Azúcares
reductores (g/L)
0,67 b
Ácido Peracético -Neutralización lavados
0,083 c
NaOH 5 % 1:1- Esterilización 30 minutos
0,16 c
NaOH 10 % - Neutralización lavados
0,12 c
H2SO4+ Hidróxido de calcio +sulfito sodio -Neutralización Ácido
0,090 c
Hongo concentración 10 % a los 10 días de incubación
4,375 a
Hongo concentración 10 % a los 7 días de incubación
4,256 a
Tabla 2. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con
NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en elodea.
Tratamiento
Suspensión elodea -1 % Ácido Sulfúrico 1:1- Esterilización 60min
Ácido Peracético -Neutralización lavados
0,08 e
NaOH 5 % 1:1- Esterilización 30 minutos
0,09 e
NaOH 10 %-Neutralización lavados
0,09 e
H2SO4-Hidroxido de calcio +sulfito sodio - Neutralización Ácido
0,09 e
Hongo concentración 10 % a los 10 días de incubación
3,48 a
Hongo concentración 10 % a los 11dias de incubación
3,48 ab
Hongo concentración 10 % a los 7dias de incubación
3,37 bc
Hongo concentración 3 % a los 10dias de incubación
3,27 c
Hongo concentración 3 % a los 11dias de incubación
3,21 c
ϭϴ
Azúcares
reductores (g/L)
1,08 d
Una de las ventajas del uso de la hidrólisis biológica como tratamiento del material
lignocelulolitico, es que las enzimas pueden actuar sobre los compuestos tóxicos presentes en
los hidrolizados y cambiar su composición. Se ha encontrado que el uso de la lacasa y de las
enzimas de la peroxidasa de los hongos de podredumbre blanca, ha promovido el aumento en
el consumo de glucosa y la productividad de etanol, debido a la acción de estas en ácidos y
compuestos fenólicos (Mussatto y Roberto, 2004). La selectividad de las enzimas no permite la
conversión a otro tipo de compuestos diferentes a azúcares evitando así la formación de
compuestos tóxicos para los microorganismos (Mejía et al., 2007). Lo que se ve reflejado en los
resultados, con un rendimiento mayor de azúcares reductores en la hidrólisis biológica en
comparación con los otros tratamientos probados (Tabla 1 y 2). Otros autores han encontrado
altos rendimientos con este tipo de hidrólisis como Bon, y Ferrara (1996), Nigam (2002),
Campo et al., (2006), Galbey y Zacchi (2007), Isarankura-Na-Ayudhya et al., (2007) y Kumar et
al., (2009).
Algunos autores como Hatakka (1984), Lazaro y Arauzo (1994), utilizaron este tipo de hongo
para hidrolizar materiales lignocelulosicos, ya que se alcanzan rendimientos superiores a los de
cualquier hidrólisis; encontrando en este estudio resultados similares, donde la cantidad de
azúcar hidrolizada a partir de la biomasa vegetal de las plantas acuáticas, buchón y elodea, fue
mayor al de los tratamientos químicos.
Con base a estos resultados, la hidrólisis biológica al 10 % de concentración de P. ostreatus
con 10 días de incubación, se escogió por su mayor contenido de azúcares liberados en las
dos macrófitas, para la determinación de alcohol etílico por el método del dicromato de potasio.
Este hongo es muy utilizado porque tiene un alto potencial biotecnológico en diferentes
sectores industriales, siendo capaz de degradar compuestos tan complejos como la lignina
(Manzano et al., 2004). Además esta hidrólisis trae beneficios ya que no produce sustancias
tóxicas para los microorganismos y su utilización a nivel industrial puede ser más económica
comparada con el gasto de emplear ácidos diluidos o concentrados (Badger, 2002).
6.23 Determinación de la producción de etanol
6.3.1. Prueba del yodoformo
De las cuarenta y nueve levaduras aisladas se determinó por medio de la prueba del
yodoformo, que nueve levaduras eran las posibles mejores productoras de etanol a partir de
buchón y 6 a partir de elodea en los medios con buchón y elodea hidrolizados (Anexo 10). Esta
prueba también dio positiva en YGC, el cual contiene un azúcar simple que puede ser
transformado fácilmente por las levaduras a etanol (Petrovska et al, 2000; Buitrago y Estrada,
2007).
La prueba del yodoformo (CHI3) se basa en la formación de este compuesto que se observa
como un precipitado de color amarillo a partir de una reacción de halogenación en medio
básico (Griffin, 1981.; Primo, 1996; Morrison et al, 1998). Al realizar la prueba a los tubos con
diferentes proporciones de etanol en medio estéril, se presentó un precipitado color amarillo
laminado (Anexo 9).
Algunos de los otros compuestos utilizados como controles presentaban color y apariencia
similar a los tubos con las diferentes proporciones de etanol, como el alcohol isopropílico y el
acetaldehído (Anexo 9). En literatura se ha reportado que el acetaldehído es el único aldehído
sencillo que da positivo para la prueba de yodoformo y alcohol isopropílico es un alcohol
secundario que puede oxidarse formando una cetona, la cual reacciona positivamente
formando el haloformo amarillo llamado yodoformo (Grifiin, 1981., Primo, 1996, Morrison et al,
1998) Sin embargo se visualiza (Anexo 9) que los colores de los tubos de estos compuestos
suelen ser más oscuros que el etanol, al finalizar la reacción.
Por otro lado, la cetona presenta dos fases en el tubo de proporción 1:1, se alcanza a observar
un amarillo en el fondo del tubo (Anexo 9); el cual posiblemente sea producto de la formación
de yodoformo, ya que se ha reportado como un compuesto yodoformo positivo (Grifiin, 1981,
Morrison et al, 1998). En el anexo 9 se observan las diferencias entre los precipitados formados
por los compuestos empleados como controles en esta prueba.
ϭϵ
6.3.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la técnica del dicromato de potasio
Los resultado encontrados en los dos diseños experimentales mostraron una mayor producción
de etanol con la levadura 30 en el medio buchón hidrolizado con Pleurotus ostreatus a las 48 h
de incubación (Figura 7) y en elodea con la levadura 17 en las mismas condiciones (36,425g/L)
(Figura 8). Comparando los medios sin hidrólisis de los dos ensayos se observó que la
levadura 23a en elodea presentó la mayor producción de etanol a las 48 horas (Figura 7 y 8).
Figura 7. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con
buchón durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
ϮϬ
Figura 8. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con
elodea durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
Ϯϭ
Las Figuras 7 y 8 con relación a la producción de etanol y consumo de azúcares reductores en
buchón y elodea respectivamente, muestran como la cantidad de etanol aumenta de las 24 a
las 48 horas, y los azúcares reductores disminuyen (Anexo 5; esto se debe a que los
microorganismos consumen los azúcares para su crecimiento y producción de etanol. Cuando
la cantidad de sustrato no es suficiente detienen el crecimiento y la producción de etanol como
lo afirman Palmqvist y Hahn-Hagerdal (2000), Fujita et al. (2002), Cervantes y Pedroza (2007)
Aguilar y Saucedo (2008) y Xiros y Christakopoulos (2009).
En el ensayo con buchón, la Figura 7 muestra que la más baja producción de etanol en el
medio sin hidrólisis se obtuvo con la levadura 1 y la más alta en la 16. En el medio hidrolizado
en este mismo diseño la menor concentración producida fue en la cepa 16 y R y la mayor con
la levadura 30. En elodea la menor concentración de etanol en el medio no hidrolizado se
observó en la levadura 1 y T a las 48 horas y la mayor en la 23a. En los medios hidrolizados la
menor concentración se dio en la 30 y la mayor en la 23a (Figura 8).
La levadura 30 en el diseño con buchón hidrolizado a las 24 horas presentó una concentración
de etanol de 38,40g/l y a las 48 de 55,303g/l, mostrándose un aumento significativo en la
producción, al igual que la levadura 23a en elodea con una producción de etanol de 18,511g/l a
las 24 horas y a las 48 horas de 30,867g/l (Figura 7 y 8). El análisis de varianza mostró
diferencias significativas en los dos diseños (Į 0.05) y en el caso de buchón, la levadura 30 en
el medio hidrolizado con P. ostreatus, no presentó diferencias significativas con la levadura T y
1 en el mismo medio a las 48 h, siendo los mejores tratamientos.
En la prueba de rango múltiple de Duncan al evaluar el diseño in vitro con elodea muestra que
la levadura 23a en medio hidrolizado biológicamente fue el mejor tratamiento y no evidenció
diferencias significativas con las levaduras 17, T y 23 en el mismo medio a las 48 horas, como
tampoco con las levaduras T y 23 a las 24 horas (Anexo 11).
En los medios sin hidrólisis se observó una producción de etanol en bajas Concentraciones de
las 24 a las 48 horas al compararlos con los medios hidrolizados (Figura 7 y 8); esto se puede
deber a que las levaduras no tienen los mecanismos necesarios para degradar los compuestos
de las macrófitas como la celulosa y la lignina; mientras que con relación a la hemicelulosa se
han aislado algunas levaduras degradadoras de este compuesto como Candida sp y
Trichosporon sp (Fernández y Novo, 1988; Palmqvist y Hahn-Hagerdal, 2000; Srinorakutara et
al., 2006; Battan et al., 2007: Cervantes y Pedroza, 2007). No obstante lo que pudo haber
permitido a los microorganismos acceder a estos sustratos fue el proceso de esterilización al
que fueron sometidos los medios antes de ser inoculados, además del pre-secado de las
muestras en la planta de producción de bioabono ubicada en el Municipio de Fúquene, antes
de su uso en el laboratorio.
En los medios hidrolizados si se presentó una liberación de azúcares reductores posiblemente
a partir de lignina, celulosa y hemicelulosa debido a la maquinaria enzimática que posee P.
ostreatus (Manzano et al., 2004; Mussatto y Roberto, 2004). Por consiguiente se puede ver en
este estudio al igual que lo observado por autores como Fuentes et al. (2008), que la hidrólisis
logra el aprovechamiento de los azúcares reductores liberados de la degradación de los
componentes de las macrófitas, generada por el hongo Pleurotus ostreatus.
Además es importante resaltar que el procedimiento térmico, generalmente, es utilizado como
pretratamiento para aplicar posteriormente hidrólisis, debido a que separa el complejo
celulosa–hemicelulosa facilitando la acción de las enzimas sobre cada molécula. El uso de la
temperatura en este estudio posiblemente favorece la hidrólisis de la hemicellosa mientras que
la celulosa no pudo ser afectada. Por consiguiente este tratamiento tiene efectos más notables
sobre la hemicelulosa y en menor medida sobre la celulosa (Mejia et al., 2007).
Las levaduras que produjeron la mayor concentración de etanol por el método dicromato de
potasio se escogieron para la realización de la cromatografía de gases. (Las levadura 30 en el
medio hidrolizado de buchón y la 23a en el medio sin hidrólisis de elodea).
ϮϮ
6.3.3. Cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas
En los cromatogramas se comprueba la producción etanol (Tiempo de retención de 1.48
minutos), por las levadura 30 y 23a en medios que contenían buchón y elodea
respectivamente, a las 48 horas de incubación. Con relación a la levadura 30 en medio
hidrolizado biológicamente a las 48 horas, se observa además del etanol otros productos de
fermentación como el dióxido de carbono, 1-propanol, 2-metil y 1-butanol, 2-metil (Figura 9); al
igual para elodea se presentaron productos de la fermentación como el dióxido de carbono,
acetato de etilo y 1-butanol, 3-metil (Figura 13). Estos alcoholes se pueden presentar en la
fermentación como consecuencia del metabolismo de los azúcares (Madigan et al.,2003;
Ramírez, 2006).
Figura 9. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 30 en el medio hidrolizado con
Pleurotus ostreatus, con un tiempo de retención 1.48 minutos
Ϯϯ
Figura 10. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 23a en el medio sin hidrólisis,
con un tiempo de retención 1.48 minutos
Por medio de este método se pudo comprobar la producción de etanol de las levaduras
escogidas en el medio hidrolizado como sin hidrólisis. Es un método de elección para la
determinación de etanol que ofrece alta selectividad y resultados precisos, utilizado en varios
estudios (Corrales y Rangel, 1999; Monsalve et al., 2006; Sarmiento y Silva, 2007; Oviedo et
al., 2009 y Peña y Arango, 2009).
6.4. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras
Se determinó mediante las pruebas bioquímicas y el MicroScan que la mayoría de las
levaduras escogidas como posibles productoras de etanol son cercanas al género Candida sp
(Tabla 5, Anexo 12). Los otros géneros encontrados fueron cercanos a ƌĞƚƚĂŶŽŵLJĐĞƐ ƐƉ͘, y
Hansenula sp (Tabla 5, Anexo 12).
Ϯϰ
Tabla 3. Identificación preliminar de las levaduras escogidas como mejores productoras
de etanol por el método del yodoformo
Código
Identificación
1
Brettanomyces sp.
16
Hansenula sp
17
Hansenula sp
23
Candida parasilopsis
23 a
C. lusitaniae
30
C. albicans
45
H. polymorpha
R
C. parasilopsis
T
C. lusitaniae
Los resultados encontrados tienen relación con lo reportados por varios estudios de aislamiento
de levaduras acuáticas, los cuales mencionan que algunas especies del género Cándida
pueden encontrase en dichos ambientes (Ochoa y Vázquez, 2004). Adicionalmente especies
del género Candida sp. se han reportado como productoras de etanol y algunas a partir de
compuestos vegetales prehidrolizados como el buchón de agua (Isarankura et al, 2007.,
Mishima el al, 2008., Masami et al, 2008., Nigam, 2002;). El género Hansenula sp. también ha
sido reportado por algunos autores como productor de etanol (Olena et al, 2008., Voronovsky
et al, 2009., Dejelal et al, 2006). Dichas investigaciones dan soporte a los resultados
encontrados en este estudio, ya que se determinó que las levaduras identificadas como
mejores productoras de etanol, en su mayoría fueron aisladas de las muestras de agua de la
Laguna, (1, 16, 23, 23a, 30, R, T) y se determinó que producían etanol a partir de las
macrófitas acuáticas hidrolizados y sin hidrólisis.
El hallazgo de levaduras productoras de etanol en dos macrófitas invasoras de la laguna de
Fuquene (Masami et al, 2008 y Nigam, 2002), es de importancia como punto de partida para
posteriores estudios, como una alternativa amigable con el medio y sustentable
económicamente para disponer de los residuos de dichas plantas al ser extraídas
mecánicamente de la laguna. Y además si se pueden usar para la producción del
biocombustible se va a contribuir al control de la emisión de gases tóxicos a la atmosfera por
parte de los combustibles provenientes del petróleo y a mejorar la calidad de vida de los
habitantes de la zona de influencia de la Laguna de Fúquene.
Ϯϱ
7. CONCLUSIONES
En total de la laguna de Fúquene y de las macrófitas buchón y elodea, se aislaron 49 cepas y
trece de ellas que presentaron la mayor producción de etanol fueron identificadas como
cercanas a los géneros Candida sp, Brettanomyces sp y Hansenula sp., esto demuestra la
diversidad de la Laguna de Fúquene y la importancia de la implementación de medidas para su
conservación.
El mejor pretratamiento para buchón y elodea fue el biológico con Pleurotus ostreatus a los
diez días de incubación que presentó la mayor liberación de azúcares fermentables con un
promedio de 55,303g/l y 30,867g/l para buchón y elodea respectivamente.
Las levaduras C. albicans LJ C. lusitaneae produjeron la mayor cantidad de etanol en medios
con buchón y elodea hidrolizados y no hidrolizados, los cuales fueron comprobados por
cromatografía de gases. El potencial de esas cepas para futuras investigaciones en el campo
de los biocombustibles de segunda generación es de gran importancia ya que permite el
aprovechamiento de materiales lignocelulósicos.
Con los resultados obtenidos durante este trabajo se cumplió con el objetivo general de la
investigación, ya que se aislaron levaduras capaces de producir etanol a partir de las
macrófitas acuáticas buchón y elodea, siendo un punto de partida para una posible solución a
la disposición final de estos residuos vegetales una vez extraídos mecánicamente de la laguna
de Fúquene.
Ϯϲ
8. RECOMENDACIONES
Las levaduras C. albicans y C. lusitanie se recomiendan para futuras investigaciones en la
producción de biocombustibles en medios con las plantas acuáticas, buchón o elodea, tratadas
por métodos biológicos con P. ostreatus.
Es necesario continuar con los estudios de estas macrófitas acuáticas para dar una alternativa
industrial a escalas mayores en la producción de etanol.
Continuar con la identificación molecular de las cepas aisladas de la laguna de Fuquene para
así conocer las mejores condiciones de fermentación inherentes a la cepa, para el
aprovechamiento de buchón y elodea en la producción de etanol.
Se debería investigar los microorganismos que actúan en el pre-secado que realizan la
Asociación de pescadores “Los Fundadores” para la producción de bioabono, y utilizada en
este estudio, como cepas promisorias en la liberación de azúcares fermentables, al ayudar en
la degradación del material constitutivo de la pared celular de las plantas acuáticas, buchón y
elodea.
Es recomendable cuantificar la producción de alcohol por métodos cromatograficos y optimizar
la producción de biocombustibles de las levaduras aisladas.
Ϯϳ
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ϯϲ
10. ANEXOS
Anexo 1. ŽŵƉŽƐŝĐŝſŶĚĞůŽƐŵĞĚŝŽƐĚĞĐƵůƚŝǀŽƵƚŝůŝnjĂĚŽƐĚƵƌĂŶƚĞůĂĨĂƐĞĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂů
MEDIO
Melaza
Soya-Malta
Arroz
Dextrosa Sabouraud
YGC
Medio de crecimiento de
Pleurotus ostreatus
Malta Glucosa 50 %
Malta Glucosa
Tabaco
Malta Sal Glucosa
YGC con 10 % de Cloruro
de Sodio (NaCl)
YGC con 16 % de Cloruro
de Sodio (NaCl)
COMPONENTES
Melaza
Sulfato de magnesio (MgSO4)
Sulfato de amonio (NH4)2SO4)
Fosfato de potasio (KPO4)
Cloranfenicol
Penicilina
Agar-agar
Malta
Harina de soya
Cloranfenicol
Penicilina
Agar-agar
Arroz
Cloranfenicol
Penicilina
Agar-agar
Glucosa
Peptona
Agar-agar
Glucosa
Extracto de levadura
Cloranfenicol
Agar-agar
Aserrín
Salvado de trigo
Melaza
Cal
Glucosa
Extracto de malta
Extracto de levadura
Agar-agar
Extracto de malta
Glucosa
Peptona
Agar-agar
Tabaco de cigarrillos
Agar-Agar
Glucosa
Extracto de malta
Extracto de levadura
Cloruro de sodio (NaCl)
Agar-agar
Glucosa
Extracto de levadura
Cloruro de sodio (NaCl)
Cloranfenicol
Agar-agar
Glucosa
Extracto de levadura
Cloruro de sodio (NaCl)
Cloranfenicol
Agar-agar
ϯϳ
CANTIDAD (g, mL o UI)L
100g
0.5g
5g
1g
0,5g
20000 UI
15g
30g
3g
0,5g
20000 UI
15g
500g
0,5g
20000 UI
15g
40g
10g
15g
20g
5g
0.1g
15g
1600g
360g
40g
1g
500g
10g
2.5g
15g
20 g
20 g
1g
15g
50g
15g
128g
20g
5g
100g
15g
20g
5g
100g
0.1g
15g
20g
5g
160g
0.1g
15g
Harina de Maíz
Leche
Caldo nitrato
Urea
Ascosporas
Harina de maíz amarillo
Glucosa
Peptona
Tween 80
Agar-agar
Leche entera
Cloranfenicol
Glucosa
Nitrato de sodio (NaNO3)
Sulfato de magnesio
heptahidratado (MgS04 * 7H20)
Fosfato mono potásico (KH2PO4)
Sulfato ferroso (SO4Fe)
Urea
Fosfato de potasio monobásico
(KH2PO4)
Fosfato de potasio dibásico
(K2HPO4)
Extracto de levadura
Rojo de fenol
Agar-agar
Glucosa
Cloruro de sodio (NaCl)
Peptona
Agar-agar
20g
20g
20g
0.19mL
15g
170mL
0.25g
20g
2g
0.5g
0.5g
1g
20g
9.1g
9.5g
0.1g
0.01g
15g
1g
5g
10g
15g
Todos los medios deben ser llevados a esterilizar en autoclave a 121º C (15lb de presión)
durante 15. El medio malta sal glucosa y malta glucosa 50% son esterilizados en un baño de
agua hirviendo por 30 minutos.
ϯϴ
Anexo 2.
Curva patrón para al determinación de azucares reductores por el método del ácido 3,5dinitrosalicilico (DNS)
Preparación del reactivo
En un vaso de precipitado de 250mL, se adiciono 50mL de agua destilada y 1.6g de hidróxido
de sodio, disolviendo continuamente en una plancha magnética a temperatura ambiente.
Luego se agrego lentamente 43.8 g de tartrato de sodio y potasio hasta su disolución completa.
Se cubrió el vaso de precipitado con papel aluminio. Posteriormente se agrego 1g de ácido 3,5di-nitro salicílico (DNS) lentamente continuando con la agitación. Se completo hasta un
volumen de 100ml con agua destilada en el vaso de precipitado El reactivo se dejo toda la
noche en agitación constante y al otro día se paso a un balón volumétrico aforado de 100mL
previamente forrado con aluminio.
Preparación de la solución stock de glucosa 2g/L
Se peso 0.2g de glucosa anhidra y se disolvió en 50mL de agua destilada utilizando un balón
volumétrico aforado de 100mL. Después de homogenizarse de completo, se llevo a un volumen
de 100mL con agua destilada.
Preparación de las soluciones de glucosa de la curva patrón
Se utilizo la formula de V1*C1= V2*C2 y para preparar las seis diferentes Concentraciones de
glucosa g/L con un volumen final de 2mL. El procedimiento para preparar cada una se ve a
continuación.
Reactivo
Blanco
Concentraciones g/L
0.50
0.70
1.00
1.50
1.70
2.00
Glucosa (mL)
-
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
Agua (mL)
0.25
-
-
-
-
-
-
Se protegen los tubos de ensayo tapa rosca de 13*100mm con papel aluminio.
Reactivo de
DNS
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
Se calientan los tubos de ensayo en un baño termostatado con agua hirviendo sin papel
aluminio por cinco minutos y posteriormente detenga la reacción por inmersión de los tubos en
hielo durante 5 minutos.
Agua
destilada (mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
Se pone nuevamente el papel aluminio a cada tubo y se determina la absorbancia de cada
solución a una longitud de onda de 540nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba.
ϯϵ
Determinación de la concentración de azucares reductores de cada muestra
Se toman 0.25mL de la muestra en un tubo de ensayo, forrando cada uno con aluminio para
protegerlo de la luz, y se agregan 0.25mL de reactivo DNS. Se calientan los tubos de ensayo
en un baño termostatado con agua hirviendo sin papel aluminio por cinco minutos y
posteriormente detenga la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos.
Al cabo de este tiempo se pone nuevamente el papel aluminio a cada tubo y se determina la
absorbancia de cada solución a una longitud de onda de 540nm, ajustando la absorbancia con
el blanco de prueba.
Luego de tener la absorbancia se reemplaza en la ecuación que se determino por medio de
una regresión lineal con la curva patrón que se muestra a continuación.
Curvas patrón para la cuantificacion de azucares reductores del reactivo de DNS.
ϰϬ
Anexo 3.
Curva patrón para la determinación de etanol por el método del dicromato de potasio
Preparación de los reactivos
• Solución oxidante
Se mezclan 4.165 g de dicromato de potasio (97%) y 250 mL de ácido sulfúrico (96%) en un
vaso de precipitado de 600mL. Luego esta solución se para a un balón volumétrico aforado de
1000 mL y se completa hasta el aforo con agua destilada.
• Solución de carbonato de potasio
Se mezclan de 20 g de carbonato de potasio (98%) en un vaso de precipitado de 250mL hasta
que se disuelva. Luego esta solución se transfiere a un balón volumétrico de 100mL y se
completa con agua destilada hasta el aforo.
Después de tener las 2 soluciones anteriores preparadas se realiza la solución final:
• Solución final.
Se toman 4 mL de la solución oxidante en un tubo de ensayo y luego se adiciona, gota a gota,
2 mL de solución de carbonato de potasio hasta finalizar el burbujeo.
Procedimiento para la realización de la curva patrón
Se prepararon diferentes concentraciones de etanol en agua destilada (2,5, 5,0, 10, 15, 20, 30)
como se muestra en la tabla siguiente. Se mezclan 2 mL de la solución final con 2 mL de los
diferentes patrones en un tubo de ensayo homogeneizándose en vórtex a 1500 rpm durante
10 s. Seguidamente se realiza un calentamiento en baño termostatado de 80-85 °C, por 30
min. Se enfría a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de 440
nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba
Concentración
g/l
Blanco*
2.5
5
10
15
20
30
•
Etanol
(mL)
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Agua
destilada(mL)
19.95
19.9
19.8
19.7
19.6
19.5
El blanco se prepara con ácido sulfúrico con una concentración de 6N.
Determinación de etanol en cada muestra
Se tomaron 10mLde la muestra de medio de cultivo en un tubo de ensayo y se centrifuga a
3500 rpm durante 20 min. Se trabaja con el sobrenadante de donde se toman 2mL en un tubo
de ensayo y se mezclan con 2mL de la solución final en un vórtex por 10 segundos.
Estos tubos son puestos en un baño termostatado de 80 a 85ºC por 30 minutos. Al cabo de
esto se dejan enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de
440 nm ajustando la absorbancia con el blanco de prueba. Los datos obtenidos se multiplican
por el factor que corresponda a cada medio que se presentan a continuación debajo de cada
grafica, para hallar la concentración en g/L.
ϰϭ
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio elodea hidrolizada con P.
ostreatus, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra
(1993). Factor= 35.71
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio elodea sin pretratamiento
hidrolítico, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra
(1993). Factor= 105.03
ϰϮ
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio buchón hidrolizado con P.
ostreatus, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra
(1993). Factor= 68.90
Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio buchón sin pretratamiento
hidrolítico, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra
(1993). Factor=133.92
ϰϯ
Anexo 4.
Aislamiento de levaduras en cada medio de cultivo utilizado en la investigación.
Muestra
Ubicación
z'
D>
>K
h,KE
ZZK
^KzͲ
D>d
Agua
Laguna de
Fúquene sector
Ubate
н
Ͳ
н
н
Ͳ
н
Agua
Laguna de
Fúquene sector
Tagua
н
н
н
Ͳ
н
Ͳ
Agua
Laguna de
Fúquene Monroy
н
н
н
Ͳ
Ͳ
н
Agua
Laguna Fúquene
sector la Isla
н
н
н
н
н
н
Buchón
Laguna Fúquene
sector la Isla
н
н
н
н
Ͳ
н
Agua
Laguna de
Fúquene sector
Suarez
н
н
н
н
Ͳ
н
Elodea
Laguna de
Fúquene sector
Suarez
н
н
н
Ͳ
н
н
Suelo
Vereda
Guatancuy,
municipio de
Fúquene. Predio
Fundación
Humedales
н
Ͳ
Ͳ
Ͳ
Ͳ
н
Compost
Vereda
Guatancuy,
municipio de
Fúquene. Predio
Fundación
Humedales
Ͳ
Ͳ
Ͳ
Ͳ
Ͳ
Ͳ
ϰϰ
Anexo 5.
Crecimiento de las levaduras escogidas en los medios hidrolizados y sin hidrólisis
biológica
Crecimiento de levaduras en buchón hidrolizado con Pleurotus ostreatus en el ensayo de
producción de etanol por el método del dicromato de potasio.
ϰϱ
Crecimiento de levaduras en elodea hidrolizado con Pleurotus ostreatus en el ensayo de
producción de etanol por el método del dicromato de potasio.
ϰϲ
Anexo 6.
Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis acida (H2SO4)
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E^
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^
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Ϭ͕ϬϴϱϯŐ
Ϭ͕ϬϵϰϭŐ
Ϭ͕ϬϴϰϴŐ
Ϭ͕ϬϴϳϮŐ
Ϭ͕ϭϬϴϮĨŐ
Ϭ͕ϭϭϭϮĨ
Ϭ͕ϬϵϴϬŐ
Ϭ͕ϭϰϵϭĨ
Ϭ͕ϬϵϱϱŐ
Ϭ͕ϬϵϵϵŐ
Ϭ͕ϬϵϮϭŐ
Ϭ͕ϬϵϲϬŐ
Ϭ͕ϬϵϳϱŐ
Ϭ͕ϭϬϭϵŐ
Ϭ͕ϬϵϭϲŐ
Ϭ͕ϬϬϬϬŐ
Anexo 7.
Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis alcalina (NaOH 5%)
ŶĄůŝƐŝƐ ĚĞ ǀĂƌŝĂŶnjĂ ĚĞ ďƵĐŚſŶ ĞŶ ůĂ ŚŝĚƌſůŝƐŝƐ ĂůĐĂůŝŶĂ ;EĂK, ϱйͿ͕ ĐŽŶ ƵŶ ŶŝǀĞů ĚĞ ƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂ ĚĞ
Ϭ͘Ϭϱ͘
Modelo
Modelo
Corregido
Intercepto
Suma de
cuadrados
tipo III
a
.022
Grados de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
11
0,002
852,829
0
0,286
1
0,286
123657,324
0
Concentración
del sustrato
Tiempo de
esterilización
(min)
Concentración
del sustrato *
Tiempo de
esterilización
(min)
Error
0,009
5
0,002
746,095
0
0,01
1
0,01
4214,046
0
0,003
5
0,001
287,318
0
0
24
0
Total
0,308
36
Corrección
Total
0,022
35
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶƉĂƌĂůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂůĐĂůŝŶĂ;EĂK,ϱйͿĞŶďƵĐŚſŶ͘
NaOH 5 %
Tiempo de
esterilización(min)
Proporción
30
60
1:1
0,159 a
0,085 bcd
1:4
0,108 b
0,075 cd
1:9
0,098 bc
0,074 cd
1:19
0,092 bcd
0,068 cd
1:49
0,088 bcd
0,068 cd
1:99
0,088 bcd
0,0670 d
ϱϭ
ŶĄůŝƐŝƐĚĞǀĂƌŝĂŶnjĂĚĞĞůŽĚĞĂĞŶůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂůĐĂůŝŶĂ;EĂK,ϱйͿ͕ĐŽŶƵŶŶŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘Ϭϱ͘
Modelo
Suma de
cuadrados
tipo III
a
.024
Grados
de
libertad
11
Cuadro
medio
.002
15.368
.000
.003
1
.003
23.839
.000
Concentración
del sustrato
Tiempo de
esterilización
(min)
Concentración
del sustrato *
Tiempo de
esterilización
(min)
Error
.017
5
.003
23.839
.000
.001
1
.001
8.310
.008
.006
5
.001
8.310
.000
.003
24
.000
Total
.031
36
Corrección
Total
.028
35
Modelo
Corregido
Intercepto
F
Significancia
calculado
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶƉĂƌĂůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂůĐĂůŝŶĂ;EĂK,ϱйͿĞŶĞůŽĚĞĂ͘
NaOH 5 %
Tiempo de esterilización(min)
Proporción
30
60
1:1
0,093 a
0,071 ab
1:4
0,078 ab
0,068 b
1:9
0,075 ab
0,067 b
1:19
0,074 ab
0,068 b
1:49
0,070 ab
0,067 b
1:99
0,073 ab
0,068 b
ϱϮ
Anexo 8.
Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus
Análisis de varianza de la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón con un nivel de
significancia de 0.05.
Modelo
Modelo
Corregido
Intercepto
Tiempo (días)
Suma de
cuadrados
tipo III
a
36.545
Grados de
libertad
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
17
2,15
101,99
0
503,25
1
503,25
23876,212
0
9,33
5
1,866
88,531
0
Concentración
del hongo
Tiempo (días) *
Concentración
del hongo
Error
23,612
2
11,806
560,128
0
3,603
10
0,36
17,092
0
0,759
36
0,021
Total
540,554
54
Corrección
Total
37,304
53
Prueba de rango múltiple de Duncan para la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en
buchón.
Tiempo (días)
Concentración del
hongo Pleurotus
ostreatus
Azucares reductores (g/L)
2%
5
2,05 h
7
2,17 gh
10
2,24 gh
11
2,22 gh
12
2,15 gh
13
2,10 h
3%
2,13 h
3,69 cd
3,73 bcd
3,50 de
3,33 ef
3,19 f
10%
2,40 g
4,25 a
4,37 a
3,96 b
3,78 bcd
3,63 d
ϱϯ
Análisis de varianza de la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón con un nivel de
significancia de 0.05.
Modelo
Modelo
Corregido
Intercepto
Suma de Grados de
cuadrados libertad
tipo III
a
12.743
17
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
,750
38,718
,000
410,804
1
410,804
21219,728
,000
Tiempo (días)
4,907
5
,981
50,698
,000
Concentración
del hongo
Tiempo (días) *
Concentración
del hongo
Error
7,191
2
3,595
185,722
,000
,644
10
,064
3,327
,004
,697
36
,019
Total
424,244
54
Corrección
Total
13,439
53
Prueba de rango múltiple de Duncan para la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en elodea.
Concentración del
hongo Pleurotus
ostreatus
Tiempo (días)
Azucares reductores (g/L)
5
7
10
11
12
13
2%
1,93 d
2,38 c
2,44 c
2,38 c
2,22 c
2,17 d
3%
2,16 d
2,99 b
3,27 ab
3,21 ab
2,96 b
2,87 b
10%
2,41 c
3,367 ab
3,48 a
3,48 a
3,01 b
2,88 b
ϱϰ
Anexo 9.
Resultados de los controles de la prueba cualitativa para la determinación de etanol
(yodoformo)
ϭ
Ϯ
Ϯ
ϭ
Ϯ
ϭ
ϱϱ
ϭ
Ϯ
ϭ
Ϯ
Prueba de yodoformo controles de etanol y algunos posibles interferentes. En la primera columna
de la izquierda se observan los resultados de la prueba de yodoformo para los controles con
proporciones de izquierda a derecha 1:1, 1:9 y 1:99 en medio buchón; en la columna de la derecha
para el medio elodea con las mismas proporciones. En las filas se encuentran los diferentes
compuestos. A. Etanol, B. Acetato de etilo, C. Acetona, D. Alcohol Isopropílico, E. Metanol.
ϱϲ
Anexo 10.
Producción de etanol por la prueba cualitativa de yodoformo y comparación
de los resultados con el crecimiento en buchón o elodea como única fuente de
carbono.
Crecimiento única
Prueba de Yodoformo
CEPA
Caldo YGC
Buchón
Elodea
Buchón
Elodea
1
+++
+++
+++
++
+++
2
-
-
-
+
++
3
++
+
-
++
++
4
++
+
+
++
++
5
+++
+
-
+
++
6
++
+
+
+
++
7
+++
-
-
+++
+++
8
-
-
-
++
++
Y
-
-
-
++
++
9
-
-
-
++
++
S
+
-
-
++
+++
10
+
-
-
+++
++
11
-
-
-
++
++
T
++
+++
++
++
++
14
+
-
-
+++
++
16
+++
+++
+
++
+
16a
-
-
-
++
++
17
+++
+
++
+
+
17a
++
+
-
+
++
17m
++
+
+
++
+
18
+
-
-
++
+++
19
+
-
-
++
+++
21
-
-
-
++
+
22a
++
+
+
+
+
23
+++
+++
++
++
++
23a
+++
++
++
+++
+++
25a
+++
+
-
++
++
26
+
-
-
++++
++++
R
+++
+++
+
++++
++++
29
-
-
-
+
+
30
++
+++
+++
+++
++++
35
+
+
-
++
++
40
-
-
-
++
+
41
+++
-
-
++
+++
ϱϳ
Fuente de carbono
42
-
-
-
+
+
45
+++
+++
+
+++
++
50
-
-
-
++
++++
52
-
-
-
+
+
59
-
-
-
++
+
U
-
-
-
+++
+++
54
+
+
-
++
++
60
-
-
-
+++
+++
63
+
-
-
++
+++
70
-
-
-
+
+++
74
-
-
-
+++
++++
76
-
-
-
+
+++
77
-
-
-
+++
+++
79
-
-
-
+
+
81
+
++
-
++
+
ϱϴ
Anexo 11.
Análisis estadístico de la determinación de etanol por la prueba del dicromato de potasio
ŶĄůŝƐŝƐĚĞǀĂƌŝĂŶnjĂĐŽŶůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽĞŶďƵĐŚſŶ͘EŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘Ϭϱ͘
Modelo
Suma de
cuadrados
tipo III
a
4863.458
Grados
de
libertad
9
Cuadro
medio
F
calculado
Significancia
540.384
12.059
.000
16.476.797
1
16.476.797
367.678
.000
159.235
1
159.235
3.553
.073
Hidrolisis
3.546.820
1
3.546.820
79.147
.000
Levadura
1.157.402
7
165.343
3.690
.009
Error
985.888
22
44.813
Total
22.326.143
32
Corrección
Total
5.849.345
31
Modelo
Corregido
Intercepto
Tiempo(horas)
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶĞŶďƵĐŚſŶƉĂƌĂůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽ͘
Levadura
1
T
16
23
R
30
45
Control
Determinación de etanol
Medio
Etanol g/L
24
48
Hidrolizado
37,180 bcd
41,570 ab
Sin hidrolisis
6,935 f
9,462 f
Hidrolizado
37,605 bcd
41,34 ab
Sin hidrolisis
10,151 f
13,413 f
Hidrolizado
23,655 cdef
34,679 bcd
Sin hidrolisis
10,656 f
22,277 def
Hidrolizado
31,245 bcde
37,665 bcd
Sin hidrolisis
8,084 f
12,310 f
Hidrolizado
23,175 cdef
36,333 bcd
Sin hidrolisis
9,278 f
11,988 f
Hidrolizado
38,400 bc
54,9704 a
Sin hidrolisis
7,533 f
12,999 f
Hidrolizado
17,706 ef
35,598 bcd
Sin hidrolisis
12,034 f
14,004 f
Hidrolizado
16,490 ef
16,655 ef
Sin hidrolisis
6,476 f
6,495 f
ϱϵ
ŶĄůŝƐŝƐĚĞǀĂƌŝĂŶnjĂĐŽŶůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽĞŶďƵĐŚſŶ͘EŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘Ϭϱ͘
Modelo
Suma de Grados
cuadrados
de
tipo III
libertad
a
2376.381
8
Modelo
Corregido
Intercepto
Cuadro
medio
F
Significancia
calculado
297.048
18.408
.000
12.905.660
1
12.905.660
799.741
.000
275.171
1
275.171
17.052
.001
Hidrolisis
1.610.432
1
1.610.432
99.796
.000
Levadura
490.777
6
81.796
5.069
.003
Error
306.609
19
16.137
Total
15.588.649
28
Corrección Total
2.682.989
27
Tiempo(horas)
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶĞŶĞůŽĚĞĂƉĂƌĂůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽ͘
Levadura
1
Determinación de etanol
Medio
Etanol g/L
24
48
Hidrolizado
17,546 fghi
32,474 abc
Sin hidrolisis
T
17
23
23 A
30
Control
8,865 i
14,698 fghi
Hidrolizado
33,393 ab
35,230 a
Sin hidrolisis
12,034 ghi
14,652 fghi
Hidrolizado
29,627 abcde
36,425 a
Sin hidrolisis
10,289 hi
17,684 fghi
Hidrolizado
30,775 abcd
33,577 ab
Sin hidrolisis
10,65 ghi
16,030 fghi
Hidrolizado
21,664 defg
37,803 a
Sin hidrolisis
18,511 fgh
30,867 abcd
Hidrolizado
23,288 cdef
31,785 abc
Sin hidrolisis
11,132 ghi
16,030 fghi
Hidrolizado
20,336 efgh
24,724 bcdef
Sin hidrolisis
6,384 i
6,568 i
ϲϬ
Anexo 12.
Identificación presuntiva de las 13 cepas de levaduras escogidas como mejores
productoras de etanol
Compuesto
LEVADURAS
L23
LR
L30
L23A
LT
L1
L16
L17
L45
Hidroxiprolina-b- Naftilamida
+
+
+
+
+
-
-
-
-
L-isoleucina-b-naftilamida
-
-
-
D
+
-
D
+
+
L-prolina-b-Naftilamida
+
+
+
+
+
-
-
-
-
L-tirosina-b-Naftilamida
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Glicina-b-Naftilamida
-
-
-
-
-
-
D
+
+
Glicilglicina-b-Naftilamida
+
-
+
+
+
-
-
-
-
Glicil-L-arginina 4-metoxi-b-Naftilamida
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
L-lisil-L-alanina 4-metoxi-b-Naftilamida
-
+
-
-
-
-
-
-
-
L-alanina-4-metoxi-b-Naftilamida
-
-
-
-
-
-
-
-
-
L-seril-L-tirosina-b-Naftilamida
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Urea
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3-Indoxil-fosfato
+
+
+
+
+
-
+
+
+
L-histidina -b-Naftilamida
D
+
D
D
D
D
D
+
+
Sacarosa
-
+
-
-
-
+
-
-
-
Sacarosa
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Trehalosa
+
+
+
+
+
+
+
+
+
p-nitrofenil-Į-D-glucopiranosido
-
-
-
-
-
-
-
-
-
o-nitrofenil-ȕ-D-glucopiranosido
-
-
-
+
+
-
-
-
-
o-nitrofenil-ȕ-D-Galactopiranosido
-
-
-
-
-
-
-
-
-
p-nitrofenil-Į-D-glucopiranosido
-
-
+
+
+
+
+
+
+
p-nitrofenil-ȕ-Fucopiranosido
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
p-nitrofenil-ȕ-D-celobiosa
-
-
-
-
-
-
-
-
-
p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Galactosaminida
-
-
+
-
-
-
-
-
-
Identificación presuntiva
ϲϭ
Brettanomyces
sp.
+
C. lusitaniae
-
Candida sp.
-
C. albicans
-
Candida sp.
-
C. parapsilosis
p-nitrofenil-Į-D-Galactopiranosido
p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Glucosamina
H. polymorpha
-
+
Hansenula sp
-
L-arginil-L-arginina-b-Naftilamida
Hansenula sp
Glicil-L-prolina-4-metoxi-b-Naftilamida